Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)

Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

BÙI THỊ THÙY DƯƠNG

ĐÁNH GIÁ SỰ PHÂN BỐ VÀ NGUỒN GỐC TIẾN HÓA CỦA VIRUS GÂY BỆNH XOĂN CÁNH (DEFORMED WING VIRUS) TRÊN ONG MẬT VIỆT NAM

MỞ ĐẦU

Ong mật được biết đến là loài côn trùng có ích trong tự nhiên thông qua việc thụ phấn cho cây Có tới 52 trong tổng số 115 loại cây trồng trên thế giới phụ thuộc vào sự thụ phấn của ong bao gồm cây ăn quả và cây lấy hạt Không chỉ thụ phấn cho cây trồng, các sản phẩm từ ong còn đem lại nguồn lợi kinh tế lớn cho người nuôi ong Tuy nhiên ong mật thường b tấn c ng bởi nhi u t c nhân gây bệnh bao gồm virus vi huẩn nấm và sinh tr ng C c d liệu nghiên c u v bệnh ong nh ng năm g n đây cho thấy virus là một trong

nh ng nguyên nhân ch nh gây tổn thất cho người nu i ong làm giảm năng suất và chất lượng thậm chí có thể hủy diệt cả đàn ong Từ đ u thế kỉ 20 cho tới nay có 22 loại virus có bản chất RNA gây bệnh phổ biến trên ong mật được công bố trong đó Deformed wing virus (DWV) DWV được phân lập

l n đ u tiên vào nh ng năm 1980 tại Nhật Bản và hiện tại đã lan rộng trên toàn thế giới DWV gây bệnh trên ong trưởng thành với nh ng dấu hiệu quăn

c nh chướng bụng, làm ong không có khả năng bay đi iếm mật; khi nhiễm trên ấu trùng làm chết ấu trùng, hậu quả gây thiệt hại lớn cho người nuôi ong

Việt Nam hiện đ ng th sáu v xuất khẩu mật ong trên thế giới và th hai ở châu Á với kim ngạch g n 80 triệu USD/năm Tuy nhiên ngành nu i ong của nước ta đang phải đối mặt với nhi u hó hăn đặc biệt là tình hình bệnh d ch do virus Vì vậy x c đ nh được sự có mặt và phạm vi phân bố cũng như nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh trên c c đàn ong mật ở Việt Nam

sẽ giúp các nhà nghiên c u và người nu i ong có cơ sở để dự phòng đi u tr hiệu quả bệnh và chủ động nguồn giống sạch bệnh nhằm đem lại lợi ích cao nhất cho người nuôi ong Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi thực hiện đ tài

“Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn

cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam”

Đ tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật phân tử, Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về các loài ong mật

Ong mật thuộc ngành chân đốt (Arthropoda) hay lớp 6 chân (Hecxapoda); phân ngành có ống h (Tracheata)

Lớp c n tr ng (Insecta)

Bộ c nh màng (Hymenoptera)

Họ ong mật (Aptsdae)

Giống ong mật (Apis)

Các loài ong cho mật:

+ Ong châu Âu (ong ngoại): Apis mellifera (A.mellifera)

+ Ong nội đ a (ong châu Á): Apis cerana (A.cerana)

+ Ong Khoái (ong gác kèo): Apis dorsata (A.dorsata)

+ Ong Hoa (ong muỗi): Apisflorea (A.florea)

Trong mỗi loài lại phân chia thành c c phân loại h c nhau như: Đối với

ong châu Âu (A.mellifera) có các phân loài: Ong ý, ong Trung - Nga, ong Cacpat ong Crain ong v ng Capcazơ Đối với ong A.cerana có: A.cerana

cerana, A.cerana indica, A.cerana japonica Mỗi phân loài đó lại có nhi u

dạng sinh th i - sinh học hình thành từ lâu đời dưới t c động của c c yếu tố ngoại cảnh h c nhau và c c đặc điểm th ch nghi với đi u iện sống h c nhau Đi u này dẫn đến c c đặc điểm có nghĩa inh tế đối với con người cũng h c nhau và có nghĩa rất to lớn trong c ng t c giống ong vì chúng bảo vệ và duy trì được t nh đa dạng sinh học th ng qua c c hệ gen qu hiếm tồn tại trong tự nhiên

