Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)

Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)Tách dòng, thiết kế vector và chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá (LV thạc sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

- - -  - - -

ĐÀO THU TRANG

TÁCH DÒNG, THIẾT KẾ VECTOR

VÀ CHUYỂN GEN LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TÍCH LŨY ASEN

VÀO CÂY THUỐC LÁ

Chuyên ngành sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Lê Thị Bích Thủy

Công trình được hoàn thành tại:

- Phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Bích Thủy

Viện CNSH, Viện HL KHCN VN

Phản biện 1: PGS TS Lê Văn Sơn

Viện CNSH, Viện HL KHCN VN

Phản biện 2: TS Hồ Quỳnh Liên

Viện Hóa sinh biển, Viện HL KHCN VN

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn họp tại:

Nhà A11, tầng 2, Viện Sinh thái và Tài Nguyên sinh vật, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Vào hồi 08 giờ30 ngày 22 tháng 12 năm 2015

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

Tôi xin cảm ơn tập thể các cán bộ phòng Di truyền tế bào thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo cùng cơ sở đào tạo Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi được học tập tại đây

Cuối cùng tôi xin gửi lời biết ơn tới gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên

và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Hà Nội, tháng 12, năm 2015

Học viên

Đào Thu Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 Tổng quan về tình hình ô nhiễm KLN 3

1.1 Tình hình ô nhiễm KLN trên thế giới 3

1.2 Tình hình ô nhiễm kim loại nặng ở Việt Nam 3

2 Tổng quan chung về Asen 5

2.1 Asen và độc tính của asen 5

2.2 Sự phơi nhiễm Asen 6

2.3 Tác động của nhiễm độc Asen đến sức khỏe con người 8

2.4 Điều trị nhiễm độc Asen ở người 8

3 Các phương pháp xử lý ô nhiễm KLN 8

3.1 Phương pháp truyền thống 8

3.1.1 Phương pháp cơ học 9

3.1.2 Phương pháp vật lý và hoá học 9

3.2 Công nghệ xử lý KLN trong đất bằng thực vật 10

3.3 Các nghiên cứu về biện pháp xử lý KLN bằng thực vật sử dụng công nghệ gen 13

3.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới 13

3.3.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 15

4 Chuyển gen ở thực vật 18

4.1 Cơ sở khoa học của chuyển gen thực vật 18

4.2 Giới thiệu chung về vector sử dụng trong chuyển gen thực vật 19

4.2.1 Các hệ thống vector sử dụng trong chuyển gen thực vật 19

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2 Vật liệu nghiên cứu 23

2.2.1 Nguyên vật liệu 23

2.2.2 Hóa chất và thiết bị 23

2.2.2.1 Hóa chất 23

2.2.2.2 Thiết bị 24

2.2.3 Môi trường nuôi cấy 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn 25

2.3.2 Phương pháp tách ARN 25

2.3.3 Phương pháp tổng hợp cDNA 26

2.3.4 Phương pháp xử lý với enzym giới hạn 26

2.3.5 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli 27

2.3.6 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmid của vi khuẩn E.coli 28

2.3.7 Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào A tumefaciens bằng xung điện 29

2.3.8 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A tumefaciens (theo Topping, 1998 ) 29

2.3.9 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thuốc lá 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 32

3.1 Tách dòng gen arsC từ RNA của cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos 32

3.1.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số 32

3.1.2 Phản ứng RT-PCR 32

3.1.3 Biến nạp cấu trúc gen arsC vào vector tách dòng pBT 33

3.1.4 Kiểm tra vector pBT-arsC 34

3.1.5 Xác định trình tự gen trình tự gen arsC 36

3.2 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC 38

3.2.1 Gắn gen arsC vào vector biểu hiện pCambia 1301 38

3.2.2 Kết quả kiểm tra vector pCambia 1301-arsC 40

3.3 Biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301-arsC vào chủng vi khuẩn A

tumefaciens C58 42

3.4 Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC 43

3.5 Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

Deoxyribonucleic Acid Deoxy Nucleoside Triphosphate Ethylene Diamine tetra- acetate Acid Gen mã hóa enzyme β-glucuronidase Kilo base

Môi trường theo Luria và Bertani Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog Naphthalene Acetic Acid

Optical density Polymerase Chain Reaction Ribonucleic Acid

Sodium dodecyl sulfate Tris bazơ – Axit acetic – EDTA Thermus aquaticus

Tế bào khả biến Transferred-DNA Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u Ultraviolet (light)

Virulence region = vùng gây độc

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hình ảnh về Asen 5

Hình 1.2: Mô hình xâm nhiễm của A tumefaciens vào tế bào thực vật 19

Hình 3.1 RNA tổng số tách từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos chưa xử lý Dnase 32

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 33

Hình 3.3 Kết quả tách chiết plasmid pBT- arsC 34

Hình 3.4 Kết quả PCR pBT-arsC với cặp mồi đặc hiệu 35

Hình 3.5 Kết quả cắt pBT-arsC bằng BamHI, M: Marker Fermentas 1kb,1-4: Sản phẩm cắt pBT-ArsC bằng BamHI 35

Hình 3.6 Kết quả cắt pBT-arsC bằng NcoI và Eco72I 36

Hình 3.7 So sánh trình tự đoạn gen phân lập từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos với trình tự được công bố trên ngân hàng gen NCBI (X80057.1) 37

Hình 3.8 Độ tương đồng các axit amin khi so sánh 2 trình tự 38

Hình 3.9 Sơ đồ cấu trúc vector pCambia 1301-arsC 38

Hình 3.10 Sản phẩm cắt plasmid pCambia1301 và pBT-arsC 39

Hình 3.11 Sản phẩm tinh sạch pCambia1301 và gen arsC sau khi cắt bằng enzyme NcoI và Eco72I 40

Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid pCambia1301–arsC 41

Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen arsC 41

Hình 3.14 Sản phẩm cắt pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I 42

Hình 3.15 Kết quả phản ứng Colony- PCR của 10 khuẩn lạc A.tumefaciens C58 được biến nạp pCambia1301- arsC 43

Hình 3.16 Hình ảnh chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen 45

Hình 3.17 Hình ảnh chồi thuốc lá trong môi trường đa chồi bổ sung hygromycin 10mg/l và cefotaxime 500mg/l 45

Hình 3.18 Khả năng ra rễ của các chồi trên môi trường RM hygromycin 10mg/l sau 3 tuần nuôi cấy 46

Hình 3.19 Cây thuốc lá hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất: trấu: cát 47

Hình 3.20 Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng thuốc lá chuyển gen 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục thiết bị 24

Bảng 2.2 Phản ứng tổng hợp cDNA 26

Bảng 2.3 Phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn 27

Bảng 2.4 Phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector 27

Bảng 3.1: Tỉ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn 44

MỞ ĐẦU

Tình hình ô nhiễm môi trường nói chung và ô nhiễm kim loại nặng nói riêng đang trở thành vấn đề hết sức cấp bách của xã hội hiện đại Công nghiệp ngày càng phát triển dẫn tới các chất thải độc hại không được xử lý hay xử lý không đạt yêu cầu giải phóng vào môi trường là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tình trạng ô nhiễm kim loại nặng nghiêm trọng Kim loại nặng (KLN) có Hg, Cd, Pb, As, Sb, Cr, Cu,

Zn, Mn, v.v thường không tham gia hoặc ít tham gia vào quá trình sinh hoá của các thể sinh vật và thường tích luỹ trong cơ thể chúng Vì vậy, KLN thường là các nguyên tố độc hại với sinh vật Ở Mỹ, hiện có trên 43.000 vùng công nghiệp trọng điểm đang trong tình trạng ô nhiễm, trong đó trên 40% là ô nhiễm KLN như: Chì (Pb), Cadmium (Cd), Crôm (Cr), Asen (As) Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới

về ô nhiễm Asen trong nguồn nước, nồng độ Asen trong khu vực nam Iowa và tây Missouri của Mỹ dao động từ 0,034- 0,490 mg/l, Mexico từ 0,008-0,624 mg/l, có tới 50% số mẫu có nồng độ Asen >0,050mg/l Bệnh nhiễm độc Asen mãn tính do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm Asen (Arsenicosis) xảy ra ở nhiều nước trên thế giới

và mang tính dịch tễ địa phương rõ rệt

Gần đây tình trạng nhiễm độc Asen đã được báo động, không chỉ ở các quốc gia trên thế giới như Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc…mà ở Việt Nam cũng đã gia tăng ngày càng nhiều Điển hình như khu vực Quỳnh Lôi, Hai Bà Trưng (Hà Nội) đã có nhiều gia đình phải chịu hậu quả và di chứng nặng nề do nhiễm độc Asen, nhiều trường hợp đã tử vong Với tình trạng khoan giếng bừa bãi như hiện nay, đa số nguồn nước sau khi khoan lên sẽ được sử dụng trực tiếp mà không qua xử lý triệt

