Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris (l fr ) link thu thập và sưu tầm từ việt nam, trung quốc và nhật bản

Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài nấm Cordyceps militaris là cơ sở khoa học quan trọng được xem như yếu tố quyết định đến sự thành bại của việc nuôi trồng thể quả nấm nhân tạo..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

-

Lê Thị Xuân

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM ĐÔNG

TRÙNG HẠ THẢO CORDYCEPS MILITARIS THU THẬP VÀ SƯU

TẦM TỪ VIỆT NAM, TRUNG QUỐC VÀ NHẬT BẢN

Chuyên ngành: Quản lý bảo vệ tài nguyên rừng

Mã số: 60.62.68

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PSG TS PHẠM QUANG THU

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học tại trường Đại học Lâm nghiệp, nhằm vận dụng kiến thức đã học vào thực tiễn, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và khả năng tổng hợp phân tích vấn đề tác giả tiến hành thực hiện Luận văn tốt nghiệp cao học

Trong quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn, tác giả đã nhận được nhiều

sự quan tâm, giúp đỡ và đóng góp của cán bộ Phòng nghiên cứu Bảo vệ Thực vật rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Khoa đào tạo sau Đại học – Trường Đại học Lâm nghiệp, từ gia đình và bạn bè đồng nghiệp Tác giả xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ đó Đặc biệt tác giả muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Phạm Quang Thu, người thầy trực tiếp hướng dẫn khoa học đã tận tình quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt quá trình thực hiện

Luận văn được hoàn thiện trên cơ sở tham khảo nhiều tài liệu có liên quan và

ý kiến đóng góp của nhiều nhà chuyên môn và sự nỗ lực của tác giả Tuy nhiên do khả năng, điều kiện và thời gian còn hạn chế, chủ đề nghiên cứu hoàn toàn mới nên luận văn không tránh khỏi những thiếu sót Tác giả rất mong nhận được ý kiến đóng góp, xây dựng của các nhà khoa học cũng như của bạn bè đồng nghiệp để Luận văn được hoàn thiện

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 9 năm 2010

Tác giả

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa……… i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các bảng vii

Danh mục các hình vii

Đặt vấn đề 1

Chương 1 Tổng quan nghiên cứu 3

1.1 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước 3

1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 15

1.3 Nhận xét đánh giá từ các công trình nghiên cứu ở trong và ngoài nước 19

Chương 2 Mục tiêu, đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 21

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21

2.2 Đối tượng nghiên cứu 21

2.3 Nội dung nghiên cứu 21

2.3.1 Sưu tập, phân lập và lưu trữ nguồn gen các chủng nấm Cordyceps militaris 21

2.3.2 Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết 21

2.3.3 Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng nấm 21

2.3.4 Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi trên môi trường dịch thể 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 22

2.4.1 Dụng cụ, thiết bị và môi trường dinh dưỡng 22

2.4.2 Phương pháp sưu tập, phân lập và lưu trữ nguồn gen các chủng nấm Cordyceps militaris 22

2.4.2.1 Sưu tập nguồn gen 22

2.4.2.2 Phân lập chủng nấm từ các mẫu Cordyceps militaris thu thập ở Việt Nam 22

2.4.2.3 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm Cordyceps militaris 23

2.4.2.4 Lưu trữ và bảo quản nguồn giống 23

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết 24

2.4.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi 24

2.4.3.2 Phương pháp nghiên cứư ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi 24

2.4.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi 25

2.4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi 25

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm 25

2.4.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm thu được 25

2.4.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng nấm thu được 26

2.4.5 Phương pháp nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi ở môi trường dịch thể 26

2.4.5.1 Phương pháp xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể 26

2.4.5.2 Phương pháp xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy 27

2.4.5.3 Phương pháp xác định thời gian thu hoạch 27

2.4.5.4 Phương pháp sấy thu hoạch sản phẩm hệ sợi nuôi cấy 28

2.4.5.5 Phương pháp sản xuất bột nấm Cordyceps militaris 28

Chương 3 Kết quả nghiên cứu 29

3.1 Sưu tập, phân lập và lưu trữ nguồn gen các chủng nấm Cordyceps militaris 29 3.1.1 Sưu tập các chủng nấm từ Trung Quốc và Nhật Bản 29

3.1.2 Kết quả phân lập các mẫu nấm Cordyceps militaris thu thập ở Việt Nam 30

3.1.2.1 Đặc điểm hình thái và giải phẫu các mẫu nấm thu thập được ở Việt

Nam 30

3.1.2.2 Kết quả phân lập các chủng nấm thu thập ở Việt Nam 34

3.1.2.3 Đặc điểm hình thái hệ sợi các chủng nấm thu thập được ở Việt Nam 35 3.1.3 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm trong nuôi cấy thuần khiết 36

3.1.4 Lưu trữ và bảo quản nguồn giống 38

3.2 Đặc điểm sinh học của hệ sợi nấm trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết 40

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi 40

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng của nấm 43

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng của nấm 44 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi 46 3.2.5 Tổng hợp nhân tố sinh thái cơ bản tối ưu cho sinh trưởng của nấm 47

3.3 Nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm thu được 48

3.3.1 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm Cordyceps militaris 48

3.3.2 Bước đầu đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng nấm thu được 51 3.4 Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi trên môi trường dịch thể 54

3.4.1 Xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể thu sinh khối hệ sợi 54 3.4.2 Xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy 58

3.4.3 Xác định thời gian thu hoạch 61

3.4.4 Thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy 63

3.4.5 Quy trình sản xuất bột nấm Cordyceps militaris 65

Kết luận 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Danh mục các bảng

Bảng 3.1: Tổng hợp các chủng nấm Cordyceps militaris thu thập ở Việt Nam 35

Bảng 3.2: Tốc độ sinh trưởng các chủng nấm Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo 38

Bảng 3.3: Sinh trưởng các chủng nấm sau thời gian lưu trữ và bảo quản 38

Bảng 3.4: Kết quả xác định môi trường dinh dưỡng tối ưu cho sinh trưởng của hệ sợi nấm 41

Bảng 3.5: Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng của hệ sợi nấm 43

Bảng 3.6: Kết quả xác định độ ẩm tối ưu cho sinh trưởng của hệ sợi nấm 45

Bảng 3.7: Kết quả xác định pH môi trường tối ưu cho sinh trưởng của nấm 46

Bảng 3.8: Tổng hợp nhân tố sinh thái cơ bản tối ưu cho sinh trưởng của nấm 48

Bảng 3.9: Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của nấm Cordyceps militaris 49

Bảng 3.10: Kết quả so sánh khả năng kháng nấm Fusarium oxysporum 52

Bảng 3.11: Kết quả xác định môi trường dịch thể nhân sinh khối hệ sợi tối ưu 55

Bảng 3.12: Kết quả xác định tốc độ lắc tối ưu cho sinh trưởng của hệ sợi nấm 58

Bảng 3.13: Sinh khối hệ sợi nấm sau những khoảng thời gian nuôi khác nhau 61

Bảng 3.14: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau 63

Danh mục các hình

Hình 1.1: Nấm C militaris nuôi trồng thử nghiệm tại Viện KHLNVN………… 19

Hình 3.1: Hệ sợi Cordyceps militaris CM 30

Hình 3.2: Hệ sợi Cordyceps militaris F1010 30

Hình 3.3: Hệ sợi Cordyceps militaris F1012 30

Hình 3.4: Hệ sợi Cordyceps militaris F1080 30

Hình 3.5: Nấm Cordyceps militaris HL1 32

Hình 3.6: Nấm Cordyceps militaris HL2 32

Hình 3.7: Nấm Cordyceps militaris HL22 32

Hình 3.8: Nấm Cordyceps militaris HL34 33

Hình 3.9: Bào tử vô tính Cordyceps militaris HL34 33

Hình 3.11: Bào tử hữu tính C militaris HL34 33

Hình 3.12: Nấm C.militaris HL35 34

Hình 3.13: BT hữu tính C.militaris HL35 34

Hình 3.14: BT hữu tính C.militaris HL35 34

Hình 3.15: Hệ sợi Cordyceps militaris HL2 36

Hình 3.16: Hệ sợi Cordyceps militaris HL22 36

Hình 3.17: Hệ sợi Cordyceps militaris HL34 36

Hình 3.18: Hệ sợi Cordyceps militaris HL35 36

Hình 3.19: Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm của các chủng Cordyceps militaris 37

Hình 3.20: Sinh trưởng của hệ sợi sau thời gian lưu trữ và bảo quản 39

Hình 3.21: C.militaris HL2 sau 06 tháng cất giống 40

Hình 3.22: C.militaris CM sau 21 tháng cất giống 40

Hình 3.23: Sinh trưởng hệ sợi nấm trên môi trường dinh dưỡng khác nhau 42

Hình 3.24: Sinh trưởng hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ không khí khác nhau 44

