Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)

Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)Ứng dụng kỹ thuật Metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của Việt Nam (LV thạc sĩ)

Trang 1

Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

1

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƯỜNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT METAGENOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ

VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY DÓ BẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH CỦA VIỆT

NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

HÀ NỘI, 2015

Trang 2

2

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƯỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

Mã số: 60 42 01 14

Người hướng dẫn: PGS.TS LÊ VĂN SƠN Đơn vị: Viện Công nghệ sinh học

Trang 3

3

Hà Nội, 2015

MỞ ĐẦU Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới, độc đáo và có thể áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học Công nghệ metagenomics kết hợp với kỹ thuật gen, kỹ thuật protein sẽ cung cấp các hiểu biết sâu sắc về các vấn đề trong tiến hóa gen hoặc thông tin về các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí

ẩn vì chúng khó có thể được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm

Môi trường đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lương và sự đa dạng các loài trong hệ vi sinh vật Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lượng các sinh vật nhân sơ được xác định từ khoảng 2000 đến 18000

bộ gen trên một gram đất Số lượng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chưa được biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích Do đó, số lượng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều Trong khi đó, phương pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất Nuôi cấy và phân lập DNA của vi sinh vật là phương pháp phổ biến nhưng chỉ được từ 0,1 đến 1% vi sinh vật là có thể được nuôi cấy sử dụng các phương pháp tiêu chuẩn,

vì vậy sự đa dạng của hệ vi sinh vật vẫn chưa được khám phá hết

Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm họ Trầm, bộ Bông là lớp Cây

gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau phân bố chủ

yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc

Trang 4

4

Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thường xanh, rừng ẩm nguyên sinh Trầm hương được sử dụng để chữa một số bệnh hiểm

nghèo, có tác dụng kháng khuẩn, có tính kháng sinh Giá trị quan trọng nhất của

cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm hương Trầm hương được coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị thương mại quốc tế nhất Trên thế giới, Trầm hương được sử dụng để chưng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, được dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nước hoa cao cấp, giá trị

Hệ vi sinh vật vùng rễ đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của cây dó bầu Tuy nhiên, vai trò của chúng chưa được nghiên cứu

kỹ cũng như chưa có một nghiên cứu nào về sự tác động của hệ vi sinh vật đến khả năng tạo trầm Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào sử dụng kỹ thuật mới metagenomic để nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định được thành phần giới, họ, chi, loài của các mẫu nghiên cứu

- So sánh sự giống và khác nhau của các mẫu nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu

- Phân lập DNA tổng số từ đất của các mẫu nghiên cứu

- Gắn adapter với mỗi mẫu nghiên cứu

- Xác định trình tự 16S của các mẫu nghiên cứu

- Xác định độ đa dạng của các mẫu nghiên cứu

- Xác định thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu

- So sánh thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu

Trang 5

5

I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cây dó bầu và khả năng tạo trầm

1.1.1 Nguồn gốc, phân bố

Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm (Aquilaria), họ Trầm (Thymelaeaceae), bộ Bông (Malvales), lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan

Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 loài có khả năng cho

trầm hương gồm: Aquilaria crassna; A.baillonii; A.sinensis hoặc A.chinesis; A.borneensis ; A.malaccensis ; A.gollocha ; A.hirta; A.rostrata; A.beccariana; A.cummingiana; A.filaria; A.khasiana; A.microcarpa; A.grandiflora; A.bancana; A.rugosa, trong đó loài A rugosa được Kiet và cộng sự phát hiện năm 2005 (Kiet et al., 2005)

Chi Trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam

Á và miền Nam Trung Quốc Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thường xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc (Hình 1, Danh

lục các loài thực vật Việt Nam) Trầm hương phân bố tại Việt nam có 4 loài là:

Trang 6

6

Trầm hương (A.crassna Pierre ex Lecomte); dó baillon (A baillonii Pierre ex Lecomte), dó bana (A banaensae.Phamhoang.) (Phạm Hoàng Hộ 1992) và dó quả nhăn (A rugosa L.C Kiet & Krbler) (Lê Công Kiệt et al., 2005) Trong đó, cây dó bầu A crassna là loài được trồng phổ biến nhất vì khả năng loại trầm tốt nhất thế giới (Hoàng Cảnh 2006) Các loài dó baillon (A baillon), dó bana (A banaensae) và dó quả nhăn (A rugosa) đều là đặc hữu có thể bắt gặp tại một

vài địa điểm thuộc Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam Trong kho đó,

dó quả nhăn (A rugosa) là loài mới được phát hiện tại Kon Tum

Hình 1.1 Phân bố dó bầu tại Việt Nam Hiện nay, các cá thể trưởng thành của trầm hương cơ bản bị tuyệt diệt trong tự nhiên Vùng trọng điểm gây trồng cây dó trầm hiện nay ở nước ta là Bán Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, và Tây Nam Bộ Trong đó, vùng Bắc Trung Bộ tập trung chủ yếu tại Hà Tĩnh,vùng Nam Trung

Bộ tập trung chủ yếu tại Quảng Nam, vùng Tây Nguyên chủ yếu tập trung tại Kon Tum, Đông Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Bình Phước, Tây Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Kiên Giang và An Giang

1.1.2 Giá trị kinh tế, dược liệu và sinh thái

Trang 7

7

Giá trị kinh tế: Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu

sinh trầm hương Trầm hương được coi là một loại lâm sản ngoài gỗ có giá trị thương mại quốc tế nhất Trên thế giới, Trầm hương được sử dụng để chưng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công nghiệp mỹ phẩm cao cấp Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, được dùng trong công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nước hoa cao cấp, giá trị Theo công ước về buôn bán quốc

tế những loài động thực vật hoang dã nguy cấp, khối lượng mua bán trầm hương trên thị trường thế giới thời kỳ 1995 – 1997 khoảng 1.350 tấn Giá mua bán Trầm hương được tính theo kg tùy thuộc vào chất lượng Giá bán Trầm tại thị trường Dubai (Arabia Saudi) vào năm 1993 dao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại

thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt nhất) (Barden et al., 2000)

Giá trị dược liệu: Trong y học, trầm hương còn được sử dụng để chữa

một số bệnh hiểm nghèo, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen suyển, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích dục… Trầm hương có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn

Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng

thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết thương), có tác dụng chữa một số bệnh như bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh về tiêu hoá (đau bụng, buồn nôn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện) Đặc biệt có thể dùng trầm hương để chữa ung thư tuyến giáp

Giá trị sinh thái: Đối với môi trường sinh thái và phát triển bền vững, việc đưa dó bầu (Aquilaria sp.) vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng

tại tỉnh Hà Tĩnh nói riêng và trong cả nước nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng

độ che phủ của rừng, chống xói mòn đất và bảo vệ môi trường Cây gió bầu góp phần bảo tồn và phát triển loài cây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và

Trang 8

8

kinh tế của nước ta, đây còn là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi với bảo vệ môi trường, kết hợp lợi ích trước mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu trên cơ sở khai thác và tái tạo lợi thế đặc hữu, ưu việt của tài nguyên quốc gia Hơn nữa, cây dó bầu còn có ý nghĩa tạo công ăn việc làm cho người lao động,

mở ra hướng phát triển kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa (Thái Thành Lượm 2009)

1.1.3 Khả năng sinh trầm của dó bầu

Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử

gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các loài nấm…Có 3 giả thuyết tồn tại đến sự tạo trầm liên quan đến các tác nhân bệnh lý, thương tích bệnh lý hoặc thương tích không bệnh lý (Ng et al., 1997) Kết quả của nghiên cứu không cung cấp được bằng chứng thuyết phục là tác nhân nào trong số 3 tác nhân trên tác động đến sự tạo trầm của cây Ngoài ra, nghiên cứu của Oldfield

et al (1998) cho rằng quá trình tạo trầm có liên quan đến sự đáp ứng của cây với nấm Hơn nữa, Heuveling và Phillips (1999) cho rằng nó liên quan đến đáp ứng với thương tích Nghiên cứu cho rằng sự xâm nhiễm của nấm có thể làm tăng sự tạo trầm cũng như sự đáp ứng của tế bào chủ với vết sự phát triển của nấm xâm

nhiễm Dó bầu có thể được xâm nhiễm tự nhiên bởi một vài các loại nấm như: Aspergillus spp, Botryodyplodia spp, Diplodia spp, Fusarium bulbiferum, F laterium, F oxysporum , F solani, Penicillium spp, and Pythium spp (Anon

1998; Soehartono and Mardiastuti 1997; Wiriadinata 1995) Sự tương tác giữa tế bào chủ với nấm hay các tác nhân khác để tạo thành trầm vẫn chưa được nghiên cứu kỹ Sự tương tác này xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác Căn

cứ vào sự hóa nhựa nhiều hay ít mà có những sản phẩm như: Tóc, Trầm hương

và Kỳ nam Thực tế cho thấy những cây dó bầu sau khi chết rục thì lượng Kỳ nam hoặc Trầm hương thường được phát hiện ở phần gốc rễ, nơi thường tiếp

Trang 9

do cơ chế và sự tương tác các tác nhân (đặc biệt tác nhân sinh học) của việc sinh tạo trầm trong tự nhiên vẫn chưa được làm rõ Hơn nữa, trong những năm

gần đây các nghiên cứu tạo các chromone invitro (thành phần chính trong tinh

dầu trầm) từ nuôi cấy huyền phù tế bào của dó bầu đã thu được các kết quả khả

quan ban đầu (Qi et al., 2005; Ito et al., 2005)

1.2 Ứng dụng Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật

1.2.1 Vai trò của hệ vi sinh vật đối với môi trường và cây trồng

Các vi sinh vật đóng vai trò to lớn đối với các sinh vật sống trên trái đất

Sự đa dạng của hệ vi sinh vật phản ánh sự phong phú về chức năng, cung cấp các thành phần cần thiết cho tất cả các dạng sống tồn tại Các vi sinh vật tham gia vào hầu hết các chu trình sinh, hóa học trên tái đất từ xử lý rác thải tới thúc đẩy sự tăng trưởng và sinh sản của thực vật, động vật Hơn nữa, vi sinh vật cung cấp cho con người các sản phẩm như: thuốc, các loại sản phẩm lên men và góp phần vào việc duy trì sức khỏe Chỉ gần đây các nhà vi sinh vật học mới đánh giá chính xác sự đa dạng trong hệ vi sinh vật do nhiều vi sinh vật không thể được nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm Kết quả dẫn đến các nhà vi

Trang 10

10

sinh vật rất khó để tìm hiểu về các hệ vi sinh vật không thể phát hiện bằng các phương pháp truyền thống này Vai trò của các vi sinh vật có thể được khái quát như sau:

Microbial services: Các vi sinh vật là các sinh vật rất quan trọng trên trái

đất nhưng vai trò của chúng ít được biết đến do chúng không thể được phát hiện bằng mắt thường Vi sinh vật cung cấp cho con người không khí, thức ăn và thực hiện hầu hêt các chức năng của cơ thể, trong khi đó rất ít người biết về vai trò của chúng với cuộc sống Có rất nhiều các ví dụ điển hình cho việc cung cấp các thành phần thiết yếu của vi sinh vật cho các sinh vật khác (Madigan and Martinko 2005)

Sự tạo thành oxi: Một bước quan trọng trong lịch sử sống trên trái đất là

sự chuyển từ hô hấp kỵ khí sang hiếu khí được tạo ra bởi vi sinh vật tự dưỡng Khi sự sống trên trái đất bắt đầu, môi trường sống là hô hấp kỵ khí hoặc không cần oxi Khoảng 1 tỷ năm trước đây, một vài vi sinh vật ngoài đại dương tiến hóa khả năng sử dụng năng lượng mặt trời để tham gia vào các phản ứng mà kết quả là giả phóng oxi Oxi trên trái đất tích tụ lại tạo thành khí quyển cho đến khi lượng của chúng đủ để hình thành và nuôi dưỡng các sinh vật hiếu khí Trong

đó một dạng oxi phân tử cao được hình thành là O3 do các phân tử O2 va chạm với nhau Ozone là một phân tử rất đặc biệt, không giống như oxi, nó có thể hấp thụ tia UV Do đó, sự sống trên bề mặt trái đất có thể phát triển vì tầng ozone đã lọc hết các tia UV và bảo vệ trái đất khỏi phóng xạ có thể phá hủy DNA và tế bào Ngay sau khi hình thành oxi và tầng ozone ở tầng bình lưu, sự sống bắt đầu bùng Tầng oxi và ozone được hình thành đầu tiên hoàn toàn do vi sinh vật và ngày nay được duy trì bởi các vi khuẩn tự dưỡng và thực vật (Handelsman 2007)

