Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen crprx phân lập từ cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don)

Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn theo hướng công nghệ gen là một hướng nghiên cứu được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới... Số hóa bởi

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

ĐÀO THỊ NHÂM

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP

TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2016

Trang 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM –––––––––––––––––––

ĐÀO THỊ NHÂM

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN

MANG CẤU TRÚC GEN CrPrx PHÂN LẬP

TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm

THÁI NGUYÊN – 2016

Trang 3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiê ̣n dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi

rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2016

Tác giả

Đào Thị Nhâm

Trang 4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bô ̣ môn Di truyền & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Ban chủ nhiê ̣m K hoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn, Ths Hồ Mạnh Tường và các cán

bô ̣ Phòng DNA ứng dụng , Phòng thí nghiệm Trọng điểm C ông nghê ̣ gen , Viê ̣n Công nghê ̣ S inh ho ̣c , Viê ̣n Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghê ̣ Viê ̣t Nam đã ta ̣o điều kiê ̣n và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiê ̣m của đề tài luận văn

Tôi xin cảm ơn sự động viên , khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian ho ̣c tâ ̣p và thực hiê ̣n đề tài luận văn

Đề tài luâ ̣n văn th uô ̣c chương trình đào ta ̣o nghiên cứu sinh và cao ho ̣c của Bộ môn Di t ruyền & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , Khoa Sinh học, Trường Đa ̣i ho ̣c Sư phạm - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2016

Tác giả

Đào Thị Nhâm

Trang 5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt iv

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

MỞ ĐẦU 1

1. Đặt vấn đề 1

2. Mục tiêu nghiên cứu 2

3. Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây dừa cạn 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn 4

1.1.3 Tác dụng của cây dừa cạn 5

1.2 Hợp chất alkaloid và tác dụng 6

1.2.1 Alkaloid 6

1.2.2 Alkaloid trong cây dừa cạn 10

1.2.3 Peroxidase và gen mã hóa peroxidase 14

1.3 Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn 17

1.3.1 Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 17

1.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 22

Trang 6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn iv

2.1.1 Vật liệu 22

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Thiết kế cặp mồi nhân gen 27

2.2.2 Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số 28

2.2.3 Phương pháp tổng hợp cDNA từ mRNA 28

2.2.4 Nhân gen CrPrx bằng kĩ thuật RT-PCR 29

2.2.5 Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR 30

2.2.6 Kỹ thuật tách dòng gen 31

2.2.7 Phương pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen CrPrx 34

2.2.8 Thiết kế vector chuyển gen mang CrPrx 34

2.2.9 Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả phân lập và tách dòng gen CrPrx 38

3.1.1 Kết quả khuếch đại đoạn gen CrPrx từ mRNA 38

3.1.2 Kết quả ghép nối gen CrPrx vào vector tách dòng 39

3.2 Xác định trình tự gen CrPrx 43

3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx 47

3.3.1 Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) 48

3.3.2 Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121 51

3.4 Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 56

Trang 7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

promoter

cây dừa cạn

tranferase

Gen DAT

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

Assa

Xét nghiệm ELISA

β-D-1-Thiogalactopyranoside

bản nuôi cấy vi khuẩn

RT-PCR Reverse transcription - Polymerase

Chain Reaction

Phản ứng chuỗi polymerase -phiên mã ngược

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalacto-pyranoside

Trang 8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen CrPrx 29

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng RT- PCR nhân gen CrPrx 30

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng gắn gen CrPrx vào vector tách dòng pBT 31

Bảng 2.4: Thành phần môi trường nuôi cấy khuẩn 32

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng colony - PCR 32

Bảng 2.6: Thành phần hoá chất tách plasmid 33

Bảng 2.7: Thành phần cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx và pRTRA7/3 35

Bảng 2.8: Thành phần ghép nối vector pRTRA7/3 và gen CrPrx 35

Bảng 2.9: Thành phần phản ứng cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx và pBI121 36

Bảng 3.1: Vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự gen CrPrx và LN809932 46

Trang 9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G Don 4

Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp vinblastine và vincristine 12

Hình 1.3: Công thức hóa học của vinblastine 13

Hình 1.4: Công thức hóa học của vincristine 13

Hình 2.1: Vector tách dòng pBT 23

Hình 2.2: Vector pRTRA7/3 23

Hình 2.3: Vector pBI121 23

Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm phân lập và thiết kế vectorchuyển gen pBI121-CrPrx 26

Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạncDNA CrPrx 38

Hình 3.2: Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E coli DH5 chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen CrPrx 40

Hình 3.3: Kết quả điê ̣n di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc 41

Hình 3.4: Kết quả điện đi sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt plasmid bằng NcoI/NotI 43

Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotid của gen CrPrx với trình tự gen mang mã số LN809932 45

Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx 47

Hình 3.7: Đoạn DNA đích đã tinh sạch từ pRTRA7/3 cắt mở vòng bằng NcoI/NotI 49

Hình 3.8: Kết quả PCR các dòng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx 50

Hình 3.9: Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx bằng HindIIIthu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx 52

Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121 53

Hình 3.11: Kết quả điện di colony-PCR của vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx 54

Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen 55

Trang 10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Nước ta là một nước nhiệt đới với những điều kiện khí hậu thuận lợi, vì vậy nguồn tài nguyên thiên nhiên rất phong phú và đa dạng Cùng với nền y học cổ truyền dân tộc có truyền thống lâu đời, nhân dân ta đã biết sử dụng các loài cây cỏ xung quanh làm nguồn dược liệu để chữa bệnh rất có hiệu quả Ngày nay, bên cạnh thuốc tân dược thì các loại dược liệu có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng

Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi trường sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt của con người thay đổi, thực phẩm không an toàn… Những yếu tố này tác động đến sức khỏe của con người, làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh, trong đó có nguy cơ các tế bào bị biến đổi Đây là một trong các nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thư ngày càng tăng Vì thế, một trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học là nghiên cứu, cải tiến các biện pháp chữa trị ung thư để nâng cao chất lượng đời sống cho người bệnh

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) là một trong những cây

có khả năng sản xuất các indol alkaloid có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt là ung thư máu Trong các indol alkaloid

có mặt trong cây dừa cạn, hai loại alkaloid là vinblastine, vincristine được sử dụng nhiều nhất Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong cây dừa cạn, khoảng nửa tấn lá khô mới chiết được 1g vinblastine cho sản xuất dược phẩm (Noble, 1990) [21] Các chất này không thể tổng hợp bằng con đường hóa học do có cấu trúc rất phức tạp Do vậy, nâng cao hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn theo hướng công nghệ gen là một hướng nghiên cứu được quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới

Trang 11

Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine được tạo ra từ sự kết hợp

của catharanthine và vindoline Gen CrPrx mã hoá peroxidase có chức năng

xúc tác cho phản ứng tạo tiền chất cho sự tổng hợp vinblastine và vincristine Các nghiên cứu cho thấy, trong các giống dừa cạn hiện có thì giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím có hàm lượng alkaloid toàn phần và các chất là vinblastine

và vincristine cao nhất

Nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết Để tăng năng suất tổng hợp hai loại alkaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen tham gia vào các con đường tổng hợp alkaloid và thiết kế vector phục vụ chuyển gen là rất quan trọng

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế

vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập được đoạn mã hóa cDNA của gen CrPrx từ cây dừa cạn hoa

hồng tím

Thiết kế được vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ

cây dừa cạn hoa hồng tím, phục vụ chuyển gen nâng cao hàm lượng alkaloid ở cây dừa cạn

3 Nội dung nghiên cứu

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây dừa cạn

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây dừa cạn hay còn gọi là hải đằng, dương giác, bông dừa, trường

xuân, hoa thuộc họ Apocynaceae, chi Catharanthus, loài Catharanthus

roseus [4], [37]

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) có nguồn gốc ở

Madagasca (châu Phi), mọc hoang và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới và ôn đới như Việt Nam, Ấn Độ, Indonesia… Cây dừa cạn được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam để làm cây cảnh Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng nóng cây dừa cạn được trồng quanh năm, nhưng ở những vùng lạnh cây được trồng theo mùa vì không chịu được lạnh Cây dừa cạn dễ trồng, phát triển nhanh chịu nắng, hạn tốt, không kén đất và ít phải chăm sóc, cách chăm sóc không quá đặc biệt nên ít lâu sau nó đã lan ra ở nhiều địa phương, nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển nước ta Cây dừa cạn ra hoa quanh năm, chủ yếu là

từ tháng 5 - 9 [5]

Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển Trước đây cây dừa cạn còn chỉ được trồng để làm cảnh, nhưng gần đây cây đã được trồng để thu hoạch lấy cây, lá, rễ dùng làm thuốc [5]

Cây dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc alkaloid terpenoid indole được phân lập từ 3 giống cây khác nhau: (1) Catharanthus roseus “Roseus” có hoa

Trang 13

màu hồng tím; (2) Catharanthus roseus “Ocellatus” có hoa màu trắng nhụy đỏ; (3) Catharanthus roseus “Albus” có hoa màu trắng Trong đó, hoa màu hồng

tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất [37]

Hình 1.1: Hoa của ba giống Catharanthus roseus (L.) G Don [37]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của cây dừa cạn

Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40cm – 60cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên Thân hình trụ có 4 khía dọc, lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím có bộ rễ rất phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên Cây dừa cạn mọc thành bụi dày có cành đứng Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, kích thước của lá thường biến động tùy từng vùng phân bố dài 3cm - 6cm, rộng 2cm - 3cm Cuống lá ngắn 3 - 5mm Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, gồm 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới Mỗi cành thường có 8 - 15 cặp lá, lá có phiến bầu dục màu xanh thẫm, mặt trên nhẵn mặt dưới có nhiều lông Mùa hoa và quả vào tháng 4 - 5 và tháng 9 - 10 hàng năm [5]

Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4 - 5mm Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài

3 - 4mm Cánh hoa 5, dính Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím, trắng, … Mặt trên và mặt dưới của hoa màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím) Nhị 5, rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen

Trang 14

kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn Hoa có mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên Quả gồm hai đại dài 2cm - 4cm, rộng 2mm – 3mm, mọc thẳng đứng hơi ngả hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù Trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc [4], [2]

Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ Rễ cái đâm thẳng xuống đất

có thể đạt chiều dài 30cm – 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát triển theo chiều ngang [4], [5]

