Nghiên cứu thành lập tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứa alcaloid

Nhưng nhờ được tiến hành trong một số điều kiện chuẩn nhất định với sự hỗ trợ của của máy móc và phần mềm vi tính chuyên dụng khiến HPTLC có những đặc tính uru việt nổi trội hơn hẳn như:

B Ộ Y T Ế

NGHIÊN CỨU THÀNH LẬP TIÊU CHUẨN KIỂM m n g h iệmm m ộ tm

( KHOÁ LUẬN TÓT NGHIỆP DUỌC s ĩ KHOÁ 2001-2006)

Người hưóng dẫn: TS Nguyễn Viết Thân

TS Bành Như Cưcttig Nơi thực hiện: Bộ môn ĨXrợc liệu

Trữòng Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: Tháng 2-5/20Ò6

HÀ NỘI, THÁNG 5/2006

Em xin b à y tỏ lòng kính trọng và b iết ơn sâu sắc thầy:

N h â n d ịp n à y em xin cảm ơn gia đinh, bạn bè, những người đ ã tạo điều kiện, động viên tôi rấ t nhiều trong su ố t thời gian qua.

Hà Nội, tháng 5/2006 Nguyễn Thị Thu Hương

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Mục lục

Chú giải chữ viết tắt

PHẦN I.TỔ N G QUAN

1.1 Tổng quan về alcaloid 3

1.2 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu 5

PHẦN 2 THựC NGHIỆM VÀ KẾT q u ả n g h i ê n CÚU 2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu 5

2.1.2 Phưcfng pháp nghiên cứu 6

2.2 Kết quả thực nghiệm 2.2.1 Bách bộ 9

2.2.2 Dừa cạn 15

2.2.3 Đ ạ i 23

2.2.4 Lạc tiê n 32

2.2.5 Mã tiề n 39

2.2.6 Hoàng n à n 48

2.2.7 Ô đầu 54

PHẦN 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 62 Tài liệu tham khảo

Phu luc

CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT

uv 254nm : Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm

uv 366nm : Ánh sáng tử ngoại bước sóng 366nm

ĐẶT VẤN ĐỂ

Ngay từ thưở sơ khai, nhân dân ta đã biết lựa chọn, tìm hiểu các loại cây cỏ trong tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh Trải qua bao thế hệ, với những kinh nghiệm truyền từ đời này sang đời khác, kho tàng dược liệu Việt Nam không ngừng được bổ sung, hoàn thiện đã trở nên vô cùng đa dạng, phong phú Thêm vào đó, sự phát triển vượt bậc của công nghệ khoa học hiện đại giúp phát hiện thêm nhiều loại cây thuốc mới, với những tác dụng chữa bệnh mới Việc kết hợp hài hòa tân dược và đông dược tạo nên hiệu quả chữa bệnh rất tích cực, đồng thời cũng mở rộng thêm nhiều phương thuốc đông y mới

Nhưng cũng chính sự phát triển nhanh chóng, mạnh mẽ của ngành dược liệu như hiện nay, sự đa dạng, phong phú của cây thuốc, sự biến đổi phức tạp

về hình thái và thành phần hoá học trong quá trình chế biến, đã đặt việc kiểm nghiệm, quản lý chất lượng trước nhiều khó khăn, thách thức, đôi khi dãn đến tình trạng thả nổi Nhất là trước thực trạng ngành kiểm nghiệm còn nhiều thiếu thốn: trang ihiết bị, máy móc; nhân lực; thông tin không đầy đủ, rõ ràng

dễ dẫn đến sự nhầm lần

Bởi vậy, với mong muốn góp phần nâng cao chất lượng kiểm nghiệm

dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài: “N g h iê n c ứ u th à n h lậ p tiê u c h u ẩ n

k iể m n g h iệ m m ộ t sô d ư ợ c liệ u c h ứ a a ỉc a lo id ” với mục đích xây dựng

dữ liệu góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số dược liệu chứíì aicaloid, giúp việc kiểm nghiệm dễ dàng, thuận tiện hơn Dược liệu chứa alcaloid chiếm một lượng rất ỉớn, trong đề tài này, chúng tôi chỉ lựa chọn nghiên cứu một sô' dược liệu thông dụng, phổ biến, đó là: Bách bộ, Dừa cạn, Đại, Lạc tiên, Mã tiền, Hoàng nàn, Ô đầu phụ tử

Với mục đích như trên, nội dung của đề tài bao gổm:

* Chọn dược liệu chuẩn Chụp anh và mô tả đặc điểm hình thái, đặc

điểm hiển vi các dược liệu nghiên cứu

* Thực hiện các phương pháp kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam

* ứng dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao vào kiểm nghiệm dược liệu Thành lập sắc ký đổ dịch chiết các dược liệu nghiên cứu trong một số điều kiện nhất định

Phần I

TỔNG QUAN

1 Sơ bỏ về dươc liêu chứa alcaloid:

Từ xưa đến nay, nhiều dược liệu chứa aicaloid vẫn luôn được biết đến như những vị thuốc quý, được sử dụng rộng rãi trong Y học: Reserpin từ Ba gạc, Vinblastin, Vincistin lừ Dừa cạn, Morphin từ Thuốc phiện, Aconitin (Ô đầu), Strychnin (Mã tiền) Bởi có tác dụng điều trị cao và rộng, lại rấl phổ biến trong thực vật nên alcaloid được chú ý nghiên cứu rất nhiều ở Viột Nam,

dù rằng hiện nay các alcaloid dùng được trong Y học ít hơn rất nhiều so với các loại alcaloid đã phát hiện [8], Thực tế hàm lượng alcaloid trong cây thường rất thấp (Một dược liệu chứa 1-3% alcaloid đã được coi là cổ hàm lượng alcaloid khá cao), nhưng ngay ở hàm lượng rất thấp đó aỉcaloid đã có thể cho hiệu quả rõ rệt trên lâm sàng, đặc biệt ở những dược liệu có độ độc cao như: Lá ngón, 0 đầu (2-5mg aconitin đã có thể gây chết người lớn), Mã tiền .Bởi vậy việc kiểm nghiệm càng cần phải cẩn trọng, chính xác, đảm báo

sự an toàn cho người bệnh

Theo định nghĩa của Pôlônôpski: " Aỉcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị \òng, có phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật, thường có dược lực tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alcaloid"