Trang 11

11

Sự chuyển hóa nito: Một trong những vai trò quan trọng khác của vi

khuẩn là cung cấp nito dưới dạng có thể hấp thu được đối với động vật và thực vật Một trong những điều thú vị là mặc dù khí quyển có tới 79% là nito, tuy nhiên hầu hết các sinh vật đề không thể sử dụng chúng Nito trong khí quyển tồn tại dưới dạng bền N2 nên các sinh vật không thể bẻ gẫy các liên kết này để sử dụng được Thực tế vi khuẩn là sinh vật duy nhất có thể bẻ gẫy các liên kết trong N2 và cố định chúng (Handelsman 2007)

Duy trì sức khỏe con người: Các hệ vi sinh vật sống trong, trên cơ thể con

người rất cần thiết cho sức khỏe của vật chủ Vi khuẩn trong hệ đường ruột bảo

vệ con người khỏi sự tấn công của các mần bệnh, khi mà sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột bị phá vỡ thì sẽ kéo theo sự xuất hiện của rất nhiều bệnh như: nhiễm trùng đường ruột, ung thư ruột, béo phì và tiểu đường những bệnh này không gây ra bởi một sinh vật riêng lẻ mà liên quan tới các quá trình của hệ

vi sinh vật Trong một số khía cạnh các chức năng của hệ vi sinh vật như là một đơn vị trong đó mỗi vi sinh vật phụ thuộc vào các vi sinh vật khác cần thiết cho cuộc sống và hiệu quả chức năng của hệ thống phụ thuộc vào sự tương tác và hợp tác giã mỗi thoành viên trong cộng đồng Các hệ vi sinh vật liên quan tới cơ thể con người là chủ đề của hai quá trình tiến hóa Đầu tiên, chúng đồng tiến hóa với con người qua hàng ngàn năm cộng sinh, do đó gen của con người đã được

sự hỗ trợ và dựa vào những gen những vi sinh vật này Thứ hai, mỗi vi sinh vật trong hệ tiên hóa trong thời gian sống của chúng Tiến hóa của các hệ vi sinh vật với loài người cũng như với sinh vật khác tạo ra sự phụ thuộc và giao tiếp giữa chúng Kết quả là cá vi sinh vật cần được nghiên cứu về cả hệ vi sinh vật mà không chỉ nuôi cấy trong phòng thí nghiệm (Handelsman 2007)

Tổng hợp kháng sinh: Các vi sinh vật là nguồn cung cấp hầu hết các

kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn Năm 1920, Alexander Fleming đã

Trang 12

12

tìm ra chất tiết penicillin của nấm có thể ngăn cản việc phát triển của vi khuẩn Phát hiện ra penicillin đã dẫn tới việc khám phá và thương mại hóa kháng sinh cho y học và nông nghiệp Rất nhiều vi khuẩn tiết ra kháng sinh với nhiều tính chất hóa học và chức năng khác nhau, cung cấp các loại thuốc chúng ta có ngày nay Nguyên nhân nấm và vi sinh vật sản sinh ra kháng sinh vẫn chưa được biết nhưng khả năng phổ biến là chúng rất quan trọng trong đời sống của các sinh vật này Một giả thuyết được quan tâm là các sinh vật này sử dụng để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác; một giả thuyết khác là chúng sử dụng kháng sinh như là một tín hiệu để cảnh báo với các loài khác trong khu hệ (Handelsman 2007)

Các vai trò khác: Vai trò của vi sinh vật với các quá trình sinh hóa và tự

nhiên là vô cung to lớn: tham gia vào các chu trình dinh dưỡng, hoặc cải tiến y học Ngoài ra, chúng còn tham gia vào các quá trình chuyển hóa thức ăn: lên men, cung cấp các enzyme hay polymers, làm sạch các rác thải độc hại và bảo

vệ sức khỏe của con người, thực vật và động vật mặc dù vi sinh vật thường liên quan tới các bệnh nhưng các tác nhân gây bệnh chỉ là một phần nhỏ của hệ vi sinh vật trên trái đất và các vi sinh vật có ích sẽ giúp kiểm soát các tác nhân gây bệnh (Handelsman 2007)

Ngoài ra, các hệ vi sinh vật tồn tại trên và xung quanh cây trồng đóng vai trò hết sức quan trọng lên năng suất và chất lượng cây trồng Tuy nhiên, mới chỉ một số loài vi khuẩn có vai trò đã được biết đến Nhiều loài vi sinh vật khác có khả năng sử dụng các chất từ xác động vật và thực vật phân hủy, hoặc chuyển hóa một số nguyên tố như sắt và mangan, thành các hình thức mà thực vật có thể hấp thụ được Thực vật không thể tồn tại và phát triển nếu thiếu hệ vi sinh vật đất Trên một số môi trường đất, cây trồng vẫn phát triển tốt ngay cả khi tồn tại các tác nhân gây bệnh ở mật độ cao Sau nhiều thập kỷ nghiên cứu, các nhà bệnh

Trang 13

13

lý học thực vật phát hiện các hệ vi sinh vật cực kỳ phức tạp đóng vai trò ức chế tác nhân gây bệnh, các nghiên cứu chỉ ra rằng các phức hệ vi sinh vật này có thể góp phần vô cùng hữu ích cho sản xuất nông nghiệp Không một vi sinh vật riêng lẻ nào được phân lập lại có khả năng tương tự, điều này cho thấy tác động qua lại, hỗ trợ nhau trong quá trình ức chế tác nhân gây bệnh của các thành viên trong hệ vi sinh vật đất Các nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng của hệ vi sinh vật đất là rất lớn và nghiên cứu thành công hệ vi sinh vật này hứa hẹn mang lại nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực sản xuất các chế phẩm sinh học như phân bón vi sinh hay tác động đến hệ vi sinh vật đất nhằm cải thiện và nâng cao chất lượng cây trồng Qua trên có thể thấy rằng Metagenomics là một bước cách mạng hóa ngành vi sinh vật vì nó đã mở ra một cửa sổ để nghiên cứu thế giới vi sinh vật khổng lồ mà trước đây chưa được nghiên cứu

