Nghiên cứu đa dạng di truyền và đặc điểm hệ enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc gây thối quả cà chua, đu đủ, thanh long sau thu hoạch

Nấm mốc là nguyên nhân chủ yếu gây thiệt hại nghiêm trọng đối với hoa quả sau thu hoạch, với giả thiết mức độ gây thối có liên quan tới hoạt động hệ enzyme ngoại bào của nấm mốc, tôi đã tiến hành đề tài “ Nghiên cứu đa dạng di truyền và đặc điểm hệ enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc gây thối quả cà chua, đu đủ, thanh long sau thu hoạch”.Những công việc chính trong đề tài bao gồm phân lập các chủng nấm từ ba loại quả cà chua, đu đủ, thanh long thối hỏng, thử lây nhiêm nhân tạo đánh giá mức độ gây thối trên ba loại quả cà chua, đu đủ, thanh long. Định danh các chủng nấm mốc phân lập được dựa vào đặc điểm hình thái và phương pháp sinh học phân tử, khảo sát đặc điểm của hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc.Trong phạm vi đề tài, từ 14 mẫu quả bị thối hỏng, 25 chủng nấm mốc đã được phân lập. Kết quả định danh dựa trên các đặc điểm hình thái và giải trịnh tự cho thấy các chủng nấm mốc thuộc các chi: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Collectitrichum, Rhizopus, Phoma, Cladosporium, Acremonium, Mucor, Lasiodiplodia. Đồng thời, kết quả lây nhiễm ngược của các chủng nấm mốc với quả đu đủ và cà chua, thanh long cho thấy, tất cả các chủng nấm mốc phân lập được đều gây thối quả đu đủ và cà chua, thanh long không bị bệnh với mức độ gây thối khác nhau. Kết quả có chín chủng gây bệnh mạnh trên ba loại quả đu đủ, thanh long và cà chua thuộc chi Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Mucor.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

đu đủ, thanh long sau thu hoạch”

Sinh viên thực hiện : Dương Thị Thiện

Giảng viên hướng dẫn : TS Đặng Xuân Nghiêm

“Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội là một phần yêu

cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học”.

HÀ NỘI - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của tôi với sự giúp đỡ tậntình của thầy giáo hướng dẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong khóa luận là trungthực, chưa từng được sử dụng Các thông tin, trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc và tôixin chịu trách nhiệm về những số liệu trong bài khóa luận này

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Sinh viên

Dương Thị Thiện

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Xuân Nghiêm đãtận tình hướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Văn Giang và các thầy cô đã tạo mọiđiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại Bộ môn Công nghệ visinh

Tôi xin cảm ơn KS Đỗ Hải Quỳnh, KS Nguyễn Khắc Hải , KS Nguyễn ThuHương đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực tập

Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Phòng, Ban của khoa Côngnghệ sinh học và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợicho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp

Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơntới Bố, Mẹ, Ông, Bà và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên và tạo độnglực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

TÔI XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN!

Sinh viên

Dương Thị Thiện

PCR : Polymerase chain reaction

PDA : Potato dextrose agar

ppm : Parts per million (w/v)

Sbi : Sodium Bisulphite

TS : Tiến sĩ

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH viii

TÓM TẮT viii

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khái quát về nấm mốc hại quả 3

2.2 Nấm mốc trên ba loại quả 3

2.2.1 Nấm mốc hại quả cà chua 3

2.2.2 Nấm mốc hại quả đu đủ 5

2.2.3 Nấm mốc hại quả thanh long 7

2.3.Đặc điểm hệ enzyme ngoại bào nấm mốc 8

2.3.1 Các loại enzyme chính có trong nấm mốc 8

2.3.2 Mối tương quan giữa hoạt động của hệ enzyme ngoại bào và khả năng gây thối 10 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12

3.1 Vật liệu 12

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

3.1.2 Hóa chất và môi trường 12

3.1.3 Máy móc thiết bị 13

3.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Phân lập và lây nhiễm nhân tạo 14

3.2.1.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 15

3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm mốc bằng phương pháp giải trình tự vùng ITS - rDNA 16

3.2.4 Phương pháp tách chiết enzyme ngoại bào nấm mốc 17

3.2.5 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 18

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Phân lập 20

4.2 Lây nhiễm nhân tạo 20

4.2.1 Trên đu đủ 21

4.2.2 Trên cà chua 22

4.2.3 Trên thanh long 24

4.3 Định danh bằng phương pháp quan sát quan sát đặc tính hình thái và giải trình tự vùng ITS – rDNA của các chủng nấm mốc 27

4.3.1 Định danh bằng quan sát đặc tính hình thái các chủng nấm mốc 27

4.3.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 29

Cây phát sinh chủng loại của chủng TH17 cho thấy chủng này có hệ số tin cậy với giá trị Bootstrap lần lượt là 37 và 54 với 2 loài Fusarium verticillioides và Fusarium oxysporum Đối chiếu với đặc điểm hình thái của chủng TH17 có thể kết luận được chủng TH17 thuộc loài Fusarium verticillioides 32

4.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme 32

4.4.1 Ảnh hưởng của pH 32

4.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 37

4.5 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm mốc trên môi trường bổ sung hóa chất chống nấm 41 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Tài liệu Tiếng Việt 45

Tài liệu Tiếng Anh 45

DANH MỤC CÁC BẢNG

LỜI CAM ĐOAN i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH viii

TÓM TẮT viii

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khái quát về nấm mốc hại quả 3

2.2 Nấm mốc trên ba loại quả 3

2.2.1 Nấm mốc hại quả cà chua 3

2.2.2 Nấm mốc hại quả đu đủ 5

2.2.3 Nấm mốc hại quả thanh long 7

2.3.Đặc điểm hệ enzyme ngoại bào nấm mốc 8

2.3.1 Các loại enzyme chính có trong nấm mốc 8

2.3.2 Mối tương quan giữa hoạt động của hệ enzyme ngoại bào và khả năng gây thối 10 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 12

3.1 Vật liệu 12

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 12

3.1.2 Hóa chất và môi trường 12

3.1.3 Máy móc thiết bị 13

3.2 Phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Phân lập và lây nhiễm nhân tạo 14

3.2.1.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo 15

3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm mốc bằng phương pháp giải trình tự vùng ITS - rDNA 16

3.2.4 Phương pháp tách chiết enzyme ngoại bào nấm mốc 17

3.2.5 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch 18

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4.1 Phân lập 20

4.2 Lây nhiễm nhân tạo 20

4.2.1 Trên đu đủ 21

4.2.2 Trên cà chua 22

4.2.3 Trên thanh long 24

4.3 Định danh bằng phương pháp quan sát quan sát đặc tính hình thái và giải trình tự vùng ITS – rDNA của các chủng nấm mốc 27

4.3.1 Định danh bằng quan sát đặc tính hình thái các chủng nấm mốc 27

4.3.2 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 29

Cây phát sinh chủng loại của chủng TH17 cho thấy chủng này có hệ số tin cậy với giá trị Bootstrap lần lượt là 37 và 54 với 2 loài Fusarium verticillioides và Fusarium oxysporum Đối chiếu với đặc điểm hình thái của chủng TH17 có thể kết luận được chủng TH17 thuộc loài Fusarium verticillioides 32

