Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)Nghiên cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN (LV thạc sĩ)

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

ĐẶNG THỊ THU GIANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN TỪ DẤU VẾT MÁU TRÊN CÁC VẬT MANG LÀ VẢI SAU KHI BỊ GIẶT BẰNG XÀ PHÒNG TRONG CÁC VỤ ÁN HÌNH SỰ PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH ADN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2015

Trang 2

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

ĐẶNG THỊ THU GIANG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ADN TỪ DẤU VẾT MÁU TRÊN CÁC VẬT MANG LÀ VẢI SAU KHI BỊ GIẶT BẰNG XÀ PHÒNG TRONG CÁC VỤ ÁN HÌNH SỰ PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH ADN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Trang 3

Luận văn cao học Đặng Thị Thu Giang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luâ ̣n văn này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới Đại tá, PGS.TS Nguyễn Văn Hà - Phó giám đốc T rung tâm giám đi ̣nh Sinh học Pháp lý - Viê ̣n Khoa ho ̣c hình sự - Bô ̣ Công an đã rất tâ ̣n tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luâ ̣n văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đa ̣o Viện Khoa học hình sự , Lãnh đạo Trung tâm và các đồng nghiệp trong Trung tâm giám đi ̣nh Sinh ho ̣c Pháp lý - Viê ̣n Khoa ho ̣c hình sự - Bô ̣ Công an đã đô ̣ng viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo th uô ̣c Viê ̣n Sinh thái

và Tài nguyên sinh vật , Viện Công nghệ Sinh học đã tâ ̣n tình truyền đa ̣t kiến thức và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình và ba ̣n bè , đã đô ̣ng viên, góp ý và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Đặng Thị Thu Giang

Trang 4

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4

4 Nội dung nghiên cứu 4

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Lịch sử giám định gen trong khoa học hình sự 6

1.2 Nhận thức chung về dấu vết máu trong khoa học hình sự 7

1.2.1 Khái niệm về máu 7

1.2.2 Cơ sở khoa học của giám định dấu vết máu 8

1.3 Ảnh hưởng của xà phòng lên dấu vết máu 9

1.4 Phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng 11 1.4.1 Mục đích 11

1.4.2 Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải 12

1.4.3 Giám định định hướng dấu vết máu và xác định tính đặc hiệu loài 12 1.5 Tách chiết ADN từ dấu vết máu 15

1.6 Định lượng ADN 16

1.7 Khuếch đại ADN (PCR) 17

1.8 Những khó khăn trong nâng cao hiệu quả PCR và chất lượng ADN 21

1.9 Kỹ thuật điện di 22

1.9.1 Nguyên lý của kỹ thuật điện di 22

1.9.2 Nguyên lý điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 Genetic Analyzer 23

1.10 Phân tích dấu vết ADN khi bị lẫn 23

1.11 Vấn đề nhiễm ADN 24

Trang 5

1.12 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước đối với lĩnh vực

nghiên cứu của đề tài 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liê ̣u 28

2.1.1 Thiết bị máy móc 28

2.1.2 Dụng cụ 28

2.2 Hóa chất 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải 29

2.3.2 Phương pháp giám định định hướng dấu vết máu 29

2.3.3 Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép – Ouchterlony 30

2.3.4 Phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu 31

2.3.5 Định lượng ADN 34

2.3.6 Phương pháp PCR 36

2.3.7 Kỹ thuật điện di trên máy điện di mao dẫn(Capillary Electrophoresis - CE) 36 2.4 Thiết kế bố trí thí nghiệm 37

2.4.1 Các mẫu khảo nghiệm được tạo ra 37

2.4.2 Các mẫu tạo ra được ký hiệu 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B, 5A, 5B, 5C, 6A, 6B, 7A, 7B, được tiến hành các bước thí nghiệm như sau: 43

2.4.3 Tách chiết ADN bằng dung dịch Chelex 5% và bộ kít PrepFiler 44

2.4.4 Thử nghiệm kết quả tách chiết bằng bộ kít PrepFiler trên các mẫu từ các vụ án cụ thể 44

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Kết quả nghiên cứu 47

3.1.1 Kết quả xác định định hướng dấu vết máu thu từ các vụ án với dung dịch phenolphthalein 47

Trang 6

3.1.2 Kết quả xác định protein loài sử dụng kỹ thuật khuếch tán miễn

dịch kép theo Ouchterlony 47

3.1.3 Kết quả thực nghiệm tách chiết bằng phương pháp sử dụng chelex 5% và tách chiết bằng bộ kít PrepFiler 47

3.1.4 Kết quả tách chiết bằng phương pháp PrepFiler ứng dụng vào mẫu vụ án thực tế 56

3.1.5 Hình ảnh điện di một số mẫu thực nghiệm, mẫu án thực tế 58

3.2 Thảo luận kết quả nghiên cứu 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

Trang 7

DANH MỤC CÁC TƢ̀ VIẾT TẮT

ADN (DNA) : Axit deoxyribonucleic

ARN : Axit ribonucleic

LR : Likelihood Ratio (tỉ lệ khả dĩ)

RFU : Relative Flourescence Units (đơn vị huỳnh quang tương đối)

RFLP : Restriction fragment Length Polymorphism (đa hình chiều

dài đoạn cắt giới hạn) PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân bội gen)

ProK : Proteinaza K

STR : Short Tandem Repeat (đoạn lặp lại ngắn)

VNTR : Variable Number Tandem Repeats (đoạn lặp có độ dài

trung bình) KHHS : Khoa học hình sự

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH MINH HỌA

Bảng 1.1: Thành phần và thể tích phản ứng PCR 36

Bảng 1.2: Các thành phần hóa chất sử dụng để điện di mao quản 37

Bảng 2.1: Kết quả định lượng ADN tách chiết bằng chelex 5% 48

Bảng 2.2: Chất lượng ADN tách chiết bằng chelex 5% 50

Bảng 2.3: Kết quả định lượng ADN tách chiết bằng bộ kít PrepFiler 52

Bảng 2.4: Chất lượng ADN tách chiết bằng bộ kít PrepFiler 54

Bảng 3.1: Kết quả định lượng ADN với mẫu máu trên vải đã bị giặt trong vụ án cụ thể 56

Bảng 3.2: Chất lượng ADN thu được từ dấu vết máu đã bị giặt trong các vụ án cụ thể 57

Hình 4.1: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 1A, lần thực nghiệm 1.1 58

Hình 4.2: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 1B, lần thực nghiệm 1.2 59

Hình 4.3: Biểu đồ kết quả điện di mẫu 6B, lần thực nghiệm 1.2 60

Hình 4.4: Biểu đồ kết quả điện di mẫu MA1.1 61

Trang 9

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của việc nghiên cứu đề tài

Phân tích dấu vết ADN đã trở thành một phần không thể thiếu trong công tác giám định hình sự nói chung và giám định dấu vết sinh học nói riêng

và là một công cụ quan trọng cho các nhà điều tra phá án Thông qua phân tích ADN có thể truy nguyên, nhận dạng cá thể trong các vụ án hình sự, tìm tung tích nạn nhân, người mất tích trong các vụ cháy, vụ tai nạn, thảm họa… hoặc xác định quan hệ huyết thống

Mỗi năm Viện Khoa học hình sự nhận được hàng trăm trưng cầu giám định ADN từ các vụ án, chủ yếu là từ dấu vết máu, tinh trùng, tóc, tế bào, răng xương, mô và tổ chức cơ thể, móng tay móng chân… Thống kê năm

2014 tại Viện Khoa học hình sự có 421 vụ án yêu cầu giám định ADN, trong đó số lượng trưng cầu giám định ADN từ dấu vết máu là 146 vụ và số vụ án có dấu vết máu trên vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối đệm… là 54 vụ với 144 mẫu cần giám định, trong số đó có nhiều vụ án vật mang dấu vết máu

là vải được đưa đến giám định trong tình trạng đã qua ngâm giặt bằng xà phòng, dấu vết trên vật mang không còn nguyên vẹn, giảm đáng kể về số lượng và chất lượng ADN Gây khó khăn rất lớn trong công tác giám định

Trong các vụ án hình sự việc khẳng định dấu vết máu của nạn nhân để lại trên quần áo của đối tượng gây án hay máu của đối tượng bám dính trên các vật mang là vải để lại hiện trường là một nguồn chứng cứ rất quan trọng, thủ phạm có thể do vô tình hay cố ý đã dùng hóa chất như xà phòng, chất tẩy rửa để giặt quần áo, hay các vật mang là vải có bám dính dấu vết máu trên đó

Vì vậy việc tách chiết ADN từ các dấu vết máu này gặp rất nhiều khó khăn

Do chất tẩy rửa tác động lên dấu vết phá hủy và rửa trôi dấu vết Trong thực

tế khi gặp những trường hợp như vậy mà áp dụng phương pháp tách chiết thông thường như đối với các dấu vết máu có chất lượng tốt thì tỉ lệ thành

