Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)

Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lập từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84 (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HÀ THU NGA

ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN ISOFLAVONE SYNTHASE (IFS1)

PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT26 và ĐT84

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HÀ THU NGA

ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN ISOFLAVONE SYNTHASE (IFS1)

PHÂN LẬP TỪ HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT26 và ĐT84

Chuyên ngành : Di truyền ho ̣c Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa ho ̣c : GS.TS Chu Hoàng Mâ ̣u

Thái nguyên, 4- 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những kết quả trong luận văn này

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 4 năm 2016

Tác giả luận văn

Hà Thu Nga

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn trong suốt thời gian nghiên cứu , thực hiện và hoàn thành bản luận văn tha ̣c sỹ sinh ho ̣c này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bô ̣ môn Di truyền &Sinh học hiê ̣n đa ̣i, Khoa Sinh ho ̣c , trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập cũng như thực hiện

đề tài luâ ̣n văn tha ̣c sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn và các cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tốt nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn cùng tôi trong suốt

quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thiện luận văn này

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 4 năm 2016

Tác giả luận văn

Hà Thu Nga

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY ĐẬU TƯƠNG 3

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại học và đặc điểm sinh học của cây đậu tương 3

1.1.2 Thành phần hóa học trong hạt đậu tương 4

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA ISOFLAVONE 11

1.2.1 Cấu trúc và thành phần cơ bản của isoflavone 11

1.2.2 Cơ chế hoạt động và chức năng của isoflavone 13

1.3 CHUYỂN HÓA ISOFLAVONE VÀ GEN MÃ HÓA ISOFLAVONE SYNTHASE 14

1.3.1 Chu trình chuyển hóa isoflavone trong hạt đậu tương 14

1.3.2 Con đường sinh tổng hợp isoflavone 15

1.3.3 Isoflavone synthase và gen mã hó a IFS 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BI ̣ VÀ ĐI ̣A ĐIỂM NGHIÊN CỨU 19

2.1.1 Vật liệu 19

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị 21

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone trong các mẫu đậu tương ĐT26, DT90, DT84 21

2.2.2 Phương pháp tách chiết mRNA tổng số 22

2.2.3 Phương pháp nhân bản đoạn mã hóa của gen GmIFS1 23

2.2.4 Tách dòng phân tử 25

2.2.5 Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide của gen 28

2.2.6 Phân tích và xử lý dữ liê ̣u 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 HÀM LƯỢNG ISOFLAVONE TRONG HẠT NẢY MẦM CỦA BA GIỐNG ĐẬU TƯƠNGĐT26, ĐT90, ĐT84 29

3.2 TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦ A GEN GmIFS TỪ mRNA CỦA ĐẬU TƯƠNG 32

3.2.1 Thiết kế cặp mồi PCR và nhân bản gen GmIFS 32

3.2.2 Tách dòng phân tử đoạn mã hóa của gen GmIFS trong E.coli 34

3.2.3 Trình tự gen GmIFS phân lập từ hai giống đâ ̣u tương ĐT26 và ĐT84 35

3.3 SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA GEN GmIFS1 42

3.3.1 Sự đa da ̣ng về trình tự nucleotide của gen GmIFS1 42

3.3.2 Sự đa da ̣ng về trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1 44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ 47

1 Kết luận 47

2 Đề nghị 47

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

DANH MỤC NHƢ̃NG TƢ̀ VÀ CHƢ̃ VIẾT TẮT

bp : base pair (cặp bazơ)

DEPC : diethyl pyrocarbonate

DNA : deoxyribosenucleic acid

dNTP : deoxynucleoside triphosphate

mRNA : messenger ribonucleic acid

IFS : Isflavone synthase

PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside

E coli : Escherichia coli

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA 23

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi PCR sử du ̣ng trong nghiên cứu 23

Bảng 2.3 Thành phần của phản ứng PCR 24

Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 24

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối gen GmIFS1 vào vector pBT 26

Bảng 3.1 Hàm lượng daidzein , genistein và isoflavo ne trong ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi của 3 giống đâ ̣u tương ĐT26, ĐT90 và ĐT84 31

Bảng 3.2 Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen GmIFS1 giữa các giống đậu tương ĐT26, ĐT84 và NM_001249093 39

Bảng 3.3 Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen GmIFS1 giữa ba giống đâ ̣u tương ĐT26, ĐT84, NM_001249093 41

Bảng 3.4 Trình tự gen GmIFS1 của giống đậu tương ĐT26, ĐT84 và các trình tự có mã số trên Ngân hàng gen quốc tế được sử dụng trong phân tích 43

Bảng 3.5 Hê ̣ số tương đồng và hê ̣ số phân ly của các giống đâ ̣u tương dựa trên trình tự nucleotide của gen GmIFS1 44

Bảng 3.6 Hê ̣ số tương đồng và hê ̣ số phân ly của các giống đâ ̣u tương dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của các aglucone 12 Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của các ß-glucoside 12 Hình 1.3 Con đường sinh tổng hơ ̣p isoflavone (Phản ứng xúc tác bởi enzym

IFS màu xanh dương) [14] 16

Hình 2.1 Sơ đồ vector pBT 26

Hình 3.1 Hình ảnh hạt đậu tươngnảy mầm 3 ngày tuổi được sử dụng chiết rút

daidzein và genistein A ĐT26, B: ĐT90, C: ĐT84 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ phân tích daidzein , genistein từ ha ̣t nảy mầm 3 ngày tuổi

của các giống đậu tương A: ĐT26, B: ĐT90, C: ĐT84 30 Hình 3.3 Biểu đồ so sánh hàm lượng daidzein và genistein trong ha ̣t nảy mầm

giữa ba giống đâ ̣u tươngĐT 26, ĐT90, ĐT84 (mg/100 g) Thanh

đứng trên mỗi cột biểu đồ biểu thị sai số chuẩn (x S x) 32 Hình 3.4 Kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmIFS từ hai

giống đâ ̣u tương ĐT26 và ĐT84 34 Hình 3.5 A: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony -PCR vớ i că ̣p mồi

SoyIFS-NcoI-F/ SoyIFS-NotI-R từ 4 dòng khuẩn lạc có kiểu hình

trắng đươ ̣c lựa cho ̣n ngẫu nhiên M: thang DNA 1 kb; giếng 1, 2:

ĐT26; giếng 3,4: ĐT84 35

Hình 3.6 Trình tự nucleotide của gen GmIFS1 phân lâ ̣p từ hai giống đâ ̣u tương

ĐT26 và ĐT84 so với trình tự gen IFS1 của giống đậu tương mang

mã số NM_001249093 trên Ngân hàng Gen 37 Hình 3.7 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmIFS 1 phân lập từ hai

giống đâ ̣u tương ĐT 26, ĐT84 và từ gen IFS 1 mang mã số

NM_001249093 trên Ngân hàng Gen 40

Hình 3.8 Vị trí của gen GmIFS1 phân lâ ̣p từ hai giống đâ ̣u tương ĐT 26 và

ĐT84 42 Hình 3.9 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của mô ̣t số giống đậu tương dựa

trên trình tự nucleotide của gen GmIFS1 44

Hình 3.10 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của mô ̣t số giống đậu tương dựa

trên trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1 46

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill, thuộc chi Glycine,

họ đậu (Fabaceae) đươ ̣c trồng phổ biến ở Viê ̣t Nam và trên thế giới Sản phẩm từ

cây đâ ̣u tương rất đa da ̣ng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ,

ép thành dầu đậu tương, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu tương, okara đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc [6] Hạt đậu tương có hàm lượng protein cao , từ 20-40%, dễ tan và chứa hầu hết các loại amino acid cần thiết cho cơ thể con người Cây đâ ̣u tương ngày càng được quan tâm nhiều do trong thành phần có chứa dược chất isoflavone Đây là chất chống oxy hóa ma ̣nh , ngăn chă ̣n các gốc tự do , hỗ trợ miễn di ̣ch và giảm nguy cơ mắc bê ̣nh tim ma ̣ch ở người [26], [6]

Đậu tương giờ đây không chỉ là cây thực phẩm mà đã và đang được nghiên cứu dưới vai trò là cây dược phẩm Theo những nghiên cứu cho thấy, ngoài hàm lượng protein và lipid cao trong đậu tương còn chứa nhiều khoáng chất, các vitamin và đặc biệt là các hoá chất thảo mộc như: lecithin, saponin, trypsin inhibitor, lectin, phenolic acid, omega-3 fatty acid,… và hiện nay isoflavone đang được quan tâm nhiều nhất , vì isoflavone có cấu trúc tương tự như hormone kích thích tố sinh dục phái nữ (female hormone estrogen) và hoạt động giống như estrogen Isoflavone kiểm soát quá trình tương tác giữa cây và vi sinh vật , điều chỉnh hormone , kích thích tố sản xuất estrogen , do vâ ̣y có thể cải thiện các hội chứng tiền mãn kinh và chống loãng xương ở phụ nữ mãn kinh Isoflavone cũng là chất chống oxy hóa mạnh, có thể làm giảm nguy cơ ung thư bằng cách ngăn chặn các gốc tự do , trong đó genistein là chất chống oxy hóa mạnh nhất trong số các isoflavone, tiếp theo là daidzein Isoflavone làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch ở người bằng cách làm giảm nồng độ LDL -cholesterol huyết thanh Isoflavone còn là chất hỗ trợ miễn dịch [25], [31], [33], [39]

Tuy nhiên, hàm lượng isoflavone trong đậu tương thấp , trong khoảng từ 50

- 3000 µg/g và tồn tại ở hai dạng chính là glycoside và aglucone Dạng glycoside

có trọng lượng phân tử lớn, chiếm tới trên 90% isoflavone tổng số được cho là hấp thụ hạn chế trong hệ tiêu hóa người , trong khi đó , dạng aglucone được hấp thụ nhanh hơn, nhưng hàm lượng la ̣i rất thấp , chỉ chiếm từ 1% - 5% isoflavone tổng

số Isoflavone trong đâ ̣u tương bao gồm daidzein, genistein và glycitein được tổng hợp thông qua con đường phenypropanoid , được thay đổi bởi các enzyme đặc hiệu

và chứa trong không bào Isoflavone synthase (IFS) và chalcone isomarase (CHI)

là hai enzyme chìa khóa tham gia vào phản ứng tổng hợp genistein và daidzein [21] Tác động làm tăng cường hoạt động của hai loại enzyme này bằng công nghệ gen là giải pháp cải thiê ̣n hàm lượng isoflavone trong đâ ̣u tương Xuất phát từ những cơ sở đó chúng tôi đã xây dựng và tiến hành đề tài “ Đặc điểm của gen isoflavone synthase 1 phân lâ ̣p từ hai giống đậu tương ĐT26 và ĐT84”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích được đă ̣c điểm của gen GmIFS1 phân lâ ̣p từ mRNA của hai giống

đậu tương khác nhau về hàm lượng isoflavone trong ha ̣t nảy mầm

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 So sánh hàm lươ ̣ng genistein và daidzein của ba giống đâ ̣u tương trồng phổ biến ở miền Bắc Viê ̣t Nam ĐT26, ĐT90, ĐT84

3.2 Nghiên cứ u thông tin , nhân bản và tách dòng , xác định trình tự nucleotide của

gen GmIFS1 từ mRNA của cây đâ ̣u tương Phân tích đă ̣c điểm trình tự nucleotide

và trình tự amino acid suy diễn của gen GmIFS1

3.3 Phân tích tính đa da ̣ng trong trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy

diễn của gen GmIFS1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại học va ̀ đặc điểm sinh học của cây đậu tương

Đậu tương có tên khoa học là Glycine max (L.) Merill, thuộc chi Glycine,

họ đậu (Fabaceae), bộ Fabales, lớp Magnoliopsida, ngành Magnoliophyta, giới

Plantae Đậu tương có thể được phân loại theo đặc điểm thực vật học, theo thời

gian sinh trưởng và theo thời vụ Fukuda (1933) và nhiều nhà khoa học đã thống nhất cây đậu tương có nguồn gốc từ vùng Mãn Châu (Trung Quốc) xuất phát từ

một loại đậu tương dại, thân mảnh, dạng dây leo, có tên khoa học là Glycile Soja

Sieb và Zucc Từ Trung Quốc đậu tương được lan truyền sang các nước Đông

Nam châu Á và dần lan rộng trên khắp thế giới Ngày nay, cây đậu tương đã trở nên phổ biến và được trồng ở rất nhiều nước trên thế giới, trở thành cây thực phẩm

có giá trị kinh tế cao, quan trọng nhất trong các loại cây thuộc họ đậu, nhờ vào những đặc điểm ưu việt vượt trội so với các loại cây đậu khác, như hàm lượng isoflavone, protein, lipit, nhiều vitamin, các khoáng chất và nhiều loại hoá chất thảo mộc có lợi cho sức khoẻ con người