4.4 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme 32

4.4.1 Ảnh hưởng của pH 32

4.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 37

4.5 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm mốc trên môi trường bổ sung hóa chất chống nấm 41 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Tài liệu Tiếng Việt 45

Tài liệu Tiếng Anh 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Vị trí gắn mồi ITS1 và ITS4 trên cụm gene rDNA 17

Hình 4.1: Nấm mốc TH25 gây thối trên 3 miếng đu đủ: (a) xanh, (b) ương, (c) chín 22

Hình 4.2: Nấm mốc TH17 gây thối trên 3 miếng đu đủ: (a) xanh, (b) ương, (c) chín 22

Hình 4.3: Nấm mốc TH12 gây thối trên quả cà chua: (a) ương, (b) chín 24

Hình 4.4: Nấm mốc TH25 gây thối trên quả cà chua: (a) ương, (b) chín 24

Hình 4.5: Nấm mốc TH3 gây thối trên quả cà chua: (a) ương, (b) chín 24

Hình 4.6 Nấm mốc TH3 gây thối trên quả thanh long tại 3 vị trí: (a) đầu, (b) giữa, (c) cuối 27

Hình 4.7 Nấm mốc TH23 gây thối trên quả thanh long tại 3 vị trí: (a) đầu, (b) giữa, (c) cuối27 Hình 4.8 Cây phát sinh chủng loại chủng TH9( số ở gốc nhánh là giá trị bootstrap) 31

Hình 4.9 Cây phát sinh chủng loại chủng TH17 (số ở gốc nhánh là giá trị bootstrap) 32

Hình 4.10 Hoạt tính amylase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau 33

Hình 4.11 Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau 34

Hình 4.12 Hoạt tính lipase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau 35

Hình 4.13 Hoạt tính pectinase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau 36

Hình 4.14.Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các pH khác nhau 37

Hình 4.15 Hoạt tính amylase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các nhiệt độ khác nhau 38

Hình 4.16 Hoạt tính cellulase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các nhiệt độ khác nhau 38

Hình 4.17 Hoạt tính lipase ngoại bào ở các nhiệt độ khác nhau 39

Hình 4.18 Hoạt tính pectinase ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các nhiệt độ khác nhau 40 Hình 4.19 Hoạt tính protease ngoại bào của các chủng nấm mốc ở các nhiệt độ khác nhau 40

Hình 4.20 khả năng phát triển của nấm mốc trên các loại môi trường 43

TÓM TẮT

Nấm mốc là nguyên nhân chủ yếu gây thiệt hại nghiêm trọng đối với hoa quả sau thu hoạch, với giả thiết mức độ gây thối có liên quan tới hoạt động hệ enzyme

ngoại bào của nấm mốc, tôi đã tiến hành đề tài “ Nghiên cứu đa dạng di truyền và đặc điểm hệ enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc gây thối quả cà chua, đu đủ, thanh long sau thu hoạch”.

Những công việc chính trong đề tài bao gồm phân lập các chủng nấm từ ba loại quả cà chua, đu đủ, thanh long thối hỏng, thử lây nhiêm nhân tạo đánh giá mức độ gây

thối trên ba loại quả cà chua, đu đủ, thanh long Định danh các chủng nấm mốc phânlập được dựa vào đặc điểm hình thái và phương pháp sinh học phân tử, khảo sát đặcđiểm của hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc.

Trong phạm vi đề tài, từ 14 mẫu quả bị thối hỏng, 25 chủng nấm mốc đã được phânlập Kết quả định danh dựa trên các đặc điểm hình thái và giải trịnh tự cho thấy các chủng

nấm mốc thuộc các chi: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Collectitrichum, Rhizopus, Phoma, Cladosporium, Acremonium, Mucor, Lasiodiplodia Đồng thời, kết quả lây nhiễm

ngược của các chủng nấm mốc với quả đu đủ và cà chua, thanh long cho thấy, tất cả cácchủng nấm mốc phân lập được đều gây thối quả đu đủ và cà chua, thanh long không bịbệnh với mức độ gây thối khác nhau Kết quả có chín chủng gây bệnh mạnh trên ba loại quả

đu đủ, thanh long và cà chua thuộc chi Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Mucor.

Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc cho thấy21/25 chủng nấm mốc có hoạt tính pectinase; 17/25 chủng có hoạt tính cellulase vàlipase; 16/25 chủng có hoạt tính protease; 15/25 chủng có hoạt tính amylase ChủngTH9 gây thối mạnh trên cả quả đu đủ ương và chín có hoạt tính cellulase, pectinase,amylase và lipase mạnh Các chủng TH3, TH20, TH23, TH25 gây thối mạnh trên cả 3loại quả nhưng không có hoạt tính cellulose và hoạt tính pectinase, amylase, lipase,protease đều yếu

PHẦN I MỞ ĐẦU

Các sản phẩm rau quả của nước ta không chỉ phục vụ nhu cầu tiêu dùng trong nước màcòn là mặt hàng xuất khẩu được nhiều nước ưa chuộng Hàng năm nước ta thu về hàng trămtriệu USD từ việc xuất khẩu rau quả Tuy nhiên, việc xuất khẩu vẫn có nhiều hạn chế, mànguyên nhân chủ yếu là do tình trạng hư hỏng của rau quả sau khi thu hoạch còn rất cao, theothống kê của Cục Chế biến, Thương mại Nông - lâm - Thủy sản và Nghề muối (Bộ Nôngnghiệp và PTNT), tổn thất sau thu hoạch đối với các loại quả lên tới 25%

Các loại quả sau thu hoạch có thể bị nhiều tác nhân gây bệnh xâm hại đặc biệt lànấm mốc Chất lượng của các loại trái cây phụ thuộc vào chất lượng và hàm lượng củacác loại đường, vitamin, acid amin, acid hữu cơ và một số chất thiết yếu khác trongchúng Trong khi đó, các loại nấm hại làm hỏng, biến dạng, gây thối quả làm giảm đáng

kể chất lượng quả sau khi thu hoạch (Rathod và cs, 2012; Awoite và cs, 2013) Vì vậy việcnghiên cứu các loại nấm hại sau thu hoạch rất cần thiết để làm tiền đề cho nghiên cứu cácbiện pháp xử lý, bảo quản hiệu quả

Cà chua, đu đủ, thanh long là những loại quả phổ biến, dễ trồng, cho năng suấtcao và giá trị kinh tế lớn, ngoài ra chúng còn là những thực phẩm quan trọng nên xuấthiện trong khẩu phần ăn hàng ngày nhằm bổ sung chất dinh dưỡng và các loại vitamincần thiết cho cơ thể con người Nhưng các loại quả này lại rất dễ bị hư hỏng do nấmmốc trong quá trình vận chuyển và bảo quản

Sự phát triển của bệnh sau thu hoạch trên quả phụ thuộc vào khả năng tiếtenzyme thủy phân các polymer pectic không hòa tan và các thành phần khác của nấmmốc để dẫn đến mất liên kết mô và tế bào Các tế bào của các mô sẽ bị tăng tính thấm

và chết, cho phép các chất chuyển hóa của quả khuếch tán ra bên ngoài, cung cấp dinhdưỡng cho nấm mốc sinh trưởng và phát triển Như vậy khả năng gây thối của các loạinấm mốc có thể có liên quan đến hoạt động của hệ enzyme ngoại bào