Hình 3.25: Sinh trưởng của nấm ở thang độ ẩm không khí khác nhau 46

Hình 3.26: Sinh trưởng của nấm ở các pH môi trường khác nhau 47

Hình 3.27: Khả năng kháng khuẩn của các chủng nấm Cordyceps militaris 50

Hình 3.28: Khả năng kháng khuẩn của các chủng Cordyceps militaris 51

Hình 3.29: Khả năng kháng nấm F oxysporum của nấm Cordyceps militaris 53

Hình 3.30: Khả năng kháng nấm F oxysporum của nấm Cordyceps militaris 54

Hình 3.31: Chủng CM nuôi cấy trong môi trường dịch thể 56

Hình 3.32: Sinh khối hệ sợi nấm trên các môi trường dịch thể khác nhau 57

Hình 3.33: Chủng Cordyceps militaris Việt Nam 57

Hình 3.34: Chủng Cordyceps militaris Sưu tầm 57

Hình 3.35: Sinh khối hệ sợi nấm ở các tốc độ lắc khác nhau 59

Hình 3.36: Thời gian lắc liên tục 61

Hình 3.37: Thời gian lắc cách nhật 61

Hình 3.38: Sinh khối khô hệ sợi ở các thời gian thu hoạch khác nhau 62

Hình 3.39: Hệ sợi nấm trước khi thu hoạch 63

Hình 3.40: Thời gian sấy khô hệ sợi nấm ở các thang nhiệt độ khác nhau 64

Hình 3.41: Hệ sợi nấm C militaris sấy khô 65

Hình 3.42: Bột nấm C militaris 65

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộng hoặc sâu trưởng thành một số loại côn trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành của một số loài côn trùng nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh Sợi nấm xâm nhiễm

và hút các chất dinh dưỡng trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Người ta thường đào lấy cả xác sâu và nấm để làm thuốc Vì mùa đông nấm ký sinh trên sâu, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là đông trùng hạ thảo (ĐTHT)

Loài nấm Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link là đối tượng nghiên cứu của đề

tài, nấm ký sinh ở giai đoạn nhộng của côn trùng, mùa hạ mọc thành cây nấm vì vậy

một số tác giả gọi là Nhộng trùng thảo Nấm Cordyceps militaris là loài nấm được

đánh giá cao về giá trị dược liệu, nhờ có hợp chất cordycepin trong thành phần hoá học của thể quả nấm Đây là hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của quá trình sinh tổng hợp mới của các tế bào ung thư Tác dụng kìm hãm của các tế bào ung thư

vú, ung thư phổi, ung thư máu cũng được nhiều nhà khoa học như: Yoo H.S et al.,

2004 [33]; Ahn Y.J et al., 2000 [16]; Kim G.Y và đồng tác giả (2006) [22] đã

nghiên cứu và phát hiện Theo y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng để điều trị các chứng rối loạn nhịp lipit máu, rối loạn nhịp tim, viêm thận mạn tính, cao huyết áp, ung thư phổi, thiểu năng sinh dục và viêm gan B mạn

tính Nấm Cordyceps militaris đã được Nan J.X và đồng tác giả (2001) chứng

minh có hiệu quả chữa trị bệnh rối loạn chức năng gan Ngoài ra nấm này còn có tác dụng chống viêm và kìm hãm sự oxy hoá của lipit và lipoprotein Không chỉ vậy

loài nấm Cordyceps militaris còn được phát hiện có hàm lượng dinh dưỡng cao:

giàu các vitamin A, vitamin B6, vitamin B12, vitamin B3, vitamin B1, có hàm lượng protein khá cao (40,69%), nhiều nguyên tố khoáng như Zn, Se, Cu Như vậy

giá trị của loài nấm Cordyceps militaris là vô cùng quý giá

Hiện tại loài nấm Cordyceps militaris đã được phát hiện ở các nước Trung

Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc Việt Nam là nước có nhiều nét tương đồng với các khu hệ nấm này Qua điều tra sơ bộ của Phòng nghiên cứu Bảo vệ thực vật rừng - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cũng đã phát hiện loài nấm này có mặt tại

vùng núi cao Việt Nam Nấm Cordyceps militaris ngoài tự nhiên rất hiếm và khó

tìm, xuất hiện theo mùa, mặt khác giá trị của Đông trùng hạ thảo đã được nhiều người biết đến và chú tâm do đó nhu cầu khai thác loài này sẽ rất lớn Vì vậy, việc nhân nuôi và gây trồng nhân tạo thành công loài nấm này có ý nghĩa vô cùng to lớn trong việc bảo tồn và phát triển loài Đây là loài nấm không dễ phân lập và nhân nuôi trên môi trường nhân tạo, và không thể nhân nuôi thành công nếu như không biết được đặc điểm sinh học của chúng Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài

nấm Cordyceps militaris là cơ sở khoa học quan trọng được xem như yếu tố quyết

định đến sự thành bại của việc nuôi trồng thể quả nấm nhân tạo

Chính những lý do trên đề tài tiến hành “Nghiên cứư đặc điểm sinh học

của các chủng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link thu

thập và sưu tầm từ Việt Nam, Trung Quốc và Nhật Bản ” nhằm góp phần bảo

tồn, nghiên cứu ứng dụng và phát triển bền vững các loài Đông trùng hạ thảo quý hiếm Thành công của đề tài sẽ có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu khoa học và y học nước nhà, đặc biệt là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu quy trình nuôi trồng nhân tạo loại nấm thần dược này

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước

Nghiên cứu về phân loại, thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo đông trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non hoặc nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số loại côn trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành của một

số loài nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm cho côn trùng chết Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao điều kiện thuận lợi hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân sâu Người ta thường đào lấy cả xác sâu và nấm để làm thuốc Vì mùa đông nấm ký sinh trên sâu, mùa hạ mọc thành cây nấm nên có tên là đông trùng hạ thảo Đông trùng hạ thảo thường được tìm thấy ở các vùng núi cao trên 3000 m so với mặt nước biển, Ở Trung Quốc nấm được phát hiện thấy ở vùng cao nguyên Tây Tạng và Tứ Xuyên Đối tượng nghiên cứu của đề

tài là loài nấm Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link, nấm ký sinh ở giai đoạn nhộng

của côn trùng, mùa hạ mọc thành cây nấm vì vậy một số tác giả gọi là Nhộng trùng thảo

Chi nấm Cordyceps đã được thu mẫu và định loại trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại truyền thống các loài này được xếp vào họ Clavicipitaceae

Dựa trên đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về cấu trúc phân tử, các loài nấm

trên được xếp trong 162 đơn vị phân loại, bao gồm các chi chủ yếu là: Cordyceps, Elaphocordyceps, Metacordyceps và Ophiocordyceps thuộc 2 họ Cordycipitaceae

và Ophiocordycipitaceae (Gi-Ho Sung et al 2007) [19]

Michael Kuo (2006) đã mô tả đặc điểm phân bố, đặc điểm hình thái, giải

phẫu và ảnh minh họa của 2 loài Đông trùng hạ thảo là loài nấm Cordyceps militaris và loài Cordyceps ophioglossoides [38] Năm 1753 Linnaeus một nhà nghiên cứu nấm đã đặt tên cho loài nấm này với tên gọi ban đầu là Clavaria

militaris và ông cũng chính là người đầu tiên đặt tên cho nấm Năm 1833 nhà nghiên cứu nấm học tên Link đã quyết định đổi tên gọi thành Cordyceps militaris vì theo ông nấm này thuộc chi Cordyceps, từ đó tên chính thức đầy đủ của nấm cho đến ngày nay là Cordyceps militaris (L) Link, chữ L trong ngoặc đơn là chữ cái viết

tắt của tên Linnaeus nhằm ghi nhận công lao tới người đã đặt tên đầu tiên cho loài nấm Chữ Link là tên của nhà khoa học quyết định loài nấm này thuộc chi

Mao X.L (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh họa

cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, đó là các loài: Cordyceps barnesii Thwaites, Cordyceps capiata (Holmsk.:Fr.) Link., Cordyceps crassispora Zang, Yang et Li, Cordyceps gunii (Berk.) Berk., Cordyceps hawkesii Gray, Cordyceps kyushuensis Kobayasi, Cordyceps martialis Gray, Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link., Cordyceps nutans Pat., Cordyceps ophioglossoides (Ehrenb.) Link., Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc., Cordyceps sobolifera (Hill.) Berk Et Br., Cordyceps tubeculata (Leb.) Maire [26]

Sung Jae Mo (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái và hình ảnh của 25 loài nấm

thuộc chi Cordyceps phân bố ở Hàn Quốc, bao gồm các loài sau: Cordyceps adaesanensis, C agriota Kawamura, C bifisispora, C crassispora, C discoideocapiata, C formicarum, C gemiculata, C gracilis, C heteropoda, C ishikariensis, C kyushuensis, C martialis, C militaris, C nutans, C ochraceostromata, C ophioglossoides, C oxycephala, C pentatoni, C pruinosa, C rosea, C scarabaeicola, C sinensis, C sphecocephala, C tricentri, C yongmoonensis [16 ]

Tại Nhật Bản, Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) đã mô tả và giới thiệu

bằng hình ảnh 33 loài nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps, đó là các loài: Cordyceps agriota, C longissima, C yakushimensis, C sobolifera, C heteropoda,

C tricentri, C coccidiicola, C nutans, C pruinosa, C crinalis, C militaris, C takaomontana, C neovolkiana, C nakazawai, C purpureostromata, C ferruginosa,

C nigripoda, C roseostromata, C annullata, C clavata, C atrovirens, C

gracilioides, C michiganensis., C subssesilis, C stylophora, C macularis, C discoideocapitata, C sphecocephala, C japonensis, C japonica, C ophioglossoides, C capita, C intermedia f michinoluensis [32]

Như vậy, loài nấm Cordyceps militaris có phân bố ở cả 3 nước Trung Quốc,

Nhật bản và Hàn Quốc Các khu hệ nấm này có nhiều nét tương đồng với Việt Nam

Nghiên cứu về thành phần hóa học của nấm Đông trùng hạ thảo

Các phân tích hoá học cho thấy trong sinh khối (biomass) của Đông trùng hạ

thảo Cordyceps militaris có 17 a xít amin khác nhau, D-mannitol, lipit và nhiều

nguyên tố khoáng (Se, Zn, Cu ) Quan trọng hơn là trong sinh khối có nhiều chất

có hoạt tính sinh học mà các nhà khoa học phát hiện được nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự nhiên Nhiều hoạt chất này có giá trị dược liệu thần

kỳ Trong đó phi kể đến cordeceptic acid, cordecepin, adenosine, adenosine Đáng chú ý hơn cả là nhóm chất HEAA (Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs) và chứa nhiều loại vitamin Theo số liệu của Viện sinh thái ứng dụng thuộc Viện Hàn lâm khoa học Trung Quốc, thành phần hóa học của thể quả nấm

hydroxyethyl-Cordyceps militaris như sau:

Hợp chất cordycepin là một hợp chất quan trọng, quyết định phẩm chất, chất

lượng của nấm Đông trùng hạ thảo (Mina Masuda et al., 2005) [27] Cordycepin

(3’-deoxyadenosine) là một dạng nucleotide có hoạt tính sinh học phổ rộng, thường được chuyển đổi thành 5’-mono, di và triphosphate, hợp chất này ức chế sự hoạt động của quá trình sinh tổng hợp mới của các tế bào ung thư Những nghiên cứu của Trung Quốc, Hàn Quốc và Mỹ tập trung chủ yếu vào tuyển chọn và nâng cao

hàm lượng cordycepin trong thể quả hoặc trong dịch nuôi cấy hệ sợi Khi nuôi cấy

hệ sợi trên môi trường lỏng, nấm đã sản sinh ra cordycepin, hàm lượng đạt 26,8 mg/lít Nếu cung cấp đủ lượng oxy cho quá trình nuôi cấy, hàm lượng này được tăng lên nhiều từ 114,8 đến 167,5 mg/lít (Xian-Bing Mao và Jian-Jiang Zhong, 2004) [36] Tuy nhiên sản lượng cordycepin thu được từ thể quả nấm phụ thuộc vào khối lượng theo thể tích dung môi chiết xuất, thời gian chiết xuất và nồng độ của cồn làm dung môi Sản lượng đạt cực đại khi sử dụng cồn có nồng độ 20,21%, thời gian chiết xuất là 101,88 phút, khối lượng dung môi là 33,13 ml/gam thể quả nấm

(Jiang-Feng Song et al., 2007) [21]

Như vậy qua phần phân tích ở trên, hợp chất cordycepin là một hợp chất

quan trọng, quyết định phẩm chất, chất lượng của nấm Đông trùng hạ thảo

Nghiên cứu về giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu truyền thống của Trung Quốc và chữa trị được nhiều bệnh nan y Y thuật Trung Quốc coi đây là một vị thuốc quý từ cách đây 1500 năm Tên Đông trùng hạ thảo được ghi chép là vị thuốc lần đầu trong cuốn Bản cương mục đời Minh của Lý thời Trần Dược tính theo Đông y là vị ngọt, tính ấm, đơi độc, nó nhập vào kinh Phế và kinh Thận Một câu chuyện kể rằng năm 1993, Trung Hoa lục địa tổ chức một Đại hội thể thao vớii sự tham gia của nhiều Quốc gia Một nhóm 9 nữ lực sĩ Trung Hoa đã toàn thắng về môn chạy đua Thành tích của họ đã làm cho giới thể thao kinh ngạc vì cả 9 “lực sĩ gái” đã phá kỷ lục, chạy 42 giây trên kỷ lục quốc tế Trước kết quả đó người ta nghi ngờ có sự gian lận, tuy nhiên kết quả điều tra đã cho biết họ lập được thành tích kỳ diệu như vậy là nhờ sử dụng Đông trùng hạ thảo [41]

Tháng 10 năm 2004, trong một phóng sự đường trường về dãy Hymalaya do đài BBC (Anh Quốc) thực hiện, phóng viên Michael Palin đã tuyên bố với cả thế

giới rằng “Đông trùng hạ thảo có thể trị được tất cả các bệnh”

Lần đầu tiên, y học phương Tây đã công nhận tính năng bổ dưỡng của một

loại nấm có tên là Cordyceps, được người Trung Quốc phát hiện cách đây 1500

năm Chiết xuất từ thảo mộc này có thể giúp người trung niên lấy lại sự cân đối sau

nhiều năm phải ngồi nhiều do công việc Phát biểu tại một hội thảo của hiệp hội Sinh lý học Mỹ, các nhà khoa học thuộc trung tâm Pharmanex, California, đã khẳng

định nấm Cordyceps có thể nâng cao sức luyện tập, khả năng chịu đựng và làm

giảm mệt mỏi ở những người trong độ tuổi 40-70 Nhóm đã phát triển một loại

thuốc có tên là Cordymax chứa chiết xuất của nấm Cordyceps được thử nghiệm trên

131 người tình nguyện trong 12 tuần và cho kết quả khả quan [44]

Qua đánh giá khả năng tập luyện, sức chịu đựng và những thay đổi trong chuyển hóa của số người thử nghiệm vào các giai đoạn trước, trong và sau khi thử

nghiệm, các chuyên gia nhận thấy lượng tiêu thụ Oxy ở nhóm dùng Cordyceps tăng lên 5,5% Huyết áp tâm trương ở nhóm dùng Cordyceps cũng giảm 3,2% Đồng thời khoảng thời gian đi bộ quãng đường 1,6 km của nhóm dùng Cordyceps cũng giảm

29 giây, trong khi nhóm kia tăng nhẹ Tất cả đều chứng tỏ rằng đã có sự gia tăng thể

lực ở những người đã sử dụng nấm Cordyceps Y văn Trung Quốc đã nhấn mạnh

tác dụng cải thiện chức năng phổi và thận của loại nấm này Ngoài ra, nấm

Cordyceps đã được chứng minh là loại thảo dược làm gia tăng hệ miễn dịch trong

ngừa và trị bệnh ung thư, tăng lực và tăng tinh trùng, có tác dụng bổ thận, phổi, tăng

sản xuất máu huyết Trong nấm Cordyceps chứa 8% chất béo, 25% protein, 29%

carbohydrate, 4% chất khoáng vi lượng; uracil, uridin, adenine, adenosine acid cordicepic có tính kháng sinh (Furuya, 1983) và 3 protein chống ung thư O-N, SN-C

và CO-1 (Yingetal, 1987) Theo Pereira trong “Tạp chí y học New York” cho rằng

Cordyceps có những tính chất tương tự Nhân sâm, dùng để phục hồi cơ thể sau khi bị

kiệt quệ hoặc do bệnh kéo dài [43]

Dưới góc nhìn Tây y Đông trùng hạ thảo không chỉ được đông y coi là vị thuốc quý Tây y cũng có rất nhiều nghiên cứu về loài nấm này và khẳng định, nó

có thể nâng cao hệ miễn dịch, giải độc thận, tăng cường chức năng gan và khả năng tình dục Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy, đông trùng hạ thảo có rất nhiều công dụng và liều sử dụng như: [42]

Tăng sức bền: Liều 3 g đông trùng hạ thảo mỗi ngày cho kết quả tốt trong việc gia

tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mạn tính Một thí nghiệm

thực hiện năm 2004 tại Mỹ cho thấy những người ở độ tuổi 40-70 có sức khỏe tốt nếu được dùng trích tinh đông trùng hạ thảo trong 12 tuần đã có sự gia tăng sức bền thể lực so với nhóm đối chỉ dùng giả dược

Cải thiện chức năng gan: Kết quả một nghiên cứu thực hiện trên 70 bệnh nhân viêm

gan B hoặc xơ gan cho thấy, loại nấm này giúp cải thiện chức năng gan Một thí nghiệm khác thực hiện trên 33 bệnh nhân viêm gan B cũng cho kết quả tương tự

Giải độc cho thận: Thử nghiệm được thực hiện trên 21 bệnh nhân cao tuổi theo liệu

trình điều trị với amikacine (một kháng sinh rất độc cho thận), người ta quan sát thấy bệnh nhân có sử dụng nấm thì thận được bảo vệ tốt hơn, giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chiếu dùng giả dược Kết quả một nghiên cứu khác trên 51 bệnh nhân bị suy thận chỉ dùng nấm đông trùng hạ thảo thì thấy có cải thiện chức năng thận và hệ miễn dịch Một thử nghiệm khác cũng được thực hiện trên 69 bệnh nhân ghép thận, kết quả là nấm đã làm giảm độc tính của cyclosporine trên thận

Nâng cao khả năng miễn dịch: Một thí nghiệm kéo dài 5 năm trên 61 bệnh nhân bị

bệnh lupus cho thấy, việc dùng đông trùng hạ thảo với liều 3-4 g/ngày và artémisinine (0,6 g/ngày) đã làm giảm sự tái diễn căn bệnh tự miễn này Trong một thí nghiệm khác với các bệnh nhân bị ung thư giai đoạn tiến triển, người ta kết luận rằng các bệnh nhân được điều trị bằng loại nấm này đã được cải thiện chức năng miễn dịch và nâng cao chất lượng cuộc sống

Kích thích chức năng tình dục: 5 nghiên cứu tại Trung Quốc với trên 1.000 người

tham gia ở cả 2 phái với liều lượng 3 g/ngày cho thấy, nấm này có hiệu quả trong việc kích thích chức năng tình dục ở những người bị giảm sút

Làm dịu triệu chứng bệnh hô hấp: Nhiều nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy, nấm

đông trùng hạ thảo tỏ ra hữu hiệu trong việc làm dịu các triệu chứng của nhiều bệnh

hô hấp, cụ thể là viêm phế quản mạn tính

Làm giảm LDL-cholesterol trong máu: Nghiên cứu trên 273 người tại Trung Quốc

bị cao lipid máu với liều 3 g/ngày đã làm giảm lượng cholesterol toàn thể và giúp gia tăng cholesterol tốt

Một số nghiên cứu khác về lợi ích của Đông trùng hạ thảo cũng cho kết quả tương tự như sau [45]

Đông Trùng hạ Thảo Duy trì cung cấp Cholesterol Healthy: Một số nghiên cứu đã

chứng minh rằng Đông trùng hạ thảo giúp hạ thấp cholesterol tổng số 10-21% và chất béo trung tính bởi 9-26% Đồng thời nó giúp làm tăng HDL-cholesterol tới 27-30%