1.1.3 Tác dụng của cây dừa cạn

Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid Người ta đã chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicine… chúng được sử dụng làm nguyên liệu điều trị bệnh ung thư [5]

Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, săn da, chữa bệnh ngoài da

Một số bài thuốc dân gian chữa bệnh ung thư của cây dừa cạn [4]:

Tăng huyết áp: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và 20g lá dâu, sắc lấy nước, chia uống từ 2 – 3 lần mỗi ngày Cách khác, lấy 6g hoa dừa cạn, 10g

nụ hoa hoè (hoặc 10g cúc hoa), hãm với nước sôi trong bình kín khoảng 20 phút Uống thay nước trà mỗi ngày

Ung thư máu, viêm đại tràng: Lấy từ 15 – 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng và sắc uống từ 2 – 3 lần trong ngày

Mất ngủ: Lấy 20g thân lá dừa cạn khô sao vàng, 12g lá vông nem, 12g hạt muồng sao đen, sắc uống trước khi đi ngủ

Rong kinh: Lấy từ 20 – 30g dừa cạn sao vàng (toàn cây có cả hoa và rễ), sắc lấy nước, uống liên tục từ 3 – 5 ngày

Chữa bỏng nước sôi: Lá dừa cạn tươi lượng vừa đủ, giã nát, nhuyễn với chút gạo, đắp lên vết thương bỏng

Trang 15

Trị bệnh bạch cầu lympho cấp: Dùng 15g dừa cạn sắc nước uống Y học

đã chiết được vinblastine từ lá dừa cạn và dưới dạng thuốc tiêm vinblastine sulfate để chữa bệnh này

Cây dừa cạn chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc dùng thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân, lá khô/ngày) sắc uống

Điều trị zona: Dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 16g, thổ linh 16g, bạch linh 10g, kinh giới 12g, chi tử 10g, nam tục đoạn 16g, cam thảo đất 16g, hạ khô thảo 16g Sắc uống ngày 1 thang, sắc 3 lần, uống 3 lần Thuốc đắp: lá dừa cạn kết hợp với lá cây hòe Hai thứ lượng bằng nhau, giã nhỏ đắp lên các tổn thương, băng lại Tác dụng làm giảm đau nhức

Điều trị lị trực trùng: Đi ngoài nhiều lần, bụng đau từng cơn, phân có chất nhầy, có máu mũi, sút cân nhanh Bài thuốc: dừa cạn (sao vàng hạ thổ) 20g, cỏ sữa 20g, cỏ mực 20g, chi tử 10g, lá khổ sâm 20g, hoàng liên 10g, rau má 20g, đinh lăng 20g Đổ 3 bát nước sắc lấy 1,5 bát, chia 3 lần uống trong ngày

Cây dừa cạn điều trị u xơ tuyến tiền liệt: Dừa cạn 12g, huyền sâm 12g, xuyên sơn 10g, chè khô 12g, hoàng cung trinh nữ 5g, cát căn 16g, bối mẫu 10g, đinh lăng 16g Sắc uống ngày 1 tháng, chia ba lần

1.2 Hợp chất alkaloid và tác dụng

1.2.1 Alkaloid

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ

gia thực phẩm có giá trị Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ Chúng là sản phẩm các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ chống lại vi sinh vật và động vật Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside [2], [27]

Trang 16

Alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh

lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm codein, nicotine, caffeine và morphine [2], [27]

Một số loại thực vật chứa nhiều alkaloid như là cây thuốc phiện, cây cà độc dược, cây thuốc lá và khoai tây Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, cũng có khi chỉ tập trung trong lá Trong cùng một cây có thể tùy theo bộ phận của cây

mà tạo ra các alkaloid khác nhau Tùy theo từng loại alkaloid mà tác dụng lên các bộ phận khác nhau như lên hệ thần kinh, hệ cơ, mạch máu và hệ hô hấp [2]

Hàm lượng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất đất, phân bón, giống cây, bộ phận thu hái và thời kỳ thu hái Vì vậy, đối với mỗi loại dược liệu cần nghiên cứu cách trồng trọt, thu hái và bảo quản để có hàm lượng hoạt chất cao [2]

1.2.1.1 Đặc điểm chung của alkaloid

Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ và có tính base, thường gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài

động vật Ngoài ra, alkaloid còn được sử dụng rộng rãi để bào chế thuốc

(cafeine, cocaine, ephedrin ) [11]

Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật nhất là đối với hệ thần kinh Tùy vào hàm lượng alkaloid nó có thể là chất độc gây chết người nhưng có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [12]

Alkaloid có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh Hàm lượng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng như khoai tây, chè, cà phê Alkaloid là hợp chất thiên nhiên rất quan trọng về nhiều mặt Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao [12]

1.2.1.2 Phân loại alkaloid

Các alkaloid thông thường được phân loại theo đặc trưng phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất được sử dụng để tạo ra phân tử

Trang 17

Khi người ta chưa biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì chúng được gộp nhóm theo tên gọi của các hợp chất đã biết Ví dụ: do các cấu trúc phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện đôi khi còn được gọi là các “phenanthrene” Hay gọi tên dựa theo nhóm động/thực vật từ đó chiết xuất ra các alkaloid, ví dụ như các alkaloid chiết từ

cây dừa cạn vinca thì được gọi chung là các vinca alkaloid [12]