để, thường chỉ sử dụng biện pháp thô sơ như: lắng, lọc để lấy nước trong…Các biện pháp này không thể loại bỏ được các kim loại nặng còn lẫn trong nước, lại thiếu sự kiểm soát và hướng dẫn của các cơ quan chức năng nên chất lượng nước làm ảnh hưởng đến sức khỏe người dân là điều khó tránh khỏi Ở Hà Nội 40% giếng khoan

có hàm lượng As lớn hơn mức an toàn nhiều lần

As hay còn gọi là thạch tím là chất rất độc Các hợp chất As vô cơ được xếp vào nhóm A các chất gây ung thư ở người và gây ung thư da, phổi, thận và gan, phá

máu, ảnh hưởng đến hệ sinh sản và miễn dịch Chính vì thế, giải quyết được vấn đề

ô nhiễm As đang là vấn đề thời sự rất cấp thiết hiện nay

Xử lý ô nhiễm KLN là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp và vốn đầu tư cao Để xử lý đất ô nhiễm người ta thường sử dụng các phương pháp truyền thống như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học hoặc vật lý, xử lý nhiệt, trao đổi ion, ôxi hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến những nơi chôn lấp thích hợp, Hầu hết các phương pháp đó rất tốn kém về kinh phí, giới hạn về kỹ thuật và hạn chế về diện tích Gần đây, nhờ những hiểu biết về

cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu và loại bỏ KLN của một số loài thực vật, người ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý môi trường như một công nghệ đặc biệt Khả năng làm sạch môi trường của thực vật đã được biết từ thế kỷ XVIII, tuy nhiên đến những năm 1990 phương pháp này mới được nhắc đến như một loại công nghệ mới dùng để xử lý môi trường đất và nước bị ô nhiễm bởi các kim loại, các hợp chất hữu cơ, thuốc súng và các chất phóng xạ

Việc nghiên cứu một số gen liên quan đến hấp thụ KLN nói chung và As nói riêng trên thế giới đã thu được những kết quả nhất định, mở ra triển vọng áp dụng công nghệ gen vào tạo thực vật có khả năng hấp thụ và tích lũy KLN cao để phát triển công nghệ xử lý chất thải KLN bằng thực vật So với những nghiên cứu tại các nước tiên tiến, ở Việt Nam chưa có công trình nào sử dụng công nghệ gen để tạo thực vật có khả năng hấp thụ và tích lũy KLN Hầu hết các nghiên cứu tập trung đánh giá và sử dụng các loài cây sẵn có khả năng tích lũy KLN trong tự nhiên cho mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật hoặc bằng phương pháp xử

lý truyền thống Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Tách dòng, thiết kế vector và

chuyển gen liên quan đến sự tích lũy Asen vào cây thuốc lá” Đây là một hướng

nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn với mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật ở Việt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Tổng quan về tình hình ô nhiễm KLN

1.1 Tình hình ô nhiễm KLN trên thế giới

Thế giới đang ngày càng phát triển làm con người phải đối mặt với nạn ô nhiễm môi trường trong đó ô nhiễm KLN đang là vấn đề đáng báo động hiện nay Nguyên nhân chủ yếu là do hoạt động của con người như: khai khoáng, nấu kim loại, mạ điện, sản xuất nhiên liệu chất cháy nổ, sử dụng phân bón và chất thải từ các vùng dân cư và các khu công nghiệp Trong mười năm qua, các nhà khoa học thế giới đã nhận thấy rằng nhiều nước gặp phải vấn đề nghiêm trọng cho sức khỏe cộng đồng do ô nhiễm Asen trong môi trường ngày càng tăng Các quốc gia này bao gồm

Ấn Độ, Đài Loan, Arhentina, Thái Lan, Mông Cổ, Mexico, Chile, Trung Quốc và Bangladesh (Willard Chappell 1999)

Ở Mỹ, hiện có trên 43.000 vùng công nghiệp trọng điểm đang trong tình trạng

ô nhiễm, trong đó trên 40% là ô nhiễm KLN như: Pb, Cd, Cr, As Mỗi năm ngân sách nước Mỹ phải tốn 1,5 tỷ USD cho việc xử lý và ngăn chặn ô nhiễm Trong năm 2005, ước tính lượng nước thải của Trung Quốc lên tới 31 tỷ tấn, kim loại nặng lên tới 15 triệu tấn, khoảng 20% đất nông nghiệp của Trung Quốc bị nhiễm kim loại nặng làm mất 10 triệu tấn hoa màu mỗi năm Viện hàn lâm khoa học Trung Quốc,

đã phát hiện đất ở nhiều khu vực có chứa As ở mức cao (Liao X 2004)

Theo số liệu của tổ chức y tế thế giới về ô nhiễm As trong nguồn nước, nồng

độ As trong khu vực nam Iowa và tây Missouri của Mỹ dao động từ 0,034- 0,490 mg/l, Mexico từ 0,008-0,624 mg/l, có tới 50% số mẫu có nồng độ As >0,050mg/l Bệnh nhiễm độc As mãn tính do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm As xảy ra ở nhiều nước trên thế giới và mang tính dịch tễ địa phương rõ rệt

1.2 Tình hình ô nhiễm kim loại nặng ở Việt Nam

Ở Việt Nam việc phát triển kinh tế và mức độ đô thị hoá cao cũng là nguyên nhân dẫn đến sự xuống cấp nghiêm trọng của hệ sinh thái Ô nhiễm môi trường nhất

là KLN ở nước ta đang là một vấn đề đáng lo ngại KLN xuất phát từ rất nhiều nguồn khác nhau như: các khu công nghiệp, mỏ khai thác kim loại, bãi rác, làng

Hg đều tìm thấy trong các chất thải Trong đó As và Cd là phổ biến Kết quả phân tích đất trồng ở khu vực mỏ thiếc Sơn Dương, Tuyên Quang có hàm lượng As là 642mg/kg và Cu là 235mg/kg (Bùi Thị Kim Anh 2011), trong khi tiêu chuẩn đặt ra tương ứng là 12 mg/kg và 50mg/kg (QCVN 03:2008/BTNMT)

Đầu những năm 1990, vấn đề ô nhiễm As được biết đến qua các nghiên cứu của Viện Địa Chất và các liên đoàn địa chất về đặc điểm địa chất thủy văn và đặc điểm phân bố As trong tự nhiên Theo nghiên cứu khảo sát phân tích nước bề mặt

và các nguồn nước đổ ra sông Mã ở khu vực Đông Nam bản Phúng, hàm lượng As trong các mẫu nước đều vượt quá 0,05 mg/l Kết hợp với điều tra của trường đại học

Y Hà Nội cho thấy, sự ô nhiễm này có khả năng ảnh hưởng đến sức khỏe dân cư sống ở khu vực đó Từ những năm 1995-2000, nhiều công trình nghiên cứu điều tra

về nguồn gốc As có trong nước ngầm, mức độ ô nhiễm, chu trình vận chuyển… đã tìm thấy nồng độ As trong các mẫu nước khảo sát ở khu vực thượng lưu sông Mã, Sơn La, Phú Thọ, Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thanh Hóa… đều vược tiêu chuẩn cho phép đối với nước sinh hoạt của Quốc Tế và Việt Nam (Đặng Đình Kim 2010)

Trước tình hình đó, trong hơn 2 năm (2003-2005), chính phủ Việt Nam và UNICEF đã khảo sát về nồng độ As trong nước của 71.000 giếng khoan thuộc 17 tỉnh

từ đồng bằng miền Bắc, Trung, Nam Kết quả phân tích cho thấy nguồn nước giếng khoan ở các tỉnh vùng lưu vực Sông Hồng như : Hà Nam, Nam Định, Hà Tây, Hưng Yên, Hải Dương và các tỉnh thuộc Đồng Bằng Sông Cửu Long như : An Giang, Đồng Tháp đều bị nhiễm As rất cao Tỷ lệ các giếng có nồng độ As từ 0,1 mg/l đến > 0,5 mg/l (cao hơn tiêu chuẩn cho phép của Việt Nam và tổ chức Y Tế Thế Giới 10-50 lần) của các xã dao động từ 59,6-80% Có thể thấy tình trạng ô nhiễm As trong nguồn nước của các giếng khoan tại các xã là rất nghiêm trọng Tỷ lệ các giếng có nồng độ