Xuất phát từ các lý do trên tôi đã lựa chọn đề tài:“Nghiên cứu đa dạng di

truyền và đặc điểm hệ enzyme ngoại bào các chủng nấm mốc gây thối quả cà chua, đu đủ, thanh long sau thu hoạch” nhằm tìm ra mối tương quan giữa hoạt động

của hệ enzyme ngoại bào của nấm mốc và khả năng gây thối quả của chúng

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

- Phân lập được các chủng nấm mốc từ các mẫu quả cà chua, đu đủ, thanh longthối hỏng, đánh giá được khả năng gây thối quả của các chủng nấm mốc

- Sơ bộ định danh được các chủng nấm mốc

- Khảo sát được hoạt tính của hệ hoạt tính enzyme ngoại bào

- Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các chủng nấm gây thối quả dựa vào đặcđiểm hình thái, hóa sinh học và giải trình tự đoạn ITS trong vùng gene mã hóa chorRNA của nấm mốc

- Nghiên cứu đa dạng của các chủng bằng hình thái và giải trình tự ITS

- Nghiên cứu đặc điểm hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm mốc

- Phân tích kết quả để tìm ra mối liên hệ giữa hoạt tính của hệ enzyme và khảnăng gây thối quả

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát về nấm mốc hại quả

Thiệt hại sau thu hoạch của hoa quả có thể rất lớn, chiếm tới 25% tổng sảnlượng ở các nước công nghiệp hóa và trên 50% ở các nước đang phát triển nơi

mà các điều kiện bảo quản và xử lý sau thu hoạch không được tối ưu Đối vớicác loại quả, phần lớn những tổn thất này là do sự tấn công của một vài loại nấmbệnh gây ra Nguyên nhân do quả có nhiều dinh dưỡng, nước, pH thấp và hơnnữa do sau khi thu hoạch quả mất đi hầu hết các cơ chế bảo vệ từ cây (Droby và

cs, 1992) Khác với các tác nhân gây bệnh tấn công trên đồng ruộng, hầu hết cáctác nhân gây bệnh sau thu hoạch không thể tấn công trực tiếp qua lớp cutin củaquả mà thường thông qua các tổn thương trên quả, xuất hiện trong quá trình thuhái, vận chuyển, đóng gói và lưu trữ (Barkai, 2001) Các nấm bệnh hại sau thu

hoạch quan trọng nhất bao gồm một số loài thuộc chi Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Geotrichum, Gloeosporium, Mucor, Monilinia Penicillium, Rhizopus và các chi khác (Barkai, 2001).

2.2 Nấm mốc trên ba loại quả

2.2.1 Nấm mốc hại quả cà chua

Cà chua (Solanum lycopersicum) là loại rau ăn quả rất được ưa thích vì

phẩm chất ngon và có nhiều cách chế biến Cà chua được trồng trên toàn Thếgiới do có khả năng sinh trưởng trong nhiều điều kiện khác nhau Hơn nữa trong

cà chua còn chứa nhiều chất dinh dưỡng, các chất khoáng vi lượng và cácvitamin có lợi đối với sức khỏe ( Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng trong 100 g cà chua

(Nguồn: Asian Vegetable Research and Development Center, 1972)

Quả cà chua bị tấn công bởi nhiều tác nhân gây bệnh, chủ yếu là donấm (Taskeen-un-Nisa và cs, 2011) Theo nghiên cứu của Sharma (1994) sản lượng cà

chua sau thu hoạch bị thối do nấm là 0,5-19,7% và trong đó 81,3% là do nấm Fusarium equisetica, Fusarium pallidoroseum, Geotrichum candidum, Didymellaly copersici, Alternaria alternata và Phytophthora nicotianae var parasitica Một nghiên cứu khác của Mallek và cs (1995) chỉ ra rằng Alternaria alternata, Rhizopus stolonifer và Aspergillus niger là những tác nhân gây bệnh phổ biến nhất và gây thiệt hại lần lượt là

52,7%, 35,9% và 25% sản lượng cà chua sau thu hoạch ở Ai Cập Ngoài ra 91,8% thiệt

hại do thối Phytophthora ( do nấm Phytophthorainfestans) và 30-70% vào bệnh thán thư

do Collectotrichum coccodes cũng được ghi nhận tại Mỹ bởi Byrne và cs (1997).

Bệnh đốm vòng (do nấm Alternaria solani và Alternaria tenuis) vết bệnh xuất

hiện đầu tiên ở cuống hoặc tai quả, hình tròn, màu nâu sẫm, hơi lõm xuống, cũng hình

thành những đường vòng đồng tâm màu đen, quả dễ rụng Thối Alternaria đã được

xem như là bệnh phổ biến nhất trên quả cà chua và là nguyên nhân gây tổn thất nặng

nề về chất lượng của các loại trái cây (Douglas, 1922) Alternaria là nguyên nhân

chính gây ra những vết thối đen trên quả cà chua sau thu hoạch (Thomas, 1944)

Bệnh mốc sương (do nấm Phytophthora Infestans, Phytophthora nicotianae

var parasitica) vết bệnh thường xuất hiện ở phía trên của quả từ khi còn xanh với

những đốm màu xanh xám, ướt, sau vết bệnh lớn dần, chuyển màu nâu sẫm, hơi lõm,ủng và nhăn nheo có rìa phân cách rõ rệt, bên trong quả bị thối nhũn (Mills,1940).

Bệnh thán thư (do nấm Colletotricum coccodes, Colletotricum sp.) vết bệnh

tròn nhỏ, hơi ướt và lõm xuống Trong điều kiện ẩm ướt,vết bệnh lan rộng nhanh làm

thối cả quả Bệnh phát sinh trên đồng ruộng và làm thối quả khi bảo quản (Illman và

cs, 1959; Stevenson, 1991)

Ngoài ra, quả cà chua sau thu hoạch còn bị thối hỏng do một số chủng nấm mốc

Phoma destructiva, Fusariumspp (Ali và cs, 2005; Iqbal và cs, 2003; Jones, 1991; Patel và cs, 2005), thối mốc xanh do Penicillium spp (Kwon và cs, 2008)

2.2.2 Nấm mốc hại quả đu đủ

Đu đủ (Carica papaya) là cây ăn quả ngắn ngày, sớm cho thu hoạch, đạt sản

lượng cao, chiếm ít diện tích, thích hợp với nhiều loại đất, có thể trồng xen với các câytrồng khác Quả đu đủ được sử dụng với nhiều mục đích như sử dụng trực tiếp, làmrau, chế biến, làm thức ăn chăn nuôi Quả đu đủ chín có giá trị dinh dưỡng cao, đượcthị trường các nước châu Âu, châu Mỹ, Nhật Bản rất ưa chuộng Quả đu đủ xanh chứakhoảng 60 - 70% các chất dinh dưỡng so với quả chín Chúng rất được coi trọng ởvùng ít có điều kiện sản xuất rau (Trần Thế Tục và Đoàn Thế Lữ, 2002).Tuy nhiên,việc bảo quản sau thu hoạch của đu đủ gặp nhiều khó khăn Đu đủ thành phẩm thường

bị các loài nấm mốc tấn công làm giảm phẩm chất và giá trị dinh dưỡng

Bênh thán thư (do loài nấm Colletotrichum gloeosporioides) Quá trình xâm

nhiễm thường xảy ra rất sớm, từ những giai đoạn đầu tiên trong quá trình phát triểncủa quả, tuy nhiên chúng thường tồn tại ở trạng thái ủ bệnh cho đến khi quả chín Nấm

có thể xâm nhập trực tiếp vào quả bằng vòi xâm nhập (Dickman và Alvarez,1983)

