Nghiên cứu tạo chế phẩm compozit chứa chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic ứng dụng trong bảo quản quả đào pháp sau thu hoạch

NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ BẢO QUẢN CỦA COMPOZIT CỦA CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VỚI AXIT OLEIC TRONG BẢO QUẢN ĐÀO PHÁP SAU THU HOẠCH .... Thông tin chung Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế p

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: Ks PHẠM THỊ PHƯƠNG

Thái Nguyên, Ngày 09 tháng 03 năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

Chủ nhiệm đề tài Xác nhận của hội đồng nghiệm thu

(Ký, họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

- Phản biện 1: ………

- Phản biện 2: ………

Thái Nguyên, Ngày 09 tháng 03 năm 2017

Chủ nhiệm đề tài: Phạm Thị Phương

Những người tham gia: Lương Hùng Tiến

Nguyễn Văn Bình Bùi Tuấn Hà, Phạm Thị Ngọc Mai

Phạm Thị Tuyết Mai Thời gian thực hiện: Tháng 1/2016 đến tháng 12 năm 2016

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm khoa CNSH-CNTP Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, Ngày 09 tháng 03 năm 2017

MỤC LỤC

MỤC LỤC Error! Bookmark not defined

DANH MỤC CÁC BẢNG v

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 5

1.2 Mục đích 6

1.3 Yêu cầu 6

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN 7

2.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan 7

2.1.1.1 Nguồn gốc chitin/chitosan 7

2.1.1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan 7

2.1.2 Tính chất vật lý 8

2.1.3 Tính chất hóa học 9

2.1.4 Tính chất sinh học và độc tính của chitosan 9

2.1.5 Đặc tích kháng vi sinh vật của chitosan 10

2.1.5.1 Những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng vi sinh vật của chitosan 11

2.1.5.2 Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan 12

2.1.6 Ứng dụng của chitosan trong bảo quản rau quả tươi 13

2.2 GIỚI THIỆU VỀ CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 14

2.2.1 Khả năng kháng khuẩn của chitosan khối lượng phân tử thấp 14

2.3 GIỚI THIỆU VỀ COMPOZIT CỦA CHITOSAN VỚI AXIT OLEIC 15

2.3.1 Một số tính chất của compozit của chitosan với axit oleic 15

2.3.2 Một số ứng dụng của compozit của chitosan trong bảo quản rau quả tươi 16

2.4 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU ĐÀO 17

2.4.1 Tình hình sản xuất đào trên thế giới và Việt Nam 17

2.4.1.1 Tình hình sản xuất đào trên thế giới 17

2.4.1.2 Tình hình sản xuất đào ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 21

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 21

3.1.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 21

3.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.1.4.1 Địa điểm nghiên cứu 22

3.1.4.2 Thời gian nghiên cứu 22

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 22

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.3.1 Phương pháp tổng hợp chitosan khối lượng phân tử thấp từ chitosan thông thường 23

3.3.2 Phương pháp xác định khả năng kháng nấm mốc của chitosan khối lượng phân tử thấp 23

3.3.3 Phương pháp chuẩn bị compozit 26

3.3.4 Phương pháp xác định một số tính chất của màng 26

3.3.5 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm compozit chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic tới chất lượng và thời gian bảo quản quả đào pháp sau thu hoạch 27

3.3.5.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 27

3.3.5.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu 27

f Phương pháp đánh giá cảm quan 29

3.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 29

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP 30

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử tới khả năng kháng nấm mốc của chitosan khối lượng phân tử thấp 30

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý chitosan đến sự phát triển của nấm mốc 31

4.2 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA MÀNG FILM TẠO RA TỪ COMPOZIT CỦA CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VỚI AXIT OLEIC 32

4.2.1 Tính tan của màng trong nước 32

4.2.2 Tính hút ẩm của màng 33

4.3 NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ BẢO QUẢN CỦA COMPOZIT CỦA CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP VỚI AXIT OLEIC TRONG BẢO QUẢN ĐÀO PHÁP SAU THU HOẠCH 33

4.3.1 Ảnh hưởng của compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic đến hao hụt khối lượng tự nhiên 33

4.3.2 Ảnh hưởng của compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic đến hàm lượng chất rắn hòa tan tổng số (TSS) 34

4.3.3 Ảnh hưởng của compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic đến hàm lượng vitamin C 35

4.3.5 Ảnh hưởng của compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

đến tỷ lệ thối hỏng 37

4.3.6 Ảnh hưởng của compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic đến chất lượng cảm quan 37

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

5.1 KẾT LUẬN 38

5.2 KIẾN NGHỊ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng đào một số nước trên thế giới năm 2008 18

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến sự phát triển của nấm mốc Penicillium expansum 30

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý chitosan đến sự phát triển của nấm mốc Penicillium expansum 31

Bảng 4.3 Tính tan và tính hút ẩm của compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic 32

Bảng 4.4 Hao hụt khối lượng tự nhiên của đào Pháp trong quá trình bảo quản 34

Bảng 4.5 Sự biến đổi chất rắn hòa tan tổng số (oBx) trong quá trình bảo quản

đào Pháp 35

Bảng 4.6 Sự biến đổi hàm lượng vitamin C trong quá trình bảo quản đào Pháp 35

Bảng 4.7 Sự biến đổi hàm lượng axit tổng số trong quá trình bảo quản đào Pháp 36

Bảng 4.8 Tỷ lệ thối hỏng trong quá trình bảo quản đào Pháp 37

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic đến chất lượng cảm quan của đào sau 28 ngày bảo quản 37

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

1 Thông tin chung

Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chế phẩm compozit chứa chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic ứng dụng trong bảo quản quả đào Pháp sau thu hoạch

Mã số: T2016 - 25

Chủ nhiệm đề tài: Phạm Thị Phương Tel: 0962 075 082

E-mail: phamthuphuonghb@gmail.com

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện: Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ

Pháp sau thu hoạch:

- Đánh giá được hiệu quả của chế phẩm compozit chứa chitosan khối lượng phân

tử thấp với axit oleic tới chất lượng và thời gian bảo quản đào Pháp sau thu hoạch

3 Nội dung chính:

- Tổng hợp chế phẩm compozit chứa chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Xác định khả năng kháng nấm mốc gây hư hỏng quả đào pháp của chitosan

khối lượng phân tử thấp

- Xác định một số tính chất, chức năng của màng film tạo thành từ compozit chứa chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Đánh giá được hiệu quả của chế phẩm compozit chitosan khối lượng phân tử

thấp với axit oleic tới chất lượng và thời gian bảo quản quả đào pháp sau thu hoạch

4 Kết quả chính đạt được

Tổng hợp được chitosan khối lượng phân tử thấp và compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Xác đinh được chitosan khối lượng phân tử 6 104 có khả năng kháng tốt nhất

sự phát triển của nấm mốc penicillium expansum ở nồng độ 3000ppm và thời gian

kháng tốt nhất là 30 giờ

- Xác định được màng tạo ra từ compozit của chitosan có khối lượng phân tử

là 6.104 Da nồng độ 15ml/l với axit oleic nồng độ 10ml/l có tính tan và khả năng hút ẩm thấp nhất

- Xác định được compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp kết hợp với axit

oleic nồng độ 15ml/l và 10ml/l có khả năng bảo quản tốt nhất đối với quả đào pháp bảo quản lạnh Sau 28 ngày bảo quản hao hụt khối lượng tự nhiên thấp nhất, hàm lượng TSS, hàm lượng vitamin C, axit tổng số, giảm it nhất, tỷ lệ thối hỏng thấp nhất, kết quả đánh giá chất lượng cảm quan được xếp vào loại khá

5 Sản phẩm:

a Sản phẩm đào tạo: 02 đề tài nghiên cứu khoa học của sinh viên

b Sản phẩm khoa học: 01 bài báo đăng tạp chí trong nước

6 Hiệu quả và khả năng ứng dụng:

Chế phẩm compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic được sử dụng để bảo quản đào Pháp và một số loại quả ôn đới khác (hồng, lê, mận, ) cho các tỉnh trồng đào chính như Lào Cai, Hà Giang, Yên Bái,…

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1 General information:

Project title: Study on create composite of chitosan low molecular weight with oleic

acid application on storage France peachs

Code number : T2016-25

Coodinator: Pham Thi Phương

Tel: 0962.075.082 Email: phamthuphuonghb@gmail.com

Implementing institution : Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry Incooperating institution(s): Falcuty of Biotechnology and Food technology

Duration: from 01/2016 to 12/2016

2 Objective(s):

- Created composite of chitosan low molecular weight with oleic acid was improved some of the characteristics and functions suitable for postharvest France peachs

- Evaluate the effect of composite of chitosan low molecular weight with oleic acid on quality and shelf –life of postharvest France peachs

3 Main contents:

Content 1: Composite of chitosan low molecular weight with oleic acid was created

Content 2: Evaluate the inhibition ability of chitosan low molecular weight with mold cause deseas on France peach fruits

Content 3: Determine a number of characteristics of the films formed from composite

of chitosan low molecular weight with oleic acid

Content 4: Evaluate the effect of composite of chitosan low molecular weight with

oleic acid on the quality and shelf-life of postharvest France peach fruits

4 Results obtained:

- Synthesized composite of chitosan low molecular weight with oleic acid

- Identification of chitosan molecular weight 6 104 Da was best able to

inhibiting growth of penicillium expansum molds at concentration of 3000ppm and the

best time sensitivity assay was 30 hours

- Films are formed from composites of chitosan low molecular weight (6.104 Da) at concentration of 15ml/l with oleic acid at concentration of 10ml/l as the lowest solubility and water vapor permeability