Các nhóm alkaloid hiện nay, gồm có nhóm pyridine (piperine, coniine, trigonelline, arecaidine, guvacine, pilocarpine, cytisine, nicotine, spartein, pelletierine); nhóm pyrrolidine (hygrine, cuscohygrine, nicotine) nhóm tropan (atropine, cocaine, ecgonine, scopolamine); nhóm quinoline (quinine, quinidine, dihydroquinine, dihydroquinidine, strychnine, brucine, veratrine, cefradine); nhóm isoquinoline (morphine, codeine, thebaine, papaverine, narcotine, sanguinarine, narceine, hydrastine, berberine); nhóm phenethylamine (mescaline, ephedrine, dopamine, amphetamine); nhóm indole gồm các tryptamine (DMT, N-metyltryptamine, psilocybin, serotonine), ergoline (alcaloid từ ngũ cốc/cỏ như ergine, ergotamine, axid lysergic v.v), beta-cacbolin (harmin, harmaline, yohimbine, reserpine, emetine) và các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia) (reserpine); nhóm purine bao gồm xanthine (caffeine, theobromine, theophylline); nhóm terpenoid gồm các alkaloid aconitin, steroid (solanine), samandarin (muscarine, choline, neurin) [12]

1.2.1.3 Tính chất của alkaloid

Phần lớn alkaloid trong tự nhiên, công thức cấu tạo có oxy thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường Ví dụ: Morphine (C17H19NO3), codeine (C18H21NO3), strychnine (C21H22N2O2), quinine (C20H24N2O2), reserpine (C33H40O9N2)… Những alkaloid trong thành phần cấu tạo không có oxy thường ở thể lỏng Ví dụ như: Coniine (C8H17N), nicotine (C10H14N2), sparteine (C15H26N2) [27]

Trang 18

Tuy nhiên, cũng có vài chất trong thành phần cấu tạo có oxy vẫn ở thể lỏng như arecoline (C8H13NO2), pilocarpidine (C10H14N2O2) và có vài chất không có oxy vẫn ở thể rắn như sempecviren (C19H16N2), conexine (C24H40N2) Các alkaloid ở thể rắn thường kết tinh và có điểm chảy rõ ràng, nhưng cũng

có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy bởi nhiệt độ trước khi chảy [27]

Đa số alkaloid không mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay như capsaicin, piperine… Hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một số alkaloid

có màu vàng như berberine, palmatine, chelidonine Các alkaloid base không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen… Muối của alkaloid dễ tan trong nước, hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và muối alkaloid người ta sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của

nó bằng dung dịch kiềm trung bình và mạnh như NH4OH, NaOH… [27]

Qua nghiên cứu định tính và định lượng alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự vận chuyển của chúng, người ta nhận thấy nơi tạo

ra alkaloid không phải là nơi tích tụ nhiều alkaloid Nhiều alkaloid được tạo ra

ở rễ sau đó vận chuyển lên phần trên của cây Sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả và hạt Ví dụ: L-hyoscryamine trong cây

cà độc dược (Atropa belladonna) được tạo ra ở rễ, sau đó chuyển lên phần trên

của cây Khi cây 1 tuổi thân cây chứa nhiều alkaloid hơn lá, khi cây 2 tuổi thân cây hóa gỗ nhiều hơn, hàm lượng alkaloid giảm xuống, hàm lượng alkaloid ở phần ngọn đạt được mức tối đa vào lúc cây ra hoa và giảm đi khi quả chín[6] Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và bộ phận thu hái [32]

Trang 19

1.2.2 Alkaloid trong cây dừa cạn

1.2.2.1 Một số alkaloid chính trong cây dừa cạn

Lá và hoa cây dừa cạn có hàm lượng vindoline, catharanthine và anhydro vinblastine cao, trong khi ở rễ lại tích lũy hàm lượng ajmalicine, vindolinine và serpentine cao hơn ở các vị trí khác trong cây [25]

Cây ở giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì mức độ sản sinh alkaloid khác nhau Hàm lượng alkaloids indole mono giảm, trong khi alkaloid bisindole tăng với lá già và khi cây ngừng phát triển [24]

Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân 0,40%, rễ chính 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏ quả 1,14%, hạt 0,18% Trong khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ cây dừa cạn, người ta đặc biệt chú ý 20 nhóm alkaloid dimeric là những nhóm có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine và vinblastine [22]

Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0,013% - 0,063%, ở bộ phận trên mặt đất 0,0015%, ở rễ 0,23% Nếu cây bị bệnh asteryllow-virus thì sẽ không

có vinblastine Vincristine có hàm lượng thấp hơn 0,0003% - 0,0015% [23]

Lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phương khác nhau chứa 0,7% - 1,2% alkaloid toàn phần Vinblastine có với hàm lượng 1,6 – 2 phần vạn ở lá Thời gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lượng hoạt chất cao là vào cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dương lịch [20]

1.2.2.2 Tác dụng của alkaloid trong cây dừa cạn

Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây dừa cạn hai alkaloid vinblastin và vincristin, là những chất ức chế mạnh sự phân bào Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với Tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào ngăn cản sự tạo thành các vi ống và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa Cho nên, chúng hạn chế hình thành bạch cầu thừa ở bệnh nhân ung thư máu Vì vậy, vinblastin và vincristin được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [5]