As cao > 0,1 mg/l (gấp hơn 10 lần tiêu chuẩn cho phép) ở hầu hết các xã chiếm từ 70%- 96% trừ Mai Động có tỷ lệ thấp hơn (46%)(Nguyễn Khắc Hải 2006)

Hiện nay, chính phủ đã có kế hoạch hành động quốc gia về giảm thiểu ô nhiễm As ở Việt Nam với các nội dung tiến hành khảo sát toàn quốc để xác định mức độ ô nhiễm As ở nguồn nước ngầm các khu vực khác nhau, xây dựng bản đồ ô nhiễm As ở Việt Nam, đánh giá thực trạng ảnh hưởng của ô nhiễm As trong nguồn

nước sinh hoạt tới sức khỏe của cộng đồng và xây dựng các biện pháp phòng chống, nghiên cứu và áp dụng các giải pháp làm giảm thiểu ô nhiễm As trong nguồn nước, tăng cường thông tin tuyên truyền nâng cao nhận thức của cộng đồng về vệ sinh nguồn nước, phòng chống bệnh tật do sử dụng nguồn nước bị ô nhiễm nói chung và

ô nhiễm As nói riêng

2 Tổng quan chung về Asen

2.1 Asen và độc tính của asen

Asen hay còn gọi là thạch tín, một nguyên tố hóa học có ký hiệu As và số nguyên tử 33 Khối lượng nguyên tử của nó bằng 74,92

Hình 1.1: Hình ảnh về Asen

As là một á kim gây ngộ độc khét tiếng và có nhiều dạng thù hình: màu vàng (phân tử phi kim) và một vài dạng màu đen và xám (á kim) Ba dạng có tính kim loại của As với cấu trúc tinh thể khác nhau cũng được tìm thấy trong tự nhiên (các

khoáng vật asen sensu stricto và hiếm hơn là asenolamprit, parasenolamprit) As

hay tồn tại dưới dạng các hợp chất asenua và asenat Trạng thái oxy hóa phổ biến nhất của nó là -3 (asenua: thông thường trong các hợp chất liên kim loại tương tự như hợp kim), +3 (asenat (III) hay asenit và phần lớn các hợp chất asen hữu cơ), +5 (asenat (V): phần lớn các hợp chất vô cơ chứa oxy của asen ổn định) As cũng dễ tự liên kết với chính nó, chẳng hạn tạo thành các cặp As-As trong sulfua đỏ (α-As4S4)

và các ion As43- vuông trong khoáng coban asenua có tên skutterudit Ở trạng thái ôxi hóa +3, tính chất hóa học lập thể của As chịu ảnh hưởng bởi sự có mặt của cặp electron không liên kết

As về tính chất hóa học rất giống với nguyên tố đứng trên nó là phốt pho Tương tự như phốt pho, nó tạo thành các oxit kết tinh, không màu, không mùi như

As2O3và As2O5 là những chất hút ẩm và dễ dàng hòa tan trong nước để tạo thành các dung dịch có tính axit Tương tự như phốtpho, As tạo thành hidrua dạng khí và không ổn định, đó là arsin (AsH3) Do vậy, As sẽ thay thế phần nào cho phốt pho trong các phản ứng hóa sinh học và vì thế nó gây ra ngộ độc

Theo nghiên cứu của Thomas và cộng sự, As vô cơ ở trạng thái hóa trị ba có độc tính cao hơn nhiều so với As vô cơ ở trạng thái hóa trị năm Ý tưởng này xuất phát từ các thí nghiệm về liều tử vong cấp tính trên động vật (Thomas D J et al 2001) As hóa trị năm bị khử trong cơ thể thành As hóa trị ba (mà sau đó bị methyl hóa) nên nó tác động giống như As hóa trị ba, với giả thiết rằng phản ứng khử đủ nhanh so với thời gian bán hủy Thông thường giai đoạn methyl hóa trong quá trình trao đổi chất thường được cho là bước giải độc Gần đây hai nhóm nghiên cứu của Aposhian và cộng sự, Styblo và cộng sự đã công bố rằng, trạng thái As hóa trị ba của monomethyl arsenic độc hơn nhiều so với các dạng vô cơ, các dạng hóa trị năm của monomethyl và dimethyl arsenic thì kém độc hơn (Aposhian H.V et al 2001, Styblo M and Lin S 2001) Việc phát triển các phương pháp phân tích trạng thái hóa trị ba của monomethyl arsenic sẽ cho phép tiến hành các nghiên cứu này

2.2 Sự phơi nhiễm Asen

Sự phơi nhiễm có thể xảy ra qua nước và không khí Sự phơi nhiễm cũng có thể là từ việc sử dụng thực phẩm và các thuốc cổ truyền cũng như từ các chất thải độc hại như phế thải khai thác mỏ Ở Tây Bengal và Bangladesh xảy ra phơi nhiễm

từ việc uống nước ngầm được bơm lên từ các “giếng khoan” (Chowdhurry T.R

1997, Chowdhurry T.R et al 1999) Các nhà nghiên cứu ở Nội Mông đã nghiên cứu

về các tác hại đến sức khỏe từ việc sử dụng nước ngầm với nồng độ As cao Ở các nước này As hòa tan trong nước ngầm có thể có nguồn gốc tự nhiên Tuy nhiên một vài nghiên cứu cho thấy rằng ở Tây Bengal và Bangladesh, As liên kết với đá gốc được giải phóng vào nước do việc bơm hút quá nhiều nước phục vụ cho thủy lợi trong những năm gần đây

Nước bề mặt cũng có thể chứa As với nồng độ cao Hàm lượng As cao trong nước bề mặt ở Thái lan và Chile đã gây ra các triệu chứng nhiễm độc As

(Choprapawon C ; Ajjimangkul S 1999, Sancha A.M 1999) Ở Thái Lan mức As tăng cao là do các chất thải từ các hoạt động khai thác mỏ thiếc

Nồng độ As gia tăng trong không khí có thể do việc đốt than có chứa As cao, như ở Slovakia (Bencko V 1997) và Trung Quốc (Sun G.F 1999) dùng than cho nhà máy nhiệt điện Ở tỉnh Guizhou, Trung Quốc, nhiều gia đình dùng loại than có chứa hàm lượng As cao để sấy khô các nông phẩm được treo trên trần nhà Họ đốt than trong một cái hố dưới nền nhà hoặc trong một cái lò không có ống khói hoặc ống xả Điều này dẫn tới nồng độ As rất cao trong không khí và thấm sâu vào thực phẩm

Đất cũng là một nguồn phơi nhiễm As Sự ô nhiễm đất có thể xảy ra do tiếp xúc với các chất thải rắn như chất thải hầm mỏ, hay với bùn cống có As nồng độ cao Đất

bị nhiễm As cũng có thể do sử dụng tưới tiêu bằng nước có chứa nhiều As, hay từ việc

sử dụng các thuốc trừ sâu hay diệt cỏ chứa As (Folks D J 2001) Các loại đất này có thể gây ô nhiễm cho các loại cây lương thực mà con người hay vật nuôi ăn phải và làm giảm năng suất mùa màng

As là một nguyên tố tồn tại trong tự nhiên và có thể được tìm thấy trong bất kỳ mẫu vật chất nào nếu như sử dụng một phương pháp phân tích đủ nhạy Thông thường

As dạng vô cơ có độc tính cao gấp rất nhiều lần so với dạng hữu cơ Trong thực phẩm, phần lớn As ở dạng hữu cơ và chỉ một lượng nhỏ As ở dạng vô cơ Hàm lượng As vô

cơ cao nhất được phát hiện trong lúa, bột mì, nước nho và rau spinach (Borum D.R ; Abernathy C.O 1994)

Dược phẩm cũng có thể là một nguồn phơi nhiễm As Năm 1969 các bệnh nhân ở Anh được cho dùng dung dịch Fowler (potassium arsenite) để điều trị một số loại bệnh

về da (Sasieni P ; Evans S ; Cuzick J 1994) Một số bệnh nhân sử dụng các liều tích lũy nhiều tới 10g As hoặc hơn dưới dạng vô cơ Năm 1970, 142 bệnh nhân đã được khám vào để tìm các dấu hiệu của nhiễm độc As (tăng sừng hóa, sậm màu da hay ung thư da) cho thấy: 45% có ít nhất một dấu hiệu, 45% bị tăng sừng hóa và 10% bị ung thư da vào thời điểm tiến hành khám Theo Choprapawon và Rodeline (1997), hơn 100

ca nhiễm độc As mãn tính có liên quan đến việc sử dụng các loại thuốc cổ truyền ở Thái Lan (Choprapawon C ; Rodcline A 1997)