Tăng cường hệ thống miễn dịch: Một số nghiên cứu đã cho thấy Đông trùng hạ thảo

làm tăng tế bào giết chết tự nhiên - Natural Killer cells (NK), là một phần chính của

hệ miễn dịch bẩm sinh Nghiên cứu trong ống nghiệm, Đông trùng hạ thảo nâng cao đáng kể hoạt động của tế bào NK ở người khỏe mạnh cũng như ở bệnh nhân bệnh bạch cầu Theo một nghiên cứu được xuất bản tại Trung Quốc, Trùng Thảo tăng cường các hoạt động tế bào NK ở người khỏe mạnh bằng 74%, và tăng hoạt động

NK của bệnh nhân ung thư máu bằng 400% cải tiến các hoạt động tương tự của tế bào NK đã được tìm thấy ở bệnh nhân ung thư hắc tố

Tăng khả năng cung cấp năng lượng và giảm mệt mỏi: Một vài nghiên cứu với

động vật đã chứng minh rằng ĐTHT làm tăng quá trình sản xuất năng lượng tế bào

và cung cấp oxy Trùng Thảo làm tăng tổng hợp Adenosine-5`-triphosphate (ATP)

là một nucleotide đa chức năng, là đơn vị cơ bản của sản xuất năng lượng, qua đó phát huy hiệu quả oxy tốt hơn, năng lượng phục hồi, và giảm mệt mỏi nhanh hơn Trong một nghiên cứu lâm sàng đối với cá nhân cao tuổi và mệt mỏi, sau khi uống Trùng Thảo bổ sung trong 30 ngày, 92% cá nhân đang cho thấy giảm mệt mỏi, 89% cho thấy giảm cảm giác lạnh, 83% cho thấy giảm chóng mặt Trùng Thảo đã được chứng minh lâm sàng để gia tăng năng lượng tế bào sinh học càng nhiều càng tốt 55% Đối với các cá nhân là người cao tuổi sử dụng 3 gam Trùng Thảo một ngày cho thấy giảm đáng kể mệt mỏi và cải thiện khó thở

Giúp tăng khả năng chịu đựng và hiệu suất thể lực: Trùng Thảo giúp làm giảm đau

nhức cơ bắp, tăng cường phục hồi, cải thiện khả năng chịu đựng và tính năng thể thao Trong một nghiên cứu với những con chuột đã chứng tỏ khả năng bơi lội được cải thiện sau sáu tuần bổ sung ĐTHT so với một nhóm không sử dụng

Tăng cường chức năng tình dục: Trùng Thảo có thể giúp cải thiện ham muốn tình

dục và chất lượng cuộc sống ở nam giới và phụ nữ trải qua sự thất vọng tình dục Trong một nghiên cứu với 200 người (đàn ông nhiều gấp đôi) bị giảm ham muốn tình dục và các vấn đề tình dục khác, kết quả cho thấy ĐTHT tăng cường đáng kể chức năng tình dục của họ 64% số người dùng ĐTHT đã được cải thiện đáng kể chức năng tình dục so với 24% nhóm không sử dụng Theo kết quả công bố trên Tạp chí Sức khỏe & Bổ Sung về kết quả nghiên cứu giữa nhóm người được sử dụng ĐTHT và nhóm dùng giả dược thì 21 phụ nữ cao tuổi trải qua sự thất vọng tình dục

đã được bổ sung ĐTHT cho kết quả đã có 90% số người cải thiện ham muốn tình dục và sức khoẻ tình dục sau khi sử dụng Trùng Thảo, so với nhóm dùng giả dược Cũng trong một nghiên cứu lâm sàng liên quan đến 189 người đàn ông và phụ nữ có ham muốn tình dục giảm và mong muốn, 66% cho thấy sự cải thiện các triệu chứng

và mong muốn sau khi Trùng Thảo bổ sung

Chức năng cải thiện khả năng sinh: Trùng Thảo giúp cải thiện khả năng sinh sản

bằng cách tăng số lượng tinh trùng Theo một nghiên cứu công bố trên tạp chí

“Chuẩn đoán và điều trị”, 22 con đực với số lượng tinh trùng thấp được sử dụng Trùng Thảo bổ sung trong 8 tuần Kết quả cho thấy tăng 33% số lượng tinh trùng, 29% giảm tỷ lệ dị dạng tinh trùng và tỷ lệ sống sót của tinh trùng tăng 79%

Duy trì chức năng hô hấp: Một số nghiên cứu khoa học đã chứng minh những lợi

ích của ĐTHT trong việc giảm các triệu chứng của nhiều bệnh hô hấp bao gồm viêm phế quản mãn tính và bệnh suyễn Trong kết quả nghiên cứu với 30 tình nguyện viên người cao tuổi dùng ĐTHT đã được cải thiện đáng kể khả năng đồng hóa oxy

Chức năng nâng cao sức khỏe tim mạch: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh những

lợi ích của ĐTHT về rối loạn nhịp tim và suy tim mãn tính Trong một thí nghiệm gây viêm trên cơ thể sống của chuột, kết quả nghiên cứu cho thấy động vật dùng Trùng Thảo đã có một tỷ lệ sống sót tăng đáng kể, tỷ lệ tử vong 20% so với cũ là 80% trong 30 phút, đáng chú ý là đã cải thiện đến 400%

Duy trì chức năng gan khỏe mạnh: Trong một nghiên cứu được công bố trên sứ

dược vật học Trung Quốc, liên quan đến 33 bệnh nhân bị “viêm gan B", 8 bệnh nhân bị xơ gan uống bổ sung ĐTHT cho thấy đã cải thiện được 71,9% về tỷ lệ albumin và glubolin và cải thiện 78,6% về SGPT (Serum Glutamic Pyruvic

Duy trì chức năng thận khỏe mạnh: Theo “Tạp chí y học Trung Quốc” cho biết

bệnh nhân bị bệnh thận mãn tính đã cải thiện 51% sau một tháng được bổ sung

ĐTHT

ĐTHT kết hợp với điều trị hoá chất: Một số nghiên cứu lâm sàng đã được thực hiện

tại Trung Quốc và Nhật Bản với bệnh nhân ung thư được điều trị bằng Đông trùng

hạ thảo với liều điều trị 6 gam/ngày (tương đương 4 viên nang hai lần mỗi ngày) Trong một nghiên cứu với 50 bệnh nhân ung thư phổi Đông trùng hạ thảo kết hợp với hóa trị liệu, giảm kích thước khối u ở 46% bệnh nhân

Theo y học cổ truyền của Trung Quốc, nấm Đông trùng hạ thảo được dùng

để điều trị thành công các chứng rối loạn lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi và thiểu năng sinh dục Tại Viện nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc), Nấm Đông trùng hạ thảo đã được dùng để chữa liệt dương có hiệu quả tốt

Những năm gần đây, rất nhiều tính chất dược lý của loài nấm này được nghiên cứu một cánh khoa học và đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành được thể hiện thông qua một số công trình tiêu biểu như sau:

Nan J.X và đồng tác giả (2001) [28] chứng minh nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris có hiệu quả để chữa trị bệnh rối loạn chức năng gan Tác dụng

chống ung thư được đề cập đến trong nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả ở

nhiều quốc gia trên thế giới Dịch chiết từ thể quả Cordyceps militaris có tác dụng

chống ung thư, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách giảm sự biểu hiện của bFGF, một trong những nhân tố kích thích quá trình

này Do có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có thể ngăn chặn

được quá trình di căn và sự phát triển của tế bào ung thư (Yoo H.S et al., 2004)

[33] Dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng kìm hãm sự phát triển của tế

bào ung thư vú, ung thư phổi (Ahn Y.J et al., 2000) [16] Dịch chiết bằng nước ấm nấm Cordyceps militaris có tác dụng kìm hãm sự phát triển của dòng tế bào ung thư

máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thông qua sự hoạt

hoá enzym caspase-3 (Lee H et al., 2006) [24] Thí nghiệm của Kim G.Y và đồng

tác giả (2006) [22] cũng cho kết quả tương tự với khả năng điều trị ung thư máu của

dịch chiết từ nấm Cordyceps militaris Các nhà khoa học cũng đã sử dụng dịch chiết

từ loài nấm này để thử nghiệm trên các dòng tế bào bình thường và các dòng tế bào ung thư Kết quả cho thấy hai dòng tế bào K562 (tế bào ung thư máu-leukemia) và Du145 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt-prostate carcinoma) bị ức chế mạnh bởi dịch chiết bằng dung môi butanol Dịch chiết xuất bằng nước từ nhộng trùng thảo làm kích thích sự trưởng thành về mặt hình thái và chức năng của tế bào dạng cây, một trong những loại tế bào quan trọng nhất trong việc trình diện kháng nguyên

Theo kết quả nghiên cứu của Hong SH, Lee JY và đồng tác giả, 2005 về sự

ức chế tăng trưởng của tế bào bạch cầu U937 của dịch chiết xuất từ C militaris Theo các nhóm tác giả thì Nhộng trùng thảo C militaris là một thành phần dược

thảo truyền thống, đã được sử dụng cho bệnh nhân bị ung thư trong y học phương Đông Kết quả nghiên cứu đã xác định được cơ chế sinh hoá của hiệu ứng chống

tăng nhanh do dịch chiết xuất của C militaris với tế bào bạch cầu U937 [40]

Chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy được thể hiện trong công trình nghiên cứu của Won S.Y và Park E.H (2005) [35] Ahn Y.J và đồng tác giả (2000) [16] cho rằng nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số virut, vi khuẩn và nấm Ngoài ra nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp Chất chống oxy hoá có trong nhộng trùng thảo có vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa một số bệnh gây ra bởi một loạt phản ứng oxy hoá dẫn đến việc phá hoại ADN, protein và các phân tử lớn khác Những hiện tượng

trên dẫn đến sự thoái hoá hoặc làm tăng mức độ của một số bệnh như: lão hoá, hen, viêm nhiễm, xưng tấy và ung thư (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004; Balaban R.S et al., 2005) [23] Một số chất chống oxy hoá đã được tổng hợp nhân tạo như butylated hydroxyanisole Do đó, việc sử dụng nhộng trùng thảo trong việc chống

Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả trên giá thể và nuôi cấy sinh khối hệ sợi

Nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris được tiến

hành ở nhiều nước trên thế giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Mỹ Tại Trung Quốc có các trang trại lớn chuyên nuôi trồng loài nấm này ở các tỉnh: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tô Chỉ tính một trang trại nuôi trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được 100.000 kg sản phẩm Sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã

có mặt ở nhiều nước trên thế giới kể cả các nước phương Tây và mang lại lợi nhuận

cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm (Li Cui et al., 2008) [25] Tại

Thái Lan, Patcharaporn Wongsa và đồng tác giả (2005) đã nghiên cứu phân lập và

sự sinh trưởng của hệ sợi và hình thành bào tử chồi của nấm Cordyceps unilateralis

ký sinh kiến Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) và môi trường MEA (Malt Extract Agar) được dùng để phân lập và nuôi cấy hệ sợi [29]

Jae Sung Kim và đồng tác giả (2006), tại Hàn Quốc, đã sử dụng nhộng tằm

để nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris Nhộng tằm được đựng trong trong

cường độ ánh sáng 500-700 lux đã hình thành mầm thể quả Nuôi cấy thu sinh khối

hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O [22]

Hai loài Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc và Cordyceps militaris (L ex Fr.)

Link được tập trung nghiên cứu nuôi trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi

nhiều nhất (Russell R., Paterson M., 2008) [30] Duck-Hyun Cho và đồng tác giả (2000) [18] tại Hàn Quốc, đã tiến hành nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi của 3

chủng ký hiệu là CHO-7208; CHO-7845; CHO-7846 của loài Cordyceps militaris trên môi trường dinh dưỡng và quá trình hình thành thể quả nấm Cordyceps militaris với giá thể là sâu non loài Allomyrina dichotoma Linnaeus Kết quả cho

thấy sự sinh trưởng của hệ sợi của các chủng khác nhau là khác nhau trong nuôi cấy thuần khiết Chỉ có 2 chủng CHO-7208 và CHO-7846 hình thành thể quả khi sử

dụng sâu non Allomyrina dichotoma Linnaeus làm giá thể Chiều dài của thể quả đạt

51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy

xuất thể quả mấm Cordyceps militaris với giá thể là 3 loài nhộng cánh phấn (Mamestra brassicae, Spodoptera litura và Bombyx mori) và một loài nhộng cánh cứng Coleoptera (Tenebrio Molitor) Bằng cách tiêm dịch chiết lên cơ thể côn trùng Kết quả là nấm Cordyceps militaris đã giết chết 4 loài nhộng và hình thành

hợp nhất cho nấm nảy mầm và hình thành thể quả đồng bộ so với nhộng của bộ cánh cứng [22]

Nhộng trùng thảo được xí nghiệp dược phẩm tỉnh Cát Lâm – Trung Quốc phân lập được từ năm 1986, năm 1990 đã được nuôi cấy thành công trong nồi lên men Năm 1994 đã được đưa vào sản xuất lớn trên nhộng tằm, sau đó lại thành công trong việc nuôi cấy trên các môi trường nhân tạo như gạo, tiểu mạch, ngô… Còn tại thành phố Hayward, bang California, Mỹ, Công ty công nghệ sinh học BIOKEN đã

nuôi trồng quy mô công nghiệp loài nấm Cordyceps militaris Sản phẩm được tiêu

thụ trong nước và thị trường quốc tế

trên toàn thế giới đã được cải thiện nên thị trường thực phẩm chữa bệnh có tiềm năng rất lớn Giá trị sản xuất các mặt hàng thực phẩm chữa bệnh đạt 70 tỷ nhân dân

tệ ở Trung Quốc năm 2004 Nhật bản đạt mỗi năm 3,6 tỷ đô la mỹ trong những năm

1990 Mỹ đạt mỗi năm 3,5 tỷ đô la mỹ trong những năm 1990 Các sản phẩm thực

phẩm chức năng và thuốc từ Cordyceps militaris chiếm thị phần lớn Một số ví dụ

về giá sản phẩm được sản xuất từ nguồn nguyên liệu Cordyceps militaris như sau:

sản phẩm viên nang Ultraceps được sản xuất từ Cordyceps của công ty Zeolite với giá 41,95 đô la mỹ/lọ, 90 viên/lọ, 650 mg/viên Cordygen5 với giá 19,95 đô la mỹ/lọ 90 viên [34]

1.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Nghiên cứu về thành phần loài các loài nấm ký sinh côn trùng và nấm Đông trùng hạ thảo

Các loài nấm ký sinh côn trùng như Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae đã được nghiên cứu về những vấn đề khác nhau như điều tra thành

phần loài, loài sâu bị ký sinh, phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm và đặc biệt là nhân sinh khối, tạo chế phẩm để phòng trừ một số loài sâu hại đối với cây

nông nghiệp và cây lâm nghiệp Phân lập và sử dụng nấm Beauveria để phòng trừ mọt hại nông sản (Lê Doãn Diên et al., 1994) [1] Nghiên cứu sản xuất với quy mô

công nghiệp và thử nghiệm trên diện rộng chế phẩm nấm ký sinh côn trùng

Beauveria và Metarhizium được thể hiện nhiều trong các công trình nghiên cứu của (Phạm Thị Thùy et al., 1994) [11]

Kết quả nghiên cứu của Phòng Vi sinh ứng dụng thuộc Viện Sinh thái Nhiệt đới và Trung tâm về kỹ thuật di truyền và Công nghệ sinh học Quốc gia Thái Lan (2007) thực hiện khảo sát sự hiện diện và phân bố nấm côn trùng tại vườn quốc gia Cát Tiên Kết quả thu được 259 mẫu trong đó có 39 mẫu trên mặt đất, trên lá cây rừng là 220 mẫu Thuộc 41 loài trong 17 chi nấm ký sinh côn trùng, trong đó có cả chi Cordyceps.[13]

Nghiên cứu về thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo:Trịnh Tam Kiệt (1996) [4], Trịnh Tam Kiệt và đồng tác giả (2001) [5], đã nêu danh mục các loài

nấm Đông trùng hạ thảo có ở Việt Nam thuộc họ Clavicipitaceae có 3 loài thuộc chi

Cordyceps đó là Cordyceps martialis Speg., Cordyceps sinensis (Berk) Sacc và loài Cordyceps sobolifera (Hill) Berk & Br Các tác giả đã ghi nhận nấm Đông trùng hạ

thảo có phân bố ở các tỉnh của Việt Nam như: Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh

Đặc biệt trong vài năm gần đây đã có một số kết quả nghiên cứu về nấm Đông trùng hạ thảo được công bố trên tạp chí chuyên ngành, trong đó nhiều loài lần

đầu được phát hiện ở Việt Nam như: Lần đầu phát hiện loài Cordyceps militaris,

một loài Nhộng trùng thảo đặc biệt quý tại Vườn quốc gia Hoàng Liên (Phạm

Quang Thu và Nguyễn Mạnh Hà, 2009) [9] Loài Cordyceps gunnii cũng được phát

hiện đầu tiên ở Vườn quốc gia Tam Đảo (Phạm Quang Thu, 2009) [7] Tại Khu bảo

tồn thiên nhiên Tây Yên Tử cũng phát hiện loài Đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans lần đầu phát hiện ở Việt Nam (Phạm Quang Thu, 2009) [6] Phạm Quang

Thu, Lê Thị Xuân (2009) [8], đã công bố kết quả điều tra phát hiện 8 loài nấm ký sinh côn trùng từ rừng tự nhiên và rừng trồng bạch đàn ở Việt Nam, trong đó phát

hiện được 5 loài thuộc chi Cordyceps thì có 2 loài Cordyceps tuberculata (Lebert) Maire và Cordyceps oxycephala Penz & Sacc lần đầu tiên được mô tả cho khu hệ nấm lớn của Việt Nam Loài Cordyceps takaomontana lần đầu được phát hiện và

mô tả ở Việt Nam (Phạm Quang Thu & Nguyễn Mạnh Hà, 2010) [10]

Nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị dược liệu nấm Đông trùng hạ thảo

Đỗ Tất Lợi (1977) [2] cho rằng Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ, dùng

để chữa trị thần kinh suy nhược, chữa ho, ho lao, bổ tinh khí, chữa đau lưng, bổ thận Liều dùng 6-12 gam với hình thức ngâm rượu

Theo tài liệu tổng hợp của y học cổ truyền Việt Nam thì ĐTHT có tác dụng

bổ phế và thận, ích khí, chỉ huyết và trừ đờm Chủ trị: trị ho lâu ngày, yếu mệt, thổ huyết, nhiều mồ hôi, di tinh, đau lưng mỏi gối Thận kém biểu hiện như bất lực, xuất tinh và đau lưng dưới và đầu gối: Dùng ĐTHT với Sơn thù du, Sơn dược và

Thỏ ti tử, hoặc dùng độc vị ĐTHT Ho và hen mạn tính hoặc ho có đờm máu, do phế hư: Dùng ĐTHT với Sa sâm, A giao và Xuyên bối mẫu Ra mồ hôi nhiều do cơ thể mệt, ốm: ĐTHT nấu với thịt gà, vịt hoặc heo [15]

Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp và Nguyễn Thế Hải (2005) đã tổng quan các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc, Hàn Quốc và tài liệu ở các nước

phương Tây về giá trị dược liệu của loài nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris và Cordyceps sinensis Các loài nấm này có thể dùng để chữa trị cho 25

loại bệnh khác nhau nên các tác giả đã gọi nấm Đông trùng hạ thảo là thần dược bao gồm các tác dụng: [14]

1-Chống lại tác dụng xấu của các tân dược đối với thận, thí dụ đối với độc tính của Cephalosporin A

2-Bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thưng do thiếu máu 3-Chống lại sự suy thoái của thận, xúc tiến việc tái sinh và phục hồi các tế bào tiểu quản ở thận

4-Làm hạ huyết áp ở người cao huyết áp

5-Chống lại hiện tượng thiếu máu ở cơ tim6- Giữ ổn định nhịp đập của tim 7-Tăng cường tính miễn dịch không đặc hiệu

8- Điều tiết tính miễn dịch đặc hiệu

9-Tăng cường năng lực thực bào của các tế bào miễn dịch

10-Tăng cường tác dụng của nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trương nở các nhánh khí quản

11-Tăng cường dịch tiết trong khí quản và trừ đờm

12-Làm chậm quá trình lão hoá của cơ thể

13- Hạn chế bệnh tật của tuổi già

14-Nâng cao năng lực chống ung thư của cơ thể

15- Chống lại tình trạng thiếu oxygen của cơ thể

16- Tăng cường tác dụng lưu thông máu trong cơ thể

17- hạn chế tác hại của tia gamma đối với cơ thể

18- Tăng cường tác dụng an thần, trấn tĩnh thần kinh

19-Tăng cường việc điều tiết nồng độ đường trong máu

20-Làm giảm cholesterol trong máu và chống xơ vữa động mạch

21-Xúc tiến tác dụng của các nội tiết tố (hormone)

22- Tăng cường chức năng tiêu hoá và hấp thu các chất dinh dưỡng

23- Ức chế vi sinh vật có hại, kể cả vi khuẩn lao

24- Kháng viêm và tiêu viêm

25- Có tác dụng cường dương và chống liệt dương

thảo như sau [12]:

* Rượu trùng hạ thảo nhân sâm: Đông trùng hạ thảo và nhân sâm lượng bằng nhau,

ngâm trong rượu tốt, mỗi ngày uống một chén nhỏ Công dụng: Bổ thận, tráng dương dùng cho người bị suy nhược, liệt dương

* Canh đông trùng hùng áp: Đông trùng hạ thảo 10g, vịt đực 1 con, rượu trắng,

gừng tươi, hạt tiêu, gia vị vừa đủ Vịt làm thịt rồi bỏ Đông trùng hạ thảo vào trong bụng, hầm nhừ, cho gia vị, ăn thịt, uống nước, mỗi tuần một lần Công dụng: Bổ hư, trợ dương dùng cho người bị liệt dương, suy giảm ham muốn tình dục

Một số cách chế biến theo lương y Bàng Cấm và Trần Duy Linh từ đông trùng hạ thảo như sau:

* Hầm với sườn heo: 6 - 9 gram đông trùng hạ thảo (ĐTHT), nhân sâm, kỷ tử,

đương quy (mỗi thứ 12 g) và một lượng sườn heo vừa đủ, cùng các gia vị, tất cả đem hầm để ăn trong ngày Món này có tác dụng bồi bổ cơ thể, chống mệt mỏi, mất sức, thận hư lao, tinh thần kém minh mẫn, hay quên

* Hầm với thịt dê: ĐTHT 18g, độ nửa ký thịt dê, 30 gr hoài sơn, 15 gr câu kỷ tử, 4

lát gừng tươi, 4 quả chà là, cùng gia vị vừa đủ Rửa sạch thịt dê, cắt lát (hơi to một chút), rồi trụng qua nước sôi để khử mùi ĐTHT, kỷ tử, chà là, hoài sơn rửa sạch Cho tất cả cùng một lượng nước vừa đủ vào nồi đất, nấu đến khi sôi thì hạ lửa nhỏ hầm tiếp trong 2 giờ Dùng cả cái lẫn nước, một tuần có thể dùng 2 - 3 lần Có công dụng trị chứng tiểu đêm và hoạt tinh, tinh loãng

Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả

trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps sinensis Tuy nhiên,

những thông tin này đều tập hợp từ các nguồn tài liệu tham khảo của Trung Quốc Chưa có những nghiên cứu ở Việt Nam [3]

Nghiên cứu về nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở Việt Nam cho đến nay mới ở bước đầu, chưa có tài liệu nào được công

bố Phạm Quang Thu (2007) đã thử nghiệm nuôi trồng thể quả trên giá thể nhân tạo

chủng nấm CM1 loài Cordyceps militaris, chủng giống đang nuôi trồng với quy mô

công nghiệp tại Quảng Châu, Trung Quốc Kết quả đã thu được thể quả nấm phát triển bình thường trên giá thể xem Hình 2.1

Hình 1.1: Nấm C militaris nuôi trồng thử nghiệm tại Viện KHLNVN

1.3 Nhận xét đánh giá từ các công trình nghiên cứu ở trong và ngoài nước

nước và trong nước cho thấy: Nấm Đông trùng hạ thảo là một loài nấm có giá trị dược liệu quý, chữa trị được nhiều loài bệnh nan y như ung thư, kháng khuẩn, chống oxy hóa và các bệnh về yếu sinh lý…

tiến hành nghiên cứu với trình độ cao ở nhiều nước trên thế giới và đạt được kết quả tốt Thực tế cho thấy tại Trung Quốc, Hàn Quốc và Mỹ, kỹ thuật nuôi trồng loài nấm này đã đạt được trình độ cao và được thực hiện trên quy mô công nghiệp Chỉ

tính một trang trại nuôi trồng loài nấm này tại Kaiping, Quảng Châu, sản lượng một năm thu được 100.000 kg sản phẩm Sản phẩm nấm đông trùng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới kể cả các nước phương Tây và mang lại lợi nhuận cao cho các doanh nghiệp và người nuôi trồng nấm Nhiệt độ

nuôi trồng thể quả trên giá thể nhân tạo

được công bố vào năm 1996 và đến 2010 có khoảng 12 loài nấm thuộc chi

Cordyceps, trong đó có 8 loài lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam Về thành

phần hóa học và giá trị dược liệu chưa được nghiên cứu nhiều, từ các nguồn tài liệu khác nhau các nhà khoa học đã khẳng định nấm Đông trùng hạ thảo là một dược liệu quý và hiếm Nhiều bài thuốc có giá trị liên quan đến Đông trùng hạ thảo đã được lưu truyền để chữa các bệnh nan y và tăng cường sức khỏe

CM là loài nấm Cordyceps militaris Đây là chủng nấm đang nuôi trồng quy mô

công nghiệp tại Trung Quốc Những nghiên cứu bước đầu cho thấy chủng nấm này phát triển tốt trong điều kiện ở Việt Nam và đã hình thành thể quả thành thục trên giá thể nhân tạo

thảo ở Việt Nam là rất cần thiết Để đạt được mục tiêu như trên, việc cần thiết là tiến hành điều tra ở một số vùng sinh thái để thu hái thể quả, phân lập thuần khiết các chủng nấm ở Việt Nam, kết hợp với sưu tập các chủng giống ở các nước trong khu vực như Trung Quốc, Nhật Bản để lưu trữ nguồn gen, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các loài nấm sưu tầm được, kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở cho việc xây dựng một mô hình và quy trình nuôi trồng nấm trên giá thể nhân tạo sau này mà trong đó sử dụng nguồn nguyên liệu sẵn có và dễ áp dụng trong điều kiện Việt Nam

Chương 2 MỤC TIÊU - ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Nắm được một số đặc điểm sinh học, đặc điểm của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết của các chủng nấm thu thập và sưu tập được

Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng nấm thông qua hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm

2.2 Đối tượng nghiên cứu

- Chủng nấm phân lập được từ Việt Nam: 4 chủng

- Chủng nấm sưu tập từ trang trại nuôi trồng nấm của Trung Quốc: 1 chủng

- Chủng nấm sưu tập từ ngân hàng gen ở Nhật Bản: 3 chủng

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Sưu tập, phân lập và lưu trữ nguồn gen các chủng nấm Cordyceps militaris

- Sưu tập các chủng nấm từ Trung Quốc và Nhật Bản

- Phân lập các chủng nấm từ các mẫu Cordyceps militaris thu thập ở Việt Nam

- Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm Cordyceps militaris trong nuôi cấy thuần

khiết

- Lưu trữ và bảo quản giống gốc

2.3.2 Đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sự sinh trưởng của hệ sợi

- Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của hệ sợi

- Tổng hợp nhân tố sinh thái cơ bản tối ưu cho sinh trưởng của hệ sợi nấm

2.3.3 Bước đầu nghiên cứu hoạt tính sinh học của các chủng nấm

- Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm thu được

- Đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng nấm thu được

2.3.4 Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi trên môi trường dịch thể

- Xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể thu sinh khối hệ sợi

- Xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy

- Xác định thời gian thu hoạch hệ sợi nấm

- Xác định thời gian sấy sản phẩm hệ sợi nuôi cấy

- Tóm tắt quy trình sản xuất bột nấm Cordyceps militaris

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Dụng cụ, thiết bị và môi trường dinh dưỡng

- Dụng cụ sử dụng: Que cấy, đèn cồn, dao chuyên dụng, dao, kéo, kẹp, hộp lồng

(đĩa Petri), lam kính, la men, thước đo, bình tam giác, lọ thuỷ tinh, ống cất giống, bình hút ẩm loại lớn, Pipet, dụng cụ đục giếng khoan, Dây lọc và một số dụng cụ khác