Khi những quả bị nhiễm nấm chín, chúng tiết ra những hạt nhựa mủ trên bềmặt, có hình giọt nước Khi quá trình xâm nhiễm phát triển, có một vết lõm hình tròn

có rìa màu nâu sáng Xuất hiện các sợi bào tử và bào tử ở giữa vết tổn thương có màucam sáng hoặc màu hồng Các mô ở phần thịt quả tại chỗ vết thương cứng và có màuxám trắng sau hóa nâu Một lớp callose tại các tế bào nhu mô cho phép vùng tổnthương nổi lên trên bề mặt của quả (Stanghellini và Aragaki, 1966)

Bệnh thối khô gây ra bởi nấm Mycosphaerella sp Loại nấm này không có khả

năng tiết ra các loại enzyme để xâm nhập qua lớp vỏ cutin của quả, do đó, sự xâm

nhiễm của chúng có liên quan đến các vết thương cơ giới Các vết nhăn trên bề mặtquả là những triệu chứng ban đầu và các vết thương màu nâu có mép mờ xuất hiệntiếp sau Một lớp mô cứng ở phía dưới vị trí xâm nhiễm, phân tách phần nhu mô màutối với lớp biểu bì của quả đu đủ (Hine và cs, 1965; Hunter và Buddenhagen, 1972).

Bệnh thối ướt do nấm Phomopsis sp thường hiếm khi xuất hiện nhưng gây hại

trên diện tích lớn Toàn bộ vết bệnh trở nên mềm và trong Các túi bào tử có thể xuấthiện ở giữa vết bệnh Bệnh phát triển nhanh chóng từ bề mặt vào bên trong quả và các

mô bệnh có thể nổi lên so với các vùng khác (Hunter và Buddenhagen, 1972)

Bệnh thối Alternaria có các triệu chứng bao gồm các vết bệnh tròn hoặc hình

oval màu đen và sau đó mọc lên các sợi sinh bào tử của nấm Alternaria alternata trên

toàn bộ vết bệnh Vết thương thường phân tách trên bề mặt của quả và không gây nênnhững vết thối nghiêm trọng ở phần thịt quả Việc bảo quản lạnh trong quá trình vậnchuyển là nguyên nhân khiến bệnh phát triển mạnh hơn và các triệu chứng thường ítxuất hiện ở các quả không được bảo quản lạnh (Alvarez và cs, 1977)

Bệnh đốm quả với triệu chứng là các vết thương nhỏ, tròn, màu nâu sẫm là do

sự xâm nhiễm của nấm Stemphylium Vết thương sau đó phát triển rộng và có viền

màu nâu đỏ đến tím Lớp bào tử dày, màu xanh đậm phủ lên trên vết bệnh, xuất hiệncác sợi nấm màu trắng đến xám ở trung tâm vết bệnh, bệnh này và thường xuất hiện ởcác quả bị tổn thương do nhiệt hoặc trong quá trình bảo quản lạnh (Chau và Alvarez,1983; Glazener và cs, 1984)

Bệnh thối Fusarium, vết bệnh nhỏ khô, phát triển trên bề mặt quả, sau đó

chuyển dần sang màu trắng do các sợi nấm đan xen chặt tạo thành Tác nhân gây bệnh

được cho là do Fusarium solani Bệnh thường ít gặp trên quả sau khi thu hoạch

(Hunter và Buddenhagen, 1972)

Bệnh đốm Guignardia có liên quan đến các loại nấm thuộc chi Guignardia với

triệu chứng xuất hiện các vết lõm, màu xanh đậm Bệnh này thường được quan sátthấy ở những quả đu đủ được xử lý trong nước nóng 420C trong 40 phút trong quátrình diệt ruồi hại quả Nhưng tỷ lệ nhiễm giảm xuống khi giảm thời gian ngâm trongnước nóng xuống còn 30 phút (Hine và cs, 1965)

Bệnh do nấm Mycosphaerella sp với triệu chứng ban đầu là các vùng trong

mờ xuất hiện quanh cuống Trong những giai đoạn đầu tiên, khi nấm tấn công vào hệmạch, chỉ xuất hiện màu nâu nhạt ở trên cuống Khi sự xâm nhiễm tăng lên, rìa của vếtbệnh ở dạng mờ, trong khi các mô bị nhiễm bệnh trở nên đen, nhăn, khô Sợi nấmtrắng mọc ở phần núm quả (Hunter và Buddenhagen, 1972)

Nấm Botryodiplodia theobromate Có triệu chứng các mô bị nhũn ướt, có mép

rộng, bề mặt xù xì bởi các túi bào tử bị vỡ ra có dạng không bình thường Xuất hiệncác khoang rỗng phần nhu mô ở vùng nhiễm bệnh, sau đó, sợi nấm xuất hiện dày đặc ởcác khoang này Vết cắt dọc theo vùng nhiễm bệnh, các mô bị nhiễm bệnh có màu

xanh đen hơi trong, giống với sự xâm nhiễm do Mycosphaerella Ngược lại, sự xâm nhiễm do Stemphylium lycopersici có đặc tính là nhu mô màu nâu đỏ, trong và mép

giữa mô bệnh và mô lành có màu đỏ sáng đến tím (Hunter và Buddenhagen, 1972)

Bệnh do nấm Rhizopus stolonifer gây ra hiện nay đang là bệnh hại sau thu hoạch

có sự tàn phá mạnh nhất Nấm tấn công vào vị trí tổn thương, và nhanh chóng làm thốitoàn bộ quả, để lại lớp cutin bên ngoài Khi lớp cutin bị chọc thủng, nấm sẽ phát triển cácsợi nấm thô xám và các túi bào tử đen bao bọc quanh quả (Anne và Wayne, 1987)

2.2.3 Nấm mốc hại quả thanh long

Thanh long (Hylocereus undatus) được nhiều nước biết đến như loại trái cây

đặc trưng của Việt Nam, là loại cây nhiệt đới, chịu hạn tốt nên được trồng ở nhữngvùng nóng Theo số liệu thống kê của Viện cây ăn quả Miền Nam (2009), ở Việt Nam,thanh long được trồng ở Tây Nam Bộ với diện tích 9.800 ha và Đồng bằng sông CửuLong 3.991 ha) Thanh long có vị ngọt, mát nên được nhiều người tiêu dùng ưachuộng, được xuất khẩu qua nhiều nước trên thế giới