Trang 10

công là rất thấp Hơn nữa do phải tách chiết, PCR, chạy điện di nhiều lần gây tốn kém hóa chất và mất rất nhiều thời gian, mặt khác do lượng dấu vết thường không nhiều nên đòi hỏi phải có phương pháp tách chiết hiệu quả để tránh sử dụng hết dấu vết mà không cho kết quả phân tích ADN dẫn đến không góp phần giải quyết được vụ án

Trong thực tế các vụ án có dấu vết máu trên các vật mang là vải theo như lời khai của đối tượng là đã qua ngâm giặt bằng xà phòng và thực tế trong giám định quan sát bằng mắt cũng thấy vật mang dấu vết tương đối sạch, lượng dấu vết bám dính trên vật mang là khá mờ nhạt thì với phương pháp tách chiết thông thường hiện nay là dùng chelex 5% không cho hiệu quả cao với lý do:

- Lượng ADN tách chiết được không đủ để thực hiện phản ứng PCR

- Không loại bỏ được hết các chất ức chế ảnh hưởng đến chất lượng ADN

- Hình ảnh điện di kém: Mất alen, nhiều alen lặp ảnh hưởng đến việc phân tích kiểu gen

Trong quá trình giải quyết các vụ án thực tế thấy rằng nhiều khi dấu vết máu để lại trên vật mang là nguồn chứng cứ duy nhất nếu không tách chiết được ADN có chứa trên đó để phân tích giám định thì vụ án sẽ đi vào bế tắc Trước tình hình đó, chúng tôi thấy rằng việc nghiên cứu thử nghiệm các phương pháp tách chiết khác nhau đối với dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng là rất cần thiết, nhằm tạo ra quy trình ổn định trong tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải đã bị giặt bằng

xà phòng trong các vụ án, góp phần giải quyết yêu cầu thực tế đặt ra, cũng như góp phần hoàn thiện quy trình giám định ADN đối với loại dấu vết khó

thường gặp và có giá trị này Vì vậy việc tiến hành triển khai đề tài: “Nghiên

cứu một số phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang

là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự phục vụ công tác giám định ADN” là một yêu cầu cấp thiết

Trang 11

2 Mục tiêu nghiên cứu

Sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex 5% và bộ kít tách chiết PrepFiler để tách chiết ADN từ dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi

bị giặt bằng xà phòng với trang thiết bị, phương tiện, hóa chất của phòng thí nghiệm Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích phân tích, đánh giá sự tác động qua lại của một số yếu tố lý, hóa như: xà phòng, chất liệu vải, thời gian tồn tại của dấu vết máu trên vải trước khi bị giặt, cách thức giặt … lên dấu vết máu bám dính trên các vật mang là vải như quần áo, chăn ga, gối đệm… Chất lượng và số lượng của ADN tách chiết được từ các dấu vết máu trên các vật mang là vải như quần áo chăn ga gối đệm… sau khi đã bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án cụ thể và trên các mẫu khảo nghiệm

Kết quả nghiên cứu giúp đưa ra nhận định với phương pháp tách chiết nào thì tối ưu nhất đối với dấu vết máu trên vải đã bị giặt bằng xà phòng, phục

vụ tốt nhất công tác giám định gen hình sự, góp phần hoàn thiện cơ sở lý luận hiện có về quy trình tách chiết ADN nói chung cũng như tách chiết ADN từ những dấu vết có chất lượng kém nói riêng phục vụ cho công tác giám định ADN tại Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an

Kết quả đánh giá ADN tách chiết từ dấu vết máu thể hiện qua các bảng kết quả nồng độ ADN tổng số được tách chiết trực tiếp từ dấu vết máu; biểu

đồ về hình thái các peak biểu thị cho các alen thu được ở 16 locus gen theo hệ STR (IdentifilerTM), qua đó giúp giám định viên gián tiếp đánh giá số lượng

và chất lượng đối với từng alen của ADN tách chiết được từ mẫu máu cần khảo sát

Việc sử dụng kỹ thuật định lượng bằng realtime PCR chỉ là một khâu trong quy trình giám định giúp đánh giá được về hàm lượng ADN tách chiết được từ các dấu vết máu, từ đó định hướng điều chỉnh hàm lượng ADN

Trang 12

khuôn đưa vào mỗi phản ứng PCR Kết quả định lượng bằng Real time PCR không hoàn toàn phản ánh chất lượng ADN phục vụ cho phản ứng PCR các locus hệ Identifiler

3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu thực nghiệm các phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi đã giặt bằng xà phòng

- Mẫu thực nghiệm được tạo ra và thu từ các vụ án mà cơ quan điều tra công an các tỉnh thành trong cả nước gửi giám định ADN tại phòng thí nghiệm của Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an

4 Nội dung nghiên cứu

4.1 Sử dụng các phương pháp để tách chiết ADN

Qua tham khảo tài liệu và thực tế giám định tại Viện Khoa học hình sự hiện nay cho thấy có 2 phương pháp tách chiết thông dụng và đạt hiệu quả đảm bảo cho quá trình giám định ADN từ dấu vết máu đó là:

- Phương pháp tách chiết bằng chelex 5%

Phương pháp tách chiết bằng chelex 5% là phương pháp thông dụng nhất, giá thành rẻ, dễ thao tác, nhanh Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi chất lượng của ADN phải tốt, số lượng của ADN phải tương đối nhiều có độ tinh khiết cao Như vậy dấu vết gửi giám định phải tương đối tốt ít bị biến tính

- Phương pháp tách chiết bằng bộ kít PrepFiler

Phương pháp tách chiết bằng bộ kit tách chiết PrepFiler cho hiệu quả cao và tối ưu nhất hiện nay áp dụng đối với các mẫu có hàm lượng ADN thấp, bị biến tính và lẫn nhiều tạp chất, chất ức chế Tuy nhiên giá thành cao,

dễ bị nhiễm trong quá trình thao tác

Bởi vậy chúng ta phải có những khảo sát để có được sự lựa chọn phù hợp Xác định phương pháp tách chiết tối ưu với từng loại mẫu vật cụ thể,

vì lượng dấu vết trong các vụ án thường không nhiều nếu chúng ta lựa chọn

Trang 13

không đúng phương pháp tách chiết thì có thể sẽ sử dụng hết mẫu vật mà vẫn không cho kết quả Ngoài ra việc lựa chọn đúng phương pháp tách chiết còn vừa tiết kiệm chi phí vừa tiết kiệm thời gian

4.2 Quy trình đánh giá và kết quả dự kiến

- Sản phẩm tách chiết được định lượng bằng phương pháp Real-time Mỗi mẻ thí nghiệm sau khi tách chiết ADN bằng phương pháp chelex 5% và

bộ kít PrepFiler sẽ được chạy phản ứng PCR , sau đó điện di phân tích kết quả

- Toàn bộ sản phẩm tách chiết bởi phương pháp chelex 5% và bộ kít PrepFiler sẽ được so sánh, đánh giá lượng ADN thu được bằng phương pháp định lượng, chạy PCR và phân tích kết quả hình ảnh điện di từ đó rút ra phương pháp tách chiết cho kết quả tốt nhất

- Trên cơ sở kết quả của các phương pháp tách chiết, luận văn dự kiến

sẽ áp dụng phương pháp tách chiết phù hợp cho dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Từ kết quả nghiên cứu của đề tài, đã tách chiết được lượng ADN hiệu quả nhất nhờ lựa chọn đúng phương pháp phù hợp đối với dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự, góp

phần rút ngắn thời gian, tiết kiệm chi phí

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Ứng dụng để tách chiết thành công ADN đối với các dấu vết máu trên các vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng trong các vụ án hình sự Giúp truy nguyên được cá thể, có căn cứ để xác định tội phạm, là nguồn

chứng cứ để giải quyết các vụ án hình sự

Trang 14

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Lịch sử giám định gen trong khoa học hình sự [3]

Trong giám định kỹ thuật hình sự có nhiều phương pháp để truy nguyên cá thể người, giám định ADN hiện nay là một trong những phương pháp đắc lực nhất để giúp các nhà điều tra hình sự xác định chính xác tội phạm, truy tìm tung tích nạn nhân cũng như xác định quan hệ huyết thống Giám định ADN ra đời dựa trên nền tảng của sinh học phân tử và gắn liền với

sự phát triển của nó Theo thời gian, cùng với sự phát triển của sinh học phân

tử, công nghệ thông tin và các ngành khoa học khác có liên quan… giám định ADN ngày càng được hoàn thiện và phát triển không ngừng, trở thành một phương pháp giám định mang tính toàn cầu