Trang 20

Nhờ thực nghiệm trên chuột, các nhà khoa học Canada đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ dừa cạn và phát hiện ra chất vincaleucoblastine và 3 ankaloid khác cũng có tác dụng chống khối u là leurosine, leurocristine và leurosidine Ngoài ra, các nhà khoa học còn phát hiện

ra tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthine, vindolinine

và vincolidin [33]

Các alkaloid được chiết xuất từ dừa cạn được dùng dưới dạng muối sulfate Vinblastine sulfate được coi là lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, ngoài ra nó rất hiệu quả trong liệu pháp trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận Hơn nữa, vinblastine sulfate còn được dùng để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư

vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da [30]

Vincristine sulfate là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi hàng đầu, đặc biệt đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp Đây là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không - Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân Ngoài ra, ở dạng dùng phối hợp, vincristine sulfate còn được dùng cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính [30]

Hiện nay, y khoa vẫn chưa tìm ra phương pháp nào điều trị bệnh bạch cầu tốt hơn vinblastine và vincristine nên cây dừa cạn càng trở nên có giá trị Tuy nhiên, để chữa được bệnh ung thư cần sử dụng vincristine, vinblastine với hàm lượng rất cao Nhưng dùng các thành phần này, cần có sự hướng dẫn của bác sỹ điều trị, nếu không dễ bị ngộ độc [9]

Vinblastine được chuyển hóa chủ yếu ở gan để thành desacetyl vinblastine Thuốc này được thải trừ qua mật vào phân và nước tiểu, một số đào thải dưới dạng thuốc không biến đổi [9]

Trang 21

1.2.2.3 Quá trình sinh tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn

Sự khác nhau của alkaloid trong cây dừa cạn phụ thuộc vào loại terpenoid indole alkaloid (TIA) Chúng gồm hai nửa bắt nguồn từ hai quá trình chuyển hóa riêng biệt là quá trình mevalonate cho nửa không chứa tryptophan và quá trình tryptophan cho nửa chứa tryptophan Cấu trúc phức tạp của những alkaloid này luôn có mặt hai nguyên tử nitơ Một là indole nitơ (nửa bắt nguồn

từ tryptophan) và nguyên tử nitơ thứ hai được tạo thành từ sự tách rời của hai carbon tại vị trí β của vòng indole Nửa không có tryptophan bắt nguồn từ mevalonic acid và nó là một C10-geraniol (monoterpenoid) Geraniol được tạo thành, thông qua một chuỗi chuyển hóa sẽ chuyển thành dạng loganin và sau đó

là secologanin (một monoterpenoid glucoside) [7]

Hình 1.2: Sơ đồ tổng hợp vinblastine và vincristine

Chất trung gian hình thành các monoterpenoid indole alkaloid là 3α strictosidine Enzyme chịu trách nhiệm cho phản ứng kết hợp giữa trytamine và

Trang 22

(S)-Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 13

secologanin là strictosidine synthase Strictosidine sau đó sẽ hình thành cấu trúc cathenamine (alkaloid loại coryanthe) Cathenamine phải trải qua một chuỗi các phản ứng để dẫn đến sự hình thành catharanthine (alkaloid loại iboga) và vindoline (alkaloid loại aspidosperma) Catharanthine và vindoline là các alkaloid monomeric indole, xuất hiện tự do trong cây 3’,4’- Anhydrovinblastine được hình thành do từ sự ghép nối của catharanthine và vindoline, với sự xúc tác của peroxidase Sau đó, 3’,4’- Anhydrovinblastine được chuyển thành vinblastine cuối cùng là vincristine [6] Vincristine cũng có cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay nhóm fromyl bằng một nhóm methyl trên phân tử nitrogen indole của vindoline [24]

Hình 1.3: Công thức hóa học của vinblastine (C48H58N4O9)

Hình 1.4: Công thức hóa học của vincristine (C46H56N4O10)

Việc nghiên cứu sáng tỏ con đường chuyển hóa tổng hợp các alkaloid nói chung, vinblastine và vincristine nói riêng ở cây dừa cạn, cùng sự phát hiện các enzyme xúc tác cho các quá trình tổng hợp và các gen mã hóa tổng hợp các enzyme tương ứng tạo cơ sở thuận lợi cho việc nghiên cứu tạo cây dừa cạn

Trang 23

chuyển gen có khả năng tổng hợp các alkaloid có lợi với hàm lượng cao phục

vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư có hiệu quả

1.2.3 Peroxidase và gen mã hóa peroxidase

Quá trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn có sự tham gia của nhiều nhân

tố phiên mã và các gen chức năng như DAT, ORCA3, Prx… [34]

Peroxidase là loại enzyme thực vật có khả năng sử dụng H2O2 để oxy hóa một số chất cho quá trình chuyển hóa trung gian, đặc biệt là hợp chất phenol Những enzyme này được định vị trên thành tế bào hoặc trong không bào, đây là sản phẩm của quá trình chuyển hóa trung gian Chức năng sinh hoá của peroxidase trong cây dừa cạn đã được phát hiện bởi những nghiên cứu về khả năng oxy hóa các hợp chất phenol sử dụng H2O2 Phân tích các hợp chất phenol từ không bào lá người ta đã phát hiện sự có mặt của 3 axit caffeoylquinic và 4 flavonoid trong bào quan này Điều thú vị là peroxidase hoạt động trong không bào chiếm tỷ lệ lên tới hơn 90% peroxidase tổng số trong lá [10]