1.2.2 Giới thiệu về công nghệ metagenomics

Thuật ngữ "metagenomics" lần đầu tiên được đưa ra năm 1985 bởi

nhóm nghiên cứu của Handelsman (Handelsman et al., 1998)

“Metagenomics” là phương pháp phân tích hệ vi sinh vật các loài vi sinh vật trong các phức hệ vi sinh vật thu trực tiếp từ môi trường tự nhiên mà không cần nuôi cấy thông qua phương pháp đọc trình tự (Handelsman et al., 1998; Handelsman and Sjoling, 2007, Chen and Patcher 2005; Riesenfeld et al., 2004; Schloss et al., 2004; Susannah and Edwward 2005; Patrick et al., 2005)

Đây là một ngành khoa học mới nhằm cung cấp cho các nhà khoa học công cụ tiếp cận với hầu hết các loài vi sinh vật khó nuôi cấy trên môi trường nhân tạo

Do đó, metagenomics cho phép nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi sinh vật mà chưa từng được nghiên cứu trước đây, vì vậy cung cấp một nhận thức hoàn toàn

Trang 14

14

mới về cấu trúc và chức năng của hệ sinh thái cúng như sự đa dạng của đại dương và hệ tiêu hóa của con người Như đã biết, chỉ có khoảng 0,1 đến 10% trong tổng số lượng các loài vi sinh vật đã được quan sát trong tự nhiên là có thể nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm Những sinh vật không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo này đôi khi là độc nhất và có những tiềm năng độc đáo như phân hủy rác thải hay tổng hợp các hợp chất có thể sử dụng như là thuốc hay kháng sinh Metagenomics là một công cụ mạnh mẽ trong việc tiếp cận với các nguồn tài nguyên vi sinh vật mà chưa được khai thác về đa dạng sinh học trong các mẫu thu từ môi trường Metagenomics được sử dụng như một công cụ của hệ thống điều tra, phân loại và thao tác toàn bộ vật liệu gen phân lập từ môi trường Quá trình đa bước này dựa vào 4 bước chính: (1) phân lập các vật liệu gen; (2) thao tác trên các vật liệu gen này; (3) xây dựng thư viện gen; (4) phân

tích các vật liệu gen trong các thư viện metagenomic

Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới và có thể áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học Mặc dù đã có những bước phát triển trong biểu hiện các gen khác nhau, xây dựng thư viện gen , nhưng việc thiết

kế vector cần phải cải tiến hơn nữa Các kỹ thuật phân tử hiện nay đã được chứng minh là có đủ khả năng giải quyết các vấn đề về sản phẩm như: khám phá ra các loại kháng sinh và các loại enzime mới Các nghiên cứu gần đây về tảo biển

(Sargasso Sea) (Venter et al., 2004), Acid mine drainage (AMD) (Tyson et al., 2004), đất (Tringe et al., 2005) đã sử dụng phương pháp giải trình tự đoạn ngắn

(shotgun-sequencing) để phát hiện và thống kê các mẫu trong các mẫu môi trường khác nhau Trong mỗi nghiên cứu, các mẫu môi trường được thu thập và DNA

được tách chiết trực tiếp từ các mẫu này, sau đó chúng được nhân dòng trong E.coli

và các dòng nhân ngẫu nhiên này được giả trình tự Tuy nhiên, những thư viện gen này không thể giả thích chức năng của các gen của mỗi sinh vật trong trong hệ vi

Trang 15

15

sinh vật Do đó, khi công nghệ metagenomics kết hợp với kỹ thuật gen , kỹ thuật protein, phân tích dựa vào sự biểu hiện và kính hiển vi sẽ cung cấp các nhận thức sâu sắc về các vấn đề như: tiến hóa gen hay các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí

ẩn vì chúng khó có thể được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm (Allen et al.,

2005)

Những sự tiến bộ gần đây trong phân tích metagenomic bắt nguồn dựa vào phân tích trình tự và chức năng của các mẫu từ nước, đất và liên quan với các tế bào vật chủ Ý tưởng nhân dòng DNA trực tiếp từ các mẫu môi trường được đưa ra

đầu tiên bởi Pace (Pace et al., 1985), sau đó năm 1991 đã nhân dòng thành công vector phage (Schmidt et al., 1991) Các bước cải tiến tiếp theo đã được xây dựng

một thư viện metagenomic với DNA bắt nguồn từ hỗn hợp các sinh vật được nuôi

trên cỏ khô trong phòng thí nghiệm (Healy et al., 1995) Công việc của nhóm

DeLong đã đưa tiếp nối các thành công của lĩnh vực này khi nhóm đã thực hiện

thành công việc lập thư viện từ các loài nhân sơ từ nước biển (Stein et al., 1996)

Mặt khác, một thách thức lớn để tiếp cận với việc phân tích metagenomic là việc xác định các dòng gen chức năng Sự thành công yêu cầu sự phiên mã và dịch mã chính xác gen bao gồm phân tích năng của gen để xác định các loại kháng sinh mới

(Courtois et al., 2003; Gillespie et al., 2003), các loại gen kháng kháng sinh (Diaz Torres et al., 2003; Riesenfeld et al., 2004), vẩn chuyển Na_Li/(H) (Majernik et al., 2001) và các loại enzyme phân hủy (Healy et al., 1995; Henne et al., 1999; 2000)

Trang 16

Hệ vi sinh vật trong môi trường đất: môi trường đất rất phức tạp khi

nghiên cứu số lương và sự đa dạng các loài trong hệ vi sinh vật Một ví dụ như: một gram của đất rừng có chứa khoảng 4x107 tế bào sinh vật nhân sơ, trong khi

đó 1 gram của đất trồng trọt và đồng cỏ có chứa khoảng 2x109

tế bào sinh vật nhân sơ Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lượng các sinh vật nhân sơ được xác định từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một gram đất Số lượng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chưa được biết đến đã bị loại ra trong quá trình phân tích Do đó, số lượng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều (16177