Năm 1985, Alec Jeffreys và các cộng sự ở trường đại học Leicester nước Anh khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hóa cho myoglobin trong máu người đã phát hiện ra trình tự của các base nitơ được lặp lại một số lần với chiều dài đoạn lặp từ 10 - 15 base pair hoặc vài chục base pair, các đoạn lặp này được gọi là tiểu vệ tinh (Minisatellite) hay VNTR (Variable Number Tandem Repeats) Ông cũng phân lập được hai đoạn và nhân bội chúng, sử dụng làm đầu dò (probe) để phát hiện những vùng mà Jeffreys gọi là vùng siêu biến (hypervariable regions) ở các vật liệu di truyền khác nhau Kỹ thuật

để Jeffreys phân tích các đoạn lặp VNTR là kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Đây được coi là bước ngoặt lớn trong lịch

sử phát triển của Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng Các tiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào và ở những vị trí khác nhau trong genome của người Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau Alec Jeffreys coi đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể Giám định ADN cho mục đích tư pháp ra đời từ đây Phương pháp RFLP lần đầu tiên được sử

Trang 15

dụng để xác định đối tượng trong một vụ hiếp dâm xảy ra tại Anh vào năm

1986 Kể từ đó, việc kiểm tra truy nguyên cá thể bằng giám định ADN được phổ biến rộng rãi

Cũng vào thời điểm năm 1985, tác giả Kary Mullis đã công bố kết quả thử nghiệm thành công phản ứng chuỗi nhân gen PCR Phản ứng PCR có ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sử dụng kỹ thuật RFLP là chỉ cần một lượng rất ít ADN khuôn ban đầu sau hơn 20 - 30 chu kỳ phản ứng đã tạo ra được hàng triệu bản sao tạo điều kiện dễ dàng trong việc phát hiện và nghiên cứu phân tích

Năm 1991, một phương pháp mới trong giám định ADN được giới thiệu, đó là phương pháp phân tích sử dụng các đoạn lặp ngắn (STR - Short Tandem Repeats) có gắn chất huỳnh quang hay còn gọi là Microsatellite Các STR thường có đoạn lặp từ 2 - 6 base pair Hiện nay các hãng sản xuất đã đưa

ra các bộ kít PCR cho các locus STR rất thuận lợi cho việc thiết lập phản ứng PCR và Identifiler là một trong những bộ kít như vậy

1.2 Nhận thức chung về dấu vết máu trong khoa học hình sự

1.2.1 Khái niệm về máu [8]

Máu là chất lỏng có màu đỏ chảy trong hệ thống mạch của người và động vật, có vai trò quan trọng nhiều mặt đối với sự sống của cơ thể

Theo các nhà tổ chức học thì máu là mô liên kết đặc biệt mà chất căn bản

ở thể lỏng Trong cơ thể do sức đẩy của tim, máu được lưu thông trong hệ tuần hoàn máu theo một chiều xác định Thành phần lỏng của máu là huyết tương và thành phần hữu hình là các tế bào máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu)

Khi ra khỏi hệ tuần hoàn, máu bị đông lại, chất fibrinogen, một protein

ở dạng hòa tan trong huyết tương, biến thành lưới sợi fibrin không hòa tan bao lấy tế bào máu, tạo thành cục máu đông Khối này dần dần co lại tiết ra chất lỏng màu vàng nhạt, đó là huyết thanh

Trang 16

Máu chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng trong cơ thể người và động vật bởi nhiều chức năng khác nhau: Điều hòa hoạt động tuần hoàn, duy trì huyết áp, cung cấp oxy, đào thải CO2, bảo vệ cơ thể và là một loại dấu vết hình sự quan trọng trong giám định sinh học pháp lý

1.2.2 Cơ sở khoa học của giám định dấu vết máu [8]

Giám định dấu vết máu trong điều tra hình sự để truy tìm thủ phạm đã được ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX (Uhlenhuth 1900 – 1901) bằng việc phân biệt giữa máu người và máu động vật trong các vụ án giết người Về sau với việc phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO (Landsteiner và cộng sự 1901) và các hệ thống nhóm máu khác thì việc sử dụng dấu vết máu

để phục vụ cho công tác điều tra ngày càng được mở rộng

Mỗi thành phần có trong huyết thanh và tế bào máu đều có vị trí quan trọng, chứa đựng các thông tin cần thiết về một cá thể mà không ai giống ai (tính cá biệt) Đây là vấn đề mấu chốt để truy nguyên cá thể thông qua dấu vết máu Tuy nhiên để đáp ứng yêu cầu này đòi hỏi một quá trình lâu dài của phát triển khoa học và công nghệ Mỗi giai đoạn phát triển của ngành huyết học và giám định sinh học pháp lý thì các chỉ số khai thác được từ dấu vết máu đều có những giá trị nhất định

Mọi sự tương tác đều để lại dấu vết – Đây là nguyên lý nổi tiếng trong Khoa học hình sự do Giáo sư Edmund Lo- Card trường đại học Y khoa Jurisprudence ở Lyon đề ra và được gọi là Nguyên lý Locar Có rất nhiều ví

dụ chứng minh cho nguyên lý này Chẳng hạn, trong những hoạt động hàng ngày, con người luôn để lại những dấu vết của mình như: Lông tóc rụng khi chải đầu, tế bào da tay khi cầm điện thoại, tế bào niêm mạc khi hút thuốc lá…Trong một vụ án hiếp, giết người ta có thể phát hiện được dấu vết tinh dịch, tế bào biểu bì của đối tượng trong âm đạo, trong móng tay của nạn nhân

và dấu vết máu của nạn nhân trên quần áo đối tượng và từ đó có thể phân tích

Trang 17

ADN để truy nguyên đối tượng hoặc tìm tung tích nạn nhân ADN có trong tất

cả các tế bào có nhân vì vậy sẽ có trong các chất sinh học có nguồn gốc từ cơ thể người như máu, lông tóc, nước bọt, tinh dịch…để lại hiện trường vụ án

Giám định gen từ máu chủ yếu là phân tích ADN trong bạch cầu vì bạch cầu chiếm số lượng lớn trong máu là những tế bào có nhân Bạch cầu được chia làm 2 loại:

1.3 Ảnh hưởng của xà phòng lên dấu vết máu

Khái niệm về xà phòng:

Xà phòng là những muối natri (hoặc muối kali) của axit béo cao Những muối natri của axit béo cao RCOONa là xà phòng rắn, còn muối kali của chúng, RCOOK là xà phòng mềm Các dầu mỡ giàu axit béo no cũng cho

xà phòng rắn và các dầu chứa nhiều axit chưa no cho xà phòng mềm hơn

Xà phòng là những chất hoạt động bề mặt Nó có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt giữa các chất bẩn và quần áo, đồng thời xà phòng làm cho

khả năng thấm ướt của quần áo nhanh hơn

Xà phòng có cấu tạo như sau:

R _COO Na

Trang 18

Phần gốc hidrocacbon –R là phần kỵ nước, tan tốt trong các dung môi hữu cơ, dầu mỡ nhưng không tan trong nước Nhóm – COONa là phần ưa nước bị tan trong nước, ít tan trong các dung môi hữu cơ Khi giặt giũ quần áo bằng nước xà phòng thì phần kỵ nước (các gốc R khá dài) hòa nhập vào các hạt dầu mỡ (vì chúng dễ dàng tan vào nhau) Trong khi đó, phần ưa nước (các gốc _COONa) lại ở trên bề mặt các hạt bẩn đó và làm cho sức căng bề mặt của hạt bẩn giảm đi vì chúng có điện tích cùng dấu Khi sức căng bề mặt giảm

đi thì các hạt bẩn sẽ bị chia nhỏ ra, lực liên kết giữa hạt bẩn và quần áo yếu đi làm tăng khả năng thấm ướt và hạt bẩn tan dần vào trong nước Ngày nay khi sản xuất xà phòng người ta còn cho thêm các enzym và cơ chế tác dụng làm sạch vết bẩn của enzym là phân giải chất bẩn thành các đoạn, các phần có khối lượng phân tử thấp hơn, dễ hòa tan hơn Ví dụ: protease, amylase, lipase có thể thủy phân các vết bẩn protein, tinh bột, dầu/mỡ ngay cả khi nó ở dạng rắn, nhiệt độ thấp hơn 400

C[ 2 ]

Chính vì những cơ chế nêu trên nên dấu vết máu tồn tại trên vật mang

là vải sau khi đã bị giặt bằng xà phòng thường có số lượng rất ít và chất lượng rất kém, dẫn đến lượng và chất của ADN thu được cũng giảm đáng kể Chất lượng ADN giảm là do chúng bị rửa trôi, biến tính, bị phân hủy Mặt khác các hóa chất trong xà phòng cũng gây ức chế phản ứng PCR nên hiệu quả PCR thường không cao