Gen mã hoá enzyme peroxidase đã được phân lập từ cây dừa cạn bởi Kumar và cs (2007) có kích thước 1357 bp, vùng mã hoá gồm 993 nucleotide, từ

nucleotide số 41 đến nucleotide số 1034 Gen Prx mã hóa một sản phẩm protein

gồm 330 amino acid với 21 amino acid của peptide tín hiệu Khối lượng phân tử

của Prx ước tính 37,43 kDa và có giá trị pI 8,68 mRNA và Prx đã được tìm thấy

trong lá của cây dừa cạn và đã được xác định bằng phương pháp Northern blot

và Western blot [16]

Để có được một cái nhìn sâu sắc về trình tự hoàn chỉnh của CrPrx, Kumar

và cs (2007) đã thực hiện phản ứng PCR bằng cách sử dụng cặp mồi PFLF1 và PFLR1, được thiết kế bám để bảo tồn vùng 5' - UTR và vùng 3' - UTR trên DNA của cây dừa cạn Sản phẩm khuếch đại khi nhân bản và trình tự được tìm thấy dài

1793 bp CrPrx bao gồm bốn exon (268 bp, 189 bp, 172 bp, 405 bp, dừng lại ở UAG) và ba intron (95 bp, 435 bp, 79 bp) Intron thứ hai trong CrPrx đã được tìm

Trang 24

thấy có kích thước lớn nhất và lớn hơn so với các exon, sự phát hiện cấu trúc CrPrx

đã góp phần làm rõ thêm quan điểm về nguồn gốc của peroxidases ở cây dừa cạn từ một gen tổ tiên chung với các loài khác có ba intron và bốn exon [16]

Hình 1.5: Cấu trúc intron và exon của CrPrx [14]

Phân tích Northern Blot cho thấy biểu hiện của CrPrx khác nhau trong

các cơ quan khác nhau Trong các mô sinh dưỡng, biểu hiện nhiều nhất trong các mô liên nút gốc, tiếp theo là rễ, lá non và lá trưởng thành Trong các mô sinh sản, biểu hiện nhiều nhất trong quả, tiếp theo là nụ hoa Sự biểu hiện

CrPrx đã không được phát hiện trong lá già và hoa [16]

Maria Manuela và cs (2008) đã phân lập được gen mã hóa enzyme anhydrovinblastine synthase từ DNA genome, gen này được xác định thuộc

peroxidase III có mặt trong lá cây dừa cạn và đặt tên CrPrx1 CrPrx1 có 1388

nucleotide, vùng mã hóa từ nucleotide số 43 đến nucleotide số 1134, trình tự amino acid suy diễn tương ứng gồm 363 amino acid, trong đó có đoạn peptide tín hiệu nằm ở đầu tận cùng N điều khiển sự vận chuyển loại protein này trong

tế bào [19]

Gen Arabidopsis Prx (AtPrx12) là gen có tương đồng cao nhất với

CrPrx1 Gen AtPrx12 chứa hai intron, có vùng mã hóa gần như hoàn toàn

giống với các vùng tương ứng trong CrPrx1 Thiết kế mồi ở vị trí giả định của intron đã khuếch đại được một intron Intron I của CrPrx1 bao gồm 828 bp,

được lắp vào vị trí 300 của cDNA, và hai bên là các dinucleotide - GT và –

AG Intron thứ hai cũng có mặt và có khả năng cùng ở trong một vị trí tương

Trang 25

đương với intron II của gen AtPrx12 Tuy nhiên, để khuếch đại intron II

CrPrx1 bằng các cặp mồi oligoT không thành công Việc khuếch đại intron II

của gen CrPrx1 rất khó khăn có thể là do kích thước lớn Bằng phương pháp Southern blots người ta đã xác định được số lượng bản sao gen của CrPrx1 và

kích thước của intron II Kết quả, xuất hiện một băng duy nhất, điều đó cho

thấy rằng CrPrx1 tồn tại như một gen đơn bản sao trong cây dừa cạn, kích

thước ước tính của intron II là 3,5 – 4 kb [19]

Năm 2011, Kumar và cộng sự đã tách dòng và giải trình tự của hai gen

peroxidase III là CrPrx3 và CrPrx4 từ cDNA cây dừa cạn Chiều dài đầy đủ của

CrPrx3 phân lập từ DNA genome là 1233 bp, mã hóa chuỗi polypeptid gồm 330

amino acid, CrPrx4 phân lập từ DNA genome dài 1055 bp, có vùng mã hóa gồm

956 nucleotide và mã hóa cho 318 amino acid Giả định mô hình cấu trúc 3-D

của CrPrx3 và CrPrx4 đã phát hiện sự hiện diện của hai Ca(+2)

bằng các liên kết

ion ở hai đầu, và một nhóm heme phối hợp tại vị trí trung tâm CrPrx3 và CrPrx4

đều có một bản sao duy nhất trong cây dừa cạn Cả hai gen trên đều có mặt trong

một loạt các mô thực vật Định lượng CrPrx3 và CrPrx4 bằng real-time PCR đã

xác nhận được, chúng biểu hiện tối đa trong thân tiếp theo là hoa [17]