Cũng như những loại quả khác, quả thanh long sau thu hoạch cũng bị một số loạisâu, bệnh gây hại Các bệnh được ghi nhận trên quả Thanh long như: Bệnh thán thư gây ra

do nấm Collectotrichum gloeosporioide, bệnh thối Fusarium do nấm Fusarium sp., bệnh đốm nâu đen do Ascochyta sp., v.v Trong đó, bệnh thán thư là bệnh nghiêm trọng nhất,

gây nhiều thiệt hại cho cây và sản lượng cả trước và sau thu hoạch

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra, ngoài việc làm

giảm năng suất, bệnh còn làm giảm chất lượng quả nghiêm trọng Vết bệnh là những

đốm tròn hoặc gần tròn, có tâm màu nâu đỏ, lõm xuống, xung quanh có những vòng đồng tâm nâu sậm, sau đó phát triển nhanh thành những mảng thối lõm vào vỏ Bệnh tấn công trên quả sau khi đã thu hoạch làm thối, gây thất thoát rất lớn trong quá trình vận chuyển, bảo quản Nấm bệnh lan truyền trong gió, nước, con người đi lại chăm sóc Điều kiện thời tiết mưa nhiều, ẩm độ, nhiệt độ cao thì bệnh càng dễ phát triển, lây lan nhanh (Masanto và cs, 2009a)

Bệnh đốm trắng hay còn gọi là bệnh tắc kè tác nhân gây bệnh là nấm

Neoscytalidium dimidiatum Lúc đầu triệu chứng trên quả là những đốm tròn nhỏ màu trắng,

vết bệnh trũng thấp so với bề mặt quả, về sau vết bệnh có màu vàng cam và phát triển nhô lênnhững vết ghẻ có màu nâu và đôi khi gây thối nhũn nếu bị bệnh tấn công nặng (He và cs,2012)

Bệnh bồ hóng do nấm Capnodium sp gây ra triệu chứng bồ hóng phát triển tạo

thành một lớp mụi đen (khói đèn) trên quả Trong trường hợp nhiễm bệnh nặng sẽ làm cho vỏ quả bị xù xì và làm giảm giá trị thương phẩm (Lin và cs, 2006)

Bệnh thối nhũn do nấm Rhizopus sp gây ra Bệnh thường xuyên xuất hiện ở

giai đoạn quả non, triệu chứng ban đầu là quả có vết bị thối nhũn, có bọt khí nổi trên bề mặt vết bệnh, bên trên vết bệnh có xuất hiện lớp tơ nấm màu đen và lan rộng rất nhanh chóng làm thối cả quả, có mùi hôi và có dịch nhựa màu nâu vàng chảy ra Ngoài ra, bệnh cũng có thể tấn công và gây thối nhũn đầu quả (Tarnowski và cs, 2010)

2.3.Đặc điểm hệ enzyme ngoại bào nấm mốc

2.3.1 Các loại enzyme chính có trong nấm mốc

Amylases là một nhóm các enzyme sản xuất bởi một số vi sinh vật baogồm nấm (Fadel, 2000) Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinhvật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nộiphân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

R.R’ + H-OH  RH + R’OH

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) vàexoamylase (enzyme ngoại bào) (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2004)

Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide [- CO – NH -]

giữa các loại amino acid trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptide) thành acid

amine và peptide đơn giản khác (Nguyễn Đức Lượng và cs, 2004) Nó có thể đượcphân lập từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và vi sinh vật (nấm và vikhuẩn) Protease là một nhóm enzyme phân giải protein (gồm protease, peptidase,desaminase v.v) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào.

Theo phân loại quốc tế các loại thuộc nhóm này được chia thành 4 phân nhóm phụ:

 Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptide ở đầu nitơ củamạch polypeptide

 Cacboxypeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptide ở đầu cacboncủa mạch peptide

 Dipeptihydrolase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết dipeptide

 Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết

Sự hoạt động của protease phụ thuộc vào các yếu tố sau: nồng độ enzyme, nồng

độ cơ chất, các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa, nhiệt độ, nồng độ muối, pH Ngoài racòn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như: ánh sáng (đặc biệt là tia tử ngoại), sóng siêu

âm, tia bức xạ v.v Do đó nó ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng enzyme

Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc chi

Alternaria, Trichoderma, Aspergillus, Pinicillium v.v Trong đó Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất.

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác Đó là một phức hệgồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanasehay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucosideglucohydrolase (EC 3.2.1.21)

β-1,4-O-Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ

có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàntoàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất

Trong thực tế người ta thường thu nhận enzyme cellulase từ vi sinh vật Các

chủng vi sinh vật thường sử dụng: Nấm mốc (Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,

Aspergillus candidus v.v), xạ khuẩn (Actinomyces griseus, Streptomyces reticuli v.v),

vi khuẩn (Acetobacter xylinum, Bacillus Subtilis, Bacillus pumilis v.v).

2.3.2 Mối tương quan giữa hoạt động của hệ enzyme ngoại bào

và khả năng gây thối

Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được tổng hợp bên trong tếbào sau đó được bài tiết ra bên ngoài nhằm thủy phân các chất thành dạng dễ hấp thụgiúp tế bào sinh trưởng và phát triển (Sinsabaugh, 1994) Khi đã hoàn thành quá trìnhxâm nhập qua bề mặt quả (vỏ) và thiết lập mối quan hệ ký sinh, nấm tiến hành phânhủy cấu trúc tế bào và các hợp chất hữu cơ khó tan thành dễ tan để hấp thụ chất dinhdưỡng cần thiết Để thực hiện quá trình này, nấm mốc tiết vào môi trường các enzymengoại bào Quá trình sản sinh ra enzyme pectinase, cellulase bởi nấm mốc đóng mộtvai trò quan trọng trong việc phân giải pectin, cellulose làm suy yếu các tế bào để tạođiều kiện cho nấm thâm nhập vào mô ký chủ Protease, amylase, lypase là nhữngenzyme phân hủy các hợp chất tương ứng như protein, carbohydrate và chất béo cầnthiết để dinh dưỡng và phát triển (Hà Viết Cường, 2008)

Bất kỳ một loài vi sinh vật nào khi gây bệnh trên thực vật thì đều phải tiết cácenzyme ngoại bào làm phân hủy thành tế bào thực vật (Jonathan, 1994) Tác nhân gâybệnh liên quan đến bệnh lý sau thu hoạch sản xuất một hoặc nhiều pectic enzyme -endopolygalacturonase, endopectin lyase và endopectatelyase (Bateman và Basham,1976) Mặc dù pectic enzyme thủy phân ngẫu nhiên các liên kết glycosidic trong cácpolygalacturonan gây ra nhũn mô (macerate tissue) và làm chết tế bào Các enzymekhác cũng có thể đóng một vai trò trong sự phát triển của bệnh

Mặc dù quá trình thủy phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4 glycosidic trong cácpolygalacturonan là đủ để gây ra nhũn mô và chết tế bào, cellulase và cáchemicellulase cũng có thể tham gia gây bệnh Sự nhiễm bệnh của quả bị kích thích bởichính các thành phần hóa học của nó, trong khi một số chất khác lại có khả năng ứcchế tác nhân gây bệnh trên quả Khi xâm nhiễm trên quả, nấm mốc sản sinh các độc tốsau đó chúng tiết ra các enzyme gây phá hủy các mô của quả Bước tiếp theo của quátrình nhiễm bệnh phụ thuộc vào khả năng sinh trưởng, tiết enzyme của nấm và sức đềkháng của quả (Joseph và Malinie, 1983)

Nghiên cứu về vai trò của enzyme phân huỷ thành tế bào trong quá trình thâmnhập đã được thực hiện bởi Wattad và cs (1994) Enzyme pectinase làm mềm và thâmnhập vào của mô của quả bị ức chế bởi epicatechin, một hợp chất phenolic có trong vỏcủa quả chưa chín Trong quá trình chín, hàm lượng epicatechin giảm đến một ngưỡngkhông ức chế với các pectic enzym và nấm gây thối quả.