- Evaluated composite of chitosan low molecular weight with oleic acid at concentration of 15ml/l and 10 ml/l have the best result with France peach Fruits storaged in cold temperature Results after 28 days of storage showed that composite

of chitosan low molecular weight (15 ml/l) with oleic acid (10 ml/l) could maintain the best colour, the lowest natural weight loss, the lowest total soluble solids, vitamin C, titratable acid, and decay rate, sensory quality were rated as the highest

5 Products:

a Training product: 02 Student science projects

b Scientific product: 01 article published in domestic magazine

6 Efects and applications:

Composite of chitosan low molecular weight with oleic acid is used to storage France peach Fruits and ome other temperate fruits (persimmons, pears, plum, ) for the main growth plant fruit provinces likes Yen Bai, Lao Cai, Ha Giang,…

Một hạn chế khác của chitosan thông thường là khả năng kháng vi sinh vật và tính tan kém Chitosan thông thường có nồng độ 1% không có tác dụng tiêu diệt hầu hết các loại nấm mốc gây hư hỏng quả sau thu hoạch Mặt khác chitosan thông thường chỉ tan trong dung dịch axit yếu làm hạn chế khả năng ứng dụng của chitosan trong thực tế, nhất là khi kết hợp chitosan với các hợp chất có tính kiềm gây hiện tượng kết tủa chitosan, dung dịch chitosan có pH thấp cũng gây ra hiệu ứng sinh lý bất lợi khi phủ lên bề mặt quả bảo quản Do đó để cải thiện tính kháng khuẩn và tính tan của chitosan các nhà khoa học đã tổng hợp chitosan khối lượng phân tử thấp một vật liệu được đánh giá là có khả năng tan ở một dải pH rộng hơn và có khả năng kháng khuẩn cao hơn chitosan thông thường (Dutta et al., 2009; Gerasimenko et al., 2004)

Đào là loại cây ăn quả ôn đới, có tên khoa học là Prunus persica (L.) Batsch,

thuộc họ Rosaceae Trong những năm gần đây, quả đào Pháp là một trong ba loại quả (hồng, lê, đào) quan trọng trong chiến lược phát triển các giống cây ăn quả ôn đới của Bắc Hà, Sapa (Lào Cai), Mộc Châu (Sơn La), Đồng Văn (Hà Giang), và các tỉnh như Hòa Bình, Lai Châu, Lạng Sơn, (Viện KHKT Nông Lâm Nghiệp Miền Núi Phía Bắc) Quả đào là một trong những loại quả có mẫu mã quả đẹp, vị ngọt, chua rất thích hợp với khẩu vị của nhiều người, quả đào được dùng chính để ăn tươi Đào là loại quả rất giàu vitamin C, carotenoid và các hợp chất phenolics là những nguồn chất kháng

oxy hóa rất tốt (Tom’as - Baber’an et al., 2001).Tuy nhiên đào là loại quả hô hấp đột biến có hàm lượng nước khá cao (khoảng 82%), nhiều chất dinh dưỡng và kém bền vững nên dễ bị hư hỏng nếu không có công nghệ bảo quản tốt Mặt khác trên thực tế chưa có nhiều nghiên cứu bảo quản đào nói chung và đào Pháp nói riêng

Từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm compozit chứa chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic ứng dụng trong bảo quản quả đào Pháp sau thu hoạch”

1.2 Mục đích

- Tổng hợp và đánh giá được một số tính chất chức năng của chế phẩm

compozit chứa chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Đánh giá được hiệu quả của chế phẩm compozit chứa chitosan khối lượng phân

tử thấp với axit oleic tới chất lượng và thời gian bảo quản đào Pháp sau thu hoạch

1.3 Yêu cầu

- Tổng hợp được compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Xác định được khả năng kháng nấm mốc của chitosan khối lượng phân tử thấp

- Xác định được một số tính chất chức năng của màng film tạo ra từ compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Xác định được hiệu quả bảo quản của compozit của chitosan khối lượng phân

tử thấp với axit oleic trong bảo quản quả đào Pháp sau thu hoạch

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHITOSAN

2.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc hóa học của chitosan

2.1.1.1 Nguồn gốc chitin/chitosan

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó Năm 1923, Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là

“chitin” hay “chitine”, tiếng Hy Lạp gọi là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với cellulose Sự có mặt của nitơ trong chitin đã được Lassaige chứng minh vào năm 1843, từ đó nhân loại bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng lâu dài hợp chất này và các dẫn xuất của nó (Shahidi et al., 1999)

Ở động vật chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong vỏ một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác, giun tròn Hàm lượng chitin (theo % chất khô) ở động vật giáp xác như tôm, cua (58,85%), côn trùng (20-60%), động vật thân mềm (3-26%), giun đốt (20-28%), ruột khoang (3 - 30%), rong biển chứa một lượng nhỏ chitin, nấm có chứa khoảng 45% chitin (Mati-Baouche et al., 2014) Ở động vật bậc cao, monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da giúp cho

sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da Ở vi sinh vật chitin có trong thành tế bào nấm, trong sinh khối nấm mốc và một số loại tảo (Sun et al., 2014)

2.1.1.2 Cấu trúc hóa học của chitosan

a Công thức cấu tạo của chitin

Chitin có cấu trúc là một polyme được tạo thành từ các đơn vị N - acetyl - β - D - glucosamin liên kết với nhau bởi liên kết β - 1 - 4 glucoside

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của chitin

Chitosan thu được từ quá trình diacetyl hóa chitin, thay thế nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2 Do qúa trình acetyl hóa xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước nếu độ diacetyl hóa (degree of deacetylation)(DD), DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% thì gọi là chitin

Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ đơn vị 2-deoxy-β-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit

b Cấu trúc hóa học của Chitosan

Hình 2.2 Cấu trúc của chitosan

Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2deoxy- β-D-glucose; poly(1-4)- 2deoxy- β-D-glucopyranose

amino-Công thức phân tử: [C6H11O4N]n

Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n

Trong thực tế các mạch chitin - chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp (Huỳnh Nguyễn Duy Bảo

và cs, 2000)

2.1.2 Tính chất vật lý

Chitosan là chất rắn hình vẩy, xốp, nhẹ, màu trắng ngà, không mùi, không vị,

có thể xay nhỏ ở các kích thước khác nhau Nhiệt độ nóng chảy ở 309 - 3110C tùy vào trọng lượng phân tử và mức độ diacetyl hóa Trọng lượng phân tử 10000- 1200000 Da tùy theo điều kiện sản xuất Tỷ trọng của chitosan trong động vật giáp xác rất cao khoảng 0,39g/lit phụ thuộc vào loài giáp xác, phương pháp chế biến, mức độ diacetyl hóa (Dutta et al., 2004)

Quá trình diacetyl hóa bao gồm quá trình loại nhóm acetyl khỏi chuỗi phân tử chitin và hình thành phân tử chitosan với nhóm amin hoạt động hóa học cao Mức độ diacetyl hóa là một đặc tính quan trọng của quá trình sản xuất chitosan bởi nó ảnh hưởng đến tính chất lý, hóa học và khả năng ứng dụng của chitosan Mức độ diacetyl hóa vào khoảng 70 - 100% phụ thuộc vào loài giáp xác, phương pháp sử dụng Có nhiều phương pháp để xác định mức độ diacetyl hóa của chitosan như: Khử ninhydrin, chuẩn độ theo điện thế, quang phổ hồng ngoại, chuẩn độ pH, Trong đó phương pháp

sử dụng hồng ngoại thường được sử dụng để thiết lập các giá trị mức độ deacetyl hóa của chitosan Khi ở mức độ diacetyl hóa thấp, chitosan có khả năng hút ẩm lớn do vậy trước khi phân tích chitosan cần phải sấy (Pal et al., 2007)

Tính tan của chitosan phụ thuộc vào mức độ diacetyl hóa, sự phân bố của các nhóm acetyl dọc theo chuỗi chính, trọng lượng phân tử và bản chất của các axit được

sử dụng để cho proton, nhưng không giống như chitin, chitosan hòa tan trong dung dịch axit loãng có pH < 6.0 do sự có mặt của các nhóm anin (Leceta et al., 2013a).Các acid hữu cơ như acetic, formic, lactic thường được sử dụng để hòa tan chitosan Dung dịch axit axetic nồng độ cao tại nhiệt độ cao có thể dẫn đến dipolyme hóa chitosan Ở

pH cao có thể xảy ra hiện tượng kết tủa hoặc đông tụ nguyên nhân là do hình thành hỗn hợp với chất keo anion Tính tan của chitosan còn bị ảnh hưởng bởi mức độ diacetyl hóa, mức độ diacetyl hóa trên 85% để đạt được tính tan mong muốn (Shahidi

et al., 1999)

Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm Khi sử dụng màng chitosan dễ dàng điều chỉnh nhiệt độ, độ thoáng cho thực phẩm Màng chitosan khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn được dùng để bao gói (Shahidi et al., 1999)

2.1.3 Tính chất hóa học

Phân tử chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-acetyl-D-glucosamine và -OH, -NH2 trong các mắt xích D-glucosamine do đó nó vừa là alcol vừa là amin và amit, phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn suất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế O-, N-