Quê hương của đậu tương ở châu Á , nhưng 45% diện tích trồng đậu tương

và 55% sản lượng đậu tương của thế giới nằm ở Mỹ Đậu tương là một trong số các cây thực phẩm đã có nhiều giống đượ c biến đổi di truyền (GMO) nhằm tăng năng suất Hiện nay, khoảng 80% lượng đậu tương được trồng phục vụ thương

mại đều là GMO [23]

Lá

Cây đậu tương có 3 loại lá là lá mầm, lá nguyên và lá kép Lá đậu tương thường mọc so le và có nhiều hình dạng khác nhau như hình tròn, dài, ô van, trái xoan, …tùy theo giống Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dưỡng chất nuôi cây mầm, lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh Khi hết chất dinh dưỡng lá mầm sẽ khô héo đi Lá nguyên mọc phía trên lá mầm khi cây được 2-3 ngày Lá kép mọc so le thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu Trên lá có nhiều long tơ Các lá có

nhiệm vụ cung cấp dinh dưỡng cho chùm hoa nằm cạnh nó

Hoa

Đậu tương là cây có hoa lưỡng tính, tự thụ phấn Hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy Màu sắc của hoa thường có màu tím, tím nhạt hoặc trắng Cây đậu tương cho nhiều hoa nhưng tỷ lệ hoa không thành quả chiếm 20-80% Cây ra hoa sớm hay muộn, thời gian ra hoa tuỳ thuộc

vào giống và thời vụ gieo do chịu ảnh hưởng phối hợp của ánh sáng và nhiệt độ

vỏ hạt 8% tổng khối lượng hạt [2]

1.1.2 Thành phần hóa học trong hạt đậu tương

Theo thống kê, trên toàn thế giới có khoảng trên 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu tương Ở Nhật Bản, hàng năm dùng tới 460 - 500 vạn tấn đậu tương (bình quân mỗi người ăn khoảng 37 - 40kg) trong đó có khoảng 80% dùng làm dầu ăn và thức ăn chăn nuôi, 20% dùng làm thực phẩm Ở Mỹ, người ta làm ra khoảng 2500 loại thực

phẩm từ đậu tương Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm bột đâ ̣u tương đóng gói, đậu phụ, sữa đâ ̣u tương, sữa chua đâ ̣u tương v.v… [45] Có người đã tiên liệu thế kỷ 21 là thế kỷ của các loại sản phẩm làm từ đậu tương [46]

Theo GS Đỗ Tất Lợi, toàn cây đậu tương chứa 12% nước, 16% gluxit, 50% protein, khoảng 25-30% carbohydrates, 6% muối khoáng và các chất khác không có nitơ [4]

Trong đậu tương có đủ các amino axit thiết yếu như: isoleucine, leucine, lysin, metionin, phenylanin, triptophan, valin Ngoài ra, đậu tương được coi là một nguồn cung cấp protein hoàn chỉnh vì chứa một lượng đáng kể các amino acid không thay thế cần thiết cho cơ thể Trong hạt đậu tương có các thành phần hóa học sau: Protein, lipid, glucid, có các muối khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin

A, B1,B2,PP D, E, F; các enzyme, sáp, nhựa, cellulose có các loại men tiêu hóa như amylase, lipase và protease , chất chống men trypsine , chất chống đông máu, chất sinh bướu giáp và isoflavone còn gọi là estrogen thực vật làm giảm các bệnh ung thư và những rối loạn ở tuổi mãn kinh Như vậy thành phần dinh dưỡng trong đậu tương rất đa dạng, phong phú và toàn diện Hạt cây là thành phần có giá trị sử dụng nhất vì nó không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết mà còn tồn tại các hoá thảo mộc có tác dụng phòng ngừa và trị bệnh đặc biệt là các căn bệnh thời

đại như: bệnh ung thư, các bệnh liên quan đến tim mạch [3], [19]

Tại các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc, 60% lượng đạm tiêu thụ hằng ngày là do đậu tương cung cấp Hàm lượng chất đạm chứa trong đậu tương cao

hơn nhiều so với lượng chất đạm chứa trong các loại đậu khác

Lipit

Thành phần chính của lipit là triglyxerit là những hợp chất hữu cơ phức tạp gồm rượu bậc 3 glyxerol và các axit béo no, chưa no Trong hạt đậu tương còn chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật Hàm lượng lipid trong đậu tương khoảng 15-20%, lipid của đậu tương chứa một tỷ lệ các acid béo chưa no cao gồm: acid oleic có giá trị dinh dưỡng là 25-36%, acid linoleic có giá trị dinh dưỡng là 52-65% và linolenic acid

có giá trị dinh dưỡng là 2-3% Nhiều tác giả coi các axit béo chưa no linoleic, linolenoic và oleic cùng với các sản phẩm đồng phân của chúng là các axit béo chưa no cần thiết vì chúng không tổng hợp được trong cơ thể.Lipid của đậu tương chứa một tỷ lệ các acid béo no như: acid panmitic, acid stearic, acid arachidonic

photphatit và sterol cũng là những thành phần lipit quan trọng [6], [19]

Gluxit là sản phẩm ban đầu của quá trình quang hợp và được dùng làm

"nguyên liệu" để xây dựng tất cả các hợp chất có trong hạt đậu Trong hạt đậu, gluxit tự nhiên chủ yếu là xenlulo và hemixenlulo Lượng xenlulo chủ yếu tập

trung ở vỏ

Vitamin

Hạt đậu tương cũng chứa khá nhiều các loại vitamin, cả tan trong dầu và tan trong nước, đặc biệt là hàm lượng của vitamin B2 và B1 Ngoài ra, trong đậu tương còn có các loại vitamin như: PP, A, E, K, C, D,…thiamine (6,25-6,85g/g),

riboflavine (0,92-1,19g/g), vitamine E (-tocopherol chiếm 10,9-28,4g/g; tocopherol chiếm 150-190g/g; -tocopherol chiếm 24,6-72,5)

-Khoáng

Khoáng là một nhóm các chất cần thiết không sinh năng lượng nhưng giữ vai trò trong nhiều chức phận quan trọng đối với cơ thể Cơ thể người ta có gần 60 nguyên tố hóa học Một số chất có hàm lượng lớn trong cơ thể được xếp vào nhóm các yếu tố đa lượng (macroelements), số khác có hàm lượng nhỏ được xếp vào nhóm các vi yếu tố (microelements) Các yếu tố đa lượng là Ca (1,5%), P (L%),

