Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α glucosidase của các hợp chất từ quả mướp đắng (momordica charantia l )

Viên nang chứa các hợp chất có nguồn gốc từ quả mướp đắng đang ngày càng trở nên phổ biến rộng rãi trên thế giới và được sử dụng như là thực phẩm chức năng để hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đ

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐAN THỊ THÚY HẰNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

TỪ QUẢ MƯỚP ĐẮNG (Momordica charantia L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

Hà Nội – 11/2015

Trang 2

Mã số: 60420114

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS PHAN VĂN KIỆM

Hà Nội – 11/2015

Mã số: 60420114

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS PHAN VĂN KIỆM

Hà Nội – 11/2015

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Luận văn được hoàn thành tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Viện Hàn lâm: “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân lập hoạt chất

momordicoside A từ quả Mướp đắng Momordica charantia L và tác dụng của nó

trong điều trị tiểu đường trên động vật thực nghiệm”

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phan Văn Kiệm, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và phấn đấu để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra của luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của tập thể các cán bộ Viện Hóa sinh biển và tập thể cán bộ Phòng Nghiên cứu cấu trúc đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn này

Hà Nội, 11/2015

Đan Thị Thúy Hằng

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và các kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất kì công trình nào khác

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Hà Nội, 11/2015

Đan Thị Thúy Hằng

Trang 5

I

MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HÌNH V

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 Tổng quan 3

1.1 Một vài nét về thực vật của cây mướp đắng 3

1.1.1 Mô tả thực vật 3

1.1.2 Phân bố và sinh thái 3

1.1.3 Công dụng của cây mướp đắng trong y học dân gian 4

1.2 Thành phần hóa học của loài mướp đắng 5

1.3 Tác dụng dược lí của loài mướp đắng 11

1.3.1 Hoạt tính trị bệnh tiểu đường 11

1.3.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 12

1.3.3 Hoạt tính kháng virus 13

1.3.4 Hoạt tính chống ung thư 13

1.3.5 Hoạt tính chống viêm loét 14

1.3.6 Hoạt tính điều hòa miễn dịch 14

1.3.7 Hoạt tính kháng viêm 14

1.4 Bệnh tiểu đường và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 15

1.4.1 Bệnh tiểu đường 15

1.4.2 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 17

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 20

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 21

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 22

Chương 3 Thực nghiệm 24

3.1 Phân lập các hợp chất 24

3.2 Các thông số vật lí của các hợp chất đã phân lập được 25

Trang 6

II

3.2.1 Hợp chất MC1: Charantoside D 25

3.2.2 Hợp chất MC2: Charantoside E 25

3.2.3 Hợp chất MC3: Charantoside F 25

3.2.4 Hợp chất MC4: Charantoside G 26

3.2.5 Hợp chất MC5: Goyaglycoside-c 26

3.2.6 Hợp chất MC6: Goyaglycoside-d 26

3.2.7 Hợp chất MC7: Momordicoside F1 26

3.2.8 Hợp chất MC8: Momordicoside N 27

3.2.9 Hợp chất MC9: Momordicoside M 27

Chương 4 Kết quả và thảo luận 29

4.1 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 29

4.1.1 Hợp chất MC1: Charantoside D (hợp chất mới) 29

4.1.2 Hợp chất MC2: Charantoside E (hợp chất mới) 34

4.1.3 Hợp chất MC3: Charantoside F (hợp chất mới) 39

4.1.4 Hợp chất MC4: Charantoside G (hợp chất mới) 44

4.1.5 Hợp chất MC5: Goyaglycoside-c 49

4.1.6 Hợp chất MC6: Goyaglycoside-d 54

4.1.7 Hợp chất MC7: Momordicoside F1 58

4.1.8 Hợp chất MC8: Momordicoside N 62

4.1.9 Hợp chất MC9: Momordicoside M 67

4.2 Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 71

KẾT LUẬN 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

PHỤ LỤC PHỔ

Trang 7

III

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

Phổ DEPT

HMBC Heteronuclear mutiple Bond

RP-18 Reserve phase C-18 Chất hấp phụ pha đảo RP-18

Trang 8

IV

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Số liệu phổ 1 H và 13 C-NMR của hợp chất MC1 và hợp chất tham khảo 30

Bảng 6 Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất MC6 và hợp chất tham khảo 55

Bảng 9 Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất MC9 và hợp chất tham khảo 67

Trang 9

V

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Hình ảnh loài mướp đắng 4

Hình 2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ quả mươp đắng (M charantia L.) 28

Hình 3 Cấu trúc hóa học của MC1, hợp chất tham khảo MC1A và các tương tác HMBC chính của MC1 29

Hình 4 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất MC1 31

Hình 5 Phổ 1 H-NMR của hợp chất MC1 32

Hình 6 Phổ 13 C-NMR của hợp chất MC1 32

Hình 7 Phổ HSQC của chất MC1 33

Hình 8 Phổ HMBC của chất MC1 33

Hình 9 Phổ NOESY của chất MC1 34

Hình 11 Phổ HR-ESI-MS của chất MC2 37

Hình 12 Phổ 1 H-NMR của chất MC2 37

Hình 13 Phổ 13 C-NMR của chất MC2 38

Hình 14 Phổ HSQC của hợp chất MC2 38

Hình 15 Phổ HMBC của chất MC2 39

Hình 21 Phổ HMBC của hợp chất MC3 44

Trang 10

VI

Hình 28 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của MC5 49

Hình 31 Phổ DEPT hợp chất MC5 53

Hình 34 Cấu trúc hóa học của MC6 54

Hình 37 Phổ DEPT của hợp chất MC6 57

Hình 46 Phổ DEPT của Hợp chất MC8 65

Hình 49 Cấu trúc hóa học của hợp chất MC9 67

Hình 52 Phổ DEPT của hợp chất MC9 70

Trang 11

VII

Hình 53 Các hợp chất phân lập từ quả mướp đắng M charantia L 70 Hình 54 Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase ở các nồng độ khác nhau 73