Costa và cs (2008) nghiên cứu cấu trúc của peroxidase III isoenzyme hiện diện trong lá của cây dừa cạn và enzyme này tham gia vào quá trình sản xuất các alkaloid có tác dụng chống ung thư [8]

Nói chung, trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu về Prx ở

thực vật và số ít ở động vật Tuy nhiên, việc nghiên cứu về gen này trên cây dừa cạn còn hạn chế

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về cây dừa cạn chỉ được tập trung vào khảo sát hàm lượng alkaloid, phương pháp nuôi cấy và phương pháp chiết rút để thu sản phẩm alkaloid từ cây dừa cạn Tuy nhiên , nghiên cứu sinh học phân

tử các gen liên quan đến cơ chế sinh tổng hợp các alkaloid ở dừa cạn còn ít được đề câ ̣p tới

Trang 26

1.3 Các nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine

Pietrosiuk và cs (1999) đã tạo được hai dòng mô sẹo cây dừa cạn trắng

và xanh trên môi trường Gamborg rắn bổ sung kinetin 0,1mg/l và IAA 1mg/l

Mô sẹo được lấy từ những đoạn trụ dưới lá mầm của cây cây dừa cạn Dòng mô sẹo trắng đã được chọn từ những mô sẹo xanh phát triển trong pha tĩnh Trái ngược với sự rắn chắc của dòng mô sẹo màu xanh, dòng màu trắng lại mịn và mềm Phương pháp HPLC đã phân tích các chất chiết từ mô sẹo của cả hai dòng mô sẹo xanh và mô sẹo trắng cho thấy, các indole alkaloid tồn tại ở dạng vết và không có dược tính [26]

Bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC), nghiên cứu của Junaid Aslam và cs (2009) cho thấy, có sự khác nhau về hàm lượng vincristine trong các loại mô sẹo (mô sẹo phôi và không phải mô sẹo phôi) thu được từ nuôi cấy

in vitro Hàm lượng vincristine trong các giai đoạn của sự phát triển phôi (phôi

chín, phôi nảy mầm), các bộ phận khác nhau của cây (lá, rễ…) trồng ngoài tự nhiên cũng có sự khác nhau Nghiên cứu đã khẳng định, hàm lượng vincristine cao trong mô sẹo lá và phôi nảy mầm Lá của cây nuôi cấy trong ống nghiệm

có hàm lượng hàm lượng vincristine cao hơn lá của cây nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng ở giai đoạn tương tự [15] Kết quả nghiên cứu này góp phần định

Trang 27

hướng sản xuất vincristine trong các loại mô và các giai đoạn cụ thể để đạt hiệu quả cao

Zhao và cs (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận được

từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid ở huyền phù tế bào cây dừa cạn Sau 10 ngày nuôi cấy đã thu được catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25mg/l, 32mg/l và 22mg/l trong bình lắc 500ml, 1000ml và bioreactor dạng sục khí 20 lít Tác giả cũng đã quan sát thấy, có sự kết hợp giữa việc xử lý malate và alginate kích thích sự phản ứng lại, ví dụ như: sự oxy hóa lipid xảy ra ở hầu hết quá trình nuôi cấy cây dừa cạn

và điều này có thể gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua con đường jasmonate [36]

Tarek Kapiel (2010) đã nghiên cứu các điều kiện để tối ưu hóa khả năng

tổng hợp alkaloid trong tế bào cây dừa cạn nuôi cấy dịch huyền phù bằng cách

bổ sung một số yếu tố kích thích vào môi trường MS Môi trường cho sự sinh trưởng tối ưu của mô sẹo nhận được từ trụ dưới lá mầm và lá mầm là môi trường MS bổ sung 2,4D và BA đều với nồng độ 1mg/l (môi trường MS4) Trong khi đó môi trường tối ưu cho mô sẹo nhận được từ lá là MS, bổ sung NAA và BA cùng với nồng độ 1mg/l (môi trường MS6) [31] Pan và cs (2010) trong nghiên cứu của mình cũng đã khẳng định, chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp vinblastine, vindoline và catharanthine của

cây dừa cạn nuôi cấy [23]

Cùng hướng nghiên cứu trên, Jinwei Liu và cs (2013) nghiên cứu bổ sung artemisinic acid vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào cây dừa cạn và

đã nhận thấy, sự tăng cường khả năng sản sinh terpenoid indole alkaloids ở tế bào nuôi cấy Hàm lượng của vindoline và vinblastine thu được từ môi trường nuôi cấy có xử lý với artemisinic acid tăng sáu lần và gấp đôi tương ứng so với hàm lượng của 2 alkaloids này trong nhóm đối chứng Nhóm tác giả đã nghiên cứu sự biểu hiện gen của 4 enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

Trang 28

vinblastine trong môi trường nuôi cấy huyền phù cây dừa cạn Bằng phương pháp RT-PCR cho thấy, artemisinic acid có thể điều chỉnh lên phiên mã của các gen tổng hợp decarboxylase tryptophan, geraniol 10-hydroxylase, tabersonine 16-hydroxylase và deacetoxyvindoline 4-hydroxylase [14]

Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây dừa cạn bắt đầu được công bố vào năm