Hiện nay, nhiều alcaloid đã được tìm thấy ở động vật (Bufotenin từ

nhựa Cóc, samandarin ở loài Kỳ nhông Salamandra maculosa ) nhưng thực

vật vẫn là nguyên liệu chủ yếu để sản xuất các alcaloid, đặc biệl là thực vật bậc cao Thực vật bậc cao chứa alcaloid chiếm 15-20% tổng số các loại cây, lập trung ở một sô' họ thực vật như: Apocỵnaceae (họ Trúc đào) với gần 800 alcaloid, Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần 400 alcacloid, Loganiaceae (họ

Mã tiền) có 150 alcaloid

Trong cây, alcaloid thường tập trung ở một số bộ phận nhất định (ở hạt

như Mã tiền, Cà phê , ở củ như Ô đầu, Bách b ộ , ở vỏ như Đại, Hoàng

n àn ) và có thể thay đổi trong quá trình phát triển của cây cả về hàm lượng lẫn vị trí, “nơi tạo ra alcaloid không phải lúc nào cũng là nơi tích tụ alcaloid”:Nhiều alcaloid được tạo ra ở rễ tại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quíi, hạt Đây cũng là một khó khăn không nhỏ cho việc kiểm nghiệm các dược liệu chứa alcaloid Các alcaloid trong cây thường ở dạng hỗn hợp, hiếm khi chỉ có một loại duy nhất, khi đó alcaloid có hàm lượng cao sẽ được gọi là alcaloid

chính Các alcaloid rất ít khi ở trạng thái tự do mà ở dạng muối của các acid

hữu cơ như citrat, tactat, malat, oxalat, acetat (Đôi khi ở dạng muối của acid

vô cơ) tan trong dịch tế bào, ở một số cây alcaloid kết hợp với tanin hoặc với acid đặc biệt cua chính cây đó như acid aconitic có trong cây Ô đầu, acid tropic trong một số cây họ Cà [9]

Kiểm nghiệm dược liệu chứa alcaloid thường tiến hành như sau [9]:

- Các đặc điểm đặc trưng về hình thái cây thuốc, hình ảnh bột, vi phẫu được

mồ tả tỉ mỉ giúp nhân thức cây thuốc, vị ihuốc

- Để định tính alcaloid, sử dụng các phản ứng tạo tủa và tạo màu đặc trưng:+ Muốn xác định xem trên tiêu bản thức vật có alcaloid không và có ở vị trí nào người ta thường dùng thuốc thử Bouchardat, nhỏ một giọl ihuốc thử lên tiêu bản thực vật mới cắt sẽ thấy xuất hiện tủa nâu, tuy nhiên để kết luận chắc chắn, cẩn làm thêm một tiêu ban đối chứng đã loại hết các alcaloid

+ Để chứng minh là alcaloid gì thì còn phái làm thêm phản ứng tạo màu đặc hiệu, ngày nay thường kết hợp với phương pháp sắc ký nhất là sắc ký lớpmỏng

có alcaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh, phương pháp phổ hổng ngoại, phổ tử ngoại, khối phổ

- Định lượng alcaloid thường có hai giai đoạn:

+ Chiết riêng alcaloid ra khỏi dược liệu: Yêu cầu dược liệu phải được chiết kiệt ở từng giai đoạn

+ Định lưcmg: Lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp tính chất từng alcaloid Các phương pháp hay dùng là ; phương pháp cân, phưcfng pháp trung hòa, phương pháp so màu

2 Tổng quan về các dươc liêu nghiên cứu:

Để tiện cho việc theo dõi và đối chiếu, tổng quan về các dược liệu nghiên cứu sẽ được trình bày theo từng dược liệu cùng với phần kết quả thực nghiệm

Phần II.

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguỵén liệu và phương pháp nghiên cứu.

2.1.1 _Nguyên liệu

Các mẫu nghiên cứu được thu hái trực tiếp, bảo quản và sơ chế theo yêu cầu quy định, Một số mẫu được thu inua trên thị trường để kiểm tra, đối chiếu

so sánh, tổng quát hóa các đặc điểm

+ Bách bõ (Stemona tuherosa Luor ): Rễ củ Bách bộ được lấy mẫu tại

Viện Dược liệu - Hà Nội

* Dừa can (Catharanĩhus roseus (L.) G D on.ì: Phần trên mặt đất của

cây Dừa cạn được thu hái tại Vườn thực vật trường ĐH Dược Hà Nội

* Đai (Pĩưmeria rubra L var acutifolia ('Poir.) Bailev): Hoa và vỏ thân Đại được thu hái tại vườn hoa Thanh niên - Hà Đông - Hà Tây

* Lac tÌén {PassỉAora toetida L.): Phần trên mặt đất của Lạc tiên được

thu mảu tại Vườn thực vật trường ĐH Dược Hà Nội

* Hoàng nàn iStrychnos waỉlichiana Steud ex D Q : v ò Hoàng nàn

được thu mua tại trung tâm phân phối dược liệu ở Lãn ô n g - Hà Nội

* Mã tiên (Strvchnơs nux ~ vomica L.): Hạt Mã tiền được thu hái tại

Vườn Bách thảo - TP Hồ Chí Minh.