Trang 12

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây thuốc và động vật làm thuốc đã được nhiều dân tộc trên thế giới sử dụng rộng dãi để điều trị các bệnh khác nhau Theo thống kê sơ bộ, ở một số nước châu Á và châu Phi, 80 % dân số phụ thuộc vào y học cổ truyền trong việc chăm sóc sức khỏe cơ bản Ở nhiều nước phát triển, 70 % đến 80 % dân số đã sử dụng các cây thuốc hoặc chế phẩm của nó Các loài thảo mộc đã được sử dụng trong dân gian, được chứng minh bởi các nghiên cứu dược lý đã tạo ra nhiều loại thuốc Tây Trong vài thập kỉ qua, với các bài thuốc dân gian trong đó dược liệu cổ truyền đóng vai trò là nguồn nguyên liệu cung cấp cho thuốc Tây với hơn 40% tổng các loại thuốc Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc phân tích, đánh giá hoạt tính sinh học từ các hợp chất tinh khiết cũng như dịch chiết toàn phần từ các cây thuốc dân gian

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển đa dạng của các loài sinh vật Vì vậy, nước ta

có nguồn tài nguyên sinh vật rất đa dạng và phong phú, đặc biệt là tài nguyên rừng Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong phú với khoảng 12.000 loài trong

đó khoảng 4.000 loài có giá trị, được nhân dân sử dụng làm thảo dược và các mục đích hữu ích khác Cùng với sự đa dạng do thiên nhiên mang lại, Việt Nam còn là một trong những quốc gia có nhiều kinh nghiệm trong việc sử dụng các thực vật

và sinh vật trong các bài thuốc y học cổ truyền So với Tây dược, các bài thuốc y học cổ truyền có rất nhiều ưu điểm trong chữa bệnh như ít độc tính, ít có tác dụng phụ, dễ tìm nguyên liệu Chính vì vậy nhiều công ty dược phẩm trong và ngoài nước đã và đang tập trung hướng nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên Với những định hướng này đã thúc đẩy các hướng nghiên cứu tìm kiếm dược liệu từ thiên nhiên Qua các nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều loài thực vật có ứng dụng cao trong y dược như nhân sâm

(Panax ginseng), giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum), bá bệnh (Eurycoma

longifolia), linh chi (Ganoderma lucidum) đông trùng hạ thảo, … Những kết quả

Trang 13

2

nghiên cứu này giúp cho việc tìm kiếm và cung cấp các hoạt chất nhằm tạo ra các sản phẩm phục vụ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Mướp đắng (Momordica charantia L.) là một trong những cây trồng được

sử dụng phổ biến để làm thực phẩm và được dùng trong y học Quả loài này được

sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới để điều trị bệnh tiểu đường Ngoài ra, quả mướp đắng được sử dụng để điều trị các vết thương, diệt giun và kí sinh trùng Loài này cũng được sử dụng làm thuốc tránh thai, kháng virus sởi và trị viêm gan

Viên nang chứa các hợp chất có nguồn gốc từ quả mướp đắng đang ngày càng trở nên phổ biến rộng rãi trên thế giới và được sử dụng như là thực phẩm chức năng để hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường và làm giảm cholesterol Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu trong nước về thành phần hóa học và hoạt tính hạ đường huyết của loài mướp đắng Nghiên cứu khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng

hạ đường huyết về loài mướp đắng ở Việt Nam sẽ là cơ sở khoa học trong việc sử dụng và phát triển các sản phẩm từ loài mướp đắng Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề

tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất từ quả mướp đắng (Momordica charantia L.)”

Mục tiêu của đề tài là làm rõ thành phần hóa học của quả mướp đắng và tìm

kiếm được một số hoạt chất có tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase để chữa các

bệnh tiểu đường

Đề tài bao gồm các nội dung chính sau:

 Thu mẫu, tạo tiêu bản loài mướp đắng

 Phân lập các hợp chất từ quả loài mướp đắng

 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ quả mướp đắng

 Đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất phân lập

được

Trang 14

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Một vài nét về thực vật của cây mướp đắng

Cây mướp đắng hay còn được gọi là khổ qua, có tên khoa học là Momordica

charantia L., thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) Loài này thuộc loại dây leo, đường

kính dây khoảng 5-10 mm, dây bò dài 5-7 m, thân màu xanh nhạt, có góc cạnh, leo được nhờ có nhiều tua cuốn, ở ngọn có lông tơ Lá đơn nhám, mọc so le, dài 5-10

cm, rộng 4-8 cm, phiến lá mỏng chia làm 5-7 thùy hình trứng, mép có răng cưa đều, dưới lá màu xanh nhạt hơn mặt trên lá, gân lá nổi rõ ở mặt dưới, phiến lá có lông ngắn Hoa mọc đơn ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc, có cuống dài Hoa đực có đài và ống rất ngắn, tràng gồm 5 cánh mỏng hình bầu dục, nhụy rời nhau Hoa cái có đài và tràng hoa giống hoa đực Tràng hoa màu vàng nhạt, đường kính khoảng 2 cm Quả hình thoi, dài 8-15 cm, gốc và đầu thuôn nhọn Vỏ ngoài có nhiều u lồi to nhỏ không đều Quả khi chưa chín có màu xanh hoặc xanh vàng nhạt, khi chín có màu vàng hồng quả nứt dần ra từ đầu, tách làm 3 phần để lộ chùm áo hạt màu đỏ bên trong Hạt dẹt, dài từ 13-15 mm, rộng 7-8 mm, hình răng cưa, thắt đột ngột ở hai đầu Vỏ hạt cứng, quanh hạt có màng màu đỏ như màng hạt gấc [1]