Mg (0,05%), K (0,35%), Na (0,15%) ; Các yếu tố vi lượng là I, F, Cu, Co, Mn,

Zn Trong hạt đậu tương khô chứa khoảng 5% khoáng, với các nguyên tố

khoáng đa lượng như muối của K, P, Mg, S, Ca, Cl, Na Hàm lượng trung bình của các nguyên tố khoáng này nằm trong khoảng 0,2-2,1% Những nguyên tố khoáng vi lượng gồm có: Cu, Zn, Fe, Co, Pb, I, Se, Mn, Cd,… Hàm lượng của những nguyên tố khoáng vi lượng này dao động khoảng 0,01-140 ppm [6], [19]

Isoflavone

Isoflavone là một loại flavonoid có trong đâ ̣u tương và đặc biệt có hàm

lượng cao nhất trong mầm đâ ̣u tương Isoflavone có 3 loại là: genistein, daidzein

và glycitein (isoflavone aglycone)

Isoflavones trong đâ ̣u tương là một trong những hoá thảo mộc đang được các nhà khoa học nghiên cứu nhất vì nó có những tính năng kì diệu chống lại các tác dụng gây nên chứng ung thư liên hệ đến hormone, sử dụng trong điều trị các triệu chứng mãn kinh phụ nữ như: bốc hoả, đổ mồ hôi, mất ngủ, lo âu, rối loạn chức năng tình dục, lão hoá da, bệnh Alzheimer…[28] Ở Đậu tương, có chứa nhiều hợp chất isoflavone, nhưng có lợi nhất là genistein và daidzein Những hợp chất tự nhiên còn được gọi là estrogen thực vật (phytoestrogen) có khối lượng phân tử tương đối lớn, tan tốt trong nước, có tính phân cực cao và đang được quan

tâm vì lợi ích sức khỏe của nó đem lại [18]

Genistein

Công thức phân tử: C15H10O5 (trọng lượng phân tử 270 đvC) Là tinh thể không màu

Chuyển màu sang vàng sau khi hòa tan trong kiềm, và màu đỏ sậm trong sắt

dung dịch clorua ethanol (III)

Daidzein

Công thức phân tử: C15H10O4 (trọng lượng phân tử 254) Là tinh thể không màu, tan trong methanol, ethanol và acetone Chuyển màu sang màu vàng sau khi hòa tan trong kiềm, và phát huỳnh quang bởi tia UV Phân hủy để tạo thành axit formic, resorcin, và ρ-hydroxybenzoate với kiềm

Trong mầm đâ ̣u tươn g có chứa nhiều protein và đặc biệt có chứa chất Isoflavones Isoflavones có hoạt tính tương tự như kích thích tố nữ estrogen mà

đã được nhiều công trình khoa học chứng minh là có tác dụng trong việc điều trị

và ngăn ngừa một số bệnh đặc biệt là sức khỏe của phụ nữ Isoflavones đâ ̣u tương

là hoạt chất có cơ chế hoạt động và chức năng gần giống như nội tiết tố estrogen người Vì thế các nhà khoa học còn gọi là estrogen thảo mộc [47]

Isoflavones được xem như là một chất chống oxy hóa Trong đó genistein, một Isoflavone có nhiều nhất trong đậu tương có tác động giúp ức chế một số bước trong quá trình khởi phát và tạo thành mảng xơ vữa động mạch Nghiên cứu của Ruiz-Larrea MB bệnh viện GUY London và cộng sự thực hiện năm 1997 cũng cho thấy genistein là chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh nhất thể hiện ở

khả năng trung hòa các gốc tự do giúp làm chậm quá trình lão hóa da [47]

Chất ức chế protease

Đậu tương có khả năng ngăn cản không cho bệnh ung thư phát triển trên các loài động vật, do tác dụng của chất ức chế protease Các nhiều nhà khoa học

đã khảo sát và thử nghiệm chất ức chế protease Trong điều kiê ̣n phòng thí nghiệm thấy rằng đâ ̣u tương có tác dụng chống lại sự phát triển mầm ung thư kết tràng , ung thư phổi , ung thư miệng… [35, 36] Chất ứ c chế protease ngăn ngừa sự tác động của một số gen di truyền gây nên chứng ung thư, bảo vệ các tế bào cơ thể không cho hư hại, gây nên bởi sự tác động của môi trường xung quanh như tia

nắng phóng xạ và các chất có thể tấn công ADN [28, 37]

Phytate

Phytate là một hợp chất khoáng phosphorus và inositon Các nhà khoa học

đã chứng minh phytate không những có tác dụng ngăn ngừa mầm ung thư mà còn

có khả năng ngăn ngừa bệnh tim mạch Hai nhà nghiên cứu Graf và Eator đã cho biết phytate bảo vệ chúng ta khỏi bệnh ung thư kết tràng, kết quả trong phòng thí nghiệm cho thấy phytate đã liên tiếp ngăn cản không cho bệnh ung thư kết tràng phát triển và không cho phát sinh mầm ung thư vú Mặt khác phytate có tác dụng ngăn cản sự hấp thụ sắt trong ruột do đó bảo vệ chúng ta khỏi chứng có quá nhiều chất sắt vì chất sắt thặng dư cũng là một trong những yếu tố nguy hại đến chứng

nhồi máu cơ tim [28, 37]

Phytosteron

Phytosteron có liên hệ với cholesteron, tuy nhiên cholesteron chỉ có nơi các thực phẩm có nguồn gốc từ thịt động vật còn phytosteron chỉ có trong các thực phẩm rau đậu Không giống như cholesteron, phytosteron có tác dụng ngăn ngừa các bệnh

về tim mạch qua việc dành chỗ thẩm thấu qua ruột của cholesteron để vào máu Do

đó cholesteron không vào máu được mà phải bài tiết ra ngoài, lượng cholesteron trong máu giảm, mức độ giảm tuỳ từng cá thể Phytosteron cũng có khả năng làm

giảm sự phát triển các bướu ung thư kết tràng và chống lại ung thư da [28, 37]

Saponin

Năm 2007 các nhà khoa học Hàn Quốc và Nhật Bản dùng bột đâ ̣u tương

đã khử dầu đem chiết xuất trong metanol, butanol 80% Dịch chiết sau khi làm khô trong chân không được đem định tính bằng sắc kí lớp mỏng, sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC và xác định cấu trúc bằng cách ghi phổ Sau khi xác định thành phần saponin trong đâ ̣u tương , các khoa học gia tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính của saponin trên chuột đực 5 tuần tuổi bằng cách tiêm qua tĩnh mạch đuôi Kết quả cho thấy saponin trong đâ ̣u tương có tác dụng ngăn cản sự

di căn của những tế bào ung thư [16] Nhiều công trình nghiên cứu khác đã chỉ ra, saponin là một loại hoá thảo có đặc tính giống như antioxydant Saponin có khả năng trực tiếp ngăn cản sự phát triển ung thư kết tràng đồng

thời làm giảm lượng cholesteron trong máu

Axit phenolic

Axit phenolic có kh ả năng chống oxy hoá antioxidant và phòng ngừa các

nhiễm sắc thể ADN khỏi bị tấn công bởi những tế bào ung thư [28, 37]