* Ô đáu phu tử i Aconitum fort line i HemsL): Các mẫu Ô đầu phụ tử

được thu mua tại Sapa - Lào Cai; Lãn ôn g - Hà Nội

2.1.1 Phương pháp nghiên cứu

Xử Iv và bảo quản mẫu

Mẫu dược liệu nghiên cứu có thể là dược liệu tươi hay đã qua chế biến phơi khô Sau khi thu mẫu, dược liệu được xử iý, bảo quản theo phương pháp chung, cụ thể:

- Mẫu dược liệu cắt vi phẫu có thể dùng mẫu tươi hoặc mẫu khô được iàm mềm, bảo quản trong hỗn hợp Cồn : Nước : Glycerin (1:1:1)

- Mẫu dược liệu dùng soi bột được thái nhỏ, sấy khô, nghiền ihành bột,bảo quản trong lọ có nút kín, ghi nhãn, để nơi khô ráo

- Mẫu dược liệu để định tính được thái lát mỏng, sấy khô ư nhiệt độ

<60^C, bảo quản nơi khô ráo

Nghiên cứu đăc diểm hình thái bẽn ngoài

^ Mô tả đặc điểm thực vật cây íhuổc:

Cây thuốc được chụp ảnh, mô ta đặc điểm tại nơi thu hái trực tiếp

* Mô tả đặc điểm được ỉiệii:

Các mẫu nghiên cứu được chụp ảnh, mô tả tỉ mỉ về hình dạng, kích thước, màu sắc, thể chất, mùi vỊ

Nghiên cứu dăc điểm vi hoc

^ Nghiên cím đặc điểm vỉ phẫu của dược ỉiệu:

Làm tiêu bản vi phẫu cố định theo các bước sau:

Cắt vi phẫu:

Dược liệu tươi hay khô đã ngâm mềm được cắt ngang bằng dụng cụ cắt

vi phău cầm tay, chọn các lát cắt mỏng

Tẩy nhuộm:

Ngâm vi phẫu trong dung dịch Cloramin hay nước Javen để tẩy các chất

có chứa trong tế bào, thời gian ngâm tùy loại nguyên liệu, có thể rút ngắn thời gian bằng cách đun nóng

Rửa nước ^ ngâm Cloral hydrat với vi phẫu có nhiểu tinh bột rồi rửa nước lần nữa

Rửa bằng acid acetic 5%-lO%, rồi rửa nước cho hết acid acetic

rửa nước Thời gian nhuộm tùy thuộc vào tính chất bắt màu của từng mâu

C ổ định:

Sau khi nhuộm, vi phẫu được loại nước lần lượt bằng cồn 30", 50", 70'*, 95^ và cồn tuyệt đối

Lắc vi phẫu ba lần trong xylen

Đặt vi phẫu vào một giọt bôm canada trên phiến kính, đậy lá kính, để ở chỗ thoáng 2 - 3 tuần

Tiêu bản vi phẫu cố định được quan sát mô tả đặc điểm và chụp ảnh qua kính hiển vi

* Nghiên cứit đặc điểm bột dược Ịịệit.

Dược liệu được sấy khô, nghiền thành bột

Xác định màu sắc, mùi vị bột dược liệu bằng cảm quan

Sử dụng các dung dịch khác nhau để lên kính: nước, cloral hydrat, glycerin Quan sát dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm bột dược liệu

Nghiên cứu vé thành phần hỏa hoc

* Nghiên cứii bằng phương pháp sắc kỷ lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Nguyên tắc: sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao vẫn dựa trên nguyên tắc sác ký

[ớp mỏng thông thưòíng [6]: "Dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vố cơ hay hữu cơ theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phẩn chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy

theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại ở những vị trí khác nhau" Nhưng nhờ được tiến hành trong một số điều kiện chuẩn nhất định với sự hỗ trợ của của máy móc và phần mềm vi tính chuyên dụng khiến HPTLC có những đặc tính uru việt nổi trội hơn hẳn như:

- Khả năng phân tích tốt

- Độ nhạy, độ chính xác, độ lặp lại, tính khách quan cao

- Tốn ít thời gian

Các bước tiến hành:

Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cho 3-5g dược liệu được nghiền thành bột

thô, sấy khô, cho vào một ống nghiệm, thêm 20-30ml methanol ngâm trong

Bản mỏng được đặt vào đúng vị trí trên mấy chấm Linomat 5.0

Dùng xiỉanh chuẩn lấy một thể tích mâu chấm thích hợp

Sử dụng máy vi tính với phần mềm winCATS để điều khiển quá írình chấm: Vị trí vết, chiều dài, hình dạng, thể tích vết có thể lựa chọn điều chỉnh được, đảm bảo độ chính xác cao Sau khi nhập các dữ liệu,quá trình chấm vết được tự động tiến hành, đổng thời có sự thổi khí nén làm khô vết chấm nhanh

Triển khai sắc ký: Bằng các hệ dung môi phù hợp từng mẫu dược liệu

Quá trình triển khai được tiến hành trong bình sắc ký tiêu chuẩn, đặt trên mặt phẳng, bình kín, không di động khi chạy sắc ký

Bản mỏng sau khi triển khai được sấy nhẹ để bay hơi hết dung môi

Quan sát và chụp ảnh: Quan sát và chụp ảnh trong buồng quan sál của

hệ thống CAMAG Reprostar 3 với sự hỗ trợ của phần mểm winCATS dưới

ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm, 366nm, và ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử hiện màu.