Các phương pháp phân tích dựa vào PCR ngày nay như phân tích phức

hợp các locus STR (multiplex Short Tandem Repeat typing) trở nên rất ưu việt

bởi lẽ chỉ cần những lượng cực nhỏ ADN cũng có thể khuếch đại chúng đến một mức nào đó mà chúng ta có thể được phát hiện ra Với lượng chỉ nhỏ hơn 1

ng ADN cũng có thể được phân tích nhờ sự khếch đại PCR với một phức hợp các locus STR so với việc yêu cầu lượng 100 ng hay nhiều hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP trong những năm trước đây Tuy nhiên, khi sử dụng kỹ thuật với độ

Trang 19

nhạy cao đòi hỏi lượng ADN nguồn vào thấp cũng đem lại nhiều rủi ro, rất khó trong việc tránh sự tạp nhiễm gây ra bởi các cán bộ điều tra vụ án, hay các cán

bộ khám nghiệm hiện trường, những người có nhiệm vụ thu thập, bảo quản các mẫu chứng cứ sinh học mà cụ thể là các dấu vết máu ở hiện trường Để việc khuyếch đại PCR được diễn ra thành công, ADN khuôn cũng cần phải được nguyên vẹn ở một mức độ nhất định, đặc biệt ở vị trí gắn cặp mồi cũng như vị trí giữa các mồi sao cho việc tổng hợp kéo dài có thể được diễn ra Trong trường hợp không có được một mạch ADN nguyên vẹn xung quanh vùng lặp STR đóng vai trò như một mạch khuôn, thì phản ứng PCR sẽ không thành công bởi vì việc kéo dài đoạn mồi sẽ bị tạm dừng ở vị trí đứt gãy trên mạch khuôn Với một mẫu ADN bị phân hủy càng nhiều thì sẽ có càng nhiều sự đứt gãy xảy

ra trong ADN khuôn và càng ít phân tử ADN có được chiều dài đầy đủ, cần thiết cho sự nhân bội được chính xác trong mỗi phản ứng PCR

Vấn đề quan trọng đặt ra là làm cách nào có thể tách chiết được một lượng ADN đủ về số lượng và đảm bảo chất lượng để có thể thực hiện được phản ứng PCR như đã nói ở trên

1.4 Phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi bị giặt bằng xà phòng

1.4.1 Mục đích

Trong số các loại dấu vết ADN hình sự thì dấu vết máu là loại dấu vết

dễ bị phân hủy và biến tính nhất vì bản thân máu là chất lỏng, đó là môi trường thuận lợi để các vi sinh vật, các enzym dễ dàng xâm nhập và phân hủy dấu vết máu

Việc phát hiện, thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải là một công việc rất khó khăn vì không phải loại vải nào cũng là vải sáng màu và dễ phát hiện dấu vết máu và việc phát hiện dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt

là một công việc còn khó khăn hơn rất nhiều Do đó việc tìm kiếm phát hiện phải tỉ mỉ và không được bỏ sót bất kỳ một dấu vết nghi ngờ nào Nếu thu được

Trang 20

tối đa dấu vết máu có trên vật mang thì giúp ích rất nhiều cho việc tách chiết ADN, có thể phân tích được đầy đủ kiểu gen của cá thể để lại dấu vết máu

1.4.2 Đánh giá, tìm dấu vết máu trên vật mang là vải

Dấu vết máu xuất hiện chủ yếu do tác động của ngoại lực làm rách phần mềm cơ thể Việc tìm kiếm dấu vết máu cần chú ý đến những điểm sau:

Nắm vững các thông tin có liên quan đến vụ việc để có định hướng xem loại dấu vết nào có thể xuất hiện, vị trí dấu vết xuất hiện Đồng thời xác định phương pháp, tìm kiếm và thu dấu vết [7]

Đánh giá mức độ thương tích trên cơ thể nạn nhân để phán đoán lượng máu có thể để lại trên vật mang nhiều hay ít

Máu khi ra khỏi cơ thể có màu đỏ, quá trình khô làm cho máu chuyển thành màu nâu, nâu sẫm, thậm chí màu đen, nên khó phát hiện hoặc dễ nhầm lẫn với các dấu vết khác [7]

Xem xét toàn diện tỉ mỉ tất cả các vị trí có khả năng có dấu vết để lại, trên vật mang, đặc biệt những vị trí khó quan sát

Đối với các vật mang là quần áo, mũ, tất… phải tìm dấu vết không chỉ

ở mặt ngoài mà phải xem xét ở cả mặt trong, vì khi quần áo bị giặt tuy mặt ngoài không nhìn thấy máu nhưng vẫn có thể nhìn thấy ở mặt trong, nhất là ở đường chỉ may, mặt trong túi áo…[7]

1.4.3 Giám định định hướng dấu vết máu và xác định tính đặc hiệu loài

+ Giám định định hướng dấu vết máu:

Sử dụng dung dịch phenolphthalein để xác định định hướng dấu vết máu Nguyên lý chung của các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu

Sơ đồ 1: Nguyên lý của các phương pháp định hướng dấu vết máu[9]

Trang 21

Thành phần phản ứng:

- Chất tạo màu (các hoá chất thay đổi màu như benzidine,

tetramethylbenzidine, luminol, )

- Hydrogen peroxide (H2O2) là chất oxi hoá

- Chất xúc tác (haemoglobin hoặc peroxidase)

H2O2 oxi hoá hoá chất không màu thành hoá chất có màu

Sơ đồ phản ứng chung:

Chất nhận + H2O2 <=> Chất nhận bị oxi hoá + H2O

Trong kít xác định dấu vết máu, TMB (hoặc các chất khác) là chất nhận: TMB không màu + H2O2 <=> TMB (màu xanh) + H2O

- Kết quả âm tính (không màu hoặc không thay đổi màu sắc) có nghĩa

là dấu vết cần giám định không phải là máu

- Kết quả dương tính (hiện màu hoặc thay đổi màu sắc) có nghĩa là dấu vết cần giám định có khả năng là máu

Các kít định hướng tạo phản ứng màu hoặc phát ra ánh sáng

Các kít dựa vào đặc tính catalase của máu (sự có mặt của haemoglobin Đặc điểm của các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu:

- Ứng dụng chất tạo màu (hoá chất thay đổi màu)

- Ứng dụng tác nhân oxi hoá (hydrogen peroxidase)

- Chất xúc tác của phản ứng là haemoglobin

Sự thay đổi màu nhanh là kết quả dương tính Điều này có nghĩa là dấu vết được thử là máu

Dương tính giả: Kết quả dương tính được xác định khi thử những chất không phải là máu, do những chất này cũng có thể xúc tác như: tác nhân oxi hoá hoá chất, nguyên liệu thực vật

Âm tính giả: Phản ứng cho kết quả âm tính mặc dù chất đó là máu hoặc có mặt thành phần máu là do:

Trang 22

- Dấu vết có thể quá lâu hoặc máu quá loãng nên không tạo phản ứng

- Những chất làm ảnh hưởng đến quá trình phản ứng vào phản ứng (hợp chất khử, axit).[10]

Trong kỹ thuật này, sự khuếch tán của kháng nguyên và kháng thể gặp nhau từ những giếng trên thạch Nhìn chung, giếng trung tâm chứa phần kháng nguyên, các huyết thanh thử nghiệm được đặt ở các giếng xung quanh Để một cặp kháng nguyên – kháng thể xuất hiện, vị trí của vạch kết tủa trên thạch phụ thuộc duy nhất các hệ số khuếch tán điện kháng và không phụ thuộc vào nồng độ Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự kết tủa:

- Chất lượng của thạch

- pH và nhiệt độ

- Bản chất kháng nguyên

- Sự xuất hiện kết tủa liên quan đến nồng độ kháng nguyên – kháng thể Phương pháp này được ứng dụng trong tự miễn để phân tích chất lượng của 1 hỗn hợp kháng thể đôi khi phức tạp Sự xuất hiện nhiều vạch kết tủa chỉ ra sự hiện diện một số cặp kháng nguyên – kháng thể giống nhau (1 vài cặp có thể xếp chồng lên nhau) Hơn nữa, nó cho phép nhận dạng các kháng thể bằng cách so sánh các phản ứng của chúng đối diện với các huyết thanh mẫu chứng đặc hiệu đơn nghĩa là “huyết thanh mẫu chuẩn” Như vậy, bằng sự so sánh các vạch tạo bởi 2 hệ thống kháng nguyên – kháng thể, có thể suy luận quan

hệ của chúng.[1]

Trang 23

1.5 Tách chiết ADN từ dấu vết máu

Tách chiết ADN là công đoạn đầu tiên rất cần thiết và không thể thiếu trong hoạt động của các nhà sinh học phân tử Do các tế bào ở các mô khác nhau có các đặc điểm cấu trúc khác nhau nên các nhà khoa học đã tìm ra rất nhiều phương pháp tách chiết khác nhau để tách chiết ADN nhằm đạt hiệu quả cao nhất [6]