Trang 17

Trong khi đó, phương pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất

Kỹ thuật độc lập với nuôi cấy: Để vượt qua các hạn chế trong phương

pháp nuôi cấy trực tiếp vi sinh vật đất, một phương pháp phân tử dựa trên sự phân lập và phân tích các nucleic acid trong đó chủ yếu là DNA từ các mẫu đất

mà không cần nuôi cấy trong phòng thí nghiệm đã được phát triển Các khảo sát phát sinh loài vẫn tiếp tục với việc sử dụng phương pháp PCR với ở gen 16S rRNA của vi sinh vật đất sử dụng các cặp mồi phổ biến cho vi khuẩn và cổ khuẩn Những khảo sát này cho phép liệt kê và so sánh sự đa dạng trong các môi trường sống khác nhau, phân tích sự thay đổi trong cấu trúc hệ sinh thái do sự thay đổi của các tác nhân Các gen chỉ thị khác được sử dụng để nghiên cứu sự

đa dạng hệ vi sinh vật bao gồm dnaK (HSP-70-type molecular chaperone) và amoA (ammonia monooxygenase) Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự đa dạng của môi trường đất vẫn chỉ mới bắt đầu

Xây dựng thư viện gen DNA: Mặc dù việc lập thư viện gen của vi sinh vật

đất là phụ thuộc vào kích cỡ của metagenome vi sinh vật đất và số lượng lớn các dòng gen và yêu cầu hiểu biết đầy đủ về chúng là một nhiện vụ phức tạp và khó

Trang 18

18

khăn Việc nghiên cứu metagenomic ở vi sinh vật đất phải thông qua việc xây dựng thư viện DNA và xác định chức năng của các gen có trong thư viện này Những năm gần đây, các tiến bộ mới trong phương pháp đọc trình tự đã mang đến bước đột phá mới trong việc xây dựng thư viện gen, giảm bớt đáng kể các bước thực hiện trong công nghệ metagenomics (Metzker 2010; Mardis 2008) Công nghệ này đã góp phần xác định vai trò của các vi sinh vật khác nhau trong phức hệ vi sinh vật đất, nghiên cứu phân tích hệ vi sinh vật của các mẫu đất khác nhau và sản xuất các chế phẩm mới từ vi sinh vật đất Trong các nghiên cứu gần đây, nhiều gen mã hóa các enzyme có ích và kháng sinh đã được phát hiện nhờ nghiên cứu phân tích thư viện gen của các vi sinh vật đất, việc xác định các gen mới này đã nói lên tiềm năng to lớn của việc xây dựng và phân tích thư viện gen

của các vi sinh vật đất (Hardeman and Sjoling 2007; Lussier et al., 2011)

Như vậy mặc dù gặp phải những trở ngại khó khăn ban đầu như quá trình tách DNA khỏi các tạp chất, số lượng khổng lồ các vi sinh vật tồn tại trong môi trường đất, xây dựng thư viện metagenomic, xác định chức năng của các gen mới v.v… nhưng cùng với những bước phát triển đột phá trong phương pháp đọc trình tự và công cụ tin sinh học công nghệ metagenomics hiện nay đã đạt được những thành tựu đáng kể và ngày càng được quan tâm phát triển hơn Ứng dụng công nghệ metagenomics đã xác định được phần lớn các vi sinh vật có mặt trong môi trường đất, so sánh mức độ đa dạng giữa các môi trường khác nhau, đánh giá sự thay đổi về cấu trúc thành phần của hệ vi sinh vật dưới tác động của các tác nhân khác nhau lên môi trường Ngày nay số lượng lớn dữ liệu thu được

từ công nghệ metagenomics đã được công bố rộng rãi, không những tạo điều kiện thuận lợi cho các nhà khoa học nghiên cứu phân tích các gen mới mà còn

mở ra những hướng mới góp phần cải thiện nâng cao sản xuất nông nghiệp, công nghiệp

Trang 19

19

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật metagenomics và xây dựng thư viện metagenom cho phép đánh giá đa dạng di truyền và phương pháp trao đổi chất của các vi sinh vật không thể nuôi cấy trong quần thể vi sinh vật (Handelsman

2004; Iqbal et al., 2012) Các vector tách dòng thích hợp cho nghiên cứu

metagenomics bao gồm BAC, cosmid và plasmid Phân tích các dòng vô tính ở các bước tiếp theo có thể thực hiện bằng cách đọc trình tự hoặc thông qua các công cụ sàng lọc chức năng Việc phân tích dựa trên kết quả đọc trình tự có thể tiến hành theo phương pháp shotgun metagenome hoặc touchdown PCR với các

cặp mồi đặc hiệu cho các gen quan tâm (Iqbal et al., 2012)

1.3 Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong nghiên cứu metagenomics

1.3.1 Các thế hệ máy giải trình tự trên thế giới

Ngày nay, các công ty thương mại trên thế giới đã cho ra đời các thế hệ máy đọc trình tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) Các kỹ thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự ứng dụng huỳnh quang phân tích tự động (Olsvik et al., 1993; Pettersson et al., 2009) Các công nghệ đọc trình tự mới luôn hướng tới làm tăng dung lượng (throughput), làm giảm thời gian và giá thành (Schadt et al., 2010) Mặc dù vậy, phương pháp Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide (ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuếch đại DNA in vitro) được

sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trước đây vẫn được thực hiện xen kẽ khi cần

thiết (Sanger et al., 1977)

Đọc trình tự được thực hiện sau phản ứng khuếch đại DNA (như ở phương pháp Sanger) được thay thế bằng đọc trình tự thực hiện ngay trong giai đoạn tổng hợp sợi DNA bổ sung cho sợi khuôn (phương pháp pyrosequencing) (Nyrén, 2007; Ronaghi et al., 1996, 1998) Đây là công nghệ khởi đầu cho kỹ

Trang 20

20

thuật “đọc trình tự bằng tổng hợp”, nền tảng của kỹ thuật đọc trình tự bộ gen hay còn gọi là kỹ thuật đọc trình tự thế hệ mới sau này Với ưu thế thời gian đọc nhanh, trình tự đọc được rất chính xác, cường độ phát quang định lượng được nên dù trình tự đọc được không dài (<100 bases) nhưng pyrosequencing thể hiện

rõ ưu thế hơn hẳn phương pháp Sanger và trở thành một kỹ thuật không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử (Poehlmann et al., 2007)

Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới: theo 2 nguyên lý chính bao gồm

đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) đã được các thế hệ máy Roche 454, Ion Torrent và Illumina sử dụng SBS liên quan đến việc sử dụng một hỗn hợp các dNTP được biến đổi tại vị trí 2’ bao gồm các dNTP bổ sung tự nhiên và có đánh dấu huỳnh quang Quá trình xác định trình tự sẽ diễn

ra tương tự như phản ứng PCR Về mặt lý thuyết, độ dài đoạn được đọc bằng SBS có thể lên đến hàng trăm base.Nguyên lý thứ hai đó là đọc trình tự gắn nối (sequencing by ligation, SBL) được sử dụng ở máy SOLiD do George Church phát minh SBL đã được sử dụng để xác định trình tự genome và là nền tảng cho các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới SBL là một chu trình tuần hoàn gồm 4 bước SBL hoạt động trong cả hai chiều: chiều xuôi (5 'đến 3') và chiều ngược (3 'đến 5') (Margulies et al., 2005; Schuster, 2008; Rusk, 2011, Mardis, 2008, Valouev

Trang 21

21

template giải trình tự được cố đình trên bề mặt một flow cell (1 loại chip DNA) được thiết kế để tạo ra 1 dạng DNA hỗ trợ hoạt động các enzyme trong khi đảm bảo độ bền của các template bám trên bề mặt và mức độ bám trên bề mặt và mức độ bám không đặc hiệu thấp của các nucleotide đánh dấu huỳnh quang Quá trình nhân bản trên pha rắn tạo ra tới 1000 bản copy giống hệt nhau của mỗi template trong trạn thái đứng sát nhai (trong đường kính < 1 µm) Vì quá trình này không bao gồm việc ghi ảnh, thực hiện thao tác cơ học, hay đặt các hạt bead vào các giếng, nên mật độ của các cluster trên đơn vị diện tích được đảm bảo

Công nghệ giải trình tự bằng tổng hợp (SBS) sử dụng 4 nucleotide đánh dấu huỳnh quang để giải trình tự hàng chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt flow-cell Trong mỗi chu trình giải trình tự, một deoxynucloside triphosphate đánh dấu (dNTP) được thêm vào chuỗi acid nucleic Nhãn huỳnh quang của nucleotide đóng vai trò như một khóa dừng phản ứng polymer hóa, do đó sau khi mỗi dNTP được tích hợp, dye huỳnh quang được ghi lại để xác định nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợp nucleotide tiếp theo Vì cả 4 loại dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch có mặt đồng thời dưới dạng đơn phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểu việc tổng hợp mất cân đối Việc xác định các base dựa trực tiếp vào cường độ tín hiệu đo được trong mỗi chu trình, từ đó giảm thiểu các sai số thô so với công nghệ khác

Ưu nhược điểm của hệ thống

Phương pháp giải trình tự của Illumina dựa trên số lượng cực lớn các đoạn đọc trình tự đồng thời Khối lượng mẫu lớn và độ bao phủ đồng nhất được

sử dụng để tạo ra một tổng thể và một độ tin cậy cao được đảm bảo trong việc xác định các biến dị di truyền Khối lượng mẫu lớn cho phép sử dụng các công

cụ thống kê và cho điểm, tương tự như các phương pháp truyền thống trong việc xác định thể đồng hợp, dị hợp và phân biệt các lỗi giải trình tự Mỗi base đọc thô

Trang 22

22

có một điểm số chất lượng do đó phần mềm có thể sử dụng một số công cụ định lượng trong việc xác định sự sai khác và cho điểm số tin cậy

Phần mềm thu nhận dữ liệu của Illumina cho phép người dùng xếp các trình tự vào một vùng tham chiếu (mẫu) của các ứng dụng giải trình tự Được phát triển dựa trên sự hợp tác của các nhà nghiên cứu, phần mềm bao gồm các module thu nhận dữ liệu, xử lý và phân tích tạo thành một chuỗi thu nhận và xử

lý dữ liệu với sự can thiệp ít nhất từ người sử dụng Định dạng mở của phần mềm cho phép dễ dàng truy nhập dữ liệu tại nhiều giai đoạn của quá trình xử lý

và phân tích dữ liệu sử dụng các giao duện chương trình đơn giản

Một quy trình một chiều, khả năng tự đông hóa cao yêu cầu thời gian thao tác ít nhất Với khả năng tạo ra hàng Gb dữ liệu DNA trong một lần chạy, ngay

cả các genome lớn của các động vật có vú có thể giải trình tự trong một vài tuần thay vì một vài năm như trước kia Khả năng chạy nhiều mẫu trên 1 flow cell đồng nghĩa với việc có thể thực hiện nhiều ứng dụng trong một lần chạy

Một nhược điểm của hệ thống máy giải trình tự của Illumina đó là việc sử dụng các hóa chất và các thiết bị có giá thành ở mức cao Chính vì vậy, với nhưng nghiên cứu ở quy mô nhỏ với kinh phí thấp sẽ ít có cơ hội được thực hiện trên hệ thống này

Ứng dụng của công nghệ Illumina

Ứng dụng của hệ thống giải trình tự Illumina là rất đa dạng, hệ thống này cho phép các nhà khoa học nghiên cứu nhiều lĩnh vực trong ngành khoa học sự sống Illumina cho phép giải mã một hệ gen hoàn chỉnh trong thời gian ngắn, so sánh với các công nghệ trước đây Cụ thể trong việc giải mã một hệ gen người hoàn chỉnh, với các công nghệ trước đây chúng ta phải mất tới 10 năm, thì hiện nay với công nghệ Illumina chúng ta chỉ mất tới 4 ngày Công nghệ này cho phép ứng dụng trong lĩnh vực y tế và bảo vệ sức khỏe cộng đồng, thông qua việc

Trang 23

23

giải mã hệ gen của các vi sinh vật, các virus, các tác nhân gây bệnh; phân tích, phát hiện các điểm đột biến; phân tích các hệ gen phiên mã Bên cạnh đó, với các nghiên cứu về biểu hiện gen phục vụ công nghiệp dược đáp ứng thuốc, nghiên cứu sự tác động của thuốc tới tế bào, Ứng dụng của Illumina cho phép thay thế các công cụ trước đây, cụ thể như microarray Ngoài ra các công nghệ hiện nay vẫn đang cải tiến liên tục, cho phép phát triển nhiều hơn nữa các ứng dụng phục vụ trong đa dạng các lĩnh vực (Ayman and Weinbrecht 2013)