1.1.2 Phân bố và sinh thái

Cây mướp đắng được trồng đại trà ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới như rừng Amazon, Đông Phi, Châu Á, Ấn Độ, Nam Mỹ và Cari-bê Loài này được trồng trên khắp thế giới và được sử dụng để làm rau ăn và thuốc

Trang 15

1.1.3 Công dụng của cây mướp đắng trong y học dân gian

Hầu hết các bộ phận của cây mướp đắng đều có công dụng chữa bệnh Ngoài công dụng làm rau ăn, theo y học cổ truyền, loài mướp đắng thường sử dụng để điều trị một số bệnh sau:

− Quả mướp đắng được dùng để trị một số bệnh như: trị ho, sốt, kiết lị, kích

thích lên da non các vết thương hở Quả mướp đắng có tính hàn, mát, có tính giải nhiệt, làm tiêu đờm, nhuận tràng, bổ thận, lợi tiểu, làm bớt đau khớp xương Quả chín có tính bổ thận, dưỡng huyết Ở Trung Quốc, quả mướp đắng còn dùng để trị đột quỵ Ở Ấn Độ, quả mướp đắng còn được dùng để trị rắn cắn Ở Thái Lan, dịch

Trang 16

− Hạt có chất béo, vị đắng, hơi ngọt, tính ấm, thanh nhiệt, giải độc, hạ sốt, lợi tiểu, chữa ho viêm họng, rắn cắn, trẻ động kinh [1].

1.2 Thành phần hóa học của loài mướp đắng

Trong nhiều nghiên cứu đã chứng minh được các hợp chất thuộc khung cucurbitane-triterpene là thành phần hóa học chính của cây này Cho đến nay có khoảng 100 hợp chất thuộc khung cucurbitane đã được xác định từ mướp đắng Yumi Mryahara và cộng sự đã phân lập được 5 hợp chất trirterpene glycoside là

Trang 17

O O

HO

OH

O O HO

13: R = H 14: R= glc

O HO

OH HO

O HO

HO

OH

O O HO

HO OH HO

9 10

13 14 17 18

3β,7β,23-trihydroxycucurbita-Ngoài ra, dịch chiết từ lá của loài này cũng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn và diệt

côn trùng [15, 56] Các hợp chất được phân lập từ thân loài mướp đắng gồm:

(23E)-25-methoxycucurbit-23-ene-3β,7β-diol (18),

Trang 18

(23E)-cucurbita-5,23,25-7

triene-3β,7β-diol (19), (23E)-25-hydroxycucurbita-5,23-diene-3,7-dione (20), (23E)-cucurbita-5,23,25-triene-3,7-dione (21), (23E)-5β,19-epoxycucurbita-6,23- diene-3β,25-diol (22), (23E)-5β,19-epoxy-25-methoxycucurbita-6,23-dien-3β-ol

(23) cũng đã thể hiện khả năng điều trị bệnh tiểu đường, hoạt tính gây độc tế bào

ung thư [7]

Trang 19

Từ phần thân của loài M Charantia L., Chang và cộng sự thông báo đã phân

lập được 5 hợp chất mới: octanorcucurbitacin A-D (24-27) và kuguacin M (28)

[8] Từ dịch chiết lá, Chen và cộng sự đã phân lập được 14 hợp chất triterpenoid

mới là: kuguacin F-S (29-42), cùng với 3 hợp chất đã biết: kuguacin E (43),

3β,7β,25–trihydroxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (44) và methoxycucurbita-5,(23E)-dien-19-al (45) [10] Các hợp chất này thể hiện hoạt

3β,7β-dihydroxy-25-tính ức chế dòng virus HIV-1 Các nghiên cứu khác từ quả loài này thông báo đã

phân lập được 19 hợp chất mới (46-64), bao gồm: goyaglycoside-A-H (46-53),

(23E)-3βhydroxy-7β-methoxycucurbita-5,23,25-trien-19-al (54), epoxy-19-methoxycucurbita-6,23,25-trien-3β-ol (55), (23E)-3β-hydroxy-7β,25-

(19R,23E)-5β,19-dimethoxycucurbita-5,23-dien-19-al (56), karavilagenin A-C (57-59), và karaviloside I-V (60 -64) [26, 37, 39] Harinantenaina và cộng sự đã phát hiện dịch chiết methanol của quả loài này có tác dụng hạ đường huyết và đã phân lập

được bốn hợp chất mới (65-68), bao gồm: 5,23(E)-diene (65), 3β-hydroxy-7β,25-dimethoxycucurbita-5,23(E)-diene (66), 3-

3β,25-dihydroxy-7β-methoxycucurbita-O-β-D-allopyranosyl-7β,25-dihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al (67),

Trang 20

3β,7β,25-9

trihydroxycucurbita-5,23(E)-dien-19-al (68) [21] Từ quả loài mướp đắng, Li và

cộng sự đã phân lập được 3 hợp chất mới: momordicoside M-O (69-71) [28]

Năm 2007, Akihisa và cộng sự thông báo đã phân lập từ quả loài M

charantia L được 13 hợp chất cucurbitane thuộc khung triterpene glycoside, trong

đó có tám hợp chất mới: charantoside I-VIII (72-79) cùng với năm hợp chất đã biết (7, 8, 48, 49, và 60) Các hợp chất này có khả năng kháng dòng virus Epstein-

Barr thuộc họ virus herpes [2]

Trang 21

10

Tan và cộng sự đã phân lập được bốn cucurbitane triterpene mới từ loài

mướp đắng, gồm: momordicoside Q-T (80-83), và karaviloside XI (84) Các hợp

chất này cũng được thông báo có khả năng hạ đường huyết và chống béo phì [35]