2.3 Tác động của nhiễm độc Asen đến sức khỏe con người

Các triệu chứng cổ điển của nhiễm độc As như sậm màu da, tăng sừng hóa và ung thư da đã được biết đến từ lâu Từ những năm 1970 và đặc biệt trong thập kỷ qua, tình trạng phơi nhiễm As gia tăng gây ra nhiều tác động tiêu cực ảnh hưởng xấu tới sức khỏe con người, tiêu biểu là các bệnh về hệ mạch máu ngoại biên (chân đen) (Guo H R and Greene H L 1994) và các tác động đến hệ thần kinh ngoại biên (Kilburn K H 1997), to chướng gan, các tác động tới hệ thần kinh trung ương, bệnh đái đường, cao huyết áp, bệnh tim, bệnh xơ gan, bệnh viêm cuống phổi và các bệnh hô hấp khác (Abernathy C O.; Calderon R L and Chappell W.R 1997, Chappell W.R.;Abernathy C.O and Calderon R.L 1999) Nhiễm độc As còn gây ra các bệnh ung thư nghiêm trọng Trước đây các nghiên cứu chỉ cho thấy As có liên quan đến bệnh ung thư da, nay có rất nhiều bệnh ung thư nghiêm trọng đều do As gây ra như: ung thư phổi, ung thư bàng quang, ung thư thận, ung thư mũi, ung thư ruột kết

2.4 Điều trị nhiễm độc Asen ở người

Sự phát triển các phương pháp điều trị bệnh nhân nhiễm độc As vẫn còn chậm chạp Một trong các hướng tích cực là sử dụng các chất tạo chelat mà đã được nghiên cứu là có hiệu quả trong điều trị nhiễm độc chì Vì As không lưu quá lâu trong cơ thể, nhiều người không cho rằng quá trình tạo chelat là việc điều trị thành công Các nghiên cứu ban đầu sử dụng chất tạo chelat DMSA (một dẫn xuất tan trong nước của dimecaprol) đã không thành công (Guha Mazumder D N et al 2001) Tuy nhiên, gần đây Aposhian và cộng sự, Cebrian và cộng sự đã công bố rằng, 40% đến 60% As lưu giữ trong cơ thể tiêu hóa được bằng việc sử dụng DMPS (một dẫn xuất tan trong nước của dimecaprol) (Aposhian H V 2001, Cebrian M.E

; Aposhian H.V 2001) Các nhà nghiên cứu này đã cho biết không có tác động tiêu cực nào của điều trị bằng DMPS Họ đã thấy sự cải thiện đáng kể các triệu chứng của bệnh nhân so với nhóm đối chứng

3 Các phương pháp xử lý ô nhiễm KLN

3.1 Phương pháp truyền thống

Làm sạch đất ô nhiễm là một quá trình đòi hỏi công nghệ phức tạp và vốn đầu

tư cao Để xử lý đất ô nhiễm người ta thường sử dụng các phương pháp truyền

thống như: rửa đất, cố định các chất ô nhiễm bằng hoá học hoặc vật lý, xử lý nhiệt, kết tủa hoặc sa lắng thụ động với sắt nguồn tự nhiên, đông tụ, sa lắng, lọc, hấp phụ, trao đổi ion, oxy hoá hoặc khử các chất ô nhiễm, đào đất bị ô nhiễm để chuyển đi đến những nơi chôn lấp thích hợp (Murcott S 2001)

3.1.1 Phương pháp cơ học

Trên thực tế, phương pháp này không có khả năng loại bỏ hoàn toàn KLN Tuy nhiên, nó làm hạn chế khả năng thấm ngấm của KLN vào hệ thống nước ngầm Phương pháp chôn lấp tại chỗ được đánh giá là an toàn nhất bằng cách xây đập bê tông chặn xung quanh Đối với khu vực gần dân cư và đất canh tác thì đất ô nhiễm phải được đào và vận chuyển đến nơi chôn lấp tập trung Phương pháp này

có nhược điểm là không những chi phí cao, cần diện tích lớn, đất không được tái sử dụng mà nó còn gây nguy hiểm trong suốt quá trình vận chuyển

3.1.2 Phương pháp vật lý và hoá học

Nhóm phương pháp này đang được sử dụng rộng rãi trong việc kiểm soát

và làm giảm bớt mức độ ô nhiễm KLN trong đất Các phương pháp thường dùng là (Đặng Đình Kim 2010):

Điện động học: Điện động học liên quan đến sự di chuyển KLN thông qua

một điện trường được phát sinh từ các điện cực trong đất Kỹ thuật này có hiệu quả

xử lý đất sét bị ô nhiễm KLN: Pb, Cr, Cu, Zn và thường kết hợp với phương pháp sinh học

Rửa đất: Phương pháp này được dùng phổ biến ở Đan Mạch, Đức, Hà

Lan… Đất được phân loại sau đó được rửa bằng nước có thể bổ sung thêm axit hoặc bazơ KLN được giải phóng từ bề mặt đất vào nước cùng với các hợp chất hữu cơ cao phân tử Kỹ thuật này phù hợp để xử lý đất chứa nhiều cát và sỏi Sau xử lý vẫn còn một lượng KLN tồn dư trong đất

Xử lý nhiệt: Phương pháp này dựa vào phản ứng đốt cháy các hợp chất để

tạo thành CO2 và nước Đất được đào lên và đốt ở nhiệt độ cao thường từ 6000

C-17000C, KLN sẽ bị tách khỏi liên kết với đất, thu hồi KLN với tro và đem chôn Phương pháp này cũng hữu hiệu trong việc xử lý các KLN dễ bay hơi như thủy ngân

Cố định các chất ô nhiễm: Phương pháp này dựa vào các phản ứng oxy

hoá khử, phản ứng tạo kết tủa, phản ứng trung hoà, keo tụ hay phân huỷ các chất độc hại Có thể sử dụng thuốc thử Dichloromethane để nhận biết sự kết thúc của phản ứng hoá học Phương pháp này được dùng để xử lý đất ô nhiễm natri (Na), nhôm(Al), kẽm (Zn) nhưng thường gây ảnh hưởng đến môi trường do lượng thuốc thử dư tồn tại trong đất

Hầu hết các phương pháp truyền thống đều rất tốn kém về kinh phí, giới hạn

về kỹ thuật và hạn chế về diện tích, Đất sau xử lý vẫn còn chứa một lượng kim loại nhất định và có thể ảnh hưởng tới môi trường Hơn nữa phương pháp này còn

tỏ ra kém hiệu quả khi nồng độ kim loại trong đất thấp và mức độ phân tán của kim loại lớn Gần đây, nhờ những hiểu biết về cơ chế hấp thụ, chuyển hoá, chống chịu

và loại bỏ KLN của một số loài thực vật, người ta đã bắt đầu chú ý đến khả năng sử dụng thực vật để xử lý môi trường như một công nghệ môi trường đặc biệt

3.2 Công nghệ xử lý KLN trong đất bằng thực vật

Khả năng làm sạch môi trường của thực vật đã được biết từ thế kỷ XVIII bằng các thí nghiệm của Joseph Priestley, Antoine Lavoissier, Karl Scheele và Jan Ingenhousz Tuy nhiên, mãi đến những năm 1990 phương pháp này mới được nhắc đến như một loại công nghệ mới dùng đề xử lý môi trường đất và nước bị ô nhiễm bởi các kim loại, các hợp chất hữu cơ, thuốc súng và các chất phóng xạ

Thực vật có nhiều cách phản ứng khác nhau đối với sự có mặt của các ion kim loại trong môi trường Hầu hết, các loài thực vật rất nhạy cảm với sự có mặt của các ion kim loại, thậm chí ở nồng độ rất thấp Tuy nhiên, vẫn có một số loài thực vật không chỉ có khả năng sống được trong môi trường bị ô nhiễm bởi các kim loại độc hại mà còn có khả năng hấp thụ và tích các kim loại này trong các bộ phận khác nhau của chúng (Barcelos J ; Poschenrieder C 2003)

Trong thực tế, công nghệ xử lý ô nhiễm bằng thực vật đòi hỏi phải đáp ứng một số điều kiện cơ bản như dễ trồng, có khả năng vận chuyển các chất ô nhiễm từ đất lên thân nhanh, chống chịu được với nồng độ các chất ô nhiễm cao và cho sinh khối nhanh (Timothy Oppelt E 2000, Jerald L Schnoor 2002, Barcelos J ; Poschenrieder C 2003) Tuy nhiên, hầu hết các loài thực vật có khả năng tích luỹ