1.4 Các nghiên cứu metagenomics trên thế giới và Việt Nam

Các nghiên cứu từ trước cho thấy rằng phần lớn các vi sinh vật tồn tại trong môi trường xung quanh chúng ta không thể nuôi cấy trên môi trường nhân tạo trong phòng thí nghiệm và do đó không thể xác định trình tự DNA cũng như

nghiên cứu phân tích (Amann et al., 1995) Những nghiên cứu đầu tiên về

metagenomics đã tập trung phân tích trình tự 16S rRNA, những trình tự này thường ngắn, mang tính bảo thủ cao trong cùng một loài và khác nhau giữa các loài (Woese 1987; Beja et al., 2002) Các nhà khoa học đã phát hiện nhiều trình

tự 16S rRNA được tìm thấy không thuộc về bất kỳ loài nào đã được phân lập trước đây Điều này cho thấy rằng đã có rất nhiều loài vi sinh vật bị bỏ sót không được nghiên cứu đến Phân tích trình tự các đoạn 16S rRNA thu trực tiếp

từ môi trường tự nhiên cho thấy rằng bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống, chúng ta chỉ có thể nghiên cứu được khoảng 1% số lượng các loài vi sinh vật tồn

tại trong mẫu tự nhiên thu được (Hugenholz et al., 2002) Theo Amann et al

(1995) bằng các phương pháp vi sinh truyền thông chỉ có thể nuôi cấy khoảng 0.001–0.1% các loài vi sinh vật biển, 0.25% loài vi sinh vật nước ngọt, 0.25%

trong trầm tích và chỉ 0.3% sinh vật đất (Amann et al., 1995)

Công nghệ metagenomics ra đời đã khắc phục được những hạn chế của các phương pháp truyền thống, hướng sự tập trung nghiên cứu vào các vi sinh vật chưa

Trang 24

24

được chú ý đến Bằng cách phân lập và nghiên cứu trực tiếp genome của toàn bộ các vi sinh vật tồn tại trong một môi trường nghiên cứu, ta có thể có thông tin di truyền của hệ vi sinh vật ở đó mà không cần phải phân lập và nuôi cấy từng tế bào riêng lẻ

Người đầu tiên đưa ra ý tưởng nhân bản trực tiếp các mẫu DNA từ môi trường là Pace và cộng sự, họ đã chứng minh sự tồn tại của một hệ sinh vật phức

tạp chưa từng được nghiên cứu đến (Pace et al., 1986) Năm 1991, Pace and

Delong đã công bố nghiên cứu phân lập các gen cấu trúc từ thư viện gen của hệ

vi sinh vật phát triển trên cỏ khô trong điều kiện phòng thí nghiệm (Pace and Delong 1991) Năm 2002, Breitbart et al (2002) sử dụng công nghệ metagenomics cho thấy trong 200 lít nước biển chứa hơn 5000 loại virus khác

nhau (Breitbart et al., 2002) Các nghiên cứu sau đó cho thấy rằng có hơn một

nghìn loài virus trong phân của con người và khoảng một triệu loại virus khác nhau cho mỗi kg trầm tích biển, bao gồm cả thể thực khuẩn (Torsvik et al.,

2002; Turnbaugh et al., 2007; Tringe et al., 2005 ; Rusch et al., 2007) Về cơ

bản tất cả các virus đã được phát hiện trong các nghiên cứu này đều là những loài chưa từng được phát hiện Năm 2004, Tyson và các đồng nghiệp tại Đại học California, Berkeley đã xác định trình tự DNA của hệ vi sinh vật có trong nước

thải nhiễm acid (Tyson et al., 2004) Đây là một bước tiến quan trọng xác định

được bộ gen hoàn chỉnh, hoặc gần như hoàn chỉnh của một số vi khuẩn mà trước đây chưa nuôi cấy thành công (Hugenholz 2002)

Từ năm 2003, Venter đã đi vòng quanh trái đất bằng đường biển nhằm thu thập các mẫu và sử dụng công nghệ metagenomics với mục đích xác định các genome (và theo đó là các sinh vật) mới Dự án thí điểm, tiến hành trong vùng biển Sargasso, phát hiện DNA của gần 2000 loài khác nhau, trong đó có 148 loài

vi khuẩn chưa bao giờ được xác định trước đây (Venter et al., 2004) Phân tích

Trang 25

25

hệ sinh vật đất sử dụng công nghệ metagenomics xuất hiện chậm hơn so với những nghiên cứu phân tích hệ sinh vật biển do trong đất thường tồn tại những hợp chất liên kết với DNA hoặc ức chế phản ứng PCR, gây khó khăn cho việc nhân bản các mẫu DNA từ đất (Daniel, 2005) Tuy nhiên trong những năm gần đây những tiến bộ đáng kể trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất, xây dựng các thư viện gen của các vi sinh vật này đã giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về hệ sinh

vật phức tạp này (Kakirde et al., 2010; Parachin et al., 2011)

Các tiến bộ trong kỹ thuật đọc trình tự DNA đã mở ra phương pháp tiếp cận mới cho công nghệ metagenomics Năm 2006, các nhà khoa học tại Đại học Penn State đã công bố các trình tự thu được từ một mẫu môi trường bằng phương pháp pyrosequencing sử dụng kỹ thuật đọc trình tự 454 – kỹ thuật cho

phép đọc tới 400-600 megabases DNA chỉ trong vòng 10 giờ (Poinar et al.,

2006) Kỹ thuật này ra đời cho phép đọc trình tự nucleotit của hệ sinh vật ở quy

mô lớn trong một thời gian ngắn (Edwards et al., 2006) Gần đây công nghệ sinh

học đã thay đổi cách tiếp cận trong việc xác định các gen mới, nghiên cứu chức năng của các gen, phân tích thành phần loài và các hệ vi sinh vật Kỹ thuật metagenomics là một lĩnh vực nghiên cứu mới, đang phát triển mạnh mẽ trong hơn một thập kỷ qua, đã giúp xác định hệ gen của các vi sinh vật không thể nuôi cấy, một mặt hoàn thiện những hiểu biết của con người về các loài vi sinh vật trên trái đất, mặt khác góp phần giải quyết nhu cầu tìm kiếm các enzyme và hợp

chất sinh học có ích (Schmeisser et al., 2007; Bomar et al., 2011)