Ba cucurbitane glycoside, bao gồm: 6,23-diene-3β,25-diol 3-O-β-glucopyranoside (85), 23-O-β- allopyranosylecucurbita-5,24-dien-7α,3β,22(R),23(S)-tetraol 3-O-β-allopyranoside

Trang 22

19(R)-n-butanoxy-5β,19-epoxycucurbita-11

(86), 23(R),24(S),25-trihydroxycucurbit-5-ene glucopyranosyl}-25-O-β-glucopyranoside (87), và một steroidal glycoside 24(R)- stigmastan-3β,5α,6β-triol-25-ene-3-O-β-glucopyranoside (88) được Jie-Qing Liu

3-O-[β-glucopyranosyl(1→6)]-O-β-và cộng sự phân lập từ quả loài mướp đắng 3-O-[β-glucopyranosyl(1→6)]-O-β-vào năm 2009 [29] Harinantenaina 3-O-[β-glucopyranosyl(1→6)]-O-β-và

cộng sự cũng đã thông báo hoạt tính hạ đường huyết yếu của các hợp chất epoxy-3β,25-dihydroxycucurbita-6,23(E)-diene và 3β,7β,25-trihydroxycucurbita- 5,23(E)-dien-19-al khi so sánh với đối chứng dương glibenclamide, ở liều thử 400

5β-19-mg/kg [21]

1.3 Tác dụng dược lí của loài mướp đắng

Trong vài thập kỷ qua đã có rất nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học, tác dụng dược lí cũng như các phép thử lâm sàng của loài mướp đắng Các nghiên cứu này cho biết các dịch chiết cũng như các hợp chất từ loài mướp đắng đã thể hiện một số hoạt tính sinh học như giảm đường glucose trong máu, diệt tế bào ung thư, kháng virus, kháng khuẩn, Dưới đây là tổng quan đến các hoạt tính điển hình của loài mướp đắng :

1.3.1 Hoạt tính trị bệnh tiểu đường

Loài mướp đắng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu liên quan đến bệnh tiểu đường [3, 14, 20, 22, 50, 55, 57] Bài thuốc có chứa

quả mướp đắng đã được Pari nghiên cứu cho thấy có tác dụng giảm rõ rệt nồng độ

đường trong máu, hemoglobin chứa đường và làm tăng insulin huyết tương và hemoglobin toàn phần ở động vật [47] Các hợp chất charantin, polypeptide,

oleanolic acid 3-O-monodemoside, và oleanolic acid 3-O-glucuronide từ loài

mướp đắng đã thể hiện hoạt tính hạ đường huyết [32] Ngoài ra bốn triterpenoid từ

quả mướp đắng đã thể hiện hoạt tính hạ đường huyết, kích hoạt bởi AMP [35]

Đặc biệt, mướp đắng cải thiện khả năng hấp thụ glucose và ngăn khả năng tăng đường huyết ở chuột [52] Dịch chiết của mướp đắng có thể làm tăng độ nhạy insulin và quá trình thủy phân lipit [11, 12]

Trang 23

12

Một số nghiên cứu khác cũng khẳng định rằng tác dụng hạ đường huyết của quả mướp đắng tương đương với một số loại thuốc như chloropropamide [41] và

glibenclamide [53] So với các nghiên cứu trên mô hình động vật, chưa có nhiều

nghiên cứu lâm sàng về tác dụng hạ đường huyết của loài mướp đắng Trong thử nghiệm lâm sàng, dịch chiết nước của quả mướp đắng đã làm giảm nồng độ glucose trong máu của người mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 bằng phép thử hấp thụ glucose John và cộng sự đã chọn ngẫu nhiên 50 đối tượng (26 bệnh nhân lâm sàng

và 24 đối tượng đối chứng) mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 để uống viên nang từ quả khô loài mướp đắng và giả dược Tiêu chí dựa trên hàm lượng đường trong máu lúc chưa ăn và hàm lượng đường sau ăn Kích thước mẫu được tính toán để lấy được một lượng giảm đều với nồng độ 300 mg/mL trong tỉ lệ FBS/PPS Tính chất

cơ bản của tất cả các đối tượng đều có thể so sánh được Chỉ số của FBS và PPS được đo bằng chỉ số fructosamine tại đường cơ bản trước khi điều trị 2 tuần và trong 4 tuần sau điều trị Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy không có thay đổi nhiều lượng đường trong máu hoặc mức fructosamine trong điều trị hoặc nhóm dùng giả dược [24]

1.3.2 Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

Qua các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh dịch chiết từ lá loài mướp đắng

có hoạt tính kháng khuẩn [25] Hoạt tính kháng khuẩn của các chất phân lập từ dịch chiết metanol của quả và lá loài mướp đắng đã được quan sát thử nghiệm đối

với các loài vi sinh vật: trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa), vi khuẩn đại tràng (Escherichia coli), nấm lưỡng bội gây suy giảm miễn dịch (Candida

albicans), tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus), và 4 chủng vi khuẩn: Klebsiellapneumoniae, Proteus vulgaris, Salmonella typhi và Cryptococcus neoformans Các kết quả cũng cho thấy các chất từ quả có hoạt tính kháng khuẩn

cao hơn so với lá [38] Trong một nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II, dịch chiết từ

lá loài mướp đắng cho thấy sự ức chế tăng trưởng vi khuẩn lao bằng cách sử dụng phương pháp BACTEC 460 [17] Từ kết quả này đã củng cố và khuyến khích dân

Trang 24

13

cư sống ở các nước nhiệt đới ăn quả mướp đắng vì nó có tác dụng bảo vệ chống lại các vi khuẩn gây bệnh lao, một loại bệnh phổ biến ở các khu vực này