Lecithin

Khi nghiên cứu thành phần hoạt chất trong đâ ̣u tươngcác nhà khoa học đã nhận thấy , đạm chất đâ ̣u tương có chứa 3% lecithin bằng với lượng lecithin có trong lòng đỏ trứng gà Lecithin là một hoá chất thực vật quan trọng, đóng một vai trò quyết định trong việc kích thích sự biến dưỡng ở khắp các tế bào cơ thể lecithin có khả năng làm gia tăng trí nhớ bằng cách nuôi dưỡng tốt các tế bào não

và hệ thần kinh, làm vững chắc các tuyến và tái tạo các mô tế bào cơ thể Ngoài ra, lecithin có tác dụng cải thiện hệ thống tuần hoàn , bổ xương và tăng cường sức đề kháng Khi hệ thần kinh thiếu năng lượng , chất lecithin ở đâ ̣u tương sẽ phục hồi

năng lượng đã mất [28, 37]

Browman - Birk inhibitor (BBI)

BBI là một hoá thảo mới nhất tìm thấy trong đâ ̣u tương , có khả năng ngăn cản tiến trình phát triển mầm ung thư Trong nhiều năm qua, các nhà khoa học đã thử nghiệm và thành công trên các mẫu tế bào trong ống thí nghiệm và trong các thú vật qua hai dạng tinh chế PBBI và cô đặc BBIC Theo báo cáo kết quả tường trình tại hội nghị khoa học thế giới về vai trò của đâ ̣u tươngtrong việc phòng và trị bệnh (1996) thì PBBI và BBIC đã kiểm soát được sự phát triển tiến trình ung thư miệng,

vú, ruột già, gan, phổi, thực quản cả các tế bào trong ống thử nghiệm lẫn ở các con chuột bạch và chuột đồng Hiện nay BBI đã được dùng trên con người ở vài trung

tâm nghiên cứu và kết quả sơ bộ rất khả quan [37]

Axit béo mega - 3

Axit béo omega - 3 là loại chất béo không bão hoà có khả năng làm giảm lượng cholesterol xấu LDL đồng thời làm gia tăng lượng cholesterol tốt HDL trong máu Nhiều nghiên cứu khoa học đã xác nhận tiêu thụ nhiều axit omega - 3 fatty giúp ngăn chặn sự phát triển của các bệnh tim mạch [37]

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA ISOFLAVONE

1.2.1 Cấu trúc và thành phần cơ bản của isoflavone

Isoflavone gồm 2 vòng benzen: A và B nối với một dị vòng pyron [37]

Isoflavone là một loại flavonoid có trong đậu tương và đặc biệt có hàm lượng cao nhất trong mầm đậu Isoflavone dạng tự do có 3 loại genistein, daidzein và glycitein (isoflavone aglucone) Ngoài dạng isoflavone tự do trong hạt đậu tương còn

có isoflavone dạng liên hợp glucoside, glucoside acetyl và dạng malonyl [34]

Năm 2011, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu chuyển hóa genistein

trong isoflavone ở cây Brassica với IFS ở đậu tương kết quả cho thấy, genistein,

4',5,7-trihydroxyisoflavone, là một hợp chất isoflavonoid chủ yếu có trong các loại đậu và chứa hàm lượng phytooestrogen , các hoạt chất chống oxy hóa Enzyme isoflavone synthase (IFS) giữ vai trò quan trọng trong con đường phenylpropanoid từ flavonoids đến isoflavonoid Brassica napus là một cây cho dầu không thuộc họ đậu với các mô thực vật sản xuất phenylpropanoid và flavonoid, nhưng không có khả năng tích lũy isoflavone do sự vắng mặt của IFS [21]

Năm 2013, Cheng và cs đã nghiên cứu so sánh sự đa hình nucleotide trong Isoflavone synthase (IFS1, IFS2) và gen Flavanone 3-hydroxylase (F3H2) từ 33

giống đâ ̣u tương , trong đó có 17 giống đâ ̣u tương trồng (Glycine max) và 16 dạng hoang dã của họ (Glycine soja) Isoflavone synthase và flavanone 3-hydroxylase

(F3H) là hai enzyme quan trọng xúc tác sinh tổng hợp isoflavonoid và flavonoid,

cả hai đều đóng vai trò khác nhau trong phản ứng của stress [11]

Các nhà khoa học Bồ Đào Nha cũng đã sử dụng các phương pháp sắc kí HPLC/DAD và phổ UV để xác định thành phần của isoflavone trong 40 mẫu hạt đậu tương Sau khi nghiên cứu các khoa học đã khẳng định trong hạt đậu tương

các aglucone chiếm một lượng nhỏ, hợp chất chính trong hạt đậu tương là các dẫn xuất malonyl và dẫn xuất axetyl của ß - glucoside [23]

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của các aglucone

HO HO

Daidzin

O

O O

O HO

Hình 1.2 Cấu trúc hoá học của các ß-glucoside

Matsura và cs đã xác định được trong đậu tương nảy mầm , isoflavone dạng aglucone tăng lên rất nhiều do hoạt tính của β-glucosidase nội bào của đậu tương

và được kích hoạt bở i quá trình nảy mầm Enzyme này cắt liên kết β-glucoside

trong phân tử genistin, loại phân tử glucose để chuyển thành genistein [24]

1.2.2 Cơ chế hoạt động và chư ́ c năng của isoflavone

Isoflavone là hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc, cơ chế hoạt động và chức năng gần giống như những hormone nữ trong cơ thể và mang tính lành, không ảnh hưởng xấu lên nam giới Những hợp chất có thành phần tương tự như isoflavone vẫn được tìm thấy trong một số loại thực vật như: cỏ ba lá, cỏ linh lăng, cây dong

Cơ chế hoạt động là các estrogen tác dụng thông qua liên kết với các thụ thể estrogen trong tế bào Có hai loại thụ thể ER là alphe ER (α ER) và beta ER (ß ER), α ER có mặt tại màng trong tử cung, trong chất đệm của buồng trứng và ở tuyến vú Còn ß ER, tồn tại trong các tế bào nội mô của thành mạch máu , ở não, thận và trong các tế bào của bàng quang và niệu đạo , trong tế bào của niêm mạc ruột và phổi, tế bào xương Chức năng sinh lý chủ yếu của estrogen là kích thích α