Chitosan là những polisaccharide mà các đơn phân được nối với nhau bởi các liên kết β1-4 glucoside, các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các liên kết hóa học như: acid, base, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân (Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và cs, 2000)

Trong phân tử các chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên

tử oxy và nito của nhóm chức có cặp electron chưa sử dụng nên chúng có khả năng tạo phức với kim loại như: Hg+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+… Tùy nhóm chức trên mạch polyme mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau (Hiroshi, 1997)

2.1.4 Tính chất sinh học và độc tính của chitosan

Chitosan là hợp chất tự nhiên không độc, dùng an toàn cho người, có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học (Elsabee et al, 2012) Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: có khả năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng nấm, tính kháng khuẩn, với nhiều chủng loại vi sinh vật khác nhau, kích thích

sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện ngèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống xưng u (Zemljic et al., 2013)

Chitosan là chất thân lipid có khả năng hấp thụ dầu mỡ cao, chúng có thể hấp thụ 6 - 8 lần trọng lượng phân tử Chitosan phân tử lượng nhỏ có điện tích dương nên

có khả năng gắn kết với điện tích âm của lipid và acid tạo thành những chất có phân tử lượng lớn không bị tác dụng bởi men tiêu hóa Do đó không bị hấp phụ vào cơ thể mà được thải ra ngoài làm giảm cholesterol, acid uric trong máu nên tránh được nguy cơ

bệnh tim mạch, bệnh gut, kiểm soát được tăng huyết áp và giảm cân Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptide - insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường Nhiều công trình nghiên cứu

đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, tăng cường bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/AIDS,

chống tia tử ngoại, chống ngứa của chitosan (Hsieh et al., 2007)

Vào năm 1968, Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không độc, chỉ số LSD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc lên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch không thấy có tích lũy ở gan Loại chitosan có DD = 50% có khả năng phân hủy sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách (Dutta et al., 2004)

2.1.5 Đặc tích kháng vi sinh vật của chitosan

Chitosan có khả năng kháng nhiều loài vi sinh vật như vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương, nấm mốc và nấm men Khả năng kháng khuẩn của chitosan được cho là do tương tác tĩnh điện giữa các polycation của chitosan với các ion âm trên màng tế bào vi sinh vật Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chitosan đối với vi khuẩn Gram âm và Gram dương từ 100 - 2000 ppm (Goy et al., 2009) Nghiên cứu khả năng kháng một số vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm của chitosan cho thấy, nấm men bị loại bỏ hoàn toàn khi tăng thêm 0,3g chitosan trên mỗi lít nước ép táo đóng chai tiệt trùng được lưu trữ tại 7°C Số lượng vi khuẩn lactic tăng với tốc độ chậm hơn Tuy nhiên sự gia tăng số lượng vi khuẩn thấp hơn so với đối chứng (Rhoades & Roller, 2000) Chitosan sử dụng để xử lý nước ép trái cây kết quả cho thấy chitosan ức chế

nấm men nhưng không ức chế E coli O157: H7 (Kiskó et al., 2005) Tuy nhiên, Abd

& Niamah (2012) cho rằng chitosan ở nồng độ 0,2-1 g/L trong nước ép táo có thể ức chế sự tăng trưởng của một số vi khuẩn, nấm mốc và nấm men gây hư hỏng nước ép

táo Gần đây phức chitosan arginine cho thấy hoạt động kháng khuẩn E.coli O157

trong nước cốt gà (Lahmer et al., 2012)

Nghiên cứu hiệu quả kháng nấm mốc gây hư hỏng quả của chitosan nồng độ 0,5; 1; 1,5 và 2% cho thấy chitosan có tác dụng kháng nấm ở các giai đoạn phát triển

khác nhau (sự tăng trưởng của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử) của cả Colettochitrum musae phân lập từ chuối, Colettochitrum gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh

long (Zahid et al., 2012) Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Bautista-Baños et

al (2004) cho rằng sự tăng trưởng của sợi nấm và sự này mầm của bảo tử nấm

Fusarium, Penicillium, và Rhizopus bị ức chế bởi chitosan Tuy nhiên so với

Penicillium, và Rhizopus thì Fusarium là nấm nhạy cảm nhất Việc giảm tối đa trọng

lượng khô của sợi nấm và ức chế hình thành bào tử được quan sát thấy ở chitosan nồng

độ 2% đối với Colettochitrum musae phân lập từ chuối, Colettochitrum gloeosporioides phân lập từ đu đủ và thanh long (Zahid et al., 2012) Hiệu ứng tương

tự cũng được chứng minh trong các nghiên cứu trước đây về F oxysporum phân lập từ

đu đủ (Bautista-Baños et al., 2004) Các nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng chitosan

kích thích hình thành bào tử của Penicillium digitatum (Bautista-Baños et al., 2004),

và C gloeosporioides (Bautista-Baños et al., 2005)

2.1.5.1 Những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng vi sinh vật của chitosan

Tính kháng vi sinh vật của chitosan không chỉ phụ thuộc vào các điều kiện bên ngoài (vi sinh vật đích, tính chất của môi trường, pH, nhiệt độ, vv), mà còn phụ thuộc vào các yếu tố bên trong (như trọng lượng phân tử, và mức độ polymer hóa và mức độ diacetyl hóa) (Vargas et al., 2012)

- Trọng lượng phân tử: Nhiều nhà nghiên cứu đã thông báo rằng hoạt tính

kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử Nghiên cứu của Hwang

(1998) khảo sát khả năng kháng E coli của chitosan có trọng lượng phân tử từ 10000 -

170000 Dalton cho rằng chitosan có trọng lượng phân tử lớn hơn 30000 Dalton có hiệu

quả diệt E coli cao nhất Chitosan có khối lượng phân tử thấp được cho là có khả năng

kháng khuẩn cao hơn so với chitosan thông thường có khối lượng phân tử cao (Dutta et al., 2009) vì chitosan có khối lượng phân tử thấp có khả năng tan trong nước cao hơn dẫn đến phản ứng tốt hơn với các vị trí hoạt động của vi sinh vật Tuy nhiên kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử là

không hoàn toàn tương thích Trọng lượng phân tử tăng làm giảm hoạt tính kháng E.coli

của chitosan (Gerasimenko et al., 2004) Ngược lại với kết quả đề cập ở trên không có

sự khác biệt trong hoạt động kháng khuẩn của chitosan có trọng lượng phân tử khác

nhau đối với E coli và Bacillus subtilis (Gerasimenko et al., 2004)

và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật (Elsabee & Abdou, 2013)

- Độ pH

Hoạt động kháng khẩn của chitosan bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi pH Ở môi trường có giá trị pH thấp, có khả năng hòa tan chitosan cao và proton trong dung dịch

chitosan cao làm tăng hiệu quả kháng khuẩn (Aider & de Halleux, 2010) Nghiên cứu của Tsa & Su (1999) kiểm soát hoạt động kháng khuẩn của chitosan (DA 98%) đối với

E coli ở các giá trị pH khác nhau là 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 cho rằng chitosan có khả

năng kháng khuẩn tốt nhất ở pH 5,0 và chitosan có hoạt tính kháng khuẩn kém ở pH 9,0 Các nhà nghiên cứu khác cũng kết luận rằng chitosan không có hoạt tính kháng khuẩn ở pH 7,0 do nhóm amin và độ hòa tan của chitosan ở pH này rất kém Điều này cho thấy hoạt tính kháng khuẩn còn phụ thuộc vào bản chất cation của chitosan

- Nhiệt độ

Nhiệt độ cũng có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của chitosan Nhiệt độ cao hơn 370 C làm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của chitosan so với nhiệt độ lạnh Tuy nhiên, ảnh hưởng lớn nhất về hoạt động kháng khuẩn là môi trường xung quanh

Tsai và Su (1999) kiểm tra tác động của nhiệt độ đến hoạt động kháng E.coli của chitosan cho biết huyền phù tế bào E.coli trong đệm phosphate (pH 6) có chứa

chitosan nồng độ 150 ppm được nuôi ở các nhiệt độ là 4, 15, 25, 370C trong các khoảng thời gian khác nhau và định lượng tế bào còn sống sót Kết quả là hoạt động kháng khuẩn của chitosan tỷ lệ thuận với nhiệt độ Ở nhiệt độ 25 và 370C các tế bào

E.coli đã hoàn toàn bị giết chết trong vòng 1 giờ Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp hơn (4 và

150C) số lượng E.coli giảm trong vòng 5 giờ đầu tiên và sau đó ổn định Các tác giả

kết luận rằng hoạt động kháng vi khuẩn giảm do tỷ lệ tương tác giữa chitosan và các tế bào vi khuẩn ở nhiệt độ thấp thì thấp hơn ở nhiệt độ cao

- Vi sinh vật đích

Các vi sinh vật đích cũng có một vai trò quan trọng trong hiệu quả kháng khuẩn của chitosan Mật độ điện tích trên bề mặt tế bào vi sinh vật là một yếu tố quyết định đến lượng chitosan hấp phụ Lượng chitosan hấp phụ nhiều rõ ràng sẽ dẫn đến những thay đổi lớn trong cấu trúc và tính thấm của màng tế bào Nấm men và nấm mốc thường nhạy cảm nhất, tiếp theo là vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm (Aider

& de Halleux, 2010)