- Thiết bị: Máy ảnh kỹ thuật số, kính hiển vi soi nổi Olympus SZ-PT, kính hiển vi quang học Olympus BX50, máy đo pH, cân điện tử, tủ cấy, tủ định ôn, tủ sấy, tủ lắc, tủ lạnh, nồi hấp…

- Nguồn lưu trữ tài liệu: sổ ghi chép, máy tính

2.4.2 Phương pháp sưu tập, phân lập và lưu trữ nguồn gen các chủng nấm Cordyceps militaris

2.4.2.1 Sưu tập nguồn gen

Thu thập và sưu tập các chủng nấm Cordyceps militaris từ trang trại nuôi

trồng nấm và ngân hàng gen của các nước Trung Quốc và Nhật Bản nhờ các mối quan hệ đã có

2.4.2.2 Phân lập chủng nấm từ các mẫu Cordyceps militaris thu thập ở Việt Nam

Đặc điểm hình thái và giải phẫu: Nhận biết đặc điểm hình thái qua quan sát,

mô tả, chụp ảnh (hình dạng, kích thước, màu sắc…) bằng mắt thường và kính hiển

vi soi nổi Phương pháp giải phẫu được thực hiện trên kính hiển vi soi nổi Olympus SZ-PT, kính hiển vi quang học Olympus BX50, tách các mô tế bào để xem đặc điểm vi học của nấm như thể quả, túi bào tử, bào tử, đoạn bào tử (hình dạng, kích thước, màu sắc, cách thức sắp xếp…)

Phân lập: Môi trường phân lập nấm Đông trùng hạ thảo là môi trường PDA

trong thời gian 20 phút sau đó được đổ vào các hộp lồng vô trùng Chọn mô nấm tươi mới, non không bị sâu bệnh Dùng cồn 70% rửa bề mặt nấm, tách lấy mô nấm bên trong thể quả cấy vào môi trường dinh dưỡng, sau khi cấy xong cất giữ mẫu

nấm cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới Sau khi tách sợi nấm khoảng 2- 3 lần, sợi nấm không bị nhiễm khuẩn, nấm tạp, và sợi nấm mọc đồng nhất thì được sợi nấm thuần khiết

Đặc điểm hệ sợi nấm thu thập được ở Việt Nam trong nuôi cấy thuần khiết: Các chủng nấm được cấy trên môi trường PDA và được nuôi trong tủ định ôn có

sắc, và đo tốc độ sinh trưởng của hệ sợi và khả năng sinh bào tử vô tính (bào tử chồi) của nấm Sử dụng phương pháp quan sát, mô tả, đo đếm và chụp ảnh dưới sự

hỗ trợ của kính hiển vi soi nổi

2.4.2.3 Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm Cordyceps militaris

Nấm sau khi phân lập được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng PDA ở

vuông góc, lấy giá trị bình quân, đơn vị tính là mm Tốc độ sinh trưởng của nấm được tính theo công thức:

T(μm/giờ) = Đường kính bình quân (mm)/(số giờ nuôi cấy)

2.4.2.4 Lưu trữ và bảo quản nguồn giống

Giống nấm sau khi phân lập được sợi nấm thuần khiết, chọn những đĩa nấm còn non hoặc bánh tẻ tiến hành cất giống và bảo quản nguồn giống Giống được lưu

đương với 1at thời gian 30 phút Sau khi chuyển giống nấm vào lọ băng kín, ghi tên

thực hiện trong điều kiện vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn

Trong quá trình bảo quản, định kỳ kiểm tra sự sống của hệ sợi nấm 6 tháng một lần bằng cách cấy truyền giống nấm đang bảo quản lên môi trường dinh dưỡng,

và tiếp tục cất giống Đánh giá kết quả lưu trữ, bảo quản giống bằng tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết

2.4.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi

Thí nghiệm được thực hiện với 5 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau, chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi)

+ PDA: Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar)

+ P10: Môi trường PDA + 10% Peptone

+ P20: Môi trường PDA + 20% Peptone

+ N10: Môi trường PDA + 10% Nhộng tằm

+ N20: Môi trường PDA + 20% Nhộng tằm

vào các hộp lồng sạch, để nguội và cấy nấm Mỗi loài nấm được cấy trên 5 hộp lồng, thí nghiệm lặp lại 3 lần Sinh trưởng của hệ sợi đánh giá qua đường kính vòng sinh trưởng Đường kính đo theo hai chiều vuông góc, số liệu thu thập và phân tích bằng bằng phần mềm SPSS

2.4.3.2 Phương pháp nghiên cứư ảnh hưởng của nhiệt độ không khí đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi

Sau khi cấy nấm vào hộp lồng chứa môi trường thích hợp (được lựa chọn trong thí nghiệm môi trường dinh dưỡng), đặt vào các thang nhiệt độ không khí

sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi) Mỗi loài nấm được cấy trên 5 hộp lồng, thí nghiệm lặp lại 3 lần Phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS

2.4.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm không khí đến sinh trưởng

và phát triển của hệ sợi

Phương pháp được tiến hành theo Both.C, pha NaCl với nồng độ khác nhau

để tạo ra các thang độ ẩm không khí khác nhau: 75%, 80%, 85%, 90%, 95% và 100%, cụ thể như sau:

Dung dịch pha xong đổ vào bình hút ẩm loại lớn, đậy nắp lại để ở nhiệt độ thích hợp như đã chọn trong mục 2.4.2.3, sau 3 ngày trong bình hút ẩm sẽ có độ ẩm không khí đã tạo Nấm được cấy vào các hộp lồng chứa môi trường như đã chọn trong mục 2.4.2.2 và đặt vào các thang độ ẩm không khí như trên Đo đường kính

hệ sợi nấm theo hai chiều vuông góc và lấy trị số bình quân Mỗi loài nấm được cấy trên 5 hộp lồng, thí nghiệm lặp lại 3 lần Phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS

2.4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH môi trường đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi

Thí nghiệm nuôi cấy nấm trong các thang pH khác nhau: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 và 8,5 Điều chỉnh pH của môi trường bằng dung dịch HCl 10% và KOH 10% Sau khi đã điều chỉnh pH môi trường đem hấp khử trùng ở

trường (đã chọn như mục 2.4.2.2) có độ pH khác nhau theo dõi ở thang nhiệt độ và

độ ẩm không khí thích hợp (đã chọn ở trên) Chỉ tiêu đánh giá là sinh trưởng của hệ sợi, và sự hình thành bào tử vô tính (bào tử chồi) Mỗi loài nấm được cấy trên 5 hộp lồng, thí nghiệm lặp lại 3 lần Số liệu được xử lý bằng phần mềm SPSS

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính của các chủng nấm

2.4.4.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm thu được

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm Cordyceps militaris bằng dung dịch nấm Cordyceps militaris theo phương pháp khuếch tán giếng khoan

trên môi trường PDA của Ajay Kumar, Pragati Saini và J N Shrivastava, 2009 [17]

cách làm như sau:

Chuẩn bị dịch nuôi cấy: Nuôi cấy hệ sợi nấm của các chủng nấm Đông trùng

hạ thảo cần thử hoạt tính trên môi trường lỏng sau 20 - 25 ngày lọc lấy dịch nuôi cấy Các chất có hoạt tính sinh học do hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo tạo ra có trong dịch nuôi cấy

Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn: Khuẩn được chọn để đánh giá hoạt tính

kháng khuẩn của nấm Cordyceps militaris là loài Bacillus subtilis Môi trường PDA được đổ ra các hộp lồng để nguội trang khuẩn Bacillus subtilis đều trên mặt thạch,

giữa hộp lồng khoan lấy 1 giếng thạch có đường kính 10mm, cho 1ml dịch nuôi cấy

đường kính vòng ức chế Mỗi loài nấm thí nghiệm với 5 hộp lồng với 3 lần nhắc lại

2.4.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng nấm của các chủng nấm thu được

Đánh giá hoạt tính kháng nấm: Chuẩn bị dịch nuôi cấy giống như thí nghiệm kháng khuẩn trong mục 2.4.4.1 Môi trường PDA được đổ ra các hộp lồng, giữa hộp lồng khoan lấy 1 giếng thạch có đường kính 10mm, cho 1ml dịch nuôi cấy nấm vào

học khuếch tán ra môi trường PDA Cấy nấm Fusarium oxysporum được chọn làm

đối tượng xác định hiệu lực kháng vào 3 góc của hộp lồng chứa dịch Nuôi cấy nấm

thí nghiệm với 5 hộp lồng và 3 lần nhắc lại

2.4.5 Phương pháp nghiên cứu nuôi cấy sinh khối hệ sợi ở môi trường dịch thể

2.4.5.1 Phương pháp xác định môi trường dinh dưỡng nuôi cấy dịch thể

Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi được tiến hành trên 5 môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau:

TT Công thức Mô tả công thức thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành với 5 bình cùng thể tích, cho 100 ml môi trường,

3 lần lặp; lắc với tốc độ 120 vòng/phút nuôi cấy trong 20 ngày Thu hoạch hệ sợi và tính trọng lượng khô của hệ sợi ở các công thức thí nghiệm

2.4.5.2 Phương pháp xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy

Xác định tốc độ lắc trong quá trình nuôi cấy: Chọn môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng của hệ sợi trong thí nghiệm ở mục 2.4.5.1 Thí nghiệm được tiến hành với 5 bình cùng thể tích, cho 100 ml môi trường, 3 lần lặp Thí nghiệm thực hiện với 4 công thức lắc như sau: CT1 – lắc 100 vòng/phút, CT2 – lắc 120 vòng/phút, CT3 – lắc 150 vòng/phút với thời gian 3 ngày để tĩnh 1 ngày lắc và CT4 – để tĩnh có lắc nhẹ 3 - 5 lần/ngày với 10 phút/lần Thu hoạch hệ sợi ở thời gian đạt hiệu quả cao nhất, tính trọng lượng khô của hệ sợi ở các công thức thí nghiệm