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm mốc được phân lập từ các mẫu quả cà chua, đu đủ, thanh long

3.1.2.2 Môi trường

Môi trường nuôi cấy và khảo sát dùng trong đề tài bao gồm:

- Môi trường PDA (Potato dextrose agar):

(Khoai tây bỏ vỏ, thêm nước cất, nấu nhừ, lọc lấy 1 lít nước, pH 7,0 ± 0,2)

- Môi trường Czapek- Dox lỏng:

NaNO3: 2 g

Các máy móc thiết bị dùng trong đề tài thuộc Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ

Vi sinh- Khoa Công nghệ Sinh học - trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Máy móc và thiết bị dùng trong đề tài

Máy li tâm lạnh thu sinh khối lớn

Tủ cấy vô trùng JSCB – 1500SB JSR Hàn Quốc

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phân lập và lây nhiễm nhân tạo

3.2.1.1 Phân lập các chủng nấm mốc

Lấy 1g mẫu quả cà chua, đu đủ, thanh long bị thối hỏng cho vào 99 ml nước cất

vô trùng, lắc ở 150vòng/ phút trong 30 phút, để lắng, đem pha loãng lên các nồng độ

10-5 và 10-6 Lấy50 µl dịch đã pha loãng cấy trải trên lên đĩa petri chứa môi trườngPDA đặc (nguyên tắc Koch)

Các đĩa petri đã cấy nấm được nuôi ở nhiệt độ 28ºC – 30ºC trong 3 – 4 ngày.Các khuẩn lạc đã mọc được cấy chuyển và làm thuần bằng phương pháp cấy chấmđiểm sang môi trường PDA mới

3.2.1.2 Giữ giống

Nấm mốc được giữ giống trong thạch nghiêng bằng cách cấy zích zắc trên môitrường PDA trong ống nghiệm thủy tinh, được nuôi ở nhiệt độ 30°C cho đến khi mọcđẹp trước khi được bảo quản ở tủ 4°C Các mẫu giữ giống được cấy chuyển hàngtháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống

Nấm mốc được giữ giống ở - 80°C trong glycerol 40% Hệ sợi, bào tử nấm mốccùng với một ít môi trường nuôi cấy được gảy vào 1 ml glycerol 40% trong ốngeppendorf, lắc đều nhẹ và bảo quản trong tủ lạnh -80°C

3.2.1.3 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo

Các chủng nấm mốc đã phân lập và giữ giống được tiến hành lây nhiễm để thửkhả năng gây bệnh trên các quả cà chua, đu đủ và thanh long bình thường, không bịbệnh Quả đu đủ (xanh, ương, chín), quả cà chua (ương, chín), quả thanh long (chín)được rửa bằng NaClO trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô Cắt đu

đủ thành các miếng mỏng đặt vào đĩa petri Đặt cả quả cà chua vào cốc đựng đã vôtrùng, dùng dao vô trùng rạch tạo vết thương trên vỏ quả (do cà chua có lớp vỏ pectintương đối dày) Quả thanh long được đặt vào hộp đã vô trùng, dùng dao vô trùng rạchtạo vết thương trên vỏ quả ở ba vị trí khác nhau chia theo dọc quả Dùng que cấy gạtbào tử nấm, chấm lên trên vỏ quả đu đủ trên đĩa và vết thương đã tạo trên quả cà chua,thanh long Bọc kín cốc lại, để vào tủ ổn nhiệt 250C và quan sát trong vòng 10 ngày(Anna và cs, 2002)

chủng nấm mốc

Quan sát đặc điểm hệ khuẩn ty nấm mốc

Nấm mốc, sau khi cấy chuyển sang thạch nghiêng, được tiến hành tạo khuẩn lạcnhư sau: bào tử nấm từ ống giống được trộn trong 1ml nước cất vô trùng, lắc đều tạodung dịch huyền phù Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóngchấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa petri, tiến hành cấy trên 3 đĩa Lưu ý không đểđiểm chấm loang trên mặt thạch Nấm được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 5ngày Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc: kích thước, màu sắc, hình dạng khuẩnlạc, đặc điểm dạng sợi nấm mọc ở trên mặt khuẩn lạc

Quan sát vi thể nấm mốc

Làm tiêu bản tạm thời để quan sát được đặc điểm của sợi khí sinh, cuống đínhbào tử và bào tử (màu sắc, hình dạng) Tiến hành lau cồn cho lam kính và lamen trướckhi làm tiêu bản Cho 1 giọt nước hoặc glycerol 50% hoặc xanh methylen (pha thành 3dung dịch riêng biệt: dung dịch 1: 0,9 g Na2HPO4 trong 500ml nước cất, dung dịch 2:13,6 g KH2PO4 trong 500 ml nước cất, dung dịch 3: 0,1 g methylen xanh hòa vào 500

ml nước cất Hỗn hợp có: 0,25 ml dung dịch 1 + 99,75 ml dung dịch 2 + 100 ml dungdịch 3 (Lương Đức Phẩm, 2004) vào giữa lam kính, lấy 1 lượng nhỏ nấm mốc hòa vào

5 µl nước/ glycerol 50%/xanh methylen cho đều Đặt lamen nghiêng 1 góc 45º so vớimặt lam kính sau đó thả từ từ để không tạo bọt khí trên tiêu bản Dùng giấy thấm nướcxung quanh lamen Đem tiêu bản soi dưới kính hiển vi và quan sát.

3.2.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm mốc bằng phương pháp giải trình tự vùng ITS - rDNA

3.2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Tách DNA nấm mốc theo phương pháp Sambrook (1989) cải tiến

DNA nấm mốc được tách chiết từ sinh khối nuôi trên môi trường PDA ở 30°Ctrong 2 ngày Thu sợi nấm cho vào eppendoft 1.5 ml, sau đó để ở tủ -80oC trong 1 giờ.Nấm mốc lấy ra từ tủ -80oC được bổ sung 600 ml đệm TENS (Tris HCl 100 mM,EDTA 10 mM, NaOH 0.1 N, SDS 0.5%) nghiền nhuyễn, ủ ở 65oC trong 15 phút Chovào ống eppendoft chứa dịch nấm mốc đã được nghiền nhuyễn bổ sung dung dịch 24:1(Chloroform:isoamyalcohol) với tỉ lệ 1:1, đảo đều rồi ly tâm 11000 vòng/phút trong 15phút ở 4oC, thu pha nước ở trên vào ống eppendoff 1.5 ml mới Lặp lại bước trên, sau