2.1.5.2 Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan

Mặc dù cơ chế kháng khuẩn chính xác của chitosan chưa được hiểu một cách đầy đủ, tuy nhiên có 3 cơ chế giải thích khả năng kháng khuẩn của chitosan là: Khả năng kháng khuẩn của chitosan là do sự tương tác giữa điện tích dương của nhóm amin (NH3+) ở giá trị pH thấp hơn 6,3 (các pKa của chitosan) và bề mặt tích điện âm của vi khuẩn Kết quả là làm thay đổi các đặc tính của màng bán thấm, do đó gây mất cân bằng thẩm thấu bên trong và bên ngoài dẫn đến ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật (Shahidi et al, 1999) Chitosan thủy phân peptidoglycan trong thành tế bào vi sinh vật dẫn đến làm rò rỉ các chất điện giải trong tế bào như các ion kali, và các thành phần

protein có trọng lượng phân tử thấp khác (như protein, axit nucleic, glucoza, và lactat dehydrogenaza) (Dutta et al., 2009)

Trong nghiên cứu về tính kháng E.coli của chitosan từ vỏ tôm người ta cho rằng

khả năng ức chế vi khuẩn của chitosan là do liên kết giữa chuỗi polyme của chitosan với các ion kim loại trên bề mặt của vi khuẩn làm thay đổi tính thấm của màng tế bào Khi bổ sung chitosan vào môi trường, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ điện tích âm sang điện tích dương Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực

tiếp hoạt động ức chế vi khuẩn E.coli mà do sự kết lại của các tế bào và sự tích điện

dương ở màng tế bào của vi khuẩn

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chitosan có khối lượng phân tử khác nhau trên 6 loài vi khuẩn Cơ chế kháng khuẩn của chitosan được xác định dựa trên việc đo tính thấm của màng tế bào vi khuẩn và quan sát sự nguyên vẹn của tế bào Kết quả chỉ ra rằng khả năng này giảm khi khối lượng nguyên tử tăng Chitosan cũng là nguyên nhân làm rò

rỉ các chất trong tế bào và phá hủy thành tế bào

2.1.6 Ứng dụng của chitosan trong bảo quản rau quả tươi

Chitosan được biết đến như một chất bảo quản tự nhiên được áp dụng trên nhiều loại rau quả Bằng cách tạo ra một màng bán thấm trên bề mặt rau quả, chitosan

có tác dụng làm thay đổi khí quyển bên trong (thay đổi tính thấm nước, oxy, carbon dioxide) do đó làm giảm sự thoát hơi nước, giảm tỷ lệ hô hấp, trì hoãn quá trình chín, kéo dài thời gian bảo quản và kiểm soát thối hỏng ở nhiều loại quả (Shi et al., 2013) Trong hầu hết các nghiên cứu bảo quản rau quả đều cho rằng tác dụng duy trì chất lượng trái cây của chitosan phụ thuộc phần lớn vào tính chất của màng, loại trái cây,

độ chín cũng như điều kiện bảo quản Nghiên cứu của Krishna & Rao (2014) bảo quản

ổi bằng chitosan 1% chỉ ra rằng chitosan có tác dụng giảm tỷ lệ hô hấp, giảm hao hụt khối lượng tự nhiên, màu sắc, độ cứng và chất lượng được duy trì cho đến khi kết thức quá trình bảo quản ở nhiệt độ thường (28 - 320C, độ ẩm 32 - 41%) trong 7 ngày

Nghiên cứu của Hossain & Iqbal (2016) bảo quản chuối bằng chitosan tạo ra từ

vỏ tôm kết luận xử lý chuối bằng chitosan nồng độ 1% có tác dụng làm giảm hao hụt khối lượng tự nhiên thấp nhất, duy trì được màu sắc, chất lượng dinh dưỡng, chất lượng cảm quan tốt nhất, mức độ nhiễm bệnh, tỷ lệ bệnh thấp nhất và kéo dài thời gian bảo quản chuối 16,6 ngày bảo quản ở nhiệt độ thường

Theo nhóm tác giả Trần Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Bích Thủy (2011), Nghiên cứu ảnh hưởng của Chitosan đến những biến đổi hóa lý của quả nhãn sau thu hoạch cho biết bảo quản nhãn bằng phương pháp bao màng chitosan và để trong bao bì

có đục lỗ, kết hợp với khống chế môi trường ở mức 100 C có tác dụng kéo dài thời gian bảo quản và duy trì chất lượng quả Nhãn được bảo quản bằng màng chitosan với

nồng độ 2% có thể duy trì chất lượng của quả trong thời gian 20 ngày, đảm bảo tiêu chuẩn về dinh dưỡng và cảm quan được người tiêu dùng chấp nhận

Theo nhóm tác giả Nguyễn Bích Thủy và cs (2008) nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan đến chất lượng và thời gian bảo quản quả chanh đã kết luận: Màng chitosan bao bọc quanh quả chanh tươi có tác dụng làm giảm hao hụt khối lượng tự nhiên, giữ hàm lượng chất khô tổng số, hàm lượng axit hữu cơ tổng số, và vitamin C vẫn còn cao trong suốt thời gian bảo quản Do đó duy trì được chất lượng dinh dưỡng, chất lượng cảm quan của quả trong quá trình bảo quản Chitosan có tác dụng bảo quản chanh lên tới 30 ngày

Một số nghiên cứu bảo quản chuối bằng màng chitosan cho biết chitosan có tác dụng làm giảm sự biến màu vỏ quả Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị Rau quả bị thâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polyme hóa của oquinon Nhờ bao gói bằng màng chitosan đã ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, là thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho màu sắc của rau quả tươi lâu hơn Chitosan nồng độ 1% được hòa tan trong dung dịch axit acetic 1% sau đó được phun lên bề mặt chuối Ưu điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian bảo quản, độ tươi của chuối gấp 3 lần so với các mẫu đối chứng (không sử dụng chitosan) (Đặng Văn Phú, và cs, 2008)

2.2 GIỚI THIỆU VỀ CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

Chitosan khối lượng phân tử thấp thu được bằng quá trình thủy phân chitosan bằng hydroperoxit Tùy theo từng điều kiện, chế độ thủy phân để thu được chitosan có khối lượng phân tử khác nhau Chitosan oligosaccharide được cơ thể người hấp thụ gần như hoàn toàn, hoạt động sinh học và chức năng của nó gấp hàng chục lần so với chitosan thông thường Nó được sử dụng như một tác nhân trị đái tháo đường vì nó làm tăng dung nạp glucose, bài tiết insulin và giảm chất béo trung tính một tác nhân trị đái tháo đường vì nó làm tăng dung nạp glucose, bài tiết insulin và giảm chất béo trung tính Chitosan oligosaccharide liên kết với chất béo dư thừa và ức chế sự hấp thụ chất béo, hỗ trợ khả năng miễn dịch, giảm lượng đường trong máu, kiểm soát huyết áp, ngăn chặn táo bón, loại chì và các kim loại nặng ra khỏi cơ thể, tăng cường sự hấp thụ canxi, ngăn ngừa bệnh tim và giảm nồng độ acid uric trong máu

2.2.1 Khả năng kháng khuẩn của chitosan khối lượng phân tử thấp

Một số nghiên cứu của Uchida et al, (1989) cho rằng chitosan được thủy phân nhẹ bằng chitosanase có khả năng kháng khuẩn tốt hơn là chitosan ban đầu và oligomer của chúng Cho et al, (1998) đã báo cáo rằng hoạt tính kháng khuẩn của

chitosan với Escherichia coli và Bacillus sp tăng theo chiều giảm độ nhớt từ 1000 đến

10 cP Hiệu quả kháng S aureus là tốt hơn khi sử dụng chitosan có trọng lượng phân

tử thấp so với chitosan có trọng lượng phân tử cao Trong một nghiên cứu khác với E coli cho thấy hiệu quả kháng khuẩn giảm khi trọng lượng phân tử tăng và thích hợp

khi trọng lượng phân tử là 15kDa Ở nồng độ 0,5% oligosaccharide có thể ức chế hoàn

toàn sự phát triển của E coli Chitosan có trọng lượng phân tử là 40 kDa ở 0,5% có thể

ức chế được 90% sự phát triển của S aureus và E coli và ở 180 kDa có thể ức chế

hoàn toàn sự phát triển của hai vi khuẩn này ở 0,05% Trong một nghiên cứu khác của Jeon et al, (2001) khảng định rằng chitosan oligosaccharide có trọng lượng phân tử lớn hơn 10 kDa có hiệu quả hơn trong việc chống lại vi khuẩn gây bệnh cũng như không gây bệnh No et al, (2001) đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

và chitosan oligomer với trọng lượng phân tử khác nhau Chitosan có khối lượng phân

tử là: 1671, 1106, 746, 470, 224, và 28 kDa, chitosan oligomer với khối lượng phân tử

là 22, 10, 7, 4, 2 và 1 kDa Kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương tốt hơn vi khuẩn Gram âm ở nồng độ chitosan 0,1% Chitosan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn chitosan oligomer

Tại trường Đại học Nha Trang một số công trình nghiên cứu sử dụng chitosan oligosaccharide để bảo quản thịt lợn, thịt bò, xúc xích của tác giả Trần Thị Luyến và cộng sự, (2006) đã chứng minh rằng khả năng kháng khuẩn của oligosaccharide là đáng kể kết quả đã kéo dài thời gian bảo quản của các đối tượng trên Tác giả Lê Thị Tưởng (2007) sử dụng chitosan oligosaccharide thu được từ quá trình thủy phân chitosan bằng enzyme hemicellulose để bảo quản sữa tươi kết quả thu được rất tốt