Xử ỉ ý kết quả: Bằng phần mềm Videoscan với độ phân giải thích hợp

Kết quả bao gồm hình ảnh sắc ký đồ các dịch chiết, đồ thị biểu diễn độ đậm, diện tích, Rf các vết nhìn thấy được

* Các phương pháp nghiên cứu thành phấn hoá học khác

Các phương pháp nghiên cứu định tính khác được tiến hành theo đúng các chuyên luận trong Dược điển Việt Nam (I, III), và sẽ được trình bày theo từng dược liệu cụ thể

2.2 Kết quả thực nghiệm

2 2 1 BÁCH BỘ

Tổns quan

Bách bộ (hay còn gọi là Dây ba mươi) có tên khoa học là Stemona

tuberosa Lour., họ Bách bộ - Stemonaceae.

Bách bộ phát triển tốt ở các nước Ấn Độ, Trung Quốc, Malaixia, NhậlBản, Châu Úc ở nước ta, Bách bộ mọc hoang ở nhiều vùng rừng núi như: Hoà Bình, Phú Thọ, Bắc Giang, Thanh Hóa Bách bộ thuộc loại dây leo sống nhiều năm Rễ củ vàng nhạt, mọc thành chùm

Về thành phần hoá học: Trong rễ củ Bách bộ mọc ở Việt Nam {Stemona

tuberosa) có hàm lượng alcaloid toàn phần là 0,5-0,6%, trong đó alcaloid

chính là tuberostemonin LG Ngoài ra trong rễ củ còn có glucid, lipid, prolid

và các acid hữu cơ

Về tác dụng, công dụng: Bách bộ đùng chữa ho lâu ngày do viêm khí quản, ho gà, lao hạch, trị viêm đại tràng mạn tính Tác dụng trị ho của Bách bộ

đã được khoa học hiện đại chứng minh là do khả năng giảm thấp sự hưng phấn của Irung khu hô hấp, dịch chiết Bách bộ còn có tác dụng kháng khuẩn mạnh,

ức chế vi khuẩn lao

* Tiêu chuẩn kiểm nghiệm

Dược điển Việt Nam III có quỵ định các tiêu chuẩn kiểm nghệm đối với vị thuốc Bách bộ: Các tiêu chuẩn về đặc điểm hình thái, đặc điểm hiển vi, định tính (bằng phản ứng hoá hoạc hoá học và phương pháp HPTLC với chất chuẩn là dung dịch tuberostemonin LG hoặc Bách bộ chuẩn), định lượng bằng phương pháp acid-base với hàm lượng alcaloid toàn phần khồng dưới 0,5%

Kết quả thưc nehiêm

Mẫu dược liệu chuẩn được lấy tại Viện Dược liệu, có thu mua ihêm các mẫu Bách bộ trên thị trường để so sánh

Đăc đỉêni hình thái bên ngoài

* Mô tả cdv

Bách bộ thuộc loài dây leo, sống nhiều năm, dài 5-lOm Thân nhỏ, nhẵn

Lá mọc đối hay so le, phiến lá hình tim, gân chính hình cung, có nhiều gân ngang nhỏ và rõ Hoa mọc ỏ kẽ lá gồm 1 - 2 hoa, hoa màu vàng lục, mặt trong đỏ tía, mùi hôi Bao hoa gồm bốn phiến, có bốn nhị Rễ củ màu vàng nhạt, mọc thành chùm, có nhiều rễ phình to.(Ảnh la)

* Mô tả dược liệu

Dược liệu là rễ củ phơi hay sấy khô của cây Bách bộ Rễ nhỏ để ngu yen, loại to bổ dọc Đầu trên hơi phình to, còn vết gốc thân, đầu dưới thuôn nhỏ, mặt ngoài vàng nâu có nhiều vết nhăn nhỏ Thể chất mềm dẻo Mặt cắt ngang ihấy

mô mềm vỏ khá dày, màu vàng nâu, trụ giữa màu tráng ngà Vị đắng, hơi ngọt (Ảnh Ib)

Đặc điểm hiển vi

* Đặc điểm vi phản:

Mặt cắt rễ củ hình tròn Từ ngoài vào trong có: Lớp bần cấu lạo bơi những

tế bào thành dày hoá gỗ Mảnh vỏ gồm các tế bào to nhỏ không đều, thành mỏng, xếp lộn xộn, rải rác có sợi hình đa giác hoặc hình tròn và tinh thể calci oxalat hình cầu gai nhỏ Nội bì cấu tạo bởi một lớp tế bào hình chữ nhật, xếp đều

đặn Vỏ trụ là một lớp tế bào hình chữ nhật xếp xen kẽ với các tế bào nội bì Libe

là các tế bào nhỏ tập hợp thành các bó xếp xát vỏ trụ xen kẽ các bó gỗ Các bó gỗ cấu tạo bởi những mạch gỗ xếp tuần tự thành hình tam giác, đầu nhọn quay ra ngoài xát vỏ trụ, phía trong gỗ liền nhau thành vòng tròn Mảnh ruột là các tế bào thành mỏng to nhỏ không đều, kích thước nhỏ hơn tế bào mô mềm vỏ, xếp lộn xộn Trong mô mềm ruột rải rác có các mạch gỗ lớn

* Đặc điểm bột dược liệu:

Bột có màu xám, khống mùi, vị đắng Soi dưới kính hiển vi ihấy: Bần màu vàng gồm các tế bào hình nhiều cạnh, thành dày Mảnh mô mềm tế bào hình tròn hoặc chữ nhật, màng mỏng có khi chứa tinh bột Hạt tinh bột kích thước khoảng0,02-0,03mm, có rốn hạt và vân khá rõ, đứng riêng lẻ hay tập trung thành đám Sợi dài có thành dày, khoang rộng Mảnh mạch có mạch chấm, mạch vạch