ER và cho những tác dụng nội tiết rất quen thuộc trên màng trong tử cung và ở vú Trái lại, genistein, daidzein và các chất chuyển hoá của chúng kích thích chủ yếu vào ß ER Những tác dụng của isoflavone trong đậu tương luôn yếu hơn tác dụng của hormon estrogen thực thụ Do đó các hormone trong cơ thể người phụ nữ sau khi mãn kinh được cân bằng [31] Những nghiên cứu lâm sàng cho thấy đậu tương làm giảm cường độ bốc hỏa, giảm số lần đổ mồ hôi đêm, số lần thức giấc nâng cao chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh là nhờ có tác dụng của isoflavone trong đậu tương Do vâ ̣y ăn đậu tương giúp cải thiện toàn bộ về chất lượng sống của phụ nữ mãn kinh [22] Đặc biệt đối với những phụ nữ bị loãng xương trong thời kì mãn kinh thì isoflavone cũng có hiệu quả bất ngờ Nghiên cứu bổ sung isoflavone đậu tương trong khẩu phần ăn làm tăng đáng kể mật độ khoáng xương (BMD) lên 54%

và giảm tiêu xương biểu hiện bởi giảm DPD (deoxypyridinone) trong nước tiểu là 23% so với trị số cơ bản ở phụ nữ [40]

Những người phụ nữ sau mãn kinh khi sử dụng isoflavone đậu tương thì làn

da cũng được cải thiện đáng kể Tiến hành nghiên cứu với những phụ nữ sau mãn kinh, trước và sau khi điều trị với 100mg/ngày Kết quả của nghiên cứu này cho chúng ta thấy rằng bổ sung chiết xuất đậu tương đậm đặc giàu isoflavone trong 6 tháng thì làn da của phụ nữ mãn kinh sẽ giảm sự lão hóa Do tác dụng của isoflavone

giúp duy trì và tăng độ dầy lớp biểu mô , mạch máu, sợi đàn hồi và sợi collagen của

da Từ đó tăng giá trị sử dụng của đậu tương [7] Các kết quả nghiên cứu thu được đã khuyến cáo là nên sử dụng trực tiếp hạt đậu tương [9] Ngoài ra các isoflavone còn có vai trò ngăn chặn bệnh ung thư, đặc biệt là các bệnh ung thư phụ thuộc vào hormone như màng trong tử cung, ở vú, buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt [25]

SYNTHASE

1.3.1 Chu tri ̀nh chuyển hóa isoflavone trong ha ̣t đâ ̣u tương

Khi vào cơ thể, các isoflavone tự do được hấp thu ở ruột non nhanh hơn so với các isoflavone ở dạng glucoside Sự chuyển hoá các isoflavone đáng chú ý vì quá trình này tạo ra các sản phẩm có tác dụng mạnh hơn nhiều so với các chất ban đầu Hệ vi sinh đường ruột được chứng minh là có tầm quan trọng đặc biệt đối với chuyển hoá và tính khả dụng của các isoflavone, khi chỉ có các động vật có hệ vi sinh đường ruột mới được thấy có bài tiết sản phẩm chuyển hoá có tác dụng mạnh (equol) của isoflavone Một số nghiên cứu đánh giá mức độ thải trừ equol qua nước tiểu cho thấy chỉ khoảng 33% cá thể người phương Tây chuyển hoá daidzein thành equol Sự khác nhau về chuyển hoá isoflavone có thể có những ảnh hưởng quan trọng tới hoạt tính sinh học của các phytoestrogen này [31], [33] Chất chuyển hoá chính của genistein là hydroxy- O - demethylangolensin Những chất chuyển hoá chính của daidzein là O - demethylan - golensin, glyxitein và equol Equol là thành phần rất quan trọng cho hoạt tính của isoflavone đậu tương trong điều trị các triệu chứng mãn kinh, vì hoạt tính estrogen của equol mạnh gấp 5 lần hoạt tính này của chất daidzein và lớn gấp 2 lần hoạt tính của genistein [13]

Có nhiều bằng chứng thực nghiệm ủng hộ giả thuyết ghi nhận rằng thay vì isoflavone thì sản phẩm cuối cùng của enzyme IFS là 2 hydroxyisoflavanone - một hợp chất không ổn định ở điều kiện môi trường Thử nghiệm cho liquiritigenin và naringenin ủ với IFS có chứa microsome, sản phẩm thu được là 2-hydroxyisoflavanone Vì lý do này , “2-hydroxyisoflavanone synthase” chính là

“isoflavone synthase” [9] Tuy nhiên, ở những thực vật không thuộc họ đậu, khi có

enzyme IFS thì sự tích lũy sẽ là isoflavone , thay vì 2-hydroxyisoflavanone Điều này được lý giải do tự động chuyển đổi 2- hydroxyisoflavanone tạo ra isoflavone

đủ nhanh để ngăn chặn các hợp chất cũ tích lũy trong thực vật hoặc do có enzyme

“dehydratase flavonoid” làm mất nước hoặc cũng không thể loại trừ khả năng IFS

hỗ trợ việc chuyển đổi này với một tốc độ chậm hơn so với phản ứng dịch chuyển aryl [43] Enzyme IFS được chia làm 2 loại là IFS 1 có thể chuyển đổi liquiritigenin thành daidzein và enzyme IFS thứ hai (IFS2) chuyển đổi đồng thời

cả naringenin thành genistein và liquiritigenin thành daidzein [14]

1.3.2 Con đường sinh tổng hợp isoflavone

Isoflavone được tổng hợp từ một nhánh của con đường trao đổi chất phenylpropanoid Tiền thân của con đường là một axit amin L-phenylalanine,

mà bước khởi đầu là loại bỏ đi nhóm amin để tạo ra axit cinnamic qua các phenylalaninen ammonia lyase (PAL) Trong phản ứng thứ hai và thứ ba, cinnamate 4-hydroxylase (C4H) và 4 coumarate CoA ligase (4CL) chuyển đổi

thành axit cinnamic p-coumaryol CoA Các enzyme quan trọng đầu tiên để tổng

hợp flavonoid là chalcone synthase (CHS) và isomerase chalcone (CHI), trong

đó chuyển đổi chalcone thành flavone và chalcone reductase (CHR) là cần thiết cho sự hình thành daidzein và glyceollins Sau đó, isoflavone synthase tham gia

xúc tác cho con đường sinh tổng hợp isoflavone Đây là enzyme đầu tiên

chuyển đổi isoflavone và các sản phẩm isoflavone trong con đường sinh tổng hợp isoflavone [17], [30] Isoflavone synthase đóng một vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp isoflavone [14] IFS1 là một enzyme xúc tác đặc biệt vì nó

có ít nhất hai phản ứng với một protein; phản ứng thủy phân và phản ứng dịch chuyển aryl nội phân tử