Chitosan khối lượng phân tử thấp có nhiều ưu việt hơn chitosan, tuy nhiên hiện nay ở nước ta chưa có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất chitosan khối lượng phân

tử thấp được ứng dụng trong thực tế, các công trình này mới chỉ áp dụng trong quy mô phòng thí nghiệm

2.3 GIỚI THIỆU VỀ COMPOZIT CỦA CHITOSAN VỚI AXIT OLEIC

2.3.1 Một số tính chất của compozit của chitosan với axit oleic

Tương tự như hầu hết các màng polysaccharide, màng chitosan có tính ưa nước mạnh nên có khả năng ngăn cản tốt đối với không khí và chất béo nhưng khả năng giữ

ẩm kém (Elsabee & Abdou, 2013), việc kiểm soát độ ẩm là mong muốn của hầu hết các ứng dụng bao bì thực phẩm Để cải thiện đặc tính giữ ẩm của chế phẩm tạo màng

từ chitosan người ta thường kết hợp chitosan với một số hợp chất kỵ nước như chất béo (axit béo, dầu thực vật, tinh dầu, sáp) để tạo chất tạo màng dạng nhũ tương (Aguirre-Loredoa et al., 2014; Galus & Kadzinska, 2015) Tuy nhiên việc kết hợp với các hợp chất lipid thường làm suy yếu các tính chất cơ học của màng chitosan (Vargas

et al., 2009)

Độ giòn là đặc tính vốn có của màng chitosan do cấu trúc phức tạp và lực liên kết giữa các polymer tự nhiên yếu Theo nhóm tác giả (Suyatma et al., 2004) màng chitosan giòn là do nhiệt độ chuyển thủy tinh (Tg) của polyer cao (2030C) Nhiệt độ chuyển thủy tinh có liên quan đến độ cứng và cấu hình phân tử của chitosan Bằng cách giảm lực liên kết giữa các phân tử và do đó tăng tính linh động của các chuỗi polymer, chất dẻo hóa như glycerol, sorbitol và polyethylene glycerol được đưa vào để giảm nhiệt độ chuyển thủy tinh của màng và cải thiện tính linh hoạt, khả năng kéo dài

và độ dẻo dai của màng (Domjan et al., 2009)

Cơ chế hoạt động của chất dẻo hóa được giải thích như sau: Chất dẻo hóa được đưa vào để giảm lực ma sát giữa các chuỗi polymer Lý thuyết gel mặc nhiên cho rằng

độ cứng của polyme xuất phát từ cấu trúc 3 chiều, và chất dẻo hoạt động bằng cách phá vỡ các tương tác polymer-polymer ở các chuỗi liền kề, do đó làm tăng tính linh hoạt của các chuỗi này Các chất hoá dẻo có hiệu quả nhất là những chất có cấu trúc tương tự như các polymer, vì vậy chất dẻo như polyol là phù hợp nhất với màng polysaccharide (Sothornvit & Krochta, 2005) Một số nghiên cứu cho rằng việc bổ sung glycerol vào màng chitosan làm tăng tính thấm của màng (cả oxy và hơi nước) do

sự gắn kết trong màng giảm (Azeredo et al., 2010)

Việc tạo màng như một lớp phủ không chỉ phụ thuộc vào sự gắn kết (lực hút giữa các phân tử polymer của màng) mà còn liên quan đến độ bám dính (lực hấp dẫn giữa màng và chất nền) (Sothirnvit & Krochta, 2005) Trong quá trình phủ màng cần

có một chất bám dính tốt giữa bề mặt ẩm của thực phẩm và dung dịch tạo màng Khi các nhóm amino chính của chitosan và các proton trong dung dịch axit chiếm ưu thế sẽ chi phối các ion tích điện trái dấu trên bề mặt do đó đóng một vai trò quan trọng trong việc hấp thụ và bám dính Trong mọi trường hợp thì độ dày và tính đồng nhất là yếu tố quan trọng đối với tính giữ ẩm của màng (Hong et al., 2004) Đôi khi một chất hoạt động bề mặt là cần thiết để giảm sức căng bề mặt của dung dịch chitosan và tăng khả năng giữ ẩm (Choi et al., 2002; Casariego et al., 2008) (Choi et al., 2002) sử dụng tween 80 như một chất hoạt động bề mặt để làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo màng chitosan và tăng cường khả năng giữ ẩm trên vỏ táo (Casariego et al., 2008) báo cáo rằng độ ẩm và hệ số bám dính của màng chitosan trên bề mặt của cà chua và

cà rôt giảm khi tăng nồng độ chitosan và tính thấm của chất dẻo hóa

2.3.2 Một số ứng dụng của compozit của chitosan trong bảo quản rau quả tươi

Nghiên cứu của Puttongsiri & Haruenkit (2010) bảo quản quýt Kiew Wan ở nhiệt độ thường bằng màng chitosan kết hợp với axit oleic ở nồng độ chitosan 1% và axit oleic là 2,5% cho rằng màng tạo ra từ chitosan và axit oleic có tác dụng tốt nhất trong việc giảm hao hụt khối lượng, hàm lượng ethanol trong dịch quả, và hàm lượng

CO2 giảm. Nghiên cứu kéo dài thời gian bảo quản quả dâu tây đông lạnh bằng màng phủ chitosan 1% kết hợp với axit oleic với nồng độ (0, 1, 2 và 4%) Dâu tây được nhúng trong dung dịch thí nghiệm 15 giây, được để khô tự nhiên trong 1 giờ ở 200C và được đóng hộp 750ml Hộp được bảo quản tại 4 ± 10C Kết quả là màng chitosan kết hợp với axit oleic có tác dụng làm tăng khả năng giữ ẩm và kháng nấm Chất hòa tan,

độ acid, và độ pH không thay đổi đáng kể trong thời gian lưu trữ và không bị ảnh hưởng bởi màng bảo quản (Vargas et al., 2006)

Màng tạo thành từ chitosan có chứa Tocophenyl acetate làm chậm đáng kể sự đổi màu của quả dâu tây tươi và đông lạnh Sự phát triển của màng chitosan, kẽm và vitamin E cũng cung cấp một cách thay thế cho việc giữ rau quả tươi, mặc dù chưa hiệu quả để đạt đến đại trà (Meyers et al., 2007)

Nghiên cứu bảo quản dâu tây bằng màng chitosan 1%, 1,5%, hoặc kết hợp với canxi gluconate lưu giữ ở 100C, độ ẩm là 70 ± 5%. Kết quả với nồng độ chitosan 1,5% làm giảm đáng kể hoạt động hô hấp, chì hoãn sự chín, tỷ lệ thối hỏng, hạn chế giảm khối lượng, độ cứng, màu sắc bên ngoài tốt nhất Bổ sung canxi vào chitosan làm tăng độ cứng, giá trị dinh dưỡng của quả (Vargas, et al., 2006)

Nghiên cứu của Medieros et al (2012) Ứng dụng các lớp phủ nano nhiều lớp của k-carrageenan và lysozyme trên quả lê ‘Rocha’ nguyên vẹn, và lê tươi cắt công bố rằng có ảnh hưởng tích cực trong tính chất ngăn cản khí, và tính kháng khuẩn, cũng như duy trì màu sắc, giảm tổn thất khối lượng Trong nghiên cứu của (Jang et al., 2013) chỉ ra rằng lớp phủ Alginate/ nano-Ag có những lợi ích đáng kể về tính chất hóa

lý và sinh lý của nấm hương bảo quản 16 ngày ở 4 ± 10C

2.4 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU ĐÀO

Đào là loại quả hạch, kích thước quả đào thay đổi tùy thuộc vào giống, các giống đào Châu Á quả thường nhỏ hơn đào Châu Âu và châu Mỹ, loại quả to thường 8

- 10 quả/kg Màu sắc quả cũng thay đổi rất nhiều tùy theo giống, từ vàng đỏ, vàng trắng và một số quả khi chín vẫn giữ nguyên màu xanh Một số giống đào khi chín còn phủ một lới lông trắng bên ngoài, lớp lông này có tác dụng bảo vệ quả, chống sự xâm nhiễm của vi khuẩn, nấm, tránh cho quả hấp thụ nhiệt khi trời nóng Một số giống đào chín sớm quả thường chín vào khoảng giữa tháng 4 đến đầu tháng 5, các giống chín trung bình vào khoảng cuối tháng 5 đến đầu tháng 6, giống chín muộn vào khoảng cuối tháng 6 Nhìn chung thời gian chín của đào có thể thay đổi theo từng vùng sinh thái và thay đổi theo từng lục địa

2.4.1 Tình hình sản xuất đào trên thế giới và Việt Nam

2.4.1.1 Tình hình sản xuất đào trên thế giới

Các khu vực sản xuất đào ăn quả quan trọng trong lịch sử là Trung Quốc, Nhật

Bản, Iran và các quốc gia khu vực Địa Trung Hải, là khu vực mà đào đã được trồng trong hàng ngàn năm qua Gần đây, Hoa Kỳ (các bang California, Nam Carolina, Michigan, Taxas, Alabama, Georgia, Virginia), Canada (miền nam Ontario và Bristish Columbia) và Australia (khu vực Riverland) cũng đã trở thành các quốc gia quan trọng trong trồng đào Các khu vực có khí hậu đại dương như tây bắc Thái Bình Dương, Bristish Isles nó chung không thích hợp cho việc trồng đào do không có đủ nhiệt về mùa hè, mặc dù đào đôi khi cũng được trồng tại đây (Reisono et al., 2002)