Các đặc điểm cảm quan, đặc điểm hiển vi đã nghiên cứu hoàn toàn phù hợp các đặc điểm đã được chụp ảnh, mô tả kỹ trong tài liệu [14]

Định tính về mặt hoá học

* Định tính bằng các phản ứng hữá học

- Cân khoảng 2g bột dược liệu, thấm ẩm bằng amoniac đậm đặc (TT), để

20 phút Thêm 15ml chloroform (TT), đun cách thuỷ 5 phút, lọc, bốc hơi dịch lọc trên cách thuỷ đến khô Hoà tan cắn trong 6ml aciđ hỵdrocỉoric 0,1 N (TT), lọc Dùng dịch cho vào 4 ống nghiệm, mỗi ống Iml, tiến hành các phản ứng sau:Ống 1: Nhỏ một giọt thuốc thử Mayer, xuất hiện tủa trắng

Ống 2: Thêm một giọt thuốc thử Bouchardat, xuất hiện tủa đỏ nâu

Ống 4: Nhỏ một giọt dung dịch bão hoà acid picric(TT), xuất hiện tủa vàng

- Cần Ig bột dược liệu , thêm 5ml nước, đun sồi, lọc Lấy Iml dịch lọc,

* Định tính hằng phương pháp tiPTLC

Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phưcmg pháp nghiên cứu mục 2 ỉ 2

với hệ dung môi khai triển: Benzen ' aceton - methanol [9 : 1 : 11 Kết quả thu được là:

- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liêu các thông số của sác ký đồ dịch chiết Bách bộ trong methanol quan sál ở uv 254 nm (Hình 1.1)

- Sắc ký đổ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc ký đồ dịch chiết Bách bộ trong methanol quan sát ở uv 366nm (Hình 1.2)

- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc ký đồ

dịch chiết Bách bộ trong methanol quan sát ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc

thử hiện màu Dragendorff (Hình 1.3)

Nhân xét\ Các phản ứng hoá học định tính các mẫu Bách bộ đều dương tính

Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng theo Dược điển Việt Nam III với chất chuẩn là dịch chiết Bách bộ chuẩn Bản mỏng sau khi phun thuốc thử hiện màu Dragendorff, trên sắc ký đồ của dịch chiết Bách bộ chuẩn xuất hiện 4 vết, và trên sắc ký đổ dịch chiết các mẫu thu mua ngoài thị trường đều có các vết cùng màu, cùng Rf với dịch chiết chuẩn Sô' vết hiện màu ít hơn yêu cầu trong Dược điển (6 vết), có thể do quá trình chế biến, bảo quản mẫu

Nghiên cứu chạy sấc ký dịch chiết Bách bộ trong methanol với nhiều hệ dung môi khai triển khác nhau, kết quả là có nhiều hệ tách được trong đó hệ benzen - aceton - methanol [ 9 : 1 : 1 ] cho các vết tách tốl, rất ổn định, sau khi phun thuốc thử Dragendorff được 2 vết trên sắc ký đồ

Kết luận

Các đặc điểm hiển vi, đặc điểm hình thái, định tính bằng các phản ứng hoá học tạo tủa của các mẫu Bách bộ đều đạt các tiêu chuẩn kiểm nghiệm cua Dược điển Việt Nam ÍII

Về sác ký lớp mỏng, có thể sử dụng phưcíng pháp khác trong Dược điển, đơn giản hơn, đó là chiết bằng methanol Với HPTLC, phân tích kết quả sắc ký bằng máy móc cho ta biết sự thay đổi các thành phần trong dược liệu, giúp bổ sung thêm các dữ liệu để đưa việc kiểm nghiệm đạt đến một mức tiêu chuẩn cao hơn

2.2.2 DỪA CẠN

Tổns quan.

Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus roseus (L.) G Don {=Vinca

rosea L.) họ Trúc đào {Apocynaceae) Dừa cạn còn được gọi là Trường xuân

hoa, Dừa tây, Bông cải, Hải đằng

Dừa cạn có nguồn gốc ở đảo Madagasca, hạt di chuyển vào nước ta và phát triển rất tốt tại các vùng ven biển từ Quảng Bình đến Kiên Giang, đảo Phú Quốc, Côn Đảo Dừa cạn không chỉ đirợc trồng làm thuốc mà còn trồng làm cảnh ở rất nhiều nơi trên cả nước, bởi chúng dễ phát triển, dễ ra hoa, hoa

có nhiều màu sắc: trắng hoặc hồng [3] [9] [17]

Thành phần hoá học [9]: Có tới trên 70 alcaloid trong Dừa cạn được chia thành 3 nhóm chính

- Nhóm alcaloid có nhân indol: peridin, perosin,

- Nhóm alcaloid có nhân indolin: vindolin,ajmalin,

- Nhóm alcaloid có 2 vòng indol hoặc 1 vòng indol và 1 vòng indolin Đặc biệt trong nhóm này có những alcaloid có tác dụng chữa bệnh ung thư như vinblastin, vincristin

Về tác dụng và công đụng;