Mỗi một loại dấu vết đòi hỏi có một quy trình tách chiết riêng biệt, phù hợp với dấu vết đó thì tách chiết ADN mới đạt được hiệu quả cao Tách chiết ADN kém hiệu quả, một phần là do chất lượng dấu vết, do ảnh hưởng của vật mang dấu vết và một phần cũng là do phương pháp tách chiết chưa phù hợp [9]

Hiện nay tại viện Khoa học hình sự, đối với dấu vết máu thì chủ yếu vẫn đang sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex 5% (Chelex® 100 Resin hãng Bio-rad-Mỹ)

Chelex là một loại nhựa tạo phức có ái lực cao đối với các ion kim loại

đa hóa trị Nó là chất cấu tạo bởi styren và divinnylbenzen có chứa cặp ion imiodiacetat hoạt động là nhóm tạo phức Sự có mặt của Chelex trong khi đun ở 100oC sẽ ngăn cản quá trình biến tính của ADN bởi các ion kim loại tạo phức có thể xúc tác quá trình làm gãy ADN ở nhiệt độ cao trong những dung dịch có cường độ ion thấp Chelex còn liên kết cả với những chất bẩn ngăn cản quá trình nhân bội ADN

Phương pháp tách chiết này đạt hiệu quả cao đối với các dấu vết máu có hàm lượng ADN cao và tinh khiết tuy nhiên với những dấu vết máu đã bị biến tính, số lượng ADN ít và lẫn nhiều tạp chất, chất ức chế thì phương pháp này chưa đạt hiệu quả cao

Đối với dấu vết máu có chất lượng kém, để thu được đầy đủ kiểu gen là rất khó khi sử dụng phương pháp tách chiết bằng chelex 5% do nồng độ ADN thu được từ phương pháp tách chiết này không đủ để thực hiện phản ứng PCR

Trang 24

thành công và dẫn tới điện di cho hình ảnh kém như mất alen, nhiều alen lặp Hiện nay, Viện khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit tinh sạch Zymo Research có tên DNA Clean & Concentrator TM-5

(hãng Epigenetics, Mỹ) Tuy nhiên phương pháp này vẫn có những hạn chế nhất định đó là ADN có thể bị mất do quá trình rửa và vẫn không loại bỏ hoàn toàn được một số chất ức chế phản ứng PCR Mong muốn chọn lựa phương pháp tách chiết phù hợp, hiệu quả đặc biệt là đối với dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi đã bị gặt bằng

xà phòng

Phương pháp tách chiết ADN bằng bộ kít PrepFiler là phương pháp tách chiết sử dụng hạt từ tính rezin để hấp phụ ADN Qua đó thu được tối đa lượng ADN nguyên vẹn, tinh khiết có trong mẫu và có những ưu điểm vượt trội sau và phù hợp với những mẫu đã bị biến tính, số lượng ADN ít và lẫn nhiều tạp chất, chất ức chế:

a) Tách chiết hầu hết hoặc tất cả ADN có trong dấu vết;

b) Loại bỏ thành phần ức chế PCR mà không làm mất ADN;

c) Sử dụng toàn bộ sản phẩm ADN tách chiết được để PCR;

d) Có thể bơm trực tiếp hóa chất PCR vào ống đựng ADN sau tách chiết nếu lượng ADN quá ít, hơn là phải chuyển ADN vào một ống riêng có hóa chất PCR (để loại bỏ sự mất mát xảy ra khi chuyển ADN, ví dụ: ADN dính trên thành ống, dính vào đầu côn)

1.6 Định lƣợng ADN

Định lượng ADN là một quy trình quan trọng trong giám định ADN hình

sự, bởi lượng ADN thu được từ các dấu vết là không giống nhau Do đó bước định lượng ADN giúp ta xác định chính xác hàm lượng ADN thu được từ dấu vết và từ đó tính toán lượng ADN cần thiết đưa vào thực hiện phản ứng PCR

Định lượng từng mẫu có thể đảm bảo hiệu quả tối đa phản ứng PCR và ngăn chặn việc phân tích lặp lại, thất thoát nguồn mẫu chứa ADN

Trang 25

Việc xác định hàm lượng ADN tách chiết được từ mẫu là rất cần thiết

vì khi biết được chính xác hàm lượng và độ tinh sạch của ADN trong mẫu thì

sẽ tính được nồng độ tối ưu của các thành phần trong phản ứng PCR và khi đó phản ứng PCR sẽ cho kết quả tốt nhất

Sản phẩm sau tách chiết được tiến hành định lượng ADN sử dụng kit Quantifiler® Human DNA Quantification dùng cho định lượng bằng phương pháp Real time PCR trên máy định lượng 7500 Real time PCR System của hãng ABI - Mỹ

Phương pháp thực hiện kỹ thuật PCR nhờ có thiết bị Real time PCR với hệ thống nhận biết sản phẩm sau mỗi chu kỳ PCR bằng cách kích hoạt chất phát quang trong sản phẩm PCR Độ phát quang đậm nhạt của sản phẩm PCR sau mỗi chu kỳ sẽ được máy ghi lại và dùng trong log tự động so sánh với thang ADN định lượng chuẩn đã được chạy và nhập sẵn vào máy trước đó ở dạng đồ thị

Như vậy, chỉ cần sau một số chu kỳ ban đầu khi đã có sản phẩm PCR, chúng ta có thể xác định được chính xác hàm lượng sản phẩm PCR thu được

từ mẫu vật chứ không nhất thiết phải đợi phản ứng PCR kết thúc, đó cũng là điểm ưu việt của thiết bị này Song để thiết bị có thể nhận biết được sản phẩm thu được trong quá trình PCR, đòi hỏi sản phẩm PCR thu được sau mỗi chu

kỳ phải được gắn chất nhận biết phát quang Thường chất nhận biết đó được gắn vào mồi (primer) đã được các hãng sản xuất kèm theo trong bộ kit Do đó, để định lượng chính xác hàm lượng ADN thu được sau khi tách chiết bằng thiết bị Realtime PCR, chúng ta phải mua bộ kit có sẵn của hãng Hiện nay, tại Viện Khoa học hình sự đang sử dụng bộ kit Quantifiler® Human DNA Quantification (hãng ABI, Mỹ)

1.7 Khuếch đại ADN (PCR)

Một đoạn ADN bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần

mà không cần đưa vào tế bào vi khuẩn Điều đó xảy ra trong phản ứng tổng

Trang 26

hợp in-vitro sử dụng ADN polymerase và các oligonucleotide (các mồi –primers) Đó chính là kết quả tuyệt vời của phản ứng PCR Nhờ phản ứng này, một đoạn ADN ở một vùng bất kỳ trong genome được khuếch đại lên rất nhiều lần khi trình tự nucleotide ở hai đầu đoạn ADN đó đã biết Dựa vào trình tự đó, các cặp oligonucleotide được tổng hợp nhân tạo, mỗi oligo tạo liên kết bổ sung với từng sợi đơn Chúng được dùng làm mồi để tổng hợp ADN invitro nhờ enzym ADN polymerase Đặc biệt phản ứng PCR chỉ đòi hỏi một lượng ADN khuôn ban đầu rất nhỏ (cỡ 10-3

µg) [11]

Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ Mỗi chu kỳ phản ứng đòi hỏi ba bước Đầu tiên ADN khuôn được xử lý nhiệt độ gây biến tính thành hai sợi đơn Bước tiếp theo, nhiệt độ giảm xuống cho phép các mồi (số lượng rất lớn) liên kết tạo cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khuôn (do số lượng mồi lớn nên liên kết giữa mồi và ADN khuôn xảy ra chiếm ưu thế so với liên kết phục hồi giữa hai sợi đơn) Trong bước thứ ba, hỗn hợp ADN và mồi được ủ với enzym Taq polymerase và bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate Đoạn ADN nằm giữa hai mồi được tổng hợp Khi các chu kỳ được lặp lại, các đoạn ADN vừa được tổng hợp ở các chu kỳ trước trở thành khuôn mẫu cho chu kỳ sau Số lượng phân tử ADN tạo ra tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ Chỉ sau vài chu kỳ đầu, sản phẩm tạo ra chủ yếu là các đoạn ADN có kích thước bằng đúng khoảng cách giữa hai mồi [11]

Cả hai sợi ADN đều đuợc dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi oligonucleotid được cung cấp cho cả hai sợi Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên, sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia Như vậy, sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi ADN mới được tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới

Trang 27

được tổng hợp, các sợi này sau đó lại được dùng tiếp cho chu trình tiếp theo, bao gồm các bước: gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản ứng, tính theo lý thuyết, ta sẽ có 2n

bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi Đó là đặc điểm quan trọng thứ hai của kỹ thuật PCR, nó dẫn tới kết quả

là một đoạn ADN định trước được “nhân lên”.[5]

Phản ứng nhân gen (PCR): Trong thực tế số lượng chu kỳ của một phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ, vì phản ứng PCR diễn ra 2 giai đoạn: Giai đoạn đầu: số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu bản đầu, giai đoạn sau hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do phân hủy, cạn kiệt các thành phần phản ứng, xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế, các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với các mồi mà lại bắt cặp với nhau

Số chu kỳ phụ thuộc vào lượng mẫu ban đầu: Lượng ADN khuôn là 105

thì cần đến 30 chu kỳ, lượng ADN khuôn là 102

- 103 thì số chu kỳ phải là 35 đến 40 chu kỳ Tiến hành trên máy nhân gen Sản phẩm PCR được bảo quản

ở -200

C.[4]

Trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tăng cường hiệu quả PCR đối với những mẫu chất lượng kém có chứa ADN Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để PCR thành công ADN thu được từ những mẫu có chất lượng kém là tăng số chu kỳ PCR Quy trình này

đã được phát triển tại Trung tâm khoa học hình sự ở Anh (và đã được thực nghiệm thành công bởi các phòng thí nghiệm khác), thường gọi là phân tích Low Copy Number (LCN) [12] Đối với kỹ thuật LCN này số chu kì sử dụng trong PCR các locus của STR là 34, có khả năng cho phép tăng sản phẩm lên hơn 3 tỉ bản copies, so với phản ứng chuẩn là 28 chu kỳ Tăng số chu kỳ cũng thường được sử dụng trong nghiên cứu và giám định ADN từ những mẫu vật có niên đại lớn như hài cốt người, có thể tăng lên tới 60 chu kỳ để đạt mức tối

đa sự thành công trong phản ứng PCR [13]

Trang 28

Trong mô tả ban đầu về LCN, để thu được một kiểu gen hoàn chỉnh chỉ cần từ 5 đến 10 tế bào (30 đến 60 pg) và tăng đáng kể chiều cao peak trong điện di [12] Kloosterman và Kersbergen sử dụng phương pháp khác, thêm Taq polymerase chạy 28 chu kỳ và chu trình nhiệt cũng được tăng thêm 6 chu

kỳ [14] Mặc dù hầu hết các bộ kit PCR cũ thường có 28 chu kỳ, do đó các bộ kit thương mại mới đang tận dụng sự thành công của việc tăng số chu kỳ PCR, như bộ kit Minifiler của hãng Applied Biosystem (Mỹ) với 29 chu kỳ, Yfiler (30 chu kỳ), NGM (29 chu kỳ), Promega’s ESX và ESI (30 chu kỳ) và mới nhất hiện nay là bộ kit Identifiler plus (29 chu kỳ) Tuy nhiên việc tăng chu kỳ phản ứng PCR cũng mang đến một số yêu cầu về phòng chống nhiễm

vì nó có khả năng gây nhiễm thường xuyên hơn, có thể các đoạn ADN ngắn cũng được nhân lên và làm ảnh hưởng đến kết quả điện di Phát triển mồi cho khuếch đại locus STR trong các thành phẩm thương mại đã được cải thiện Trong khi phần lớn các bộ kít vẫn sử dụng mồi ban đầu, Butler và các đồng nghiệp đã thiết kế lại khuôn ADN nhỏ hơn để sản xuất ra “mini-STRs”, sản xuất các mồi mà có tỷ lệ thành công cao đáng kể với ADN đã bị phân hủy Kết quả nghiên cứu này tạo ra khuôn ADN nhỏ hơn được sử dụng để tạo ra bộ kít MiniFiler STR (hãng ABI) trong đó có tỉ lệ thành công cao hơn đáng kể so với ADN bị phân hủy hoặc ADN bị ức chế so với các bộ kít tiêu chuẩn, nhưng cũng có một yêu cầu lượng ADN đầu vào thấp là 0,125 ng so với 0,5

ng Ngoài việc thay đổi các điều kiện chu kỳ hoặc trình tự mồi, các thành phần của master-mix, việc giảm thể tích PCR có thể có tác động hiệu quả nhất Gaines và cộng sự đã đưa ra báo cáo rằng khả năng PCR thành công tăng gấp 4 lần khi giảm thể tích PCR xuống còn 5 µl [15] Tuy nhiên, chỉ đơn giản giảm thể tích PCR có thể không tăng hiệu quả hoặc độ chính xác, nó chỉ có thể đơn giản là làm tăng nồng độ tương đối của các mẫu với thành phần phản ứng

Trang 29

Thay đổi các thành phần cụ thể (như là MgCl2, mồi hoặc nồng độ đệm) trong các sản phẩm thương mại đa hệ STR là không thể, do cách chúng đã được chuẩn bị Có một số ý kiến cho rằng thay đổi công thức đệm hoặc nồng

độ mồi có thể cải thiện khả năng khuếch đại thành công đối với loại mẫu kém chất lượng, mặc dù vẫn chưa được kiểm tra với các STR hiện hành Tuy nhiên, việc thay đổi các loại ADN polymerase đã được chứng minh là làm tăng đáng kể độ nhạy và hiệu quả của phản ứng, giúp tăng hiệu quả với mẫu có lượng tế bào chứa ADN rất nhỏ hoặc mẫu có chứa nhiều chất ức chế

Phương pháp tinh sạch sản phẩm sau khi PCR thường được sử dụng là loại bỏ muối, ion và các dNTP chưa sử dụng và mồi dư thừa sau phản ứng sử dụng lọc (ví dụ: cột lọc Microcon), màng silica gel (ví dụ, cột Qiagen MinElute), hoặc enzyme thủy phân (ví dụ: ExoSAP-IT) Tinh sạch các ion âm như Cl- để ngăn chặn cạnh tranh phân tử diễn ra trong quá trình hút mẫu chạy điện di, đảm bảo tối đa lượng ADN được đưa vào Tinh sạch bằng cột MinElute đã cho tăng gấp bốn lần chiều cao peak.[16]

Trong quá trình tinh sạch thì cũng có thể cô đặc sản phẩm PCR Giảm

số lượng sản phẩm PCR từ 50-25 µl xuống 10 µl có thể làm tăng 6 đến 14 lần chiều cao peak Nếu toàn bộ sản phẩm PCR được giảm xuống xấp xỉ 1 µl cho chiều cao peak còn tăng hơn nữa.[16]

1.8 Những khó khăn trong nâng cao hiệu quả PCR và chất lƣợng ADN

Mặc dù tất cả các lựa chọn ở trên để cải thiện hiệu quả PCR và xác định chính xác dấu vết ADN ghi thu tại hiện trường vụ án hình sự, rất nhiều phòng thí nghiệm hình sự đã miễn cưỡng sử dụng các phương pháp đó trong quy trình giám định Không sản phẩm thương mại nào được xác nhận bởi nhà sản xuất cho việc tăng lên 34 chu kỳ cho phản ứng PCR Nguyên nhân chính để các nhà khoa học hình sự sử dụng việc tăng chu kỳ là để thu được kiểu gen hoàn chỉnh Bốn trường hợp có thể xảy ra khi PCR đối với ADN tách chiết từ dấu vết máu có chất lượng kém như dấu vết trên vải đã bị giặt:

Trang 30

a Alen bị drop-out (mất alen), hiện tượng mất alen trong locus dị hợp tử

b Giảm sự cần bằng alen dị hợp tử trong 1 locus hoặc giữa locus, gây

ra sự mất cân bằng nghiêm trọng độ cao peak trong và giữa các locus

c Alen bị drop-in (thêm alen), do hình ảnh khuếch đại tạo ra như stutter (alen lặp) dẫn tới khó khăn trong việc mô tả số lượng người cho với kiểu gen phân tích được và sự ấn định của các alen trong 1 hỗn hợp

d Alen bị drop-in (thêm alen), gây ra bởi sự nhiễm không thường xuyên từ hiện trường vụ án hoặc phòng thí nghiệm Mặc dù xác suất của alen drop-in vẫn giữ nguyên, không phụ thuộc vào số lượng mẫu Ngoài ra, phụ thuộc vào khi các nguồn gây nhiễm vào một mẫu, việc phân tích lại có thể hoặc không thể tái tạo các kết quả ban đầu