Theo Giáo sư Vũ Công Hậu, (1996) cây đào chủ yếu được trồng ở các vùng ôn đới nóng và ở các nước á nhiệt đới Trên phạm vi toàn thế giới, cùng với táo, lê, cam quýt, chuối, dứa đào là một trong 6 loại quả quan trọng nhất thế giới

Theo tài liệu Fao Statistics (2010) năm 2008 diện tích đào toàn thế giới là 1

608 768 ha, năng suất trung bình đạt 11,189 tấn/ ha, tổng sản lượng đạt 18.000.853 tấn Trung Quốc là nước có diện tích đào lớn nhất thế giới 782.686 ha, chiếm 48,65% diện tích đào trên toàn thế giới Australia là nước có năng suất đào cao nhất thế giới 44,152 tấn/ha tiếp đó là Mỹ 20,592 tấn/ha, Pháp 20,005 tấn/ha,

Bảng 1.1 Diện tích, năng suất, sản lượng đào một số nước trên thế giới năm 2008 Địa điểm Diện tích (ha) Năng suất (kg/ha)

2.4.1.2 Tình hình sản xuất đào ở Việt Nam

Vùng phân bố tự nhiên của đào Việt Nam chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía Bắc như: Bắc Hà, Sa pa (Lào Cai); Mộc Châu (Sơn La); và các tỉnh như Hòa Bình, Lai Châu, Lạng Sơn, Hà Giang, Với các giống đào nổi tiếng như đào Vân Nam trồng ở

Sa Pa (Lào Cai), đào Mẫu Sơn (Lạng Sơn), (Vũ Công Hậu, 1996)

Ngày nay, các tỉnh Sơn La, Lào Cai đã di thực thành công khá nhiều giống đào

có nguồn gốc từ Trung Quốc (các giống đào Vân Nam, đào trắng chín muộn, ) Từ Pháp (các giống đào Đ1, Đ2, Melina, ), từ Australia (các giống đào Tropic, Beauty, Earligrand, Sunwright, ) và các giống đào vỏ quả nhẵn từ nhiều nước trên thế giới như Rose diamand, Sunwright, Sunsnow (Mai Hương, 2008)

Một số giống đào được trồng ở Việt Nam

Đào Mèo: Là giống đào địa phương được trồng rất lâu đời tại các tỉnh miền núi

phía Bắc, giống đào này sinh trưởng rấy khỏe, thời gian ra hoa vào dịp tết nguyên đán, quả chín vào tháng 7, kích thước quả trung bình, quả có màu vàng hoặc vàng nhạt, chất lượng quả kém, vị rất chua và hơi đắng Giống này thường được nhân dân trồng bằng hạt, giá trị sử dụng thấp, thích hợp cho việc sử dụng làm gốc ghép

Đào Tuyết: là giống đào sinh trưởng khỏe, được trồng ở vùng Sa Pa, thời gian

ra hoa vào tháng 2, thu hoạch giữa tháng 6, kích thước quả trung bình, vỏ và thịt quả đều màu trắng, giòn, chua

Đào vàng: Là giống được trồng rải rác ở các huyện vùng cao của các tỉnh Sơn

La, Lào Cai, Hà Giang Quả chín vào tháng 6, quả chín có màu vàng, vị chua nhưng có mùi thơm rất đặc trưng Do kỹ thuật chăm sóc không tốt nên ngày nay chất lượng của giống đào này giảm đi rất nhiều

Đào Vân Nam: Là giống đào được nhập nội từ Trung Quốc vào những năm

1963 và 1967 Có hai giống là giống chín sớm và giống chín muộn, được trồng nhiều ở huyện Sa Pa (Lào Cai)

Giống chín sớm quả trung bình, chất lượng khá Màu quả phớt hồng, thịt quả hồng nhạt, giòn, hơi chua Thời gian thu hoạch quả cuối tháng 5

Giống chín muộn quả to, chất lượng quả ngon Màu vỏ quả hồng vàng, thịt quả màu trắng, giòn, róc hạt Thời gian thu hoạch quả cuối tháng 6 đầu tháng 7

Giống đào Pháp Đ 1 , Đ 2: Được tuyển chọn từ tập đoàn cây ăn quả ôn đới do FAO tài trợ từ năm 1991 Cả hai giống đều chín sớm, quả nhỏ, thời gian thu hoạch cuối tháng 4 Giống Đ1 quả nhỏ hơn có màu hồng, giống Đ2 quả to hơn màu vàng hồng, cả hai giống thịt quả đều mềm (Báo cáo kết quả tập đoàn giống cây ôn đới)

Giống đào Earligrand: Là giống đào quả to, thịt quả màu vàng và mềm Giống

này có hai phần không đối xứng và có rãnh quả lớn Quả rất hấp dẫn với 50% màu đỏ

phủ lên nền màu vàng Hạt rời Giống này sinh trưởng và phát triển tốt ở Sa Pa, Bắc

Hà (Lào Cai)

Giống đào Desertred: Là giống đào quả to, thịt quả màu vàng, thị quả hơi

trắng, rãnh quả lồi, hai nửa quả đối xứng nhau, hạt nửa dính Mẫu mã quả đẹp có từ 85

- 90% màu đỏ sáng trên nền màu vàng

Giống đào Floridagold: Là giống chính vụ, thịt quả màu vàng hấp dẫn Quả có

kích thước 50 - 65cm, vỏ quả có màu đỏ tươi chiếm 60% trên nền màu vàng tươi Hạt nửa dính Thịt quả rất chắc và chứa nhiều nước Ở những nơi nhiệt độ lạnh thấp hơn so với nhu cầu của giống thì rãnh quả phát triển rõ và hơi nhô lên Giống này mẫn cảm vơi bệnh đốm vi khuẩn

Giống đào Sunwright: Là giống đào nhăn, dạng quả tròn, có kích thước trung

bình hoặc to, rãnh quả nông, thịt quả màu vàng Quả có một điểm nhỏ ở đáy lõm của quả và đối xứng hai bên Màu quả rất hấp dẫn, màu đỏ phủ lên 70% nền vàng Độ đường thấp, mùi rất hấp dẫn (Reisono et al., 2002)

CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic được tổng hợp tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên theo phương pháp của Vargas et al, (2006) có cải tiến

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

- Quả đào Pháp có độ chín 85% được thu hái tại huyện Bắc Hà tỉnh Lào Cai Thời gian từ lúc thu hái đến khi tiến hành thí nghiệm không quá 24 h Quả được lựa chọn đồng đều về kích thước, màu sắc, độ chín, không bị dập nát, sâu bệnh, thối hỏng Rửa quả bằng nước máy, để khô tự nhiên

- Chitosan dạng bột do Việt Nam sản xuất có độ đề axetil hóa DA > 85%, trọng lượng phân tử khoảng 300.000 DA

- Chitosan khối lượng phân tử thấp được tổng hợp tại Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên theo phương pháp của (Liu et al., 2006) (khối lượng phân tử khoảng 6.104 DA)

3.1.3 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu

Hóa chất

- NaOH- Natri hydroxit (Trung Quốc)

- CH3COOH - Axít acetic (Trung Quốc)

- HCl - Axít clohidric (Trung Quốc)

- Phenolphtalein (Trung Quốc)

- C4H4O6KNa.4H2O - Muối tartrat kép (Trung Quốc)

- CuSO4.5H2O- Đồng sunfat ngậm nước (Trung Quốc)

- K2C2O4.H2O - Kali oxalate (Trung Quốc)

- KMnO4- Kali permanganate (Trung Quốc)

- Na2HPO4 - Natri hydrogenphosphate dodecahydrate (Trung Quốc)

- Pb(CH3COOH)3- Chì acetate trihydrate (Trung Quốc)

- Fe2(SO4)3- Sắt (III) sunfate (Trung Quốc)

- Glycerol (sản xuất tại Việt Nam)

- Tween 80 (sản xuất tại Việt Nam)

- Agar (Việt Nam)

- Iod (Việt Nam)

- KI (Việt Nam)

- H2SO4 (Việt Nam)

- Cồn 70%

- Nước cất, nước khử ion

- Axit oleic- Loại tinh khiết dùng trong phòng thí nghiệm

- Các loại hóa chất khác của phòng thí nghiệm

- Máy đo pH Hanna (Trung Quốc)

- Máy khuấy từ gia nhiệt ARE (Italy)

- Nồi hấp thanh trùng YX 280 (Pháp)

- Vortex (Đức)

- Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g (Trung Quốc)

- Thiết bị đồng hóa (Ultra - Turax Model T25 IKA, Đức)

- Chiết quang kế cầm tay (Atago, Nhật Bản)

3.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.4.1 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.1.4.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu 1/2016 - 12/2016

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Tổng hợp chế phẩm compozit chứa chitosan khối lượng phân tử thấp với

axit oleic

- Tổng hợp chitosan khối lương phân tử thấp từ chitosan thông thường

- Tổng hợp compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Xác định khối lượng phân tử của chitosan

Nội dung 2: Xác định khả năng kháng nấm mốc gây hư hỏng quả đào pháp của

chitosan khối lượng phân tử thấp

- Xác định ảnh hưởng của khối lượng phân tử đến sự phát triển của nấm mốc

- Xác định ảnh hưởng của thời gian kháng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc của chitosan có khối lượng phân tử khác nhau