KLN cao là những loài phát triển chậm và có sinh khối thấp, trong khi các thực vật cho sinh khối nhanh thường rất nhạy cảm với môi trường có nồng độ kim loại cao

Xử lý KLN trong đất bằng thực vật có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau phụ thuộc vào từng cơ chế loại bỏ các KLN (Pilon-Smits E 2005):

Phytodegradation (phân hủy): Các chất ô nhiễm hữu cơ bị phân hủy (chuyển

hóa) hoặc bị khoáng hóa bởi các enzyme chuyên biệt trong tế bào thực vật: nitroreductases, dehalogenases (phân giải dung môi và thuốc trừ sâu gốc Cl) và

laccases (phân giải anilines) Loài họ Liễu (Populus sp.) và họ rong xương cá (Myriophyllium spicatum) là những cây có hệ thống enzyme này

Phytostabilization (cố định): Các chất ô nhiễm hữu cơ hoặc vô cơ, được kết

hợp vào lignin của thành tế bào rễ hoặc vào mùn Kim loại bị kết tủa do rễ cây tiết dịch và sau đó chúng bị giữ lại trong đất Mục tiêu chính của cơ chế này là hạn chế

sự di chuyển và khuếch tán của chất gây ô nhiễm Loài chi Haumaniastrum (họ húng), Eragrostis (họ Hòa thảo), Ascolepis (họ Cói), Lay ơn và Alyssum (họ Cải có hoa) là ví dụ về cây trồng cho mục đích này

Phytovolatilization (bay hơi): Một số loài cây có khả năng hấp thu và bay hơi

một số kim loại hoặc á kim Một số nguyên tố của nhóm IIB, VA và VIA của bảng tuần hoàn (đặc biệt là Hg, Se và As) được hấp thu bởi rễ, được chuyển đổi thành các

dạng không độc hại, và sau đó thải vào khí quyển Ví dụ: Astragalus bisulcatus (loài có hoa Họ Đậu) và Stanleya pinnata (họ Cải có hoa) xử lý Se Loài Nicotiana tabacum (thuốc lá), Liriodendron tulipifera hoặc Brassica napus (cải dầu) xử lý Hg

Kỹ thuật này cũng có thể được sử dụng cho các hợp chất hữu cơ

Phytoextraction (tách chiết): Rễ hấp thu chất ô nhiễm sau đó chuyển vị và

tích lũy trong các bộ phận bên trên (thân, lá) Cơ chế này chủ yếu được áp dụng cho việc loại bỏ kim loại (Cd, Ni, Cu, Zn, Pb) hay yếu tố khác (Se, As) và các hợp chất hữu cơ

Phytofiltration (lọc): Thực vật hấp thu, tổng hợp và kết tủa các chất ô nhiễm,

đặc biệt là KLN, các yếu tố phóng xạ từ môi trường nước thông qua hệ thống rễ hoặc cơ quan ngập nước khác của cây Các thực vật được trồng trong hệ thống thủy canh, theo đó nước thải đi qua và được "lọc" bởi rễ (Rhizofiltration) Những loài

và chịu được điều kiện chất ô nhiễm sẽ cho kết quả xử lý tốt nhất Loài tiềm năng:

Helianthus annus (hướng dương), Brassica juncea (Cải bẹ xanh), Phragmites australis, Fontinalis antipyretica và một số loài Salix (liễu), Populus, Lemna và phân nhánh Callitriche

Rhizodegradation (phân giải vùng rễ): Rễ phát triển thúc đẩy sự gia tăng vi

sinh vật vùng rễ (chúng sử dụng dịch tiết và các chất chuyển hóa của cây là nguồn cacbon và năng lượng) Ngoài ra, cây có thể tiết ra các enzymes phân giải sinh học.Việc áp dụng phytostimulation bị giới hạn đối với chất ô nhiễm hữu cơ

Những hình thức khác xử lý KLN bằng thực vật là kết hợp hay biến thể của các hình thức trên bao gồm:

Rào cản thủy lực: Một số loài cây lớn, đặc biệt là những cây có gốc rễ sâu

(Populus sp.), hút nhiều nước ngầm qua quá trình bốc thoát hơi nước Chất ô nhiễm

trong nước này được chuyển hóa bởi các enzymes và bốc hơi cùng với nước hoặc đơn giản là cô lập trong mô thực vật

Thảm thực vật: Các loại thảo mộc, cây bụi hoặc cây lớn, trồng trên các bãi

chôn lấp chất thải, được sử dụng để hạn chế sự xâm nhập của nước mưa, và sự lan truyền chất ô nhiễm Rễ tăng thông khí, thúc đẩy phân hủy sinh học, bốc thoát hơi nước Những khó khăn của kỹ thuật này là chất thải hạn chế sự phát triển của rễ cây

Có nhiều giải thuyết đã được đưa ra để giải thích cơ chế và triển vọng của công nghệ xử lý KLN bằng thực vật

Giả thuyết sự hình thành phức hợp: cơ chế loại bỏ các kim loại độc của các

loài thực vậtbằng cách hình thành một phức hợp Phức hợp này có thể là chất hoà tan, chất không độc hoặc là phức hợp hữu cơ - kim loại được chuyển đến các bộ phận của tế bào có các hoạt động trao đổi chất thấp (thành tế bào, không bào), ở đây chúng được tích luỹ ở dạng các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ bền vững (Saxena PK

et al 1999, Barcelos J ; Poschenrieder C 2003)

Giả thuyết về sự lắng đọng: các loài thực vật tách kim loại ra khỏi đất, tích luỹ

trong các bộ phận của cây, sau đó được loại bỏ qua lá khô, rửa trôi qua biểu bì hoặc bị đốt cháy

Giả thuyết hấp thụ thụ động: sự tích luỹ kim loại là một sản phẩm phụ của cơ

chế thích nghi đối với điều kiện bất lợi của đất

Sự tích luỹ kim loại là cơ chế chống lại các điều kiện stress vô sinh hoặc hữu sinh: hiệu lực của kim loại chống lại các loài vi khuẩn, nấm ký sinh và các loài sinh

vật ăn lá đã được nghiên cứu (Saxena PK 1999, Schat H et al 1999, Barcelos J ; Poschenrieder C 2003)

Trong những năm gần đây, người ta quan tâm rất nhiều về công nghệ sử dụng thực vật để xử lý môi trường bởi nhiều lý do: diện tích đất bị ô nhiễm ngày càng tăng, các kiến thức khoa học về cơ chế, chức năng của sinh vật và hệ sinh thái, áp lực của cộng đồng, sự quan tâm về kinh tế và chính trị Hai mươi năm trước đây, các nghiên cứu về lĩnh vực này còn rất ít, nhưng ngày nay, nhiều nhà khoa học đặc biệt là ở Mỹ và châu Âu đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu cơ bản và ứng dụng công nghệ này như một công nghệ mang tính chất thương mại Công nghệ này cũng có những hạn chế là không thể xem như một công nghệ xử lý tức thời và phổ biến ở mọi nơi Tuy nhiên, chiến lược phát triển các chương trình nghiên cứu cơ bản có thể cung cấp được các giải pháp xử lý đất một cách thân thiện với môi trường và bền vững Năm 1998, Cục môi trường Châu Âu (EEA) đánh giá hiệu quả kinh tế của các phương pháp xử lý KLN trong đất bằng phương pháp truyền thống và phương pháp sử dụng thực vật tại 1.400.000 vị trí bị ô nhiễm ở Tây Âu Kết quả cho thấy chi phí trung bình của phương pháp truyền thống trên 1 hecta đất từ 0,27 đến 1,6 triệu USD, trong khi phương pháp sử dụng thực vật chi phí thấp hơn 10 đến 1000 lần (Barcelos J ; Poschenrieder C 2003)

3.3 Các nghiên cứu về biện pháp xử lý KLN bằng thực vật sử dụng công nghệ gen

3.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Việc nghiên cứu cơ chế chịu KLN ở thực vật bao gồm quá trình hấp thụ, tích lũy và vận chuyển đã đạt được nhiều tiến bộ trên thế giới, vì thế việc ứng dụng công nghệ gen đã thành công trong việc làm tăng tính chống chịu và tích lũy KLN Để đạt được điều này, có thể tạo ra nhiều phân tử trung hòa kim loại (De la Fuente J.M.;Ramirez-Rodriguez V.;Carbera-Ponce J.L 1997), các chất phytochelatin (Zhu