đó bổ sung dung dịch NaCl 0.5 M bằng 1/2 thể tích và Sol III (3M sodium acetate)bằng 1/10 thể tích rồi bổ sung 2-propanol lạnh tỉ lệ 1:1, lắc đều và ủ ở -20oC trong 1giờ Dịch sau khi ủ được ly tâm 11000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa Tủađược rửa 2 lần bằng ethanol 70% sau đó làm khô bằng máy làm khô chân không Hòatan tủa bằng 50 µl nước khử ion hoặc đệm TE, bảo quản DNA ở -20oC

3.2.3.2 Khuếch đại vùng ITS-rDNA của nấm mốc bằng phương phápPCR

Hai mồi ITS1 và ITS4 (Innis và cs., 1990) được sử dụng để nhân toàn bộ vùngITS của các chủng nấm mốc Trình tự đoạn mồi sử dụng được trình bày ở Bảng 3.3 vàHình 3.1

Bảng 3.3 Trình tự mồi ITS1 và ITS4 (Innis và cs., 1990)

Mồi Trình tự (5’-3’) Tm (oC) Kích thước sản phẩm (bp)

700

Hình 3.1 Vị trí gắn mồi ITS1 và ITS4 trên cụm gene rDNA

Đặt các ống phản ứng vào máy PCR và thực hiện phản ứng PCR

Bảng 3.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

Giai đoạn Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 0.8% ở 90V trong

40 phút sử dụng đệm Tris-acetate-EDTA (TAE) và phát hiện băng DNA bằng thuốcnhuộm Ethidium Bromide (5ng/µl), quan sát và chụp ảnh băng điện di dưới đèn UV.Sản phẩm PCR được gửi đi giải trình tự tại Công ty Macrogen, Hàn Quốc

3.2.4 Phương pháp tách chiết enzyme ngoại bào nấm mốc

Nấm mốc được nuôi starter trên môi trường Czapek-Dox lỏng ở 30°C, lắc 200vòng/phút trong 2 ngày Nhỏ 2 - 3 ml dịch nuôi lỏng vào 50 g môi trường xốp, nuôi trong tủ

ấm ở 30°C 4 - 6 ngày Enzyme ngoại bào được tách chiết từ nấm mốc nuôi trên môi trườngxốp 10g mẫu (cả môi trường và nấm mốc) được cho vào ống fancol 50 ml và 30 ml nướccất vô trùng, vortex, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút lấy dịch trong Tiếp tục lọc dịchbằng giấy thấm Thu dịch chiết enzyme ngoại bào Bảo quản ở - 4°C.

3.2.5 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng hoạt động, độ bền của enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch

50µl dịch chiết khảo sát hoạt tính amylase được nhỏ vào giếng đục trên đĩathạch với 2% agar trong đệm phosphate 0,1 M và có cơ chất 1 % tinh bột Đĩa thạch đãđược nhỏ dịch chiết được ủ ở 30ºC, qua đêm.Thuốc nhuộm là lugol (hòa 2g KI trong5ml nước cất cho tan hết, sau đó cho thêm 1g I2 vào, lên thể tích nước cất đến đủ300ml, lắc đều)

Nhỏ 50 µl dịch chiết vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar trong đệmphosphate 0,1 M và có cơ chất 0,1% gelatin Đối với thử hoạt tính protease cần cótrypsin làm đối chứng dương Đĩa thạch đã được nhỏ dịch chiết được ủ ở 30ºC, quađêm, sau đó nhuộm với amido đen 10B 0,1% trong dung dịch methanol, axit acetic,nước cất theo tỷ lệ 3: 1: 6 trong 1 giờ Tẩy bằng dung dịch pha amido đen

Nhỏ 50 µl dịch chiết vào giếng đục trên đĩa thạch có thành phần Na2HPO4 6.15

g, citric acid 2.5 g, dầu olive 2.0 g, agar 2.0 g trong 100 ml Đĩa thạch đã được nhỏdịch chiết được ủ ở 30ºC, qua đêm Tiến hành nhuộm với Lugol

Nhỏ 50 µl dịch chiết vào giếng đục trên đĩa thạch với 2% agar trong đệmphosphate 0,1 M và có cơ chất 0,5% pectin Đĩa thạch đã được nhỏ dịch chiết được ủ ở30ºC, qua đêm Tiến hành nhuộm với Lugol.

Nếu nấm mốc có hoạt tính amylase, protease, cellulase, pectinase, lipase sẽ tạovòng trong suốt quanh lỗ khoan chứa dịch enzyme Vùng tinh bột chưa bị phân giải cómàu xanh đậm Vùng protein chưa bị phân giải có màu xanh Vùng cellulose,pectinase, lipase chưa bị phân giải có màu nâu Hoạt tính tương đối các enzyme đượcxác định qua hệ số phân giải: D – d (mm) Trong đó: D là đường kính vòng phân giải(mm), d là đường kính lỗ thạch (d = 10 mm) Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần

3.2.5.1 Ảnh hưởng của pH

Pha các môi trường thử hoạt tính enzyme với cơ chất tinh bột, cellulose, gelatin,pectin ở các pH = 5, 7, 9 bằng đệm phù hợp Nhuộm và quan sát kết quả, đánh giá khảnăng phân giải cơ chất của từng loại enzyme với mỗi pH khác nhau Mỗi thí nghiệmđược lặp lại 3 lần

3.2.5.2 Đánh giá khả năng bền nhiệt

Dịch enzyme nhỏ vào lỗ thạch được xử lý ở các nhiệt độ: 30oC, 45ºC, 60ºC, 70ºCbằng máy ủ ấm eppendorf trong 1 giờ Các loại enzyme được ủ với cơ chất phù hợp trongđiều kiện pH tối thích được xác định ở mục 3.2.5.1 Nhuộm và quan sát kết quả, đánh giá

độ bền nhiệt đối với từng loại enzyme Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần

3.2.6 Thử khả năng sinh trưởng của nấm mốc trên môi trường bổ sung hóa chất

Mức độ mẫn cảm của 25 chủng nấm mốc trong đề tài đối với một số loại chấtbảo quản thực phẩm đã được nghiên cứu Hóa chất sử dụng gồm axit sorbic ở nồng độ

200 ppm và sodium bisulphite nồng độ 300 ppm Bổ sung nước muối hoặc dung dịchaxit vào bình môi trường để đạt được nồng độ cần sử dụng Bình môi trường sau đóđược hấp khử trùng 121oC trong 20 phút và chia đều vào các đĩa petri tiệt trùng Bào

tử nấm sau 5 ngày phát triển trên môi trường không bổ sung hóa chất sẽ được thu vàonước đã được hấp khử trùng (có chứa 30% Glycerol) sử dụng làm nguồn bào tử cấychấm điểm Hai ngày sau khi cấy, tiến hành theo dõi hằng ngày sự phát triển của nấmmốc đến ngày thứ 5

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Phân lập

Nguyên liệu sử dụng để phân lập nấm mốc trong đề tài này là các mẫu quả càchua, đu đủ, thanh long bị nấm bệnh Từ 14 mẫu quả nhiễm nấm bệnh được thu thậptại các khu vực trồng và bán đu đủ, cà chua, thanh long tại Gia Lâm và Đông Anh - HàNội, Thuận Thành- Bắc Ninh 25 chủng nấm mốc đã được phân lập Các chủng nấmbệnh được cấy thuần và theo dõi các đặc điểm hình thái