Nội dung 3: Xác định được một số tính chất, chức năng của màng film tạo thành từ

compozit chứa chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Xác định tính tan trong nước của màng tạo thành từ compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

- Xác định tính thấm nước của màng tạo thành từ compozit của chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic

Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm compozit chitosan khối lượng phân tử

thấp với axit oleic tới chất lượng và thời gian bảo quản quả đào pháp sau thu hoạch

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp tổng hợp chitosan khối lượng phân tử thấp từ chitosan thông thường

Chitosan khối lượng phân tử thấp được tổng hợp theo phương pháp của (Liu et al., 2006) Cân 10g chitosan cho vào 190ml axit axetic 5% ủ ở 500 C trong 20h, 25h, 37h, một cách tương ứng, sau đó ly tâm 5000 vòng/ phút trong 20 phút, sau đó chitosan được thêm NaOH 4M cho đến khi pH của dịch chitosan từ 7 - 9 Lọc phần kết tủa, sau đó rửa bằng nước máy và làm khô ở 500 C Mức độ deacetyl hóa được xác định bằng phương pháp chuẩn độ axit - bazơ (Sekiguchi et al., 1994) Sự thay đổi độ nhớt của các mẫu chitosan được xác định bằng máy đo độ nhớt Khối lượng phân tử chitosan được tính theo công thức của Mark Houwink ([η]= k.mα ), với K= 1,64 10-30

DD14 và α = -1,02 10-2 + 1,82 )

3.3.2 Phương pháp xác định khả năng kháng nấm mốc của chitosan khối lượng phân tử thấp

Phương pháp thu bào tử nấm mốc:Nấm mốc được nuôi cấy trên đĩa petri

chứa môi trường PDA trong điều kiện nhiệt độ 30oC Sau khi nấm mốc đã phát triển

và sinh bào tử, bào tử nấm mốc được thu bằng dung dich muối sinh lý và pha loãng tới mật độ 10-6 bào tử/ ml

Phương pháp pha chitosan: Chitosan nguyên liệu ban đầu ở dạng rắn, đầu tiên

cân 1g chitosan bổ sung vào 100ml axit axetic 1% , khuấy từ cho chitosan tan hết, tiếp theo sử dụng muối natri acetat điều chỉnh pH của dung dịch chitosan lên pH = 6 ta được chitosan có nồng độ 1%

Phương pháp pha môi trường PDA:Môi trường PDA (Potato dextrose agar):

khoai tây 200 g ninh nhừ trong 40 phút và nghiền trong 1 lít nước, đường 20 g/l, agar 20g/l, hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1 át trong 60 phút Sau khi khử trùng môi trường được đổ ra đĩa petri để nguội và được bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh

Phương pháp pha môi trường PDB:Khoai tây 200 g ninh nhừ trong 40 phút và

nghiền trong 1 lít nước, đường 20 g/l, hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1 át trong 60 phút, sau khi ngội được bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh

Phương pháp xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Lấy

100µl dịch bào tử nấm mốc trang đều lên bề mặt thạch sau đó nuôi trong tủ ấm ở nhiệt

độ 30oC trong 24-72h đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, để có kết quả chính xác chỉ đếm các đĩa có số khuẩn lạc khoảng 30-300 khuẩn lạc Số lượng nấm mốc được tính theo công thức sau:

Trong đó:

: Tổng số khuẩn lạc trên đĩa thạch

n1: Số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng thứ nhất

n2: Số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng thứ 2 v: thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa

f1: Hệ số pha loãng thứ nhất

Phương pháp xác định nồng độ ức chế của chitosan

Phương pháp xác đinh nồng độ ức chế của chitosan trên môi trường lỏng, được biểu

thị trên sơ đồ hình 1:

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan

Dịch bào tử

Thuyết minh quy trình:

Phương pháp xác định khả năng ức chế trong môi trường lỏng: Nấm mốc

được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường PDA trong điều kiện nhiệt độ 30oC Sau khi nấm mốc đã phát triển và sinh bào tử, bào tử nấm mốc được thu bằng dung dich muối sinh lý và pha loãng tới mật độ 106 bào tử/ ml Đồng thời tiến hành chuẩn bị các ống nghiệm môi trường nuôi cấy đối kháng lỏng chứa chitosan pha loãng ở các nồng

độ khác nhau Dịch chitosan ban đầu có nồng độ 3000ppm được pha loãng bằng môi trường PDB với nồng độ giảm dần 250ppm, 200ppm, 150ppm, 100ppm Mẫu kiểm

chứng bao gồm 2,5ml môi trường PDB + 2,5 ml dung dịch đệm acetat pH 4,4

Dịch bào tử nấm mốc được bổ sung vào các ống nghiệm chứa chitosan ở nồng

độ khác nhau với tỷ lệ 106 bào tử/ ml ( cấy 100µl dịch bào tử 106 vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường chứa chitosan) Sau đó đem nuôi trong tủ lắc ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ Rút 100µl dịch trang đều lên đĩa thạch chứa môi trường PDA và đem nuôi trong

tử nuôi 300C Sau 24h, 48h, 72h, quan sát và xác định nồng độ ức chế

Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian kháng

Dịch bào tử nấm mốc được thu bằng dung dich muối sinh lý và pha loãng tới mật độ 106 bào tử/ ml Đồng thời tiến hành chuẩn bị các ống nghiệm môi trường nuôi cấy đối kháng lỏng chứa chitosan Khối lượng phân tử 6 104 Da Dịch chitosan ban đầu

có nồng độ 3000ppm được pha loãng bằng môi trường PDB với nồng độ giảm dần 250ppm, 200ppm, 150ppm, 100ppm Mẫu kiểm chứng bao gồm 2,5ml môi trường

PDB + 2,5 ml dung dịch đệm acetat pH 4,4

Dịch bào tử nấm mốc được bổ sung vào các ống nghiệm chứa chitosan ở nồng

độ khác nhau với tỷ lệ 106 bào tử/ ml ( cấy 100µl dịch bào tử 106 vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường chứa chitosan) Sau đó đem nuôi trong tủ lắc ở nhiệt độ 300C trong 14,

24, 48 giờ Rút 100µl dịch trang đều lên đĩa thạch chứa môi trường PDA và đem nuôi trong tử nuôi 300C Sau 24h, 48h, 72h, quan sát và xác định nồng độ ức chế

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan bằng cách so sánh lượng vi khuẩn trong mẫu chitosan và lượng vi khuẩn trong mẫu kiểm chứng phần trăm tế bào chết được xác định theo công thức

% tế bào chết = CFUdc  CFUdc CFUcts x 100 %

Trong đó CFUdc: là số khuẩn lạc trên mẫu đối chứng

CFUcts: là số khuẩn lạc trên mẫu chitosan hoặc chitosan phân tử lượng thấp

Số khuẩn lạc trên các mẫu được xác định như sau:

Mi = Ai. V Di

Trong đó: Ai: là số khuẩn lạc trung bình đếm được trên đĩa

Di: là nồng độ pha loãng V: là thể tích cấy

3.3.3 Phương pháp chuẩn bị compozit

Compozit chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic được chuẩn bị theo phương pháp của (Vargas et al., 2006) có cải tiến Theo đó, lấy 15g chitosan khối lương phân tử thấp pha trong khoảng 900 ml dung dich axit axetic 1% ở nhiệt độ phòng cho tan hết rồi lọc bỏ phần không tan Lấy một cốc 1000 ml cho vào 400 ml dung dịch chitosan, 15g axit oleic, 5g glycerol và 1g Tween 80 rồi tiến hành đồng thể bằng bằng thiết bị đồng hóa (Ultra - Turax Model T25 IKA, Đức) tốc độ 15.000 v/ph trong 5 phút Chuyển sang cốc 2000 ml, bổ sung hết phần dung dịch chitosan còn lại, định mức đủ 1000 ml rồi đồng thể một lần nữa Sản phẩm là compozit chitosan khối lượng phân tử thấp (6 104 Da) 1,5g/l và axit oleic tương ứng là (0ml/l; 5ml/l; 10ml/l; 15ml/l)

3.3.4 Phương pháp xác định một số tính chất của màng

a Phương pháp đổ màng

Phương pháp đổ màng được tiến hành theo phương pháp của (Rocío, et al., 2014) Đổ 60ml một trong 4 dịch lỏng (compozit 1, compozit 2, compozit 3, compozit 4) vào đĩa petri thủy tinh phi 15 và làm khô ở 45 ± 20 C trong 72h trong tủ sấy (độ ẩm tương đối ~ 30%) sau đó màng được bóc ra khỏi đĩa petri và giữ trong bình hút ẩm có