Hiện tại chưa có phương pháp hoàn chỉnh nào để loại trừ những chất ức chế gây ra trong quá trình PCR, ADN gây ảnh hưởng tới hình ảnh điện di phân tích kết quả Một kết quả điện di của ADN thu được từ dấu vết máu có hiện tượng mất alen, alen lặp, thêm alen gây khó khăn trong việc phân tích, đối chiếu

so sánh kết quả tìm ra chứng cứ, truy nguyên cá thể có mức độ tin cậy cao

1.9 Kỹ thuật điện di

1.9.1 Nguyên lý của kỹ thuật điện di

Dưới ảnh hưởng của điện trường trong đệm có pH nhất định, các phân tử

và các hạt mang điện tích sẽ chuyển động về phía điện cực trái dấu Phân tử ADN tích điện âm nên sẽ chuyển động về phía cực dương Trong quá trình điện di do có điện tích và khối lượng khác nhau, những phân tử và những hạt trong một hỗn hợp sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và phân tách thành những tiểu phần khác nhau Những đoạn ADN có kích thước khác nhau cũng

sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau trong điện trường Để xác định được vị trí các băng ADN sau khi điện di người ta có thể sử dụng các phương pháp phát hiện khác nhau: nhuộm bằng ethidium bromide, nhuộm bạc, đánh dấu phóng xạ, gắn huỳnh quang…

Trang 31

1.9.2 Nguyên lý điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 Genetic Analyzer

Đây là phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi là điện di mao quản) Các cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chất nhuộm huỳnh quang tương ứng Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang Màu xanh (blue), xanh lá cây (green), vàng (yellow),

đỏ (red) và cam (orange) tương ứng với các dye 6-FAM, VIC, NED, PET và LIZ Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chất nhuộm màu huỳnh quang Các hạt huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn) Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó

Sau quá trình điện di, các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm

để xác định các alen của mỗi locus

1.10 Phân tích dấu vết ADN khi bị lẫn

Dấu vết ADN khi bị lẫn làm tăng phần phức tạp trong việc giải thích, phân tích dấu vết Dấu vết ADN lẫn trong các vụ án hình sự có thể bao gồm ADN của một hoặc nhiều người để lại, mức độ lẫn là khác nhau giữa mỗi người, người để lại nhiều dấu vết, người để lại ít dấu vết Ngoài ra các mẫu lẫn có thể bao gồm ADN của nhiều người nhưng đều chỉ ở mức độ lượng ít Kiểu gen thu được thực sự bắt nguồn từ một nguồn duy nhất có thể bị xử lý như là một mẫu lẫn khi đỉnh của stutter (alen lặp) cao và do đó dẫn tới giải thích sai vì coi mẫu đó bắt nguồn từ nhiều cá thể Với xác suất cao của alen bị mất đi hoặc bị lặp lại, việc xác định số lượng người để lại tế bào chứa ADN trong mẫu lẫn là một vấn đề khó khăn Tăng cường phản ứng khuếch đại có thể làm cho alen trong kiểu gen phân tích được ít bị mất đi hoàn toàn ở một

Trang 32

vài locus hoặc có thể gây ra sự khuếch đại thêm một số alen, tạo ra sự xuất hiện kiểu gen của một người khác riêng biệt Đặc biệt, việc tăng stutter (alen lặp) nhìn thấy được khi thực hiện phản ứng khuếch đại ADN từ dấu vết máu gây ra một vấn đề cực kì khó khăn cho việc phân tích mẫu lẫn Mặc dù có những hướng dẫn tỷ lệ phần trăm stutter (alen lặp) ở những locus cụ thể cho một lượng mẫu tiêu chuẩn nhưng không có tiêu chuẩn nào cho mẫu ADN có chất lượng kém

Để biện luận kết quả và đưa ra kết luận cho trường hợp mẫu lẫn phải sử dụng Tỉ lệ khả dĩ (Likelihood Ratio-LR)

LR = Hp/Hd trong đó Hp : Mẫu lẫn ở hiện trường (lẫn giữa ADN của đối tượng và ADN của một người chưa biết)

Hd : Mẫu ở hiện trường (lẫn giữa ADN của hai người chưa biết)

Ngoài ra, ta còn có thể phân biệt các nguồn ADN khác nhau bằng độ đậm nhạt của các vạch trên ADN của bản gel hoặc độ cao thấp của các peak nếu điện di trên các máy hiện đại và từ đó truy nguyên đồng nhất như trường hợp mẫu không lẫn gen Phương pháp này đuợc gọi là semi intutive Tuy nhiên, phải rất cẩn trọng khi sử dụng phương pháp này

1.11 Vấn đề nhiễm ADN

Việc nhiễm nguồn gen là một vấn đề rất quan trọng cần chú ý trong việc phân tích và giải thích ADN có số lượng ít ADN nhiễm vào mẫu có thể nhiều hay ít, hoặc nhiều hơn ADN gốc Theo lý thuyết, bất kỳ ADN nào sót lại ở hiện trường không phải ngay lập tức có liên quan đến tội phạm đang được điều tra, có thể được xem như là ADN nhiễm Việc nhiễm ADN có thể xuất hiện ở bất kỳ trường hợp nào sau đây:

(1) trước khi hành động tội phạm xảy ra;

(2) trong khoảng thời gian giữa hành động phạm tội và bảo vệ hiện trường vụ án;

Trang 33

(3) trong quá trình khám nghiệm hiện trường;

(4) trong phòng thí nghiệm

Để giảm thiểu nguy cơ nhiễm ADN ở hiện trường vụ án, cần thực hiện nghiêm ngặt các điều sau đây:

a Hạn chế thâm nhập nhiều vào nơi có khả năng có dấu vết;

b Sử dụng găng tay, khẩu trang, xem xét chặt chẽ những mẫu vật có liên quan đến tội phạm;

c Thay đổi thường xuyên găng tay khi thu thập tang vật bị tiếp xúc;

d Tránh một cách tối đa chạm vào khu vực mà có thể thu được dấu vết ADN do tiếp xúc;

e Có sẵn kiểu gen của những người tiếp xúc với mẫu vật để kiểm tra sự nhiễm ADN hay không hoặc nhiễm ADN của ai Những dữ liệu này sẽ hỗ trợ trong việc giải thích kiểu gen

Một điểm cần lưu ý trong việc sử dụng phương tiện thu lượm và phát hiện trên nhiều mẫu vật và ở nhiều hiện trường Bất kỳ dụng cụ nào, do đó khi có những tác động vật lý lên dấu vết sinh học cần được khử trùng, khử ADN

tự do trong khi sử dụng trên mẫu vật Trong phạm vi lây nhiễm phòng thí nghiệm có thể xảy ra giữa các cá nhân trong phòng thí nghiệm, giữa các mẫu vật được giám định Phương pháp để giảm thiểu tối đa khả năng lây nhiễm trong phòng thí nghiệm có thể bao gồm:

a Sử dụng những dụng cụ không dính ADN (DNA-free), không hẳn chỉ là vô trùng

b Thường xuyên làm sạch triệt để khu vực phòng thí nghiệm

c Đánh giá mức độ và vị trí ADN trong khu vực làm việc và trên các công cụ liên quan được thực hiện và kết quả xem xét từ góc độ quản lý rủi ro

d Tách khác khu vực làm việc, mỗi công đoạn có một phòng riêng: chuyển mẫu, tách chiết, PCR, điện di

Trang 34

Mỗi kiểu gen từ dấu vết máu nên được giải thích trong trường hợp có thể xảy ra nhiễm Một mẫu lẫn có thể bao gồm ADN gốc, ADN liên quan đến tội phạm và ADN sau phạm tội và có thể khó khăn trong việc xác định kiểu gen liên quan Do đó cần tiếp tục nghiên cứu, giám sát và giảm tỷ lệ của tất cả các loại lây nhiễm là rất quan trọng cho sự phát triển của phân tích dấu vết ADN

1.12 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước đối với lĩnh vực nghiên cứu của đề tài

1.12.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay, ở Việt Nam có một số cơ quan có chức năng cũng như có trình độ giám định ADN như: Viện Khoa học hình sự, Viện Pháp y quân đội, Viện Pháp y Quốc gia, Viện Công nghệ sinh học, với rất nhiều đề tài nghiên cứu về ADN nhân cũng như ADN ti thể Tuy nhiên, đề tài nghiên cứu về giám định dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng thì chưa có báo cáo nào

Tại Trung tâm giám định Sinh học pháp lý Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an trong thời gian qua tuy còn gặp rất nhiều khó khăn trong việc tìm ra phương pháp giám định ADN với dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng Nhưng hiện nay công tác giám định đã bước đầu có hiệu quả trong việc xác định dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng, phục vụ cho công tác điều ta, truy tố và xét xử

1.12.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, có một vài nghiên cứu để có thể phân tích được ADN từ các dấu vết máu trên vật mang là vải sau khi đã bị giặt bằng xà phòng Qua nghiên cứu tài liê ̣u cả trong và ngoài nước , chúng tôi chưa thấy có công trình nào đề cập một cách đầy đủ, chi tiết về sử du ̣ng phương pháp tách chiết tối ưu cho mẫu máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà trong các vụ án hình sự