Bảng 4.1 Các chủng nấm mốc được phân lập từ quả bị nấm bệnh

STT Kí hi u ệ Lo i qu ạ ả Đị Đ ể a i m l y m u ấ ẫ Đặ đ ể c i m hình thái

1 TH1 Đ đủ u Đ ông Anh, HN Khu n l c màu xanh l c, s i khí sinh ng n ẩ ạ ụ ợ ắ

3 TH3 Thanh long Thu n Thành, BN ậ Khu n l c màu xám, s i khí sinh dài ẩ ạ ợ

5 TH5 Đ đủ u Gia Lâm, HN Khu n l c màu xanh l c, s i khí sinh ng n ẩ ạ ụ ợ ắ

6 TH6 Thanh long Gia Lâm, HN Khu n l c màu xanh rêu, s i khí sinh ng n ẩ ạ ợ ắ

8 TH8 Đ đủ u Đ ông Anh, HN Khu n l c màu xanh rêu, s i khí sinh ng n ẩ ạ ợ ắ

10 TH10 Đ đủ u Đ ông Anh, HN Khu n l c màu xanh l c, s i khí sinh ng n ẩ ạ ụ ợ ắ

11 TH11 Đ đủ u Đ ông Anh, HN Khu n l c màu xanh l c, s i khí sinh ng n ẩ ạ ụ ợ ắ

12 TH12 Đ đủ u Đ ông Anh, HN Khu n l c màu xanh rêu, s i khí sinh ng n ẩ ạ ợ ắ

13 TH13 Cà chua Đ ông Anh, HN Khu n l c tr ng, s i khí sinh dài ẩ ạ ắ ợ

14 TH14 Đ đủ u Gia Lâm, HN Khu n l c màu xanh l c, s i khí sinh ng n ẩ ạ ụ ợ ắ

15 TH15 Đ đủ u Gia Lâm, HN Khu n l c màu xanh rêu, s i khí sinh ng n ẩ ạ ợ ắ

16 TH16 Đ đủ u Gia Lâm, HN Khu n l c màu xanh l c, s i khí sinh ng n ẩ ạ ụ ợ ắ

17 TH17 Đ đủ u Đ ông Anh, HN Khu n l c tr ng h ng, s i khí sinh ng n ẩ ạ ắ ồ ợ ắ

18 TH18 Thanh long Thu n Thành, BN ậ Khu n l c màu nâu, s i khí sinh ng n ẩ ạ ợ ắ

19 TH19 Cà chua Gia Lâm, HN Khu n l c nâu en, s i khí sinh ng n ẩ ạ đ ợ ắ

20 TH20 Đ đủ u Thu n Thành, BN ậ Khu n l c màu xám, s ik khí sinh dài ẩ ạ ơ

21 TH21 Đ đủ u Đ ông Anh, HN Khu n l c màu xanh rêu, s i khí sinh ng n ẩ ạ ợ ắ

22 TH22 Cà chua Đ ông Anh, HN Khu n l c tr ng, s i khí sinh dài ẩ ạ ắ ợ

23 TH23 Thanh long Thu n Thành, BN ậ Khu n l c màu xám, s i khí sinh dài ẩ ạ ợ

24 TH24 Thanh long Thu n Thành, BN ậ Khu n l c màu nâu, s i khí sinh ng n ẩ ạ ợ ắ

25 TH25 Đ Đủ u Thu n Thành, BN ậ Khu n l c màu xám, s i khí sinh dài ẩ ạ ợ

4.2 Lây nhiễm nhân tạo

Theo nguyên tắc Koch, các vi sinh vật phải được phân lập từ một sinh vật bịbệnh và phát triển trong môi trường nhân tạo Do đó, các chủng nấm mốc sau khi phânlập được tiến hành lây nhiễm ngược trên các đối tượng quả ở các thời gian sinh trưởngkhác nhau để chứng minh khả năng gây thối quả Quả được rửa bằng NaClO trong 1

phút rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng, để khô, sau đó dùng que cấy gạt bào tử nấm,chấm lên trên vỏ quả, bọc kín lại, để vào tủ ổn nhiệt 250C và quan sát trong vòng 10ngày (Anna và cs, 2002).

4.2.1 Trên đu đủ

Các chủng nấm mốc đã phân lập được tiến hành lây nhiễm trên đối tượng quả

đu đủ ở các thời gian sinh trường khác nhau, nhằm tiến hành đánh giá khả năng lâynhiễm và mức độ gây thối của chúng trên đối tượng nghiên cứu (bảng 4.2)

Bảng 4.2 Khả năng gây thối khi lây nhiễm nhân tạo nấm mốc trên đu đủ sau 10 ngày

Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng TH3, TH13, TH16, TH17, TH18,

TH19, TH20, TH23 và TH25 là gây thối trên cả 3 loại quả xanh, chín và ương Tất cả các

chủng đều gây thối trên quả ương và quả chín, trong đó các chủng gây thối mạnh trên 2

loại quả này là TH1, TH7, TH9, TH12, TH13, TH15, TH16, TH19, TH20 Tính chất của

quả xanh khác với quả ương và quả chín, chúng có lớp pectin, cellulose, hemicellulose,lignin dày, làm cho nấm khó tấn công xâm nhập và gây hại cho quả hơn là đu đủ chín Vìvậy, chỉ một số loài nấm mới có khả năng tấn công gây thối được trên quả xanh

Thí nghiệm tương tự được tiến hành với quả cà chua ở các giai đoạn chín khácnhau (Bảng 4.3)

Bảng 4.3 Khả năng gây thối khi lây nhiễm nhân tạo nấm mốc trên cà chua sau

có sự thối nhũn của quả.

Kết quả cho thấy, tất cả các chủng đều gây thối trên 2 loại quả, trong đó có cácchủng gây thối mạnh nhất là TH3, TH6, TH13, TH16, TH22

Hình 4.5: Nấm mốc TH3 gây thối trên quả cà chua: (a) ương, (b) chín

4.2.3 Trên thanh long

Tiến hành thí nghiêm trên quả thanh long chín tại ba vị trí khác nhau dọc theoquả để xác định mức độ gây thối của từng chủng nấm mốc trên các vị trí khác nhaucủa quả, kết quả thể hiện ở bảng 4.4

Bảng 4.4 Khả năng gây thối khi lây nhiễm nhân tạo nấm mốc trên thanh long

sau 5 ngày

STT Nấm mốc Nguồn gốc Vị trí

có sự thối nhũn của quả.

Kết quả cho thấy, các chủng gây thối mạnh nhất là TH3, TH17, TH20, TH23,

TH25 Đây cũng là những chủng gây thối mạnh trên miếng quả đu đủ ương và chín,

trong đó chủng TH3 gây bệnh mạnh trên cả quả cà chua ương và chín

Phần lớn các chủng nấm mốc gây thối tại vị trí giữa quả tốt hơn Một số chủnggây thối tại vị trí đầu và cuối mạnh hơn so với vi trí ở giữa như: TH1, TH6, TH13