độ ẩm tương đối là 50 ± 5% ở nhiệt độ phòng 23 ± 30 C trong 48h trước khi mô tả các tính chất của màng

b, Phương pháp xác định tính tan của màng trong nước

Độ tan trong nước của màng được định nghĩa là tỷ lệ chất khô hòa tan trong nước của màng được giải phóng sau khi ngâm trong nước cất Độ tan trong nước S của màng được xác định theo (Romero-Bastida et al., 2005) Các chất khô ban đầu của màng đã được xác định bằng mảnh màng khô có kích thước 4 cm2 trong bình hút ẩm với silica gel (0% RH) trong 7 ngày Sau đó màng được cân và ngâm trong 30 mL nước cất ở 250 C, khuấy đều theo chu kỳ trong một giờ Các mẫu được lọc bằng giấy lọc Hạt ở trong màng không có khả năng hòa tan được đưa ra và sấy khô để xác định trọng lượng cuối cùng Độ hòa tan được xác định bằng tỷ lệ giữa chất khô sau khi sấy

so với khối lượng của mẫu ban đầu

c Phương pháp xác định tính thấm nước của màng

Lấy 3 chén sứ cho mỗi công thức phủ màng, sấy khô chén đến khối lượng không đổi Cân và ghi lại khối lượng của chén + màng, cho 20ml nước cất vào mỗi chén sau đó cân khối lượng chén + nước + màng Tiếp theo bọc màng lên miệng chén

và quấn parafin xung quanh miệng chén để hơi nước không thoát ra ngoài ở phần mép chén Cân lại khối lượng một lần nữa Đặt chén vừa cân vào bình hút ẩm sau 10 ngày cân lại khối lượng Xác định lượng nước thấm qua màng chính là tỷ lệ phần trăm lượng nước hao hụt/lượng nước đưa vào cốc

3.3.5 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm compozit chitosan khối lượng phân tử thấp với axit oleic tới chất lượng và thời gian bảo quản quả đào pháp sau thu hoạch

Phương pháp lấy mẫu phân tích: Đào được lấy mẫu phân tích định kỳ sau 1, 7,

14, 21, 28 ngày bảo quản Mỗi công thức lấy 3 quả đào để phân tích cho một chỉ tiêu nghiên cứu

Các chỉ tiêu theo dõi:

- Xác định sự hao hụt khối lượng tự nhiên

- Xác định hàm lượng chất khô hòa tan tổng số (0Br)

- Hàm lượng vitamin C

- Hàm lượng axit tổng số

- Xác định tỷ lệ thối hỏng

- Đánh giá chất lượng cảm quan của mận sau thời gian bảo quản

3.3.5.2 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nghiên cứu

a Phương pháp xác định hao hụt khối lượng tự nhiên

Cân khối lượng của quả ở mỗi công thức trước khi bảo quản và ở mỗi lần phân tích bằng cân kỹ thuật với 3 lần lặp lại

Hao hụt khối lượng tự nhiên được tính theo công thức

2 1

M

M M



Trong đó:

X: Hao hụt khối lượng tự nhiên ở mỗi lần phân tích

M1: Khối lượng mẫu trước bảo quản

M2: Khối lượng mẫu ở các lần phân tích

b Phương pháp xác định hàm lượng chất khô hòa tan tổng số

Chất khô hòa tan tổng số (0Brix) được đo bằng chiết quang kế cầm tay (Atago, Nhật Bản)

c Phương pháp xác định hàm lượng vitamin C

Tiến hành: Cho vào cối sứ 2 gam nguyên liệu và một ít HCl 2%, nghiền nhỏ Sau đó chắt lấy nước chiết trong, lặp lại tương tự 3-4 lần Dùng 10 ml HCl tráng cối, chày sứ có cả bã sang bình định mức 50 ml, lên thể tích bằng nước cất

Đặt bình định mức trong bóng tối khoảng 10 phút, cho lượng vitamin C trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn, lọc lấy dịch trong Lấy 10 ml dịch lọc trong cho vào bình tam giác 100 ml Thêm vào 10 giọt tinh bột 0,5%, lắc nhẹ, dùng I2 0,01N chuẩn độ đến khi dung dịch xuất hiện màu xanh lam nhạt là được

Hàm lượng vitamin C được tính theo công thức

c v

V a

X  . .0,00088. .100.1000Trong đó:

X: Hàm lượng vitamin C có trong nguyên liệu (mg%)

a: Số ml I2 0,01N dùng để chuẩn độ

v: Số ml dung dịch mẫu đi phân tích

V: Thể tích của toàn bộ dịch chiết

c: Khối lượng nguyên liệu đem phân tích

0,00088: Số gam vitamin C tương ứng với 1 ml I2 0,01N

d Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng số

Nghiền nhỏ 2 - 3gam mẫu trong cối sứ, sau đó chuyển sang bình tam giác 250ml, thêm nước đến thể tích 150 ml Đun 30 phút cách thuỷ trên bếp điện ở 80 -

900C, thỉnh thoảng lắc Khi dung dịch nguội, lọc vào bình định mức 250, lên thể tích tới vạch bằng nước cất

Lấy 50 ml dịch lọc cho vào bình tam giác, cho thêm vào 1 - 2 giọt phenolphetalein rồi chuẩn độ bằng NaOH cho đến khi xuất hiện màu hồng

Hàm lượng acid tính theo công thức

V: Tổng thể tích dung dịch chiết v: Số ml dung dịch lấy để chuẩn độ c: Khối lượng mẫu (gam)

e Phương pháp xác định tỷ lệ thối hỏng

Tỷ lệ thối hỏng được xác định theo công thức sau:

X (%) = (M1/M2) * 100 Trong đó:

M1: Tổng số quả theo dõi

M2: Tổng số quả thối hỏng sau các lần kiểm tra định kỳ

X (%): Tỷ lệ thối hỏng

f Phương pháp đánh giá cảm quan

Đánh giá chất lượng cảm quan theo phương pháp cho điểm theo TCVN

32-1579 Đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm, sử dụng thang điểm 5 gồm 6 bậc (0-5 điểm) Đánh giá các chỉ tiêu như màu sắc vỏ quả, mùi vị, độ giòn, màu sắc thịt quả Chuẩn bị mẫu thử gồm các bước mã hóa mẫu chẳng hạn CT 1 và CT2, được

mã hóa bằng các chữ cái A, B, , chuẩn bị mẫu, chuẩn bị phiếu trả lời Hội đồng cảm quan gồm 10 thành viên Mỗi thành viên được phát một phiếu đánh giá cảm quan và các mẫu đào đã được mã hóa bằng các chữ cái in hoa, thứ tự các mẫu khi phát cho các thành viên của hội đồng là không giống nhau Sau mỗi lần thử các thành viên phải sử dụng nước lọc để thanh vị trước khi thử mẫu tiếp theo Tập hợp các mẫu, lập bảng thống kê điểm đối với từng mẫu

3.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS 11.5 So sánh sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng so sánh Duncan

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử tới khả năng kháng nấm mốc của chitosan khối lượng phân tử thấp

Nấm mốc là một trong những nguyên nhân dẫn đến sự hư hỏng của quả trong quá trình bảo quản Một trong những chủng nấm mốc gây hư hong đào bào quản là

Penicillium expansum (gây bệnh mốc xanh) Kết quả ảnh hưởng của chitosan có khối lượng phân tử khác nhau đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Penicillium expansum được trình bày ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan đến sự phát triển của nấm

mốc Penicillium expansum

Tên chế phẩm

Hiệu quả kháng nấm mốc (%)

1000 ppm

1500 ppm

2000 ppm

2500 ppm 3000 ppm

Kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của Lian-Ying et al, (2003) cho

rằng hoạt tính kháng E coli của chitosan tăng cùng với sự giảm của trọng lượng phân

tử Để giải thích cho hiện tượng này tác giả cho rằng chitosan có thể hình thành trên bề mặt tế bào vi khuẩn một lớp màng polymer do đó ngăn cản sự vận chuyển các chất dinh dưỡng vào tế bào vi khuẩn Mặt khác chitosan có trọng lượng phân tử thấp linh động hơn chitosan thông thường nên chúng dễ dàng xâm nhập vào bên trong tế bào và tương tác với cơ chất mang điện tích âm trong tế bào và làm kết bông chúng, dẫn đến làm nhiễu loạn hoạt động chức năng của cơ thể và giết chết vi sinh vật Kết quả quan

sát trên kính hiển vi cho thấy với sự có mặt của chitosan tế bào chất của E coli bị co

lại và khe hở của tế bào được thể hiện một cách rõ ràng Chiều dài mạch phân tử của chitosan có mối liên hệ với hoạt động kháng khuẩn của chitosan đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả, Nam Liu et al, (2005) cho rằng nồng độ cao trên 200 ppm, hoạt động

kháng E coli của các mẫu chitosan là tương tự nhau và hầu hết vi sinh vật bị ức chế, ở

nồng độ 50 - 100 ppm có sự khác nhau về hoạt tính kháng khuẩn của chitosan có chiều dài mạch phân tử khác nhau

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý chitosan đến sự phát triển của nấm mốc

Thời gian xử lý chitosan cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng kháng khuẩn của chitosan Ở cùng một nồng độ xử lý và cùng loại chitosan khi thời gian xử lý tăng

thì tỷ lệ nấm mốc Penicillium expansum bị ức chế tăng lên Kết quả được trình bày ở

bảng 4.2

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian xử lý chitosan đến sự phát triển

của nấm mốc Penicillium expansum

Kết quả ở bảng 4.2 cho thất thời gian xử lý tăng làm tăng khả năng kháng

khuẩn của chitosan ở nồng độ 2500 ppm 71,3% lượng nấm mốc penicillium expansum

bị ức chế Nồng độ 3000 ppm thì hầu hết các thử nghiệm trong các khoảng thời gian

khác nhau đều cho hiệu quả ức chế trên 82,7% Penicillium expansum Như vậy có thể

kết luận rằng đối với chitosan có khối lượng phân tử 6 104 Da nồng độ xử lý thích hợp nhất là 3000 ppm và thời gian xử lý thích hợp là 30h cho hiệu quả kháng tốt nhất với

sự phát triển của nấm mốc Penicillium expansum