1.3.3 Hoạt tính kháng virus

Cây mướp đắng và một số hợp chất từ loài này đã được phát hiện có khả

năng kháng các loại virus Epstein-Barr, herpes, HIV, coxsackie B3, và bại liệt Protein MAP30 được tách ra từ loài này đã thể hiện khả năng chống lại hoạt động của HIV Điều đó cho thấy quả mướp đắng có tiềm năng trong việc nghiên cứu hoạt tính kháng virus HIV Đồng thời, MAP30 là chất không độc hại đối với các tế bào thường [27] Trong nghiên cứu lâm sàng của Bourinbaiar và cộng sự về protein MAP30 cho thấy sự kết hợp của MAP30 với liều thấp dexamethasone và indomethacin có hiệu quả trong việc cải thiện khả năng kháng virus HIV [6] Hoạt tính chống virus HIV của một số hợp chất được tách từ loài cây này đã được công

bố như α,β-momorcharin [4, 58] các cucurbitacin, kuguacin C và E [9] Các lectin

như MRK29 từ loài này đã cho thấy khả năng ức chế quá trình sao chép ngược của virus [23, 54] Hoạt tính diệt virus herpes của MAP30 cũng đã được công bố MAP30 đã kháng virus HIV-1 và 2 với giá trị IC50 lần lượt là 0,1 và 0,3 µM [4] Những kết quả này cho thấy rằng protein MAP30 rất hữu ích trong ứng dụng để diệt virus herpes

1.3.4 Hoạt tính chống ung thư

Nhiều nghiên cứu về khả năng kháng ung thư của các dịch chiết và các hợp

chất phân lập từ loài mướp đắng đã cho thấy tác dụng diệt các dòng tế bào ung thư

rõ rệt như ung thư bạch cầu, ung thư nhau thai, ung thư da, ung thư hạch, ung thư

vú, ung thư tiền liệt tuyến, và ung thư bàng quang [18,51] Nghiên cứu của Pongikorn và cộng sự cho biết khi điều trị với quả loài mướp đắng trong thời gian

45 và 90 ngày đối với bệnh nhân ung thư cổ tử cung cho thấy giảm đáng kể glycoprotein, một protein có tác dụng kháng nhiều loại thuốc, trong khi không có tác dụng như vậy ở những bệnh nhân được điều trị hóa trị [48]

Trang 25

P-14

1.3.5 Hoạt tính chống viêm loét

Trong nghiên cứu của Matsuda và cộng sự, hợp chất momordinic với tỷ lệ (10 mg/kg thể trọng) có tác dụng nhanh làm lành vết thương ở niêm mạc dạ dày [33] Nghiên cứu của Gurbuz và cộng sự cho thấy quả của loài này sấy khô tẩm mật ong có khả năng chống loét dạ dày trên chuột [19] Thêm vào đó, dịch chiết etanol từ quả cũng cho thấy hoạt tính chống loét đáng kể trên chuột, gây ra bởi HCl-etanol trong indomethacin Hơn nữa, dịch chiết metanol của loài này đã thể hiện mức giảm các chỉ số loét dạ dày như axit toàn phần, hàm lượng pepsin đồng thời làm tăng lớp màng của dạ dày [49]

1.3.6 Hoạt tính điều hòa miễn dịch

Một số nghiên cứu về mướp đắng đã tập trung vào tác dụng ức chế miễn dịch cũng như kích thích miễn dịch Nghiên cứu in vivo của hợp chất momorcharin trên

chuột đã cho thấy kết quả của các mũi tiêm đơn đến sự giảm đáng kể của các phản ứng quá mẫn loại chậm cũng như sự hình thành kháng thể miễn dịch thể tế bào hồng cầu Tương tự, thioglycollate dẫn đến sự di chuyển của các đại thực bào bị hạn chế trong cơ thể Hoạt động của các tế bào trong cơ thể bị ảnh hưởng không

nhiều Ngoài ra, khả năng ức chế miễn dịch của α-và β-momorcharin không giống

như do lymphocytotoxicity trực tiếp hoặc do một sự thay đổi trong các thông số động học của các đáp ứng miễn dịch Tuy nhiên, hoạt động kích thích hệ thống miễn dịch làm tăng sản xuất interferon [13]

1.3.7 Hoạt tính kháng viêm

Dịch chiết etanol của quả mướp đắng cho thấy tác dụng làm giảm đáng kể nitric oxide (NO), sản xuất prostaglandin E2 (PGE2), nitric oxide synthase cảm

ứng (iNOS) và biểu hiện pro-IL-1β, gây ra bởi LPS (Lipopolysaccharide) Ngoài

ra, sự thay đổi di động khảo nghiệm điện di cho thấy rằng dịch chiết này ức chế quá trình kích hoạt yếu tố nhân NF-κB Những kết quả này cho thấy loài mướp đắng có lợi cho việc giảm LPS-gây ra phản ứng viêm bằng cách điều chỉnh hoạt động yếu tố nhân NF-κB Các hoạt động chống viêm của axit ferulic và axit

Trang 26

15

dehydrodimer ferulic từ loài mướp đắng đã được thử nghiệm Axit dehydrodimer

ferulic đã ức chế đáng kể việc giải phóng các yếu tố viêm TNFα, NO và ức chế sự

phát triển của phytohemagglutinin trên tế bào lá lách [46]

Trong một nghiên cứu khác, tác dụng của dịch chiết từ quả loài mướp đắng

đến hệ miễn dịch đường ruột bằng cách đánh giá các yếu tố viêm TGF-β, 7,

IL-10 và IL-12 Kết quả cho thấy dịch này thể hiện hoạt tính ức chế IL-7 và kích thích