Cao lỏng Dừa cạn có tác dụng hạ huyết áp, an thần, gây ngủ và chỉ có độc tính nhẹ Thực tế việc phát hiện tác dụng ức chế ung thư của

alcaloid Dừa cạn Vinca rosea đã thúc đẩy các công trình nghiên cứu alcaloid

của cây này, đặc biệt là khi lượng bệnh nhân mác bệnh ung thư ngày càng tăng Trong các alcaloid của Dừa cạn thì vinblastin, vincristin được sử dụng để điều trị bệnh ung thư biểu mô, đặc biệt đối với bệnh lympho hạt, bệnh bạch cầu [3] [8] [9] Hiện nay trên thị trường có lưu hành lọ bột đông khô pha tiêm

* Tiêu chuẩn kiểm nghiệm

Dược điển Việt Nam III có quy định các tiêu chuẩn kiểm nghiệm lá Dừa cạn về đặc điểm dược liệu, vi phẫu, đặc điệm bột, định tính (bằng các phản ứng hoá học), định lượng bằng phưcfng pháp cân với hàm lượng alcaloid toàn phần không dưới 0,7%

Kết quả thưc nshỉêm

Đặc đỉểm hình thái bẽn ngoài

* Mô tả cây

Về đặc điểm thực vât, Dừa cạn là cây thuộc thảo, sống nhiều năm, cao 40-80cm, cành thẳng đứng, lá mọc đối, thuôn dài, đầu hơi nhọn, phía cuống hẹp, nhọn, không có nhựa mủ Hoa tráng hoặc hồng mọc riêng lẻ ở kẽ lá ngắn, phiến có 5 thuỳ Quả gồm 2 đại, mọc thẳng đứng, hạt nhỏ màu nâu nhạt Mùa hoa, quả gần như quanh năm, (Ẳnh 2a)

* Mô tả dược liệu

Dược liệu là lá phơi hay sấy khô của Dừa cạn Lá hình bầu dục dài, màu lục xám, đầu hơi nhọn, gốc lá thuôn hẹp dài 4-5cm, phiến có mép nguyên

Gân hình lông chim, lồi ờ mật dưới lá Cuống dài 0,3-0,7cm Vị đắng, mùi hơi

hắc Thân cành Dừa cạn có màu xanh nâu hay xanh xám, nhiều đốt, giòn, dễ

bẻ gãy Có nhiều vân dọc thân Vị đắng, mùi thơm (Ảnh 2b)

Đặc điểm vi học

* Đặc điểm vi phẫu lá

Biéu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào xếp đều đặn, đa số hình tròn được bao phủ bởi lớp cutin và mang 2 loại lông che chở, lông che chở đa bào với tế bào chân ngắn, tế bào đầu đài nhọn, lông che chở đơn bào ngắn

Phần gân lá: Dưới lớp tế bào biểu bì trên là đám mô dày ở góc Mồ mềm gồm những tế bào màng mỏng, kích thước không đều, có hình tròn, giữa các tế bào mô mềm để hở những khoảng gian bào hình đa cạnh Bó libe - gỗ

chồng kép hình cung, xếp giữa gân lá, gồm những đám libe tế bào nhỏ, xếp thành hai cung bao bọc lấy cung gỗ Mạch gỗ xếp đều đặn.

Phiến lá: Gồm một hàng tế bào mô mềm giậu xếp đều đặn và mô mềm khuyết tế bào nhỏ, màng mỏng, xếp không đều (Ảnh 2c)

* Đặc điểm vi phẫu thân

Mặt cắt thân hình tròn Từ ngoài vào trong gồm có: Biểu bì là một lớp tế bào hình tròn xếp đều đặn, kích thước khá đều, được bao phủ bởi một lớp cutin và mang lông che chở đơn bào hay đa bào Mô mềm vỏ là những tế bào hình tròn, kích thước không đều, giữa các tế bào để hở những khoảng gian bào hình đa cạnh Trong mô mềm vỏ xát ngoài vòng libe là vòng các bó sợi không liên tục Các tế bào libe nhỏ, thành mỏng Tầng phát sinh libe - gỗ Gỗ là vòng liên tục, mạch gỗ hình tròn, xếp thành dãy xuyên tâm Xát chân mạch gỗ vòng

li be quanh tuỷ Mô mềm ruột các tế bào hình tròn, không đều (Ảnh 2d)

* Đặc điểm bột

Bột màu xanh xám, mùi hơi hắc, vị đắng

Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh biểu bì mang lỗ khí, lỗ khí có kích thước khoảng 0,02-0,03mm Mảnh gân lá với các tế bào màng mỏng , hình chữ nhật, gần như trong suốt (dài khoảng 0,0t0,02mm, rộng 0,04-0,05 mm) Nhiều sợi thành dày thưòng tụ lại thành bó, các sợi có đường kính 0,01-0,02

xếp xít nhau, kích thước khá đều đặn khoảng 0,04-0,06mm, một loại gồm các

tế bào hình ngoằn ngoèo Mảnh mô giậu Lông che chở đom bào hoặc đa bào, thành dày, có từ 2-5 tế bào, bề mặt lấm tấm, tế bào đầu dài, nhọn Mảnh mạch

có mạch mạng, mạch điểm, mạch xoắn có đường kính 0,008-0,015mm, nằmriêng lẻ hay xếp thành dãy trong phiến lá (Ảnh 2e)

Trong Dược điển Việt Nam III chỉ có tiêu chuẩn kiểm nghiệm lá Ọì

iSằK

17

Các đặc điểm hiển vi, đặc điểm hình thái các mẫu lá Dừa cạn đều đạl các tiêu chuẩn yêu cẩu của Dược điển Việt Nam IIL

Định tính về mặt hoá học

* Định tính bằng các phản ứng hoá học.