2.4.5.3 Phương pháp xác định thời gian thu hoạch

Xác định thời gian nuôi cấy: Chọn môi trường thích hợp nhất cho sinh trưởng của hệ sợi để thực hiện thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành với 5 bình cùng thể tích, cho 100 ml môi trường, 3 lần lặp; lắc với tốc độ thích hợp nhất đã chọn ở thí nghiệm trên Thu hoạch hệ sợi ở thời gian sau 12, 16, 20, 24 và 28 ngày

nuôi cấy Thu hoạch hệ sợi tính trọng lượng khô của hệ sợi ở các công thức thí nghiệm

2.4.5.4 Phương pháp sấy thu hoạch sản phẩm hệ sợi nuôi cấy

Hệ sợi sau khi thu hoạch được sấy khô ở nhiệt độ thấp có quạt gió với các

quá trình sấy, đóng gói sản phẩm Để xác định được độ ẩm hệ sợi đạt 10 – 12%, áp dụng công thức tính sau:

W(%) = [(M 1 – M 2 )/M2]x100

+ M1 là khối lượng hệ sợi tươi + M2 là khối lượng hệ sợi khô

2.4.5.5 Phương pháp sản xuất bột nấm Cordyceps militaris

Sau khi có nguồn giống, cấy truyền lên môi trường dinh dưỡng PDA, sau 10 -15 ngày sợi nấm mọc bông khoẻ, tiến hành cấy truyền trên môi trường dịch PD vô

rửa qua bằng nước sạch, sấy khô ở nhiệt độ phù hợp, nghiền và đóng gói kín, được

sản phẩm là Bột hệ sợi nấm Cordyceps militaris Sản phẩm được bảo quản ở nhiệt

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Sưu tập, phân lập và lưu trữ nguồn gen các chủng nấm Cordyceps militaris 3.1.1 Sưu tập các chủng nấm từ Trung Quốc và Nhật Bản

Nhờ vào các mối quan hệ đã có, kết quả sưu tập được 4 chủng nấm

Cordyceps militaris từ ngân hàng gen, Viện quốc gia Khoa học Sinh học Nông

nghiệp, 2-1-2 Kannondai, Tsukuba, Ibaraki 305-8602, Nhật Bản và từ trang trại nuôi trồng nấm ở Trung Quốc Các chủng nấm sưu tập được có ký hiệu như sau:

Chủng Cordyceps militaris CM (chủng CM), Chủng Cordyceps militaris F1010 (chủng F1010), Chủng Cordyceps militaris F1012 (chủng F1012), Chủng Cordyceps militaris F1080 (chủng F1080) Đặc điểm hệ sợi nấm của từng chủng

được mô tả dưới đây:

Chủng Cordyceps militaris CM: Hệ sợi nấm lúc đầu màu trắng sau già chuyển

màu ngà và dần dần chuyển màu vàng đậm da cam, sợi nấm dài mọc thẳng, hệ sợi mọc tròn đều về các hướng, bông và dầy 0,6, sinh trưởng tương đối nhanh trên môi trường nhân tạo Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào

tử phân sinh (Hình 3.1)

Chủng Cordyceps militaris F1010: Hệ sợi nấm bông, ngắn, màu trắng, độ dầy hệ

sợi 0,5 Nấm sinh trưởng nhanh, trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh (Hình 3.2)

Chủng Cordyceps militaris F1012: Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết, sợi nấm

có màu trắng già có màu ngà, hệ sợi ngắn, ít bông, hệ sợi mỏng 0,2, hệ sợi sinh trưởng tương đối chậm Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh (Hình 3.3)

Chủng Cordyceps militaris F1080: Hệ sợi nấm màu trắng khi già chuyển màu ngà,

hệ sợi rất bông, độ dày hệ sợi 0,7, nấm sinh trưởng nhanh trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết Trong điều kiện nuôi cấy thuần khiết chưa thấy xuất hiện chồi bào tử phân sinh (Hình 3.4)

3.1.2 Kết quả phân lập các mẫu nấm Cordyceps militaris thu thập ở Việt Nam

Kết quả điều tra thu thập được 5 mẫu nấm có xuất xứ tại Việt Nam bao gồm các mẫu có kí hiệu lần lượt là mẫu HL1, mẫu HL2, mẫu HL22, mẫu HL34 và mẫu HL35 Trong đó phân lập thành công 4 mẫu HL2, mẫu HL22, mẫu HL34, mẫu HL35 và không thành công 1 mẫu HL1

3.1.2.1 Đặc điểm hình thái và giải phẫu các mẫu nấm thu thập được ở Việt Nam

Mẫu nấm HL1: Nấm HL1 có màu vàng, hình trụ thuôn Màu sắc của nấm chia rõ 3

màu, phần chân nấm màu trắng dài bằng 1/3 chiều dài nấm, đỉnh sinh trưởng của nấm chính là phần sinh sản chứa các múi dạng gai có màu vàng da cam dài bằng 1/5 chiều dài của nấm, phần còn lại có màu vàng nhạt hơn, nấm ký sinh trên nhộng (Hình 3.5) Mẫu thu được số lượng ít và nhỏ nên chưa phát hiện được bào tử vô tính

và bào tử hữu tính Dựa trên đặc điểm hình thái, giải phẫu, đối chiếu, so sánh với

chuyên khảo về Cordyceps của Gi-Ho Sung et al (2007) [19], Sung Jae Mo (2000)

[31], Mao X.L.(2000) [26] và Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) [32] mẫu

nấm HL1 được xác định là loài nấm Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link

Mẫu nấm HL2: Nấm có hình chuỳ rất rõ ràng, dài 1 – 1,5cm, màu đỏ da cam, được

mọc từ phần cổ và ngực của nhộng, số lượng nấm mọc trên ký chủ từ 4 – 5 cây Phần sinh sản của nấm có dạng đầu chuỳ khi còn non được phủ một lớp màng trắng mỏng, trên phần hình chuỳ có rất nhiều múi hay còn gọi là thể quả nấm, thể quả nấm bên trong dạng thịt dẻo màu vàng nhạt, bên ngoài được bọc lớp vỏ lụa mỏng màu vàng (Hình 3.6) Chưa phát hiện bào tử vô tính và bào tử hữu tính trên mẫu thu được, do mẫu thu được còn non và chỉ có một mẫu Dựa trên đặc điểm hình thái đối

chiếu, so sánh với chuyên khảo về Cordyceps của Gi-Ho Sung et al (2007) [19],

Sung Jae Mo (2000) [31], Mao X.L.(2000) [26] và Tsuguo Hongo và Masana Izawa

(1994) [32] mẫu nấm HL2 được xác định là loài Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link

Mẫu nấm HL22: Nấm HL22 hình chuỳ, màu đỏ da cam, ruột chất đệm màu vàng

nhạt, dạng thịt dẻo Nấm ký sinh trên phần cổ và đầu của nhộng, số lượng nấm mọc trên một ký chủ có thể có từ 4 đến 5 cây Hình thái của nấm gồm chân nấm (màu vàng nhạt được phủ lớp màng trắng) dài bằng 1/4 chiều dài của nấm, cuống nấm (màu đỏ da cam) dài bằng 2/4 chiều dài nấm và phần sinh sản của nấm dạng hình chuỳ (màu đỏ da cam) có chiều dài bằng 1/4 chiều dài của nấm Trên phần sinh sản của nấm có nhiều múi dạng gai nhọn gọi là thể quả nấm có thể nhìn thấy rất rõ bằng mắt thường trên thể hình chuỳ, thể quả có hình chuông bên trong là thịt dẻo phía ngoài có lớp vỏ mỏng (Hình 3.7) Chưa phát hiện được bào tử vô tính và hữu tính ở mẫu thu được Dựa trên đặc điểm hình thái so sánh, đối chiếu với chuyên khảo về

Cordyceps của Gi-Ho Sung et al (2007) [19], Sung Jae Mo (2000) [31], Mao

X.L.(2000) [26] và Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) [32] mẫu nấm HL22

được xác định là loài nấm Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link

Hình 3.5: Nấm

Cordyceps militaris HL1

Hình 3.6: Nấm Cordyceps militaris HL2

Hình 3.7: Nấm

Cordyceps militaris HL22

Mẫu nấm HL34: Nấm hình chuỳ, màu vàng, hình thái nấm chia thành 2 phần, phần

cuống nấm hình trụ màu vàng nhạt đến da cam mịn, phần hình chuỳ là phần sinh sản có chứa các múi hay còn gọi là thể quả Phần hình chuỳ có hình dạng gần giống hình quả nhót có chiều dài bằng 1/4 chiều dài cây nấm (Hình 3.8) Bên trong thể quả cũng có dạng thịt dẻo màu vàng nhạt, trong đó chứa các túi bào tử, túi bào tử có kích thước chiều dài 750 đến 820m, chiều rộng 5 đến 7,5m, và trong túi bào tử chứa 8 bào tử hữu tính (BTHT) xếp với nhau tạo thành bó, mỗi một bào tử bao gồm rất nhiều đoạn bào tử hợp thành, bào tử dễ gẫy Đoạn bào tử hình trụ nhưng 2 đầu không bằng, kích thước chiều dài 2,4 – 4,5 x 1,2 – 1,9m (Hình 3.10, Hình 3.11) Bào tử vô tính hình dạng không đồng nhất thường là hạt gạo dài, kích thước từ 4,0 –

7 x 2,3 – 3,5m (Hình 3.9) Trên cơ sở đặc điểm hình thái, giải phẫu, đối chiếu, so

sánh với chuyên khảo về Cordyceps của Gi-Ho Sung et al (2007) [19], Sung Jae

Mo (2000) [31], Mao X.L.(2000) [26] và Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994)

[32] mẫu nấm HL34 được xác định là loài nấm Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link