Theo thống kê trên thế giới hiện nay có khoảng 347 triệu người mắc bệnh tiểu đường, trong đó hàng năm gần 10 triệu ca bệnh mới và hơn 3 triệu người chết liên quan đến tiểu đường Trên 80% các ca tử vong xuất hiện ở các quốc gia thu nhập thấp và trung bình Theo ước tính, đến năm 2030 bệnh tiểu đường sẽ là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 7 Tại Mỹ, số người bị tiểu đường tăng từ 5,3% năm 1997 lên 6,5% năm 2003 và tiếp tục tăng rất nhanh Người có độ tuổi trên 65

bị tiểu đường cao gấp hai lần người trong độ tuổi 45–54 Ở Việt Nam hiện nay có khoảng 5 triệu người mắc bệnh, chiếm 6% dân số và dự báo tăng lên 7-8 triệu người vào năm 2025 Số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường ở Việt Nam lại có tốc độ

Trang 27

− Bệnh tiểu đường tuýp 2 thường xảy ra ở người trên 50 tuổi, chiếm khoảng 90% trong tổng số trường hợp bị tiểu đường Đối với những người bị tiểu đường tuýp 2, mặc dù cơ thể vẫn sản xuất được insulin nhưng các insulin này trơ và kém nhạy cảm trong quá trình chuyển hóa đường thành glycogen Khi đó, cơ thể phản ứng bằng cách tăng quá trình sản xuất insulin và gây quá tải cho tuyến tụy Theo thời gian, lượng insulin được tiết ra dần dần giảm

Bệnh tiểu đường tuýp 2 còn có nguyên nhân tiềm ẩn trong cấu tạo gen, điều này làm cho bệnh phát triển nhanh hơn Nếu những người mang gen tiềm ẩn được phát hiện sớm và có biện pháp phòng ngừa bằng cách ăn uống hợp lí thì bệnh có thể không xuất hiện hoặc phát triển chậm, nhưng bệnh vẫn giữ ở dạng tiềm ẩn Trong trường hợp ngược lại, bệnh sẽ phát triển rất nhanh

Phương pháp điều trị

Phương pháp điều trị tiểu đường tuýp 1: với những người mắc bệnh tiểu

đường tuýp 1, họ sẽ phải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ thể họ không có khả năng tạo ra hoocmon này Insulin có nhiều loại nhưng nằm trong hai dạng chính tùy theo tác dụng nhanh hay chậm: dạng tác dụng nhanh dùng ngay trước bữa ăn để tăng lượng insulin trong cơ thể phù hợp với lượng carbohydrat sắp

Trang 28

ra trong ruột non và ngấm vào máu Thời gian gần đây, ta thấy xuất hiện insulin dưới dạng bột, nó được đưa vào máu qua đường phổi Qua nhiều năm nghiên cứu, người ta phát hiện được dạng thuốc bột này có hiệu quả rất cao

Phương pháp điều trị tiểu đường tuýp 2: Phụ thuộc vào tình trạng của bệnh

nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cường hoạt động Chỉ bệnh nhân tiểu đường tuýp 2 mới dùng thuốc uống kết hợp với những chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường huyết Bệnh nhân có thể dùng riêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm insulin

Thuốc sử dụng để điều trị bệnh tiểu đường tuýp 2 chủ yếu chia ba nhóm:

+ Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin

+ Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn

+ Nhóm ngăn ruột bớt hấp thu đường khi ăn bằng chất ức chế enzyme

α-glucosidase

Phương pháp ức chế enzyme α-glucosidase trong điều trị tiểu đường tuýp 2

được ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin cũng như kích thích sự sản sinh insulin… như các phương pháp khác

1.4.2 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Sơ lược về enzyme α-glucosidase

Enzyme α-glucosidase còn có tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D-

Trang 29

18

glucosidase, transglucosidase, glucopyranosidase, glucosidase hydrolase,

α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân) xúc tác phản ứng phân cắt các liên kết 1,4-alpha

Khi thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrat trong thức ăn được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme trong ruột non

Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid Enzyme α-glucosidase ở

màng ruột non lại tiếp tục phân hoá các oligosaccharit thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu Bằng cách ức chế hoạt động của enzyme

α-glucosidase có thể làm giảm sự thủy phân của carbohydrat và làm chậm sự thẩm

thấu glucose vào mạch máu

Tình hình nghiên cứu trên thế giới về các hợp chất thiên nhiên có tác dụng ức chế

-glucosidase

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các dược phẩm thiên nhiên có tác dụng ức chế men -glucosidase kết hợp với các thuốc khác trong điều trị tiểu đường sẽ làm tăng hiệu quả chữa trị đồng thời giảm đáng kể những tác dụng phụ

không mong muốn [5] Cây nấm múa Grifola frondosa từ lâu đã được sử dụng

trong y học cổ truyền Trung Quốc, Nhật Bản để chữa trị các bệnh miễn nhiễm, đường huyết, tim mạch Người ta đã phát hiện ra nó chứa thành phần polysaccharide (MMP) ức chế -glucosidase và có tác dụng hiệu quả trên bệnh nhân tiểu đường Bệnh nhân tiểu đường tuýp 2 sau khi uống 500 mg MMP 3 lần/ngày kết hợp với thuốc glibenclamide (2,5 mg/ngày) trong 10 ngày cho thấy lượng FBG giảm từ 13,8 mmol/l xuống còn 5,2 mmol/l đồng thời nồng độ HbA1c giảm từ 11,5% xuống 5,2% Khi rút liều glibenclamide xuống 1,25 mg thì chỉ số FBG luôn nằm trong khoảng 4,4-5,0 mM trong 2 tháng tiếp theo Con số này hầu như không đổi trong suốt 6 tháng tiếp theo Sau đó bệnh nhân không sử dụng glibenclamide và tiếp tục uống MMP trong 6 tháng tiếp thì chỉ số FBG và HbA1c vẫn dừng ở mức 5,0 mmol/l và 5,6% Một điểm đáng ghi nhận nữa là trong thời