Lấy 3g bột dược liệu cho vào bình nón, thấm ẩm với 2ml amoniac đâm đặc (TT) Thêm 30 ml cloroform (TT), để yên 30 phút, thỉnh thoảng lắc đều Lọc dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5 ml dung dịch acid sulfuriclO% (TT) trong 2-5 phút Để lắng, gạn lấy lớp acid cho vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 0,5 ml, lần lượt thực hiện các phản ứng sau:

Ống 2: Nhỏ 2 giọt thuốc thử Bouchardat —>■ xuất hiện tủa nâu đỏ

Ống 3: Nhỏ 2 giọt thuốc thử Dragendorff -^■có tủa đỏ cam

Ông 4: Nhỏ 1 giọt dung dịch acid picric bão hoà (TT), xuất hiện tủa vàng

* Định tính bằng phương pháp HPTLC

Nghiên cứu chạy sắc ký dịch chiết Dừa cạn trong methanol với nhiều hệ dung môi khai triển khác nhau, chúng tôi đã tìm được một số hệ phù hợp, trong đó hệ Toluen - aceton - ethanol - amoniac 25% [4 : 5: 0,6 : 0,4] cho các vết tách rất rõ, ổn định nhất trên sắc ký đồ

Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phương pháp nghiên cứu mục 2.1.2 với hệ dung môi khai triển:

Toluen - aceton - ethanol - amoniac 25% [4 : 5: 0,6 ; 0,4]

Cố kết quả:

- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đồ dịch chiết Dừa cạn trong methanol quan sát ở uv 254nm (Hình 2.1)

- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

kỷ đồ dịch chiết Dừa cạn trong methanol quan sát dưới uv 366nm (Hình 2.2)

- sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đổ dịch chiết Dừa cạn trong methanol quan sát ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử hiện màu Dragendorff (Hình 2.3)

N hận x é t Các mẫu Dừa cạn đều đạt các tiêu chuẩn định tính về hoá học như

trong Dược điển Việt Nam III

Kết luân :

Đề tài đã bổ sung các hình ảnh cụ thể, rõ ràng đặc điểm hiển vi, đặc điểm hình thái cây và dược liệu Dừa cạn Mồ tả, bổ sung đặc điểm kiểm nghiệm hiển vi thân Dừa cạn Lựa chọn, tìm hệ dung môi khai triển sắc ký phù hợp, sau đó sử dụng HPTLC xây dựng hình ảnh sắc ký đồ chuẩn và các thông

sô phân tích sắc ký đồ của dịch chiết Dừa cạn trong methanol, để tạo thêm các

dữ liệu giúp việc kiểm nghiệm chính xác, hiệu quả hơn

quan sal tf anh siing la ngoai bmk: sonj: 254nnri

TctalHeigíit 23173 9 Tolal Area ; 3901 65

(.Ịiu in Siii ơ a n l i s â i i i : t r a i i i ! SLÍII k i l l Ị i l u t n

2.2.3 ĐẠI

Tổns quan

Cây Đại được trồng làm cảnh ở rất nhiều nơi, đặc biệt là quanh đền

chùa bởi Đại có dáng cây đẹp, cho nhiều hoa, hoa lại rất thơm, sắc màu tươi sáng Hơn thế nữa, Đại còn có nhiều bộ phận có thể dùng làm thuốc trong dân gian: vỏ thân, vỏ rễ, hoa đại, thậm chí cả nụ hoa và lá tươi

Đại có tên khoa học là Plumería acutifolia Apocynaceae (họ Trúc đào),

về thành phần hoá học: Đại có các chất thuộc nhóm iridoid, alcaloid, trong hoa có một ít tinh dầu mùi thơm ngát [3] [9] [10] [17]

Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh hoa Đại có tác dụng hạ huyết

áp (hoa khô có tác dụng mạnh hofn), không làm giãn mạch, không có tác dụng với ngoại biên mà là trung tâm Tác dụng hạ huyết áp xuất hiện nhanh (nhanh hơn Ba gạc) và khá bển vững Y học cổ truyền dùng thuốc sắc hoa Đại chữa sốt, ho, viêm ruột cấp, bí tiểu tiện, huyết áp cao Nước sắc vỏ thân Đại chữa thuỷ thũng, tiểu tiện ít hoặc táo bón lâu ngày, viêm chân răng

* Tiêu chuẩn kiểm nghiệm

Dược điển Việt Nam III có quy định các tiêu chuẩn kiểm nghiệm vị thuốc hoa Đại, vỏ thân Đại: Các tiêu chuẩn kiểm nghiệm về đặc điểm dược liệu, bột, vi phẫu (vỏ thân) Với hoa Đại còn có các yêu cầu về định tính bằng

hoặc địch chiết hoa Đại, định lượng, tỷ lệ hoa màu đen,

Kết quả thưc nshiêm

Đặc điểm hình thái bên ngoài

* Mô tả cây

Cây nhỡ, cao 5-6m, cành mập, dễ gẫy Lá mọc so le, xít nhau, thường tập trung ở đầu cành Phiến lá to, dày, nguyên, dài 15-35cm, rộng 5-lOcm,

phiến thuôn ở gốc, mặt nhẵn bóng, gân giữa nổi rõ Hoa màu trắng, rất thơm,

họng màu vàng Quả đại Toàn cây có nhựa mủ trắng.(Ảnh 3a)

* Mô tả dược ỉiệu

Hoa Đại: Thu hái vào tháng 5 đến tháng 8 Hoa khô, nhẹ, quăn queo, cánh mỏng, rời từng cánh hoặc xoắn lại với nhau, dài 3-4cm Màu vàng nâu, mùi thơm nhẹ, vị hơi đắng