I.; Terada E.; Sunairi M.; wakita H.; Shinmachi F.; Noguchi A.; Nakajima M.; Yazaki J 1997) hoặc các protein tham gia vào vận chuyển kim loại (Van de Zaal B.J.; Neuteboom L.W.; Pinas J.E.; Chardonnens S.; Schat H.; Verkleij J.A.; Hooykaas.C 1999, Curie C.; Alonso J.M.; Le Jean M.; Rcker J.R.; Briat J.F 2000)

Đã có nhiều nghiên cứu về gen liên quan đến hấp thụ và vận chuyển KLN như các

gen (ZIP 1, ZIP 2, IRT1 (ion-regulated transporter), AtNramp, AtNramp 3 (metal transpoter gene family), liên quan đến cácphytochelatin (PC) – CAD1, GmPCS1 (phytochelatin synthase) và metallotionein (MT) – MT1, MT2 Các gen này được thông báo có liên quan đến tích lũy KLN và khá phổ biến ở thực vật Các gen CAX

1 và CAX 2 (Cation exchanger) ở Arabidopsis cũng đã được nghiên cứu và được

xác định tham gia vào vận chuyển KLN (Hirschi K.D.;Zhent R.; Cunningham K.W 1996) Hiện nay, tại Hàn Quốc đã chuyển được nhiều gen có khả năng hấp thụ KLN tập trung vào một dòng cây Dương (Poplar) có khả năng sinh trưởng nhanh, sinh khối lớn Dòng Dương này không có hoa và hiện đang trong quá trình thử nghiệm trong nhà kính và trên đồng ruộng (Yadav R.; Arora P.; Kumar S 2010)

Đối với As, gen ars1 mã hóa cho enzyme arsenate reductase tham gia vào

chuyển hóa As ở dạng arsenate độc hại thành arsenit không độc đã được tách từ

dòng Arabidopsis đột biến Việc chuyển gen arsC với gen khởi động rubisco từ đậu tương (SRS1p) và gen ECS với gen khởi động actin của nấm men (ACT2p) vào

Arabidopsis đã tạo được cây chuyển gen kháng As hơn cây đối chứng (Dhankher O.P.; Li Y.; Rosen B.P.; Shi J.; Salt D.; Senecoff J.F.; Sashti N.A.; Meagher R.B

2002) Một gen cho arsenate reductase khác là PvACR2 đã tách được từ cây dương

xỉ Pteris vitta, đây là cây có khả năng siêu tích lũy (Ellis D.R.; Gumaelius L.;

Indriolo E.; Pickering I.J.; Bank J.A.; Salt D.E 2006) Mới đây, một nghiên cứu của chương trình Sinh học tế bào và Phân tử thực vật tại đại học Florida, Gainesville-

Mỹ khi chuyển gen PvGRX5 của cây dương xỉ Trung quốc Pteris vittata siêu tích

lũy As trong lá vào hai dòng Arabidopsis Tuy nhiên so sánh cho thấy các dòng Arabidopsis chuyển gen có khả năng chống chịu As cao hơn đáng kể so với với các dòng đối chứng trong môi trường thử nghiệm, nhưng cho thấy một nghịch lý là sự tích lũy As giảm kể cả ở mầm, rễ và toàn bộ cây Kết quả chỉ ra rằng có thể sử dụng

gen PvGRX5 của cây dương xỉ Pteris vittata trong giải pháp công nghệ sinh học

hiện đại để làm giảm lượng As ở cây trồng (Sabarrinath S.; Shan W.; Lena Q M.; Bala R 2009)

Nghiên cứu về các loài thực vật tích lũy KLN cho thấy, loài dương xỉ Pteris vittata và Dennstaedtia scabra, không những có khả năng tích lũy cao As mà còn

có khả năng hấp thu đồng thời các kim loại khác như Mn, Cu, Fe, Zn và Pb Khi trong đất bị ô nhiễm có hàm lượng As là 3.528 mg/kg, thì hàm lượng As trong rễ và

thân D scabra tương ứng là 965,47 mg/kg và 2.241,63 mg/kg (Raskin I.; Smith R.D.; Salt D.E 1997) Loài dương xỉ Pteris Vittata có khả năng tích luỹ 14.500

ppm As mà chưa có triệu chứng tổn thương Loài này sinh trưởng nhanh, có sức chống chịu cao với As trong đất (As > 1.500 ppm) và chỉ bị độc ở nồng độ 22.630 ppm qua 6 tuần (Prasad M.N.V.; Freitas H.O 2003) Theo các nhà khoa học Mỹ,

loài Pteris Vittata có thể chứa tới 22 g As/kg lá Họ cũng đã chứng minh rằng trong

vòng 24 giờ, loài dương xỉ này giảm mức As trong nước từ 200 g/l xuống gần 100 lần, dưới mức cho phép của Mỹ (10 g/l) (Ma J Q ; Komar M ; Zhang T.W ; Cai

Y ; Kenelley E.D 2001) Một công bố mới nhất về thực vật tích lũy As là ở cây

dưa chuột (Cucumis sativus) của khoa Kỹ thuật và khoa học môi trường thuộc

trường đại học Ewha Woman - Hàn quốc Khi so sánh với các cây ngô, lúa mỳ và lúa miến cho thấy khả năng tích lũy As cao hơn nhiều lần so với 3 loài còn lại (Sun

H H.; Sun A.C.; Hyeon Y; Kyung-Suk C 2011)

Từ những công trình nêu trên cho thấy, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu về sự tích lũy KLN ở thực vật và sử dụng chúng cho cải tạo môi trường

từ những năm cuối thập niên 80 Cho đến nay, Phytoremediation đã phát triển thành một hướng cải tạo môi trường hiệu quả, an toàn và tiết kiệm Tuy nhiên, những công trình đã nghiên cứu mới sử dụng các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn và mới bước đầu sử dụng gen từ thực vật để đưa vào một số cây mô hình như Arabidopsis, cải dầu…

3.3.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam vấn đề nghiên cứu về ô nhiễm KLN cũng đã được quan tâm Viện Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, và một

số cơ sở nghiên cứu của các trường đại học như Khoa Môi trường, Đại học Khoa





gia TP Hồ Chí Minh đã bước đầu điều tra và nghiên cứu xử lý ô nhiễm KLN Các nghiên cứu tập trung vào thống kê mức độ ô nhiễm KLN và khả năng hấp thu KLN

ở một số cây như dương xỉ, bèo tây, cỏ Vetiver …(Vũ Quyết Thắng 1998, Phạm Văn Khang; Nguyễn Ngọc Minh; Nguyễn Xuân Huân 2004, Nguyễn Đình Tuấn

2005, Lâm Minh Triết ; Lê Huy Bá 2006, Diệp Thị Mỹ Hạnh 2007, Hoàng Thị Thanh Thủy ; Từ Thị Cẩm Loan ; Nguyễn Như Hà Vy 2007, Đồng Thị Minh Hậu ; Hoàng Thị Thanh Thủy ; Đào Phú Quốc 2008)

Đặng Đình Kim và các cộng sự đã tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về khả

năng chống chịu và hấp thu KLN của cây dương xỉ Pteris vittata và Pityrogramma calomelanos, cỏ Mần Trầu và Vetiver cho thấy: Dương xỉ Pteris vittata có khả năng

chống chịu As đến 1.500ppm, Pb đến 5.000ppm và Cd đến 1.200ppm Đặc biệt, khả năng tích lũy As của loài dương xỉ này là rất lớn, trong khoảng nồng độ mà cây

chống chịu được, Pteris vittata tích lũy lượng As từ 307 – 6.042ppm trong thân, 131-3.756 ppm trong rễ Còn dương xỉ Pityrogramma calomelanos có khả năng

chống chịu trên đất có bổ sung As đến 900ppm, Pb đến 4.000 ppm và Cd đến 300ppm Đây là cây dương xỉ có thể phát triển tốt trên đất ô nhiễm KLN ở Hà

Thượng Trong khoảng nồng độ mà cây chống chịu được, Pityrogramma calomelanos đã tích lũy được lượng As là 885 – 4.034ppm trong thân và 483 –