Trang 30

19

gian điều trị bệnh nhân sút 7kg nhưng sức khỏe lại tăng lên rõ rệt Điều này cho thấy MMP tách từ nấm múa có tác dụng hỗ trợ, điều trị hiệu quả bệnh tiểu đường Gần đây loại nấm này còn được sử dụng để hỗ trợ và điều trị ung thư rất tốt [34] Cây mướp đắng cũng đã được biết đến là một dược liệu có tác dụng chữa tiểu đường rất công hiệu Ngoài tác dụng ức chế -glucosidase và -amylase, mướp đắng còn có khả năng làm tăng chỉ số nhạy insulin [16] Nhiều nghiên cứu khác trên thế giới đã tiến hành sàng lọc ra những thực vật có tác dụng ức chế -glucosidase Nhóm nghiên cứu ở trường ĐH Calabria-Italia đã đánh giá tác dụng chế -glucosidase và -amylase của chín mẫu dược liệu được sử dụng chữa tiểu

đường ở Li Băng Kết quả cho thấy dịch chiết metanol của hai loài Marrubium

radiatum và Salvia acetabulosa có tác dụng mạnh nhất Đối với dịch chiết

chloroform thì hai loài Calamintha origanifolia và Erythraea centaurium lại thể hiện hoạt tính ức chế mạnh hơn trong khi tác dụng của dịch chiết hexane của C

đã phân lập được 14 hợp chất khung cucurbitane glycoside từ quả Mướp đắng Kết quả thử hoạt tính ức chế -glucosidase từ các hợp chất này cho thấy, có 11 hợp

chất thể hiện hoạt tính ức chế -glucosidase từ yếu đến trung bình [40]

Trang 31

20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu quả mướp đắng được thu tại Thái Bình vào tháng 6 năm 2011 và được

TS Bùi Văn Thanh,Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học là M charantia L., quả mướp

đắng có màu xanh nhạt, gai tù và ít đắng Mẫu tiêu bản lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Mẫu M charantia L thu hái tại Thái Bình

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập các hợp chất

Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Trang 32

21

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G

F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm

và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau

đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp

Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và chất hấp phụ pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Chất hấp phụ pha đảo RP-18 (150 m, FuJisilisa Chemical Ltd.) Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem Ind Co., Ltd.)

2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS): được đo trên hệ Agilent 6530

Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, Đại học Yonsei, Hàn Quốc

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Bruker AVANCE 500, Viện Hoá học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan)

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC và HMBC

Trang 33

22

Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD3OD

Điểm nóng chảy (mp): Điểm nóng chảy được đo trên máy Thermo scientific

Mel-Temp 3.0 của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Độ quay cực: Độ quay cực đo trên máy Jasco P-2000 Polarimeter của Viện

Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

Sàng lọc sơ bộ tìm mẫu (chất) có hoạt tính

Bước 1: Mẫu thử được pha trong DMSO rồi pha loãng ở các nồng độ thích

hợp trong đệm phosphate (0,1 M, pH 6,9)

Bước 2: 50 µl mẫu thử được ủ với 100 µl dung dịch 0,5 µg/mL enzyme

α-glucosidase trong đệm phosphate (0,1 M, pH 6,9) ở nhiệt độ 37oC trong 10 phút

Bước 3: Thêm 50 µL dung dịch 5 mM pNPG trong đệm phosphate vào hỗn

hợp trên

Bước 4: Hỗn hợp phản ứng được ủ tiếp ở nhiệt độ 37oC trong 5 phút

Bước 5: Đo hỗn hợp trên bằng máy ELISA ở bước sóng 405 nm

Chất chuẩn dương (positive control) acarbose được dùng để kiểm soát độ

ổn định và đánh giá hoạt tính ức chế tương đương Các phép thử được lặp lại 3 lần

Kết quả được tính theo công thức sau:

OD - OD

) OD - (OD - ) OD - (OD

c + c

-b s -

c

Trong đó:

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử,

có α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%);

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và

α-glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%);

Trang 34

23

ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử;

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có

α-glucosidase)

Tìm nồng độ ức chế 50% (IC 50 ) của mẫu (chất) có hoạt tính:

Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng dựa trên 5 nồng độ thử nghiệm Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy phi tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 5.0

Trang 35

24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Phân lập các hợp chất

Quả mướp đắng được phơi khô, nghiền thành bột (5,0 kg), ngâm chiết với metanol ba lần, sau đó loại dung môi thu được 350 g cặn chiết metanol Cặn này

được hòa tan vào 3 lít nước cất và chiết lần lượt bằng n-hexan, clorofoc và etyl axetat Sau khi loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn n-hexan (100 g),

clorofoc (90 g), etyl axetat (75 g) và nước (85 g)

Cặn clorofoc (90 g) được hòa tan vào dung môi tối thiểu, sau đó tẩm vào 220g silica gel, cô đuổi dung môi cho đến khi thu được bột tơi, khô Tiến hành sắc

ký cột nhồi silica gel, sau đó rửa giải với hệ dung môi n-hexan/axeton với độ phân

cực tăng dần (từ 50:1 - 1:1, v/v) thu được 5 phân đoạn chính là CC1 (32,0 g), CC2 (13,5 g), CC3 (28,5 g), CC4 (7,8 g) và CC5 (8,2 g) Phân đoạn CC3 tiếp tục sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi clorofoc/metanol/nước (9:1:0,05, v/v/v) thu được

4 phân đoạn CC3A (4,5 g), CC3B (3,4 g), CC3C (5,0 g) và CC3D (4,7 g) Sau đó,

từ phân đoạn CC3A (4,5 g) tiếp tục sắc ký cột RP-18 với hệ dung môi axeton/nước

(8:3, v/v) thu được hợp chất MC4 (35 mg) Phân đoạn CC3B (3,4 g) được chạy sắc

ký cột sillica gel với clorofoc/axeton (4:1, v/v) thu được hợp chất MC3 (80 mg)