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hơ ̣p isoflavone (Phản ứng xúc tác bởi enzym IFS màu xanh dương) [14]

1.3.3 Isoflavone synthase va ̀ gen mã hóa IFS

Enzyme isoflavone synthase (IFS) là một trong hai enzym chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp isoflavone ở cây đậu tương [40] Ở cây đậu tương , gen

IFS đã được phân lập gồm 2 gen IFS1 và IFS2 cùng mã hóa cho một sản phẩm có

521 amino acid [11] Enzyme IFS1 có thể chuyển đổi liquiritigenin thành daidzein

và enzyme IFS 2 chuyển đổi đồng thời cả naringenin thành genistein và

liquiritigenin thành daidzein và enzyme IFS 2 có ưu thế hơn enzym IFS1 [43]

Genistein (4 ', 5,7-dihydroxyisoflavone) là một tiền chất phổ biến trong sinh tổng hợp kháng sinh và phytoalexin phytoanticipins trong các loại đậu, và một thành phần dinh dưỡng quan trọng tìm thấy trong hạt đậu tương Genistein là một

phytoestrogen có nhiều tác dụng dược lý trong các tế bào động vật, bao gồm ức chế tyrosine kinase, một loạt cáclợi ích với tiềm năng về sức khỏe Chúng bao gồm chemoprevention vú và ung thư tuyến tiền liệt, bệnh tim mạch và các bệnh hậu mãn kinh Genistein có thể được tổng hợp thông qua các con đường deoxybenzoin hoặc chalcone Genistein được tổng hợp trong thực vật từ naringenin flavanone bởi một phản ứng chuyển vòng xúc tác bởi cytochrome P450 enzyme isoflavone synthase (IFS) [12]

Isoflavone synthase và cinnamate 4-hydroxylase (C4H) đã được xác định

là cùng với enzyme P450 được trong ER, tương tác với các enzyme hòa tan của phenylpropanoid và đường isoflavonoid (C4H, CHS, CHR và CHI)

Gen IFS được biết đến thuộc phân họ CYP93C của cytochrome P450 Gen

IFS có kích thước 1556 bp mã hóa cho một polypeptide 521 amino acid được biểu hiện ở các bộ phận của cây mặc dù mức độ biểu hiện là khác nhau Trong

Ngân hàng Gen quốc tế (GenBank), gen IFS đã được Jung và cs công bố năm

2015 với mã số trên trang NCBI là NM_001249093 [18] Phân lập gen IFS đã được thực hiện trên nhiều đối tượng thực vật như cây Psoralea corylifolia, cây lúa, cỏ ba lá Trifolium pratense, đậu tương, đậu xanh (AF195807), củ cải đường (AF195816, AF195817)…[18], [25], [28], [37] Thông tin về gen IFS1 của đậu

tương trên NCBI cho thấy gen nằm trên NST số 7 Số lượng nucleotide của gen là

1625 bp, từ vị trí số 1 đến vị trí 1625, mã hóa cho 521 acid amin [48] Trong

nghiên cứu phân lập gen IFS1 từ cỏ ba lá (Trifolium pratense) của Bong Gyu Kim

và cs đã cho thấy gen IFS1 của cỏ ba lá có chiều dài 1575 bp, mã hóa cho 525

amino acid [10]

Để sản xuất genistein trong gạo , các nhà khoa học Hàn Quốc đã chuyển gen

IFS phân lâ ̣p từ đậu tương vào cây lúa Gen IFS1 và IFS2 được phân lâ ̣p từ giống

đậu tương Hàn Quốc Sinpaldalkong II, giống đâ ̣u tương có hàm lượng genistein cao hơn so với các giống đậu tương khác Vector biểu hiện được thiết kế chứa gen

IFS1 hoặc IFS2 dưới sự kiểm soát của promoter điều khiển biểu hiện trong hạt

gạo Qua phân tích bằng Southern blot trên 8 cây lúa chuyển gen kết quả cho thấy

rằng các thế hệ T 0 có 1 đến 3 bản sao của gen IFS 1 hoặc IFS2 Và kết quả phân tích hàm lượng isoflavone trong các dòng lúa chuyển gen cho thấy mức độ biểu hiê ̣n cao hơn khoảng 30 lần so với hàm lượng genistein của IFS biểu hiện trong cánh hoa thuốc lá chuyển gen , bằng khoảng 12% của tổng hàm lượng genistein ở

giống đâ ̣u tươngSinpaldalkong II [35]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BI ̣ VÀ ĐI ̣A ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu

Sử dụng 3 giống đậu tương ĐT26, ĐT90, ĐT84, trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam làm vật liệu nghiên cứu Giống đậu tương ĐT 26 do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ , Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam cung cấp , hai giống ĐT90, ĐT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp

Giống đậu tương ĐT 26 được chọn tạo bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam tổ hợp lai ĐT 2000 x ĐT 12 từ năm 2002 và được công nhận giống sản xuất thử năm 2008 Giống đậu tương ĐT26 có hoa màu trắng, hạt vàng rốn nâu đậm, quả chín có màu nâu Giống đậu tương mới ĐT26 có thời gian sinh trưởng trung bình từ 90-95 ngày, chiều cao cây từ 50-60cm, phân cành khá 2,0-2,5 Tỷ lệ quả 3 hạt cao trung bình 18-22% Năng suất đạt trung bình ở độ ẩm 12%

là 22-28 tạ/ha thuộc vào mùa vụ và điều kiện thâm canh Trong điều kiện thâm canh cao, ở diện tích hẹp, năng suất có thể đạt tới 30-32 tạ/ha Hạt màu vàng đẹp, hàm lượng protêin cao (42,21%) và lipit 19,72% Giống ĐT26 có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu và khả năng chịu ruồi đục thân, chống đổ khá Giống ĐT26 thích hợp nhất trong vụ đông và vụ xuân và có thể nhân hạt ở vụ hè

Giống đâ ̣u tương ĐT90 do Viê ̣n Di truyền nông nghiê ̣p cho ̣n ta ̣o bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp với đột biến thực nghiệm sử dụng tia gamma