2.256ppm trong rễ Cỏ Mần trầu có khả năng chống chịu Pb và Zn cao (5.000 ppm

Pb và 1.000 ppm Zn) Kết quả thí nghiệm hấp thu Pb cho thấy, khi nồng độ Pb trong đất 5.000ppm thì trong rễ và phần trên mặt đất tương ứng có chứa 3.613,0 ppm và 268,57ppm Trong khi đó, cỏ Vetiver có khả năng chống chịu Pb cao Hàm lượng Pb trong đất từ 1.400,50 ppm đến 2.530,10 ppm cỏ vẫn phát triển bình thường Khả năng tách chiết Pb trong đất ô nhiễm của cỏ từ 87% – 92,56% sau 90 ngày thí nghiệm (Đặng Đình Kim 2012)

Những nghiên cứu khả năng hấp thụ KLN của thực vật với mục đích sử dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường đã bắt đầu được thực hiện Kết quả cho thấy, cây

thơm ổi Lantana camara có thể chịu được hàm lượng Pb trong đất lên tới 10.000 ppm thậm chí 20.000 ppm Cây cải xoong Nasturtium officinale có khả năng làm

giảm 60 - 80 % Cr và 70 - 80 % Ni từ nước thải mạ điện có nồng độ Cr và Ni tương ứng 58,396 mg/l và 5,77 mg/l Nghiên cứu loại bỏ Cr và Ni trong nước ô nhiễm

cũng được thử nghiệm với cây cỏ Vetiver Vetiveria zizanioides và cây sậy Phragmites australistheo “phương pháp vùng rễ”, kết quả thu được cũng rất khả

quan (Nguyễn Tiến Cư ; Trần Văn Tựa ; Đặng Đình Kim ; Đỗ Tuấn Anh ; Lê Thu Thủy 2007, Trần Văn Tựa ; Nguyễn Đức Thọ ; Đỗ Tuấn Anh ; Nguyễn Trung Kiên

; Đặng Đình Kim 2007)

Ở Việt Nam, tại Viện Công nghệ sinh học cũng đã có công trình nghiên cứu chuyển gen tích lũy KLN vào cây Xoan ta và đã thu được các kết quả nhất định Tuy nhiên có thể nhận thấy, hầu hết các nghiên cứu trong nước theo hướng cải tạo môi trường bằng thực vật chủ yếu nghiên cứu về mức độ tích lũy KLN của thực vật Các nghiên cứu tập trung đánh giá và sử dụng các loài cây sẵn có khả năng tích lũy KLN trong tự nhiên cho mục đích cải tạo môi trường bằng thực vật hoặc bằng phương pháp xử lý truyền thống Trong khi đó, việc sử dụng công nghệ gen có ưu việt là có thể chuyển gen hấp thụ và tích lũy KLN vào loài cây phù hợp cho các vùng ô nhiễm khác nhau (các loài cây sống phổ biến trên vùng bị ô nhiễm mà không

có khả năng hấp thụ và tích lũy) Đây là biện pháp xử lý môi trường với hiệu quả tốt, chi phí thấp, đặc biệt phù hợp với các nước đang phát triển như nước ta và đã được triển khai rộng rãi ở một số nước Cục Môi trường châu Âu đã so sánh hiệu quả của phương pháp sử dụng thực vật cho thấy chi phí thấp hơn 1000 lần so với phương pháp truyền thống khi nghiên cứu tại 1,4 triệu điểm ô nhiễm (Barcelos J ; Poschenrieder C 2003)

Việc nghiên cứu phát triển một số loài thực vật hấp thụ KLN phải đáp ứng được yêu cầu là giống dễ trồng, có khả năng vận chuyển KLN từ đất lên nhanh, chịu được nồng độ ô nhiễm cao, phát triển nhanh (trong khi ở thực tế, cây tích lũy KLN thường phát triển chậm, những loài phát triển nhanh lại mẫn cảm với hàm lượng KLN cao) Một vấn đề khác là nếu dùng cây xuất xứ nơi khác với các cây nơi cải tạo đất sẽ làm ảnh hưởng đến đa dạng sinh học của các cây địa phương Vì vậy, cách tốt nhất là tạo các cây địa phương có khả năng cải tạo đất để hạn chế nguy cơ

bị ảnh hưởng Để thực hiện được điều này, cần có các hiểu biết sâu hơn về các tương tác hóa sinh học cùng với các thay đổi của thực vật hấp thụ KLN bản địa và phát triển các công trình nghiên cứu cơ bản có thể cung cấp được các giải pháp xử

dụng Phytoremediation an toàn hơn và đặc biệt cần thiết nếu muốn phát triển rộng khắp và hiệu quả Để góp phần giải quyết vấn đề trên, đề tài tập trung vào sử dụng gen tách được từ một số cây hoang dại sống ở các vùng ô nhiễm để chuyển vào cây thuốc lá là cây mô hình rất tốt để nghiên cứu gen hấp thụ As

4 Chuyển gen ở thực vật

4.1 Cơ sở khoa học của chuyển gen thực vật

Thành tựu kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp ADN cho phép người ta thực hiện chuyển gen trên thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới Cây được chuyển nạp gen mục tiêu được gọi là cây “transgenic”, với hai phương pháp chuyển nạp gen: (1) chuyển nạp gen gián tiếp nhờ sự cải tiến không ngừng hệ

thống Ti-plasmid trên vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, và (2) chuyển gen trực

tiếp theo phương pháp PEG (polyethylene glycol), phương pháp vi tiêm (microinjection), phương pháp bắn gen (biolistic), phương pháp chuyển qua ống hạt phấn (pollen tube pathway) và một số kỹ thuật khác

Trong đó ba phương pháp được ứng dụng rộng rãi là chuyển gen gián tiếp

bằng A.tumefaciens, tế bào trần và phi sinh học

Trong đề tài này chúng tôi chọn phương pháp chuyển gen bằng A.tumefaciens

(Yoshihiro Narusaka ; Mari Narusaka ; Satoshi Yamasaki ; Masaki Iwabuchi 2012)

Hình 1.2: Mô hình xâm nhiễm của A tumefaciens vào tế bào thực vật

Phương pháp chuyển DNA của A.tumefaciens được sử dụng phổ biến trong

công nghệ gen hiện đại

4.2 Giới thiệu chung về vector sử dụng trong chuyển gen thực vật

4.2.1 Các hệ thống vector sử dụng trong chuyển gen thực vật

Để có thể chuyển gen vào thực vật thông qua A.tumefaciens người ta phải sử

dụng một hệ thống vector chuyển gen Có hai loại vector chuyển gen đó là vector

liên hợp và vector nhị thể

4.2.1.1 Vector liên hợp (cointegrate)

Vì kích thước Ti plasmid quá lớn nên thao tác với chúng rất khó khăn Giải pháp cho việc này là chuyển vùng T-DNA lên một vector nhỏ hơn Điều này là

hoàn toàn có thể nhờ gen vir đóng vai trò vận chuyển gen vào tế bào chủ Hệ thống

này gọi là hệ thống vector liên kết Cả gen tiền ung thư và gen tổng hợp opine ở dạng T-DNA hoang dại đều được thay thế bởi gen chọn lọc (gen kháng kháng sinh)

Gen sinh tổng hợp opine trên Ti plasmid cũng bị loại bỏ và chỉ giữ lại gen vir cần

thiết cho việc hình thành bộ máy và cấu trúc đảm cho việc sao chép bền vững của

plasmid trong A tumefaciens

Vector liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn chức năng của

một vector thông thường khác của E coli, và thường gồm những phần sau: Một vị

trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen of interest = GOI),

thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E coli Gen chỉ thị có tính kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E coli và A tumefaciens Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật Đoạn khởi đầu của E coli, không hoạt động ở A tumefaciens Như vậy, vector liên hợp thực chất là vector lai có chỗ cho

GOI đi vào trong tế bào thực vật (Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003)

4.2.1.2 Vector nhị thể (binary vector)

Hệ vector nhị thể đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T-DNA

Khắc phục tình trạng khó nhân bản trong A.tumefaciens, loại vector nhị thể được

động cả ở E coli và A.tumefaciens, gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực vật, gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển gen thông qua A.tumefaciens, không cần khi chuyển gen trực tiếp, đoạn T-DNA ngoại biên

(border), đặc biệt là đoạn ngoại biên phải bắt buộc phải có Ngoài ra còn một số thành phần phụ trợ khác như đoạn kích thích vận chuyển T-DNA (Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003, Hanif M 2004)

Hệ vector nhị thể được thiết kế bao gồm hai plasmid tự tái bản Loại vector vận

tải mang GOI giữa đoạn ngoại biên của T-DNA và một plasmid hỗ trợ có gen vir đảm

nhiệm chức năng vận chuyển vào tế bào thực vật Plasmid hỗ trợ được cải biến từ các