Phân đoạn CC3C (5,0 g) tiếp tục phân tách trên cột RP-18 với hệ dung môi

metanol/nước (4:1, v/v) thu được 2 hợp chất là MC6 (50 mg) và MC1 (37 mg)

Phân đoạn CC3D (4,7 g) được phân tách trên cột RP-18 với hệ dung môi

metanol/nước (1,5:1, v/v) thu được hợp chất MC5 (20 mg) Phân đoạn CC5 (8,2 g)

được phân tách trên cột silica gel với clorofoc/metanol/nước (5:1:0,1 v/v/v) thu được 3 phân đoạn CC5A (1,5 g), CC5B (2,5 g), CC5C (4,2 g) Sau đó, từ phân đoạn CC5B (4,2 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải

axeton/metanol/nước (2:1:1, v/vv) thu được hợp chất MC2 (12 mg) và hợp chất MC7 (35 mg)

Cặn etyl axetat được tẩm vào 150 g silica gel, cô đuổi dung môi cho đến khi thu được bột tơi, khô sau đó tiến hành phân lập bằng sắc ký cột nhồi silica, rửa giải bằng hệ dung môi clorofoc/metanol với độ phân cực tăng dần (từ 20:1 – 2:1, v/v)

Trang 36

25

thu được 5 phân đoạn chính là CE1 (20,0 g), CE2 (12,5 g), CE3 (8,5 g), CE4 (12,0 g) và CE5 (18,0 g) Phân đoạn CE2 (12,5 g) được tiếp tục phân lập bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là clorofoc/metanol/nước (6:1:0,05, v/v/v) thu được 4 phân đoạn CE2A (5,5 g), CE2B (1,4 g), CE2C (3,7 g) và CE2D (1,6 g) Từ phân đoạn CE2C (3,7 g) được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột pha đảo hệ dung

môi axeton/nước (1:1,5, v/v) thu được hợp chất MC9 (35 mg) Phân đoạn CE3 (8,5

g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải clorofoc/metanol (6/1, v/v) và cột silica gel pha đảo với hệ dung môi rửa giải là

axeton/nước (1:1, v/v) thu được hợp chất MC8 (15 mg)

3.2 Các thông số vật lí của các hợp chất đã phân lập được

Trang 37

= 6,5 Hz, H-21), 5,63 (1H, ddd J = 15,5; 8,5; 5,5 Hz, H-23), 5,41 (1H, d J = 15,5

Hz, H-24), 1,27 (3H, s, H-26), 1,27 (3H, s, H-27), 1,22 (3H, s, H-28), 0,93 (3H, s, H-29), 0,88 (3H, s, H-30), 3,46 (3H, s, 19-MeO), 3,17 (3H, s, 25-MeO), 4,80 (1H,

Trang 38

5,25 (1H, br d J = 10,0 Hz, H-24), 1,78 (3H, s, H-26), 1,81 (3H, s, H-27), 1,14

(3H, s, 28), 0,96 (3H, s, 29), 0,86 (3H, s, 30), 4,25 (1H, d J = 8,0 Hz, 1′), 4,75 (1H, d J = 8,0 Hz, H-1′′)

H-13C-NMR xem Bảng 9

Trang 39

28

Hình 2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ quả mươp đắng (M charantia L.)

Trang 40

647,4160 [M-H]- (tính toán lý thuyết cho công thức [C37H59O9]-, 647,4165) Phổ 1

H-NMR của MC1 xuất hiện tín hiệu của sáu nhóm metyl tại H 0,95 (3H, s, H-18), 1,27 (6H, s, H-26/H-27), 1,17 (3H, s, H-28), 0,90 (3H, s, H-29) và 0,93 (3H, s, H-30), một nhóm metyl bậc 2 tại H 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-21) đặc trưng cho khung

cucurbitane; ba proton nhóm metoxi tại H 3,17 (3H, s); hai proton olefin tại H 6,12

(1H, dd, J = 9,5; 2,0 Hz) và 5,60 (1H, dd, J = 9,5; 3,5 Hz) đặc trưng cho liên kết đôi

trong vòng B tại C-6/C-7; tín hiệu của hai proton tại H 5,63 (1H, ddd, J = 15,5; 9,0; 6,0 Hz) và 5,41 (1H, d, J = 15,5 Hz) đặc trưng cho liên kết đôi có cấu hình trans tại C-

23/C-24; một proton anome tại H 4,27 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′) Phổ 13C-NMR và các

phổ DEPT của MC1 xuất hiện tín hiệu của 37 cacbon trong đó có 30 cacbon đặc trưng

cho khung cucurbitane bao gồm 6 cacbon không liên kết với hydro tại C 39,70 (C-4), 86,31 (C-5), 48,48 (C-9), 46,22 (C-13), 48,65 (C-14), 76,49 (C-25); 10 cacbon metin tại C 86,98 (C-3), 134,12 (C-6), 132,58 (C-7), 42,61 (C-8), 42,69 (C-10), 51,32 (C-17), 105,98 (C-19), 37,44 (C-20), 130,01 (C-23), 137,64 (C-24), 7 cacbon metylen tại

C 19,24 (C-1), 27,88(C-2), 23,95 (C-11), 31,80 (C-12), 34,69 (C-15), 29,00 (C-16), 40,47 (C-22); 7 nhóm metyl tại C 15,16 (C-18), 19,24 (C-21), 26,20 (C-26), 26,49 (C-27), 20,55 (C-28), 25,63 (C-29), 20,20 (C-30); một nhóm metoxi tại 50,53 (25-MeO); cùng với sáu cacbon của đường glucopyranoside tại C 107,45 (C-1′), 75,37 (C-2′), 77,74 (C-3′), 71,81 (C-4′), 77,57 (C-5′), 62,87 (C-2′)

Định dạng
Số trang	91
Dung lượng	2,88 MB