2006 với công trình của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng Nghiên cứu của các

tác giả cho thấy, mô sẹo xanh được cảm ứng từ lá dừa cạn nuôi cấy in vitro

trong môi trường MS lỏng, bổ sung NAA1mg/l + kinetin 0,5mg/l cho sinh khối

và hàm lượng alkaloid cao nhất Hàm lượng đường sucrose 60g/l cho kết quả nuôi cấy tốt nhất Kết hợp giữa NAA 1mg/l + kinetin 0,5mg/l + sucrose 60g/l

đã thu nhận được hàm lượng vincristine từ mô nuôi cấy cao hơn lá cây dừa cạn ngoài tự nhiên [3] Bằng phương pháp sắc khí lỏng cao áp – khối nhỏ liên hợp (LC-MS), Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011) đã xác định được 2 alkaloid quan trọng là vinblastine và vincristine từ rễ cây dừa cạn hoa hồng đạt 65,84%

so với hàm lượng alkaloid tổng số [1]

1.3.2 Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen

Nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình thành do sự xâm nhiễm của vi

khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật tổn thương từ lâu đã được

ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật Nguyên nhân của sự phát triển rễ tơ

đã được xác định liên quan đến vùng TL-DNA nằm trên plasmid Ri của các

chủng Agrobacterium rhizogenes, trong đó giữ vai trò quan trọng là 4 locus gen

rolA, rolB, rolC và rolD Các nghiên cứu về hàm lượng alkaloid, vincristine và vinblastine ở cây dừa cạn cho thấy, các chất này có hàm lượng cao ở rễ Vì vậy, nghiên cứu sự phát triển rễ tơ ở cây dừa cạn đã được một số nghiên cứu đề cập

Trang 29

Javier và cs (1998) thu được các dòng rễ cây dừa cạn chuyển gen phát

triển rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes chủng A4 trên môi trường muối B5

1/2, không bổ sung chất kích thích sinh trưởng Hàm lượng indole alkaloid trong rễ nuôi cấy đã được xác định Kết quả cho thấy, tất cả các dòng rễ dừa cạn chuyển gen được phân tích đều có mặt của vindoline và catharanthine, hai tiền chất tổng hợp vinblastine và vincristine Trong điều kiện nuôi cấy của thí nghiệm, rễ với hình thái mỏng cho lượng sản phẩm gen rolC cao nhất Như vậy, các rễ nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng thấp thì có khả năng sản xuất alkaloid cao Ngược lại, những rễ mập là những rễ có khả năng tăng trưởng nhanh hơn thì lại cho hàm lượng alkaloid thấp hơn [13]

Wang và cs (2012) đã phát triển phương pháp chuyển gen ở cây dừa cạn

bằng cách sử dụng Agrobacterium tumefaciens chủng EHA được biến nạp

vector nhị thể pCAMBIA2301 chứa gen β-glucuronidase (GUS) và gen

neomycin phosphotransferase II (NTPII) Lây nhiễm A.tumefaciens chủng EHA

tái tổ hợp nói trên vào mô sẹo, chồi và rễ, sau đó chuyển các mẫu lên môi trường nuôi cấy bổ sung kanamycin, các tác giả đã thu được các dòng cây tái sinh Biểu hiện của gen GUS được xác định thông qua biểu hiện kiểu hình của

mô nuôi cấy trên môi trường bổ sung X-gal Sự có mặt của gen GUS được xác

định bằng phản ứng dây chuyền polymerase và phân tích southern blot Để

chứng minh hiệu quả của kĩ thuật chuyển gen thông qua gen chỉ thị GUS vào cây dừa cạn, gen DAT mã hóa deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase đã được

chuyển vào cây dừa cạn và thu được 16 cây To chuyển gen thành công, hiệu suất chuyển gen là 11% Kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy, có sự tăng hàm lượng của vindoline trong cây chuyển gen Đây là báo cáo đầu tiên tính

đến thời điểm công bố chuyển gen qua A tumefaciens ở cây dừa cạn Quan trọng hơn, việc chuyển thành công gen DAT vào cây dừa cạn sử đã khẳng định

kĩ thuật chuyển gen cây dừa cạn được phát triển hoàn thiện, nâng cao tích lũy vindoline trong cây chuyển gen [35]

Trang 30

Các nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn hiện nay trên thế giới mới chỉ công bố thành công ở mức độ mô nuôi cấy và cây trong phòng thí nghiệm Song các kết quả nghiên cứu này đã khẳng định tính khả thi của hướng nghiên cứu tạo cây dừa cạn chuyển gen nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine phục vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư hiệu quả

Trang 31

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

Bộ Kit dùng cho phản ứng PCR, bộ Kit tinh sạch sản phẩm PCR Accuprep PCR Purification (Bioneer - Hàn Quốc), bộ Kit tách dòng “TA cloning Kit” (hãng Invitrogen), bộ Kit tách plasmid tái tổ hợp “AccuprepTM

Plasmid Mini Extraction Kit”, Kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng Bioneer cung cấp

2.1.2.3 Chủng vi khuẩn và nguyên liệu DNA

Vector pTRA7/3, vector pBI121, vector tách dòng pBT, các chủng

khuẩn E coliDH5α và A tumefaciens EHA105 mang gen GUS do Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học - cung cấp

Trang 32

Trang 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu

A

Trang 34

Trang 35

Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrPrx

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	1,5 MB