Ti plasmid bình thường bằng cách loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật (Lê Trần Bình ; Phan Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003)

Với các kiểu plasmid như trình bày trên có thể tiến hành chuyển gen gián tiếp

thông qua Agrobacterium vào nhiều loài thực vật khác nhau (Lê Trần Bình ; Phan

Văn Chi ; Nông Văn Hải ; Trương Nam Hải ; Lê Quang Huấn 2003, Michielse B C

; Hooykaas P J J 2008)

4.2.1.3 Giới thiệu về vector pCambia 1301

Các vector chỉ thực hiện được chức năng của mình khi chúng có một số đặc tính như: có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bào vật chủ; có kích thước nhỏ, dễ nhận gen quan tâm, dễ xâm nhập và được sao chép; mang một số dấu hiệu chọn lọc giúp phân biệt các tế bào mang plasmid tái tổ hợp với các tế bào không có plasmid tái tổ hợp, tồn tại bền vững trong tế bào vật chủ Các đặc tính này

là cơ sở quyết định các thành phần chính của plasmid với: Gen quan tâm được gắn thêm đoạn khởi động và đoạn kết thúc; gen chỉ thị chọn lọc; các thành phần khác như vùng khởi đầu sao chép và vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (MCS) (Lê Thanh Hòa 2003) Vector pCambia 1301 có kích thước khoảng 11,8 Kb có chứa promoter CaMV 35S là một promoter mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật

với các thành phần chính như sau:

Đoạn khởi động gen (promoter)

Promoter 35S là một dạng chuỗi khởi động xây dựng được tách từ virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter CaMV35S-P), loại promoter nos

(Lê Thị Thu Hiền 2003) Trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật, CaMV35S-P được sử dụng rộng rãi nhờ khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô của cây hai lá mầm, tuy nhiên nó lại ít hoạt động ở cây một là mầm Để khắc phục nhược điểm này, CaMV35S-P được sử dụng kết hợp với các thành phần khởi động khác, chẳng hạn vector pEmu chứa nhiều bản sao của các tiểu phần phản ứng kị khí của

gen Adh1 từ ngô và các tiểu phần của gen tổng hợp octopin từA tumefaciens đã làm

gia tăng sự biểu hiện của gen trong cây một là mầm lên hàng chục lần (Nguyễn Đức

Thành 2003)

Promoter 35S dài 350bp, gồm 3 thành phần: Hộp TATA ( ở vị trí từ - 46 đến + 8), vùng tăng cường A (enhancer) từ vị trí -90 đến -46, làm tăng biểu hiện gen ngoại lai ở rễ, vùng tăng cường B (enhancer) từ vị trí -343 đến -90, làm tăng biểu hiện gen chuyển ở lá Trong vùng B gồm 5 phần nhỏ từ B1- B5 phân chia theo mức độ phản ứng của mỗi vùng đối với các yếu tố dịch mã khác nhau (Chilton M.D 1993) Nếu xảy ra sự thay đổi trong vùng tăng cường từ vị trí -207 đến -56 có thể dẫn đến mất khả năng gây nhiễm của virus Lợi dụng tính chất này, có thể gắn gen ngoại lại vào vùng enhancer sẽ làm mất khả năng gây nhiễm của virus khảm súp lơ (Chilton M.D 1993)

Đoạn kết thúc

Các đoạn kết thúc thường chứa đuôi polyA như AATTAA, hoặc AACCAA giúp bảo vệ các phân tử ARN thông tin được bền vững hơn và tránh được sự phân huỷ Hai đoạn kết thúc được sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là đoạn kết thúc của CaMV35S (có mặt trong 7 sản phẩm chuyển gen hiện nay) và đoạn kết thúc NOS có mặt trong ít nhất 16 - 28 sản phẩm (Lê Thị Thu Hiền 2003)

Gen chỉ thị

Các chỉ thị chọn lọc di truyền sử dụng trong biến nạp thực vật thường có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật, gồm 2 loại chính:

Chỉ thị chọn lọc (selectable marker): Kết cấu gen mang đoạn khởi động

NOS(nopaline synthase promoter-terminater) điều khiển sự biểu hiện gen kháng npt2 (neomycin phospho transferase gene), chỉ có những thể biến nạp sống được trên môi trường có kháng sinh kanamycin (Lê Thanh Hòa 2003)

Chỉ thị sàng lọc (screenable marker): Gen chỉ thị sàng lọc cần có một số đặc

điểm sau: sản phẩm của nó là độc nhất và không độc đối với tế bào thực vật, các enzym chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phương pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độ nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptit ngoài mà không ảnh hưởng hoạt tính enzym (Lê Thị Thu Hiền 2003)

Vùng MCS có chứa trình tự điểm cắt của rất nhiều loại enzym Trong đó

chúng ta quan tâm đến hai loại enzym là Eco72I và NcoI, trình tự điểm cắt của

chúng ở hai đầu của gen GUS Vì vậy khi cắt pCambia 1301 bằng hai loại enzym trên sau đó điện di chúng ta sẽ thu được hai băng tương ứng với kích thước

khoảng 9,8 Kb (vector) và 2 Kb (gen GUS) Nếu gắn vào đoạn gen ngoại lai mà ta mong muốn thì gen GUS không được biểu hiện Điều này rất có ý nghĩa trong việc

chọn lọc thể biến nạp (Lê Thanh Hòa 2003)

Trong tương lai, việc tối ưu hoá hệ thống vector và cải tiến các vector trên cơ

sở nghiên cứu tỉ mỉ các yếu tố tham gia vào quá trình chuyển nạp ổn định, các yếu

tố đa gen chuyển nạp vào vị trí nhất định trong genome thực vật và các điều kiện nuôi cấy tái sinh cây chuyển gen vẫn là những vấn đề cần thiết trong nghiên cứu

chuyển gen ở thực vật

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

- Tách và nhân dòng gen arsC (từ cây dương xỉ Pytirogramma calomelanos)

- Thiết kế vector chuyển nạp mang gen arsC

- Chuyển gen arsC vào cây thuốc lá và tái sinh cây chuyển gen

- Chứng minh sự có mặt của các gen chuyển nạp trong cây chuyển gen bằng PCR

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Vector biểu hiện pCambia 1301, kích thước 11838 bp

- Dòng thuốc lá K326 được sử dụng làm vật liệu để chuyển gen Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và đã được công nhận giống quốc gia, có một số đặc điểm chính như sau: Chiều cao trung bình 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng 120 ngày, thời gian ra nụ 10% là 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha, chất lượng tốt Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây trồng thuốc lá trên cả nước

Mẫu cây dương xỉ Pytirogramma calomelanos được lấy từ làng Hích thuộc

vùng mỏ than Đại Từ, Thái Nguyên Đây là mỏ than khoáng sản có trữ lượng lớn, nguồn đất và nước có hàm lượng Asen cao

2.2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.2.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử được cung cấp bởi các hãng có

uy tín như Affymetrix, Fermentas, Sigma,…

Các hóa chất dùng trong tách chiết ADN và plasmid được sử dụng của hãng Merck – Đức

- Kit tinh sạch Gene JETTM Gel Extraction KIT của hãng Fermentas - Mỹ

- Bộ kit tổng hợp cDNA của Affymetrix – Mỹ

- Các hóa chất sử dụng trong điện di DNA: TAE 1X, DNA ladder 1kb của 1st base của hãng Fermentas, Agarose và Ethidium Bromide được sử dụng của hãng Sigma – Mỹ

- Các enzym cắt giới hạn NcoI, Eco72I và BamHI và enzym nối T4 DNA

ligase (Fermentas – Mỹ)

- Các loại kháng sinh kanamycin, cefotaxime, rifamycin và hygromycin

- Các hóa chất khác của phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

2.2.2.2 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Di truyền tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Bảng 2.1 Danh mục thiết bị

Tên thiết bị Nguồn gốc , xuất xứ

Máy PCR system 9700 Applied Biosystem, Mỹ

Máy điện di Powerpac 300 Bio-Rad, Mỹ

Máy chụp gel CLS – Microdoc Cleaver Scientific Ltd, Mỹ

2.2.3 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn :

Môi trường LB (Luria and Betani ) đặc: Yeast extract 5 g/l; Trypton 10 g/l; NaCl 10 g/l; agar 16 g/l, pH = 7,0

Môi trường LB lỏng: Yeast extract 5 g/l; Trypton 10 g/l; NaCl 10 g/l; pH = 7,0

- Môi trường nuôi cấy mô thực vật MS theo Murashige và Skoog (1962)