0,1-0,3cm, nhẵn, mảnh nhỏ thường cong, giòn, dễ bẻ gẫy, mảnh dày phảng hofn Mặt ngoài màu nâu xám hay xám mốc, có lớp màng mỏng nhăn nheo, dễ bong ra, để lộ lần vỏ màu nâu, sù sì, mặt trong màu nâu nhạt, ráp Vị đắng (Ảnh3b)

Đặc điểm hiển vi

* Đặc điểm vi phẫu

Vi phảu vỏ thân Đại: Từ ngoài vào trong có: Lớp bẩn cấu tạo bởi vài hàng tế bào hình chữ nhật, kích thước khá đều đặn, xếp sít nhau Mô mềm vỏ gồm những tế bào hình đa giác không đều, có các tinh thể calci oxalat hình khối, rải rác có các đám mô cứng Libe kém phát triển, tia ruột chia libe thành từng đám (Ảnh 3c)

* Đặc điểm bột dược liệu

Hoa Đại: Bột màu nâu, vị hơi ngọt, mùi thơm Soi dưới kính hiển vi thấy: Mảnh cánh hoa, mảnh biểu bì cánh hoa gồm những tế bào màng mỏng ngoằn ngoèo, màu vàng nhạt Mảnh mạch vạch, mạch vòng Hạt phấn hìnhcầu, vàng nhạt, mép nhẩn, có 3 lỗ nảy mầm

Các đặc điểm bột hoa Đại khồng có gì sai khác so với đặc điểm bột đãđược chụp ảnh và mô tả trong tài liệu [14]

v ỏ thân Đại: Bột màu xám, vị đắng Soi dưới kính hiển vi thấy: Mô mềm vỏ là các tế bào hình đa giác khá đều đặn, xếp xít nhau Tế bào mô cứng hình dạng không nhất định, có kích thước 0,04-0,2mm, rời nhau hay đứng thành đám Tinh thể calci oxalat hình khối, đường kính 0,015-0,02mm Các hạt tinh bột hình tròn nhỏ, đường kính khoảng 0,005mm, đôi khi có những hạt hình bầu dục, thường đứng riêng rẽ, rốn hạt khá rõ (Ảnh 3d)

Nhận xét: Đặc điểm hiển vi, đặc điểm hình thái của các mẫu dược liẹu

nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với các tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III

Định tính về mặt hoá học

* Định tính bằng phương pháp HPTLC

Dược liệu được đun hồi lưu cách thuỷ với methanol trong 30 phút

Tiến hành sắc ký như đã nêu ở phần phương pháp nghiên cứu mục 2.1.2 với hệ dung môi khai triển:

Hoa đại: Cloroform - methanol - amoniac 25%(TT) [50:9:1]

Vỏ đ ạ i : Ethylacetat - cloroform - acid formic [8:1:1]

Có kết quả:

- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc kỹ

đồ dịch chiết hoa Đại trong methanol quan sát uv 254nm (Hình 3.1)

- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc ký

đổ dịch chiết hoa Đại trong methanol quan sát ở uv 366nm (Hình 3.2)

- Sắc ký đổ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc ký

đồ dịch chiết hoa Đại trong methanol quan sát ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử hiện màu Dragendorff (Hình3.3)

- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc

ký đồ dịch chiết vỏ thân Đại trong methanol quan sát dưới uv 254nm (Hình 3.4)

- sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc ký

đồ dịch chiết vỏ thân Đại trong methanol quan sát dưới uv 366nm (Hình 3.5)

- Sắc ký đồ, đường cong biểu diễn và bảng số liệu các thông số của sắc ký

đồ dịch chiết vỏ thân Đại trong methanol quan sát ở ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử hiện màu Dragendorff (Hình3.6)

Nhận xét\ Dược điển Việt Nam III không có tiêu chuẩn định tính vỏ

Đại Với hoa Đại, yêu cầu định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi khai triển: Cloroform - methanol - amoniac 25%(TT) (50 : 9 : 1) và chất chuẩn là ajmalin Tiến hành định tính hoa Đại như trong Dược điển (không có chất chuẩn), sắc ký đổ các mẫu dược liệu sau khi phun thuốc thử Dragendorff đều xuất hiện 2 vết như yêu cầu Dược điển Q iúng tôi đã nghiên cứu chạy sắc ký dịch chiết hoa Đại, vỏ Đại trong methanol với nhiều hệ dung môi khai triển khác nhau và nhân thấy hai hệ trên cho các vết tách rõ, ổn định Riêng với hoa Đại, khi phun thuốc thử Dragendorff, trên sắc ký đồ thấy xuất hiện 3 vết, nhưng các vết mờ rất nhanh khi thuốc thử bay hơi dần, do đó rất khó để chụp ảnh, bởi vây chúng tôi dùng thuốc thử hiện màu Vanilin trong acid sulfuric

Kết luận

Chúng tôi đã bổ sung các hình ảnh màu về đặc điểm hình thái, đặc điểm hiển vi vỏ thân, hoa Đại

Theo Dược điển phải sử dụng sắc ký ldfp mỏng với chất chuẩn ajmalin

và cách chiết rất phức tạp để định tính Tuy nhiên ta có thể sử dụng phương pháp đơn giản hơn, đó là chiết bằng methanol và xây dựng hình ảnh sắc ký chuẩn bằng HPTLC của vỏ Đại, hoa Đại

3d Ảnh 3a Cây Đại

Ảiứi 3b, Vị thuốc hoa Đại Ảnh 3c Vị thuốc vỏ Đại Ảnh 3d Vi phẫu vỏ Đại

1 N

Q

t

\-Anh 3e M6t s6 dac di^m b6t v6 Dai

1 Tinh th^ calci oxalat 2 Hat tinli b6t 3 T6"bao ciing

T otaiH eight 15073 Total Area 303189