Trang 35

Xuất phát từ những thực tế đó , trước yêu cầu giám đi ̣nh dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng trong lĩnh vực hình sự, đề tài thực hiện nhằm tìm ra phương pháp tách chiết phù hợp tách chiết được lượng ADN hiệu quả nhất từ những dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng, có chất lượng cao phù hợp với điều kiện hiện có tại phòng thí nghiệm của viện Khoa học hình sự - Bộ Công an Trên cơ sở đó xây dựng quy trình giám

đi ̣nh dấu vết máu trên vật mang là vải đã bị giặt bằng xà phòng phục vụ cho công tác giám đi ̣nh ADN ta ̣i Viê ̣n Khoa học hình sự - Bộ Công An

Trang 36

2.1 Vâ ̣t liê ̣u

- Máy giải trình tự gen 3130 Genetic Analyzer của hãng ABI - Mỹ sử dụng phần mềm của hãng Hitachi - Nhật bản

- Máy ly tâm siêu tốc Universal 320 và Micro 200R của CH Liên Bang Đức có vận tốc ly tâm tối đa là 15.000v/phút

- Máy định lượng 7500 Real time PCR System của hãng AB - Mỹ phục

vụ định lượng ADN

- Máy điều nhiệt 9700 của hãng ABI - Mỹ phục vụ chạy phản ứng PCR

- Block heater của hãng Selby - Australia, gồm 2 loại: đơn và đôi

- Máy điều nhiệt (Eppendorf - Đức)

- Tủ sấy (Đức), tủ lạnh (Nhâ ̣t)

- Tủ hốt hoá chất (Đức)

- Tủ hốt vô trùng (Đức)

- Block gia nhiệt

- Máy cất nước hai lần (Trung Quốc)

2.1.2 Dụng cụ

- Pipet đi ̣nh mức các loa ̣i (Gilson, Eppendorf)

- Ống Eppendorf các loại : 0,2 ml, 0,5ml, 1,0 ml, 1,5 ml

- Đầu côn các loại 10 µl, 100 µl, 200 µl, 1 ml

- Găng tay cao su chuyên dụng

- Các dụng cụ tiêu hao phục vụ quá trình nghiên cứu và giám định như

hệ thống mao quản (capillary), Gel-POP4 và các loại ống nghiệm, khay đựng mẫu, tăm bông…

Trang 37

2.2 Hóa chất

- Kít thử định hướng dấu vết máu Phenolphthalein

- Agarose (chuyên cho chạy điện di ADN protein)

- Kháng protein người, trâu bò, gia cầm và chó

- Chelex® 100 Resin (Bio-rad/Mỹ)

- Kít tách chiết PrepFiler

- Kit Human DNA Quantification dùng cho định lượng bằng phương pháp Real time PCR

- Kit PCR: Identifiler Direct (ABI, Mỹ)

- Hóa chất điện di: Hidi, Liz, pop 4

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Trong quá trình thí nghiệm thực hiện đề tài, chúng tôi có sử dụng một

số phương pháp sau:

2.3.1 Phương pháp thu lượm dấu vết máu trên vật mang là vải

Các vật mang là vải thường là: Quần áo, mũ vải, găng tay vải, tất, chăn,

ga, gối đệm, khăn mặt, rèm cửa…

Đối với dấu vết máu trên vải đã bị giặt thường có số lượng không nhiều

và quan sát màu sắc của dấu vết tương đối mờ và rất khó phát hiện nên việc tìm kiếm phải tỉ mỉ và cẩn thận

Khi đã phát hiện ra dấu vết dấu vết nghi máu trên vật mang thì dùng panh kéo đã khử trùng bằng cồn 900

cắt lấy phần vải có bám dính dấu vết, cắt nhỏ và chuyển vào tuýp để thực hiện những bước tiếp theo

2.3.2 Phương pháp giám định định hướng dấu vết máu

Phương pháp xác định định hướng dấu vết máu sử dụng bộ kít Phenophthalein do Viện Khoa học hình sự sản xuất gồm 3 loại dung dịch:

1 Dung dịch phenolphthalein 1%: lọ 50ml

2 Dung dịch Alcohol 95%: lọ 50ml

3 Dung dịch H O 3%: lọ 50ml

Trang 38

Dùng bông hay tăm bông thấm ẩm lau nhẹ để tách một phần nhỏ dấu vết cần thử định hướng, nhỏ 1 giọt dung dịch số 1 vào dấu vết và đợi khoảng

40 giây, nhỏ tiếp 1 giọt dung dịch đổi màu số 2, sau đó nhỏ 1 giọt H2O2 3% (dung dịch 3) vào:

Đánh giá kết quả:

Dương tính: Cho kết quả màu hồng

Âm tính: Không đổi màu

(Phản ứng chỉ đọc kết quả trong vòng 1 phút)

Ghi chú: Tiến hành thử thuốc thử với máu chứng trước khi thử với dấu vết nghi máu, đảm bảo thuốc thử hoạt động tốt

2.3.3 Phương pháp khuếch tán miễn dịch kép – Ouchterlony

Sử dụng phản ứng khuếch tán miễn dịch kép theo phương pháp của Ochterlony để xác định protein đặc hiệu loài đối với dấu vết máu:

Nguyên tắc của phản ứng

Trong huyết thanh, trong các dịch cơ thể đều có chứa các kháng nguyên đặc hiệu loài Khi các kháng nguyên này kết hợp với các kháng thể đặc hiệu

sẽ tạo thành dạng kết tủa, nhìn thấy được

Cách tiến hành

Dùng kéo cắt một mảnh nhỏ dấu vết (cỡ 0,1 x 0,1 cm) cho vào lỗ thạch trung tâm, dùng pipet cho nước cất vào đầy lỗ thạch, sao cho thấm hết mảnh dấu vết và không để có bọt khí, lượng nước thêm vào nhằm để cho các phân tử protein trong dấu vết tan ra và khuyếch tán ra xung quanh (quá trình chiết dấu vết) Nếu dấu vết máu quá khô hoặc vết máu quá cũ thì nên chiết dấu vết bằng nước cất trước, sau đó lấy dịch chiết với đệm làm phản ứng Thời gian chiết từ 2 – 24 giờ tuỳ theo tuổi dấu vết Trong trường hợp lượng dấu vết ít (vết máu đã bị ngâm nước hoặc đã bị giặt qua, chỉ còn màu nâu nhạt ) phải tăng lượng dấu vết lấy làm phản ứng hoặc phải chiết, cô đặc dấu vết để làm phản ứng

Trang 39

- Nếu mẫu giám định ở dạng lỏng (máu lỏng, dịch chiết dấu vết) thì dùng pipet cho mẫu vào đầy lỗ, không để có bọt khí

- Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng Tuỳ theo chất lượng dấu vết, chất lượng kháng huyết thanh, thời gian xuất hiện kết quả phản ứng sẽ khác nhau Thời gian phản ứng có thể từ 4 giờ đến tối đa là 24 giờ, thông thường là 8 - 12 giờ Khi xem kết quả nên dùng một màn tối màu đặt ở phía sau đĩa thạch hoặc dùng đèn chiếu xiên, chiếu từ phía sau đĩa thạch, theo phương xiên góc, sẽ nhận thấy vạch tủa rõ hơn Chú ý phân biệt vết mốc, vết xước với vạch kết tủa

Đánh giá kết quả

- Phản ứng dương tính: Khi có một (hoặc 2- 3) vạch tủa màu trắng, thẳng (hoặc hơi cong), dài khoảng 0,5 cm nằm ở khoảng giữa và vuông góc với đường thẳng nối tâm của lỗ thạch chứa dấu vết và lỗ thạch chứa kháng

huyết thanh xuất hiện kết tủa với kháng huyết thanh kháng protein của loài

nào thì dấu vết là máu của loài đó

- Phản ứng âm tính: Không có vạch tủa

2.3.4 Phương pháp tách chiết ADN từ dấu vết máu

Tách chiêt ADN nói chung là một trong những công việc phổ biến trong nghiên cứu hóa sinh, vì vậy có rất nhiều phương pháp tách chiết khác nhau được phát triển, nhưng về cơ bản quá trình tách chiết ADN đều phải trải qua các bước chính sau: phá vỡ màng tế bào, màng nhân, phân ly ADN khỏi protein và một số hợp chất khác

Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi sử dụng các phương pháp tách chiết dấu vết máu ứng dụng cho nghiên cứu bao gồm:

2.3.4.1 Phương pháp tách chiết bằng chelex 5% (sử dụng Chelex® 100 Resin của hãng Bio-rad -Mỹ)

Quá trình tách chiết ADN bằng chelex gồm các bước sau:

- Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang, ủ cùng chelex ở 56 oC trong

Định dạng
Số trang	78
Dung lượng	2,36 MB