Việt Nam hiện tồn tại 6 loài ong mật có ngòi đốt trong đó có loài bản đ a:

ong nội (A cerana); ong khoái (A.dorsata); ong đ (A laboriosa); ong ruồi đen (A andreniformic); ong ruồi đỏ (A florea) và ong ngoại (A mellifera)

Trong đó ong nội và ong ngoại là hai loài ong được nu i rộng rãi nhất trong sản xuất của ngành ong Việt Nam Ngoài ra trong tự nhiên còn gặp 6 loài ong mật h ng ngòi đốt (Stingless bees) tuy vậy c c loài này t có gi tr inh tế

Ong nội (Apis cerana)

Hình 1.1 Ong nội Apis cerana

Ong nội A.cerana là giống ong bản đ a ở Việt Nam, Trung Quốc và một

số nước khác Ở nước ta, ong nội phân bố rộng khắp cả nước ngoại trừ rừng tràm U Minh Ong nội có đặc t nh chăm chỉ, ch u được đi n kiện sống bất lợi,

ít d ch bệnh, chất lượng mật cao, tuy nhiên năng suất mật thấp, hung d , dễ bốc bay và chia đàn Ong nội thích nghi tốt với nguồn hoa rải rác, có thể nuôi

ở các quy mô từ hộ gia đình tới nuôi chuyên nghiệp nhưng nó th ch hợp hơn với kiểu nuôi ong quy mô nhỏ trong gia đình và cung cấp sản phẩm phục vụ tiêu d ng trong nước Để phát triển ong nội, c n chọn c c đàn có t nh tụ đàn cao, chọn giống ong tốt và quan tâm tới phòng bệnh để nâng cao năng suất mật

Ong ngoại (Apis mellifera)

Hình 1.2 ong ngoại Apis mellifera

Ong ngoại A.mellifera có nguồn gốc từ châu Âu châu Phi được nhập vào

nước ta từ nh ng năm 60 với hình th c thương mại và đã th ch nghi tốt với

đi u iện ở h hậu và nguồn hoa ở nước ta Loài ong này ph t triển tốt ở

nh ng nơi có nguồn hoa tập trung th ch hợp với iểu nu i ong chuyên nghiệp với trình độ chuyên m n hóa cao vốn đ u tư lớn Ong ngoại có ch thước lớn hơn ong nội hả năng tụ đàn và dự tr mật cao hơn mật ong ngoại chủ yếu để xuất hẩu Nhưng ong ngoại có s c ch u đựng ém nên ở nh ng nơi có nguồn hoa rải r c và đi u iện hắc nghiệt thì việc nu i ong ngoại là h ng thể Bên cạnh nh ng gi tr inh tế mà ong ngoại đem lại thì việc nhập ong

A.mellifera cũng mang theo c c loài sinh và bệnh như bệnh thối ấu tr ng

châu Âu bệnh ấu tr ng túi bệnh bào tử tr ng Nosema cho c c loài ong bản

1.2 Lợi ích của ong mật

1.2.1 Ong mật đối với ngành nông lâm nghiệp

Ong mật có vai trò quan trọng trong sản xuất n ng nghiệp trên toàn c u Mỗi năm có tới 52 trong 115 loại cây trồng trên thế giới phụ thuộc vào sự thụ phấn của ong bao gồm cả cây ăn quả và cây lấy hạt C c mặt hàng phụ thuộc vào ong sẽ giảm tới 90% nếu như h ng có ong mật Thêm vào đó sản lượng chất lượng ch cỡ quả cũng sẽ giảm từ 90-40% trong 16 mặt hàng thương mại Có tới 22 6% tổng số cây n ng nghiệp ở c c nước đang ph t triển và

14 7% ở c c nước ph t triển phụ thuộc vào sự thụ phấn của động vật Có tới 35% lượng thực phẩm trong chế độ ăn của người có nguồn gốc từ sự thụ phấn Ước t nh gi tr của c c loài c n tr ng thụ phấn đem lại cho con người hoảng 212 tỉ USD chiếm 9.5 % tổng giá tr c c sản phẩm n ng nghiệp [38] Ong mật h ng phải là loài c n tr ng thụ phấn duy nhất cũng h ng phải hiệu quả thụ phấn trên tất cả c c loại cây trồng Tuy nhiên ong vẫn là loại c n

tr ng thụ phấn quan trọng nhất đối với c c loài cây trồng trên thế giới [28] Ong có thể được nu i nhân tạo với c c loại đường và c c loại protein Chúng

có thể được gi trong c c th ng nu i an toàn để có thể vận chuyển đi c c hoảng c ch xa để thụ phấn Đặc t nh sinh học của ong mật cũng rất ph hợp cho việc thụ phấn thương mại Chúng có thể di chuyển với hoảng c ch 4.5

m quanh tổ và ghé thăm nh ng loại hoa h ng th ch hợp cho việc thụ phấn Ong mật có thể thụ phấn cho diện t ch 6360 hecta tổ ong đặt gi a trung tâm của vườn sẽ h ng làm ảnh hưởng tới c c v ng h c Một con ong có thể b o cho đồng loại biết v tr của hoa ở đâu để c c con ong h c éo tới Đi u này làm cho ong mật là một loài thụ phấn hiệu quả [36]

1.2.2 Lợi ích từ các sản phẩm của ong mật

Ong mật h ng nh ng là loài c n tr ng có ch giúp thụ phấn cho cây trồng mà còn đem lại nhi u gi tr inh tế cho người nu i ong Nuôi ong

h ng tốn đất trồng cây như c c loại hình chăn nu i h c h ng c n vốn đ u

tư lớn Ngh nu i ong ch th ch trồng cây gây rừng cây ăn quả

C c sản phẩm từ ong bao gồm:

- Mật ong : đây là sản phẩm ch nh của ong chủ yếu là đường đơn gluco

và fructose Trong mật còn có nhi u vitamin nhóm B (B1, B2, B3) và vitamin C Vitamin E và một lượng lớn Kali 1 g mật ong ch a 3150-

3350 cal d ng để bồi bổ và ch a bệnh

- Phấn hoa: là sản phẩm giàu chất dinh dưỡng được thu lượm từ nh của nhi u loài hoa h c nhau Có nhi u màu sắc h c nhau (vàng vàng

x m đỏ nhạt ) Phấn hoa ch a 7-35% protein trong đó có 10% là

c c amino acid tự do D ng để bồi bổ cơ thể ch a bệnh

- S a chúa: Là nguồn dinh dưỡng cao cấp sản phẩm đặc biệt của ong Đây là nguồn dinh dưỡng duy nhất để nu i chúa và ấu tr ng ong chúa

do ong thợ non tiết ra Thành ph n dinh dưỡng của s a chúa bao gồm: protein 18% mỡ 6 46% c c vitamin chất h 39 9% tro 0 82% S a chúa ch th ch qu trình trao đổi lipit và protein giúp cho cơ thể hỏe mạnh và hoạt b t S a chúa giàu hoocmon sinh dục và vitamin E, có

t c dụng ch th ch hoạt động sinh l t i tạo tế bào chống sự già cỗi của c c tổ ch c tế bào

- S p ong: Là vật tư chủ yếu để làm n n b nh tổ cho ong Ngoài ra s p ong còn d ng trong c c ngành c ng nghiệp dệt y tế hàng h ng

- Keo ong: Ong d ng eo để v t n he hở gi a c c c u ong xung quanh th ng để chúng đi u hòa nhiệt độ trong th ng ong cho ph hợp Keo ong có t nh s t huẩn và diệt huẩn cao nên dân gian và ngành y

tế d ng để làm thuốc chống viêm nhiễm làm lành vết thương [3]

1 3 Tình hình nuôi ong và xuất khẩu mật ong trên thế giới và Việt Nam

1.3 1 Tình hình nuôi ong và xuất khẩu mật ong trên thế giới

Theo thống ê của Tổ ch c n ng lượng thực thế giới T nh tới thời điểm

c ng bố tổng số đàn ong trên thế giới hoảng 72.6 triệu đàn cho tới năm 2007 tăng 64% so với năm 1961 Tuy nhiên tỉ lệ số đàn ong tăng giảm h c nhau trên toàn c u Số lượng đàn ong mật tại Mỹ giảm tới 61% từ 5.9 triệu đàn ong trong năm 1947 xuống còn 2.3 triệu đàn trong năm 2008 trong đó Bắc Mĩ giảm tới 49 5% Trong hi tại châu Âu số lượng đàn ong giảm 26.5% Riêng tại Anh 20% đàn ong biến mất trong năm 2008 Năm 1970 số lượng đàn ong

là 21 triệu đàn giảm xuống còn 15.5 triệu đàn t nh tới năm 2007 Trong hi

c c nước châu Á tăng (426%) châu Phi tăng (130%) Nam Mĩ (86%), và Châu Đại Dương (39%)

V sản lượng mật ong theo số liệu thống ê năm 2005 của Hiệp hội nu i ong quốc tế (APIMONDIA) sản lượng mật ong thế giới hoảng 1 2 triệu tấn Trung Quốc là nước có sản lượng mật ong lớn nhất ( hoảng 180.000 tấn) và cũng là nước xuất hẩu lớn nhất Argentina (90.000 tấn) Gi tr toàn c u năm

2007 ước t nh đạt 1 25 tỉ USD Cũng theo báo cáo th trường mật ong của Hội đồng quốc gia Mỹ ngày 24/01/2014: Năm 2013 Mỹ nhập hẩu 142.925.543

g mật ong với gi tr 455.511.802 USD C c nước xuất hẩu mật ong chủ yếu vào Mỹ là Argentina Việt Nam Ấn Độ Uruguay Canada và Brazin (Bảng 1.1) V hối lượng mật ong nhập hẩu vào Mỹ đ ng th nhất là Argentina 41.581.668 g đ ng th 2 là Việt nam 30.501.060 g th ba là Ấn

Độ 24.852.692 g tiếp theo là c c nước Uruguay Brazin và Canada Gi tr xuất hẩu đ ng đ u là Argentina đạt gi tr 136.501.855 USD đ ng th 2 là Việt Nam 75.668.847 USD tiếp đến là Ấn Độ Canada Brazin và Uruguay

Gi mật ong bình quân/ g cao nhất là Canada đạt 4 61 USD c c nước h c 3.99 tiếp đến Brazin 3.31 Argentina 3.28 và thấp nhất là Việt Nam 2.48 USD/kg

Bảng 1.1 Tình hình nhập khẩu mật ong vào Mỹ năm 2013

TT Nước Khối lượng mật(kg) Giá trị (USD) Giá bq/kg

1.3.2 Tình hình nuôi ong và xuất khẩu mật ong tại Việt Nam

Trong nh ng năm g n đây ngh nu i ong tại Việt Nam có sự ph t triển nhanh cả v số lượng đàn và sản lượng mật ong thu được số lượng mật xuất hẩu cũng tăng mạnh nhờ ch nh s ch của nhà nước v đ u tư cho c ng t c nghiên c u huyến n ng ong và mở rộng th trường xuất hẩu c c sản phẩm ong Năm 1994 cả nước có hoảng 40.000 đàn ong năm 2001 là 270.000 đàn Tổng số đàn ong của Việt Nam năm 2006 vào hoảng 678.987 đàn tăng hơn 2 l n so với năm 2000 (273.872 đàn) Theo th ng tin từ Hội Nu i ong

Việt Nam ước tính tới nay nước ta có trên 1 5 triệu đàn ong trong đó

350.000 đàn ong nội chiếm (23 33%) 1.150.000 đàn ong ngoại chiếm

76 67% Số người nu i ong hoảng 34 nghìn người trong đó số người nu i ong chuyên nghiệp hoảng 6.350 người chiếm 18 67% Tuy nhiên số lượng đàn ong còn t so với ti m năng cây nguồn mật ở c c v ng sinh th i của Việt Nam (theo t nh to n l thuyết mới chỉ hai th c được 35-45% tr lượng mật

và phấn) năng suất mật của đàn ong còn thấp chất lượng mật chưa cao nên

gi b n còn thấp

Tốc độ tăng trưởng trong giai đoạn 2001-2006 đạt bình quân 26% Số người nu i ong đến năm 2005 là 2 2 vạn người Th trường mật ong trong

nước cũng đang tăng nhanh Trong 3 năm g n đây m c tiêu thụ đã tăng trung bình hoảng 8-10% Năm 2002 mật ong của Việt nam có dư lượng thuốc

h ng sinh đặc biệt là Chloramphenicol trong một số l hàng xuất sang th trường châu Âu làm ảnh hưởng tới uy t n của ngành ong và gây hậu quả to lớn đối với ngành chăn nu i ong Do nh ng yêu c u nghiêm ngặt của c c nước nhập hẩu đặc biệt là th trường châu Âu trong nh ng năm g n đây người nu i ong đã có th c trong việc đảm bảo chất lượng sản phẩm và p dụng nh ng biện ph p ỹ thuật mới trong chăn nu i và phòng tr bệnh nên sản lượng mật tăng lên c ng với chất lượng sản phẩm cũng được cải thiện

Tình hình xuất khẩu mật ong của Việt Nam trong những năm gần đây

Việt Nam hiện đang đ ng th 2 v xuất khẩu ong mật tại Châu Á và đ ng

th 6 trên thế giới Năm 2011 sản lượng mật ong cả nước là 30.000 tấn, trong

đó 27.000 tấn được xuất khẩu sang nước ngoài Năm 2012 doanh thu xuất khẩu mật ong Việt Nam đạt 58 triệu USD – chiếm 3,1% th ph n xuất khẩu mật ong thế giới Trong đó Mỹ là th trường nhập khẩu lớn nhất, chiếm đến 95% sản lượng mật ong Việt Nam bán ra thế giới

Đến 2013, sản lượng mật ong của cả nước là 48.000 tấn trong đó 37.000 tấn được xuất khẩu Đặc biệt 2013 là năm đ u tiên Việt Nam xuất khẩu mật ong vượt mốc 30.000 tấn vào Mỹ đạt kim ngạch 75.66 triệu USD Với lượng mật xuất sang Trung Đ ng Nhật bản, EU và một số nước châu Á khác chúng

ta xuất khoảng 34.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 85 triệu USD, đây là một bước tiến nhảy vọt của ngành nu i ong Tuy nhiên lượng mật ong xuất khẩu năm 2013 gồm có vài nghìn tấn từ năm 2012 chưa xuất được Mặt khác với giá xuất khẩu 2,48 USD/kg mật là giá quá thấp so với giá bình quân xuất khẩu vào Mỹ là 3,31 USD và nhi u nước khác

Năm 2014 im ngạch xuất khẩu mật ong của Việt Nam đạt 120 triệu USD Trong quý I/2015, chỉ tính riêng th trường châu Âu, các doanh nghiệp Việt Nam đã xuất đuợc trên 80 tấn mật ong

1.3.3 Những thách thức với thị trường xuất khẩu mật ong

Trong năm 2007 th trường Đ ng Âu b mất m a mật ong vì vậy nhu c u mật ong của châu Âu vượt qu hả năng cung cấp của thế giới Gi mật ong đạt trên 1USD/pound cho cả mật đã đóng chai và nguyên liệu Mối quan tâm

v mật ong của th trường châu Âu chủ yếu là chất lượng [34] Mật ong Mỹ hiện thể hiện ưu thế vì l do là chất lượng cao và gi cả thấp hơn so với mật ong Nam Mỹ Ngành thương mại mật ong thế giới đang đ ng trước nh ng

th ch th c đòi hỏi c c nước phải đ p ng được nh ng yêu c u của h ch hàng của c c nhà nhập hẩu v c c tiêu chuẩn và ph p chế [7] C c th trường quan trọng như châu Âu và châu Mỹ đang đòi hỏi c c tiêu chuẩn cao hơn v sản xuất quản l đảm bảo chất lượng và c c phương ph p iểm so t chất lượng C c chất tồn dư h ng sinh và c c loại dược phẩm h c còn lại trong mật ong được ch ng minh là nh ng rủi ro chủ yếu trong thương mại mật ong thế giới Trong năm 2012 một số l hàng mật ong nhập hẩu vào Mỹ

từ 4-5 nhà xuất hẩu ch nh của Ấn Độ được tìm thấy có dư lượng chloramphenicol h ng sinh thường được tìm thấy trong mật ong Trung Quốc một thập ỷ trước và dẫn đến việc tự động thu gi mật ong Trung Quốc FDA đã ph t hiện c c l hàng mật ong h c của Ấn Độ Malaysia và New Zealand có pha trộn với xi ro ng hoặc mật m a C c l hàng mật ong và mật ong pha trộn xi-r từ Th i Lan và Hong Kong được iểm tra là dương t nh với

dư lượng h ng sinh Cảnh b o nhập hẩu của FDA được ph t hành vào

th ng 12 năm 2012 và th ng 2 năm 2013 Việc sử dụng h ng sinh và thuốc bảo vệ thực vật đang trở nên phổ biến tại nhi u hu vực của thế giới đặc biệt

là ở nước đang ph t triển Đây được xem là một trong c c nguyên nhân ch nh làm cho mật ong tại c c nước này hó cạnh tranh và xuất hẩu sang c c th trường châu Âu Mỹ