Co60, 18 Krad ở dòng lai F2 (K7002 x Co ̣c chùm) đươ ̣c công nhâ ̣n và khu vực hóa năm 1994 Giống ĐT 90 có hoa trắng, lá hình tim nhọn , màu xanh sáng , lông nâu, cây cao 45-50 cm, thân có 10-11 đốt, phân cành vừa phải , cây go ̣n phù hợp với trồng thuần và trồng xen Quả chín màu xanh xám , số quả chắc tà 22-35, tỷ lệ quả

3 hạt từ 15020% Giống ĐT 90 có khả năng chống đổ , chống các bê ̣nh gỉ sắt, sương mai, đốm nâu vi khuẩn , lở cổ rễ Chịu nhiệt và lạnh khá Hạt vàng sáng, rốn

hạt trắng, hạt to, khối lươ ̣ng 1000 hạt từ 180-270g Tỷ lệ protein từ 41,6-47,5%, lipid khoảng 18,4%

Giống đậu tương ĐT84 do Viện di truyền nông nghiệp tạo ra từ tổ hợp lai 80/ĐH4 bằng phương pháp lai hữu tính kết hợp gây đột biến bằng tác nhân gamma

ĐT-Co60 kral trên dòng lai F3-D333 Giống ĐT84 là giống đậu tương hiện nay đang được trồng phổ biến ở nhiều nơi vì có khả năng cho năng suất cao và chống đổ tốt, nhiễm bệnh ở mức độ nhẹ đến trung bình với 1 số bệnh hại chính Màu sắc hạt vàng, hạt tròn, to đẹp Thời gian sinh trưởng, vụ Xuân 115-120 ngày, vụ Thu 90-95 ngày,

vụ Đông 110-115 ngày, cao thân chính 50-60 cm, cứng cây, bộ lá gọn có màu xanh đậm, có hoa màu tím, vỏ quả màu vàng, hạt to, màu vàng, rốn hạt màu nâu nhạt

Năng suất trung bình đạt 15-25tạ/ha, thâm canh cao đạt 30 tạ/ha

Vector tách dòng pBT do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp

Các hóa chất dùng trong xác định hàm lượng isoflavone trong các giống đậu tương: các chất chuẩn: Genistein, Daidzein, Acetonitril, Methanol, Natri

format acid formic (HPLC); Tetrahydrofuran (HPLC); HCl (HPLC); nước cất

(HPLC) và các hoá chất khác được mua của hãng Invitrogen, Fermatas, Merck

Các loại hóa chất khác như cồn tuyệt đối, sorbitol, chloroform của Việt

Nam, Trung Quốc sản xuất

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm : máy lắc ổn nhiệt , máy li tâm la ̣nh, máy khuấy trộn Vortex, máy đo pH, Máy PCR, máy sắc ký lỏng, thiết bi ̣ giải trình tự nucleotide , máy quang phổ, máy cất nước, bể ổn nhiệt, máy chụp ảnh gel, tủ an toàn sinh học, Cân phân tích 10-4g, pipetman các loại, bộ điện di DNA,

tủ lạnh -20oC, tủ lạnh -84oC, tủ ấm

2.1.4 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm phân lâ ̣p gen được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công

nghê ̣ gen, Khoa Sinh ho ̣c , Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Giải

trình tự nucleotide của gen GmIFS1 đươ ̣c thực hiê ̣n ta ̣i Phòng thí nghiê ̣m Trọng

điểm công nghê ̣ gen , Viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c Thí nghiệm phân tích hàm lượng isoflavone thực hiê ̣n ta ̣i Phòng Công nghệ Thực phẩm - Viện Kiểm nghiệm và vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia Hà Nội, Bộ y tế

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân ti ́ch hàm lượng isoflavone trong các mẫu đậu tương ĐT26, DT90, DT84

Hạt đậu tương nảy mầm 3 ngày tuổi được sử dụng làm nguyên liệu để chiết rút

daidzein và genistein Đi ̣nh lươ ̣ng daidzein và genistein theo phương pháp HPLC

Nguyên lý: Dịch chiết chứa daidzein và genistein được chiết từ mầm đậu tương

sử dụng dung môi thích hợp Dịch chiết thu được sau đó được loại tạp, làm sạch mẫu

qua hệ thống SPE Dịch thu được sau đó được phân tích trên hệ thống HPLC

Phương phá p phân tích đi ̣nh lượng daidzein và genistein được thực hiê ̣n

theo phương pháp AOAC Official 2006.07 và theo Hao Chen và cs (2001) [15]

Cân chính xác khoảng 1-2g mẫu đã được ủ cho nảy mầm 3 ngày tuổi cho vào ống ly tâm 50ml có nắp kín, thêm 35 ml dung dịch chiết mẫu, đậy kín nắp, lắc đều Thủy phân trong 2 giờ tại nhiệt độ 800C, sau đó để nguội và ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, gạn lấy phần dịch trong phía trên Thêm 10 ml dịch chiết

vào phần cặn, lắc đều trong 1 phút rồi đem ly tâm, gộp phần dịch trong cho vào bình định mức 50ml, định mức bằng acetonitril Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45

µm, phân tích trên HPLC

HPLC là kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột

được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [15]

Điều kiện sắc ký:

Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm)

Nhiệt độ cột: 400C, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 50µl

Detector PDA quét phổ từ 200-400nm, định lượng ở bước sóng 260nm Pha động: gradient giữa methanol và dung dịch đệm format

2.2.2 Phương pháp tách chiết mRNA tổng số

Ngâm ủ hạt đậu tương cho nảy mầm , sau 3 ngày tuổi sử dụng mầm để tách RNA tổng số Sử dụng bộ Kit Trizol Reagents của hãng Invitrogen để tách chiết RNA tổng số trong điều kiê ̣n vô trùng Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều được khử DEPC 0,01% Thí nghiệm được tiến hành theo chỉ dẫn của nhà sản xuất gồm các bước như sau: (1) Nghiền nhanh mẫu trong nitơ lỏng bằng chày cối đã khử trùng (2) Bổ sung 1ml TRIzol reagents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút (3) Bổ sung 500µl chloroform:isoamyl (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ phòng 5 phút (4) Ly tâm 12000v/p trong 15 phút ở 4oC (6) Lấy 500µl dịch nổi sang eppendolf mới loại 1,5ml (7) Bổ sung 300µl (isopropanol) + 50µl CH3COONa (3M) đảo nhẹ để 15 phút (8) Ly tâm 12000vòng/phút trong

15 phút ở 4 oC (9) Loại bỏ dịch nổi, thu tủa (10) Rửa RNA bằng cồn 70% (đã pha trong DEPC 0,01%) (11) Ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút Lăp lại 2

lần (12)Làm khô 15 - 20 phút trong box