Các nghiên cứu phân tích thành phần và hoạt động của các hệ vi sinh vật

tự nhiên cho thấy tiềm năng sản xuất từ các vi sinh vật này các hợp chất sinh học

có giá trị cao sử dụng trong y tế như thuốc kháng sinh, các chất chống ung thư

và ức chế miễn dịch (Raaijmakers et al., 2002) Sử dụng kỹ thuật metagenomic

để đánh giá tiềm năng và hoạt tính sinh học của quần thể vi sinh vật không

Trang 26

26

thông qua nuôi cấy theo phương pháp cổ điển đã cho thấy tiềm năng ứng dụng

kỹ thuật metagenomic trong nghiên cứu khái thác đa dạng sinh học vi sinh vật là

rất lớn (Hochmuth et al., 2010; Nikolouli and Mossialos 2012)

Tại Việt Nam, Thi Huyen Do (2014) đã tiến hành đề tài nghiên cứu metagenomic của các gen phân hủy sinh khối của vi khuẩn sống trong ruột của mối với máy đọc trình tự Illumina Kết quả của nghiên cứu đã thu được 5.6 Gb

dữ liệu về gen trong ruột mối Coptotermes gestroi Trong đó, có 5,4 Gb dẽ liệu

có ích: 125,431 trình tự ORF chứa hơn 78 triệu bp và có hơn 80% dữ liệu của vi khuẩn Nghiên cứu cũng chỉ ra 12 loài vi khuẩn có mặt nhiều nhất và xác định được hơn 1460 loài Ngoài ra, trong hơn 125 nghìn ORF, nghiên cứu đã xác định được có khoảng 12 nghìn ORF liên quan đến chuyển hóa carbonhydrate

Có khoảng 587 ORF mã hóa enzyme phân hủy cellulose, hemicelluloses và pectin, trong đó có khoảng 316 ORF liên quan đến phân hủy cellulose

Việc áp dụng công nghệ metagenomics vào nghiên cứu hệ gen của vi sinh vật đất đã, đang và sẽ đóng vai trò to lớn trong các nghiên cứu tiếp theo Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật metagenomic trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất nói chung cũng như hệ vi sinh vật rễ cây dó bầu nói riêng Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào đánh giá các

hệ vi sinh vật ở các địa điểm trồng dó bầu khác nhau ứng dụng kỹ thuật metagenomic

Trang 27

27

II VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu – Hóa chất nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: 3 mẫu đất rừng tại vùng rễ cây dó bầu được thu tại

Sơn Dương (Tuyên Quang); Nha Trang (Khánh Hòa); Phú Quốc (Kiên Giang) được kí hiệu lần lượt là TQ, NT, PQ

Hình 2.1 Bản đồ vị trí thu mẫu đất tại 3 tỉnh

Hóa chất: Bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation (MO BIO) cho quá trình tách DNA từ đất, Bộ kit KAPA2G Robust HotStart Ready Mix (Kapa Biosystems), Agencourt AMPure XP DNA purification kit (Beckman Coulter), Nextera XT index kit (Illumina) Hóa chất dùng trong điện di DNA: agarose,

TAE 1X (Tris - Acetic acide - EDTA), ethidium bromide

Trang 28

28

Máy móc, thiết bị: Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ),

máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, Qubit (Invitrogen; LifeTechnologies Europe BV, Monza, Italy), Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies), cùng với các trang thiết bị khác của phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

(Mini-2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu đất

Địa điểm thu mẫu được định vị tại vùng rễ của các cây Dó bầu khỏe mạnh

từ 5 đến 7 năm tuổi Các mẫu đất được thu thập vào cùng một thời điểm vào mùa khô tháng 8 năm 2013 Tại các vị trí lấy mẫu, phần đất bề mặt được loại bỏ Đất tại vùng rễ được thu thập bằng cách đào tại độ sâu khoảng 30 cm Tại mỗi khu vực lấy mẫu khoảng 25 m2 gồm khoảng 3 cây dó bầu, chúng tôi tiến hành lấy mẫu đất tại 9 vị trí như trên hình

Hình 2.2 Vị trí tiến hành thu mẫu tại một khu vực nghiên cứu Sau khi loại bỏ toàn bộ các viên đá lớn, đất tại 9 vị trí trong 1 khu vực được gộp làm một, trộn đều, và sau đó chuyển vào các ống corning 50 ml Mẫu

Trang 29

29

đất được bảo quản trong điều kiện tối và ở -20o

C tới khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Các mẫu đất thu tại các vùng trồng dó bầu được tiến hành tách chiết DNA bằng bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation DNA sau khi tách thành công được tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng máy Nano drop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20o

C

B1: Thêm 0,25 gam mẫu đất vào ống PowerBead

B2: Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu

B3: Kiểm tra Giải dung dịch C1 Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60  C cho đến khi tan trước khi sử dụng

B4: Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngược nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn

B5: vortex 5-10p tốc độ tối đa

B6: ly tâm 10.000g 30s ở nhiệt độ phòng, lưu ý nếu li tâm > 10.000g có thể ống sẽ vỡ

B7: Chuyển nổi sang ống 2 ml, thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl B8: Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây Ủ ở 4  C trong 5 phút

B9: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

B10: chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhưng không nhiều hơn 600 l

B11: Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn Ủ ở 4  C trong

5 phút

B12: Ly tâm các ống ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g

Trang 30

30

B13: chuyển dich nổi vào ống 2 ml không nhiều quá 750 l

B14: Lắc để trộn đệm C4 trước khi sử dụng Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex 5 giây

B15: cho 675 l vào bộ lọc Spin và ly tâm ở 10.000 xg trong 1 phút ở nhiệt độ phòng, đổ dich qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch

B16: Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở

10.000 xg

B17: Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột

B18: Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút ở 10.000 xg

Woese et al (1977) đã xác định được 16S là phân tử thích hợp làm thước đo tiến

hóa: 16S là phân tử cổ, chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải

Trình tự mồi: các mồi được sử dụng trong nghiên cứu để khuếch đại vùng

V3 và V4 của 16S rRNA với kích thước lý thuyết khoảng 550 bp

Trang 31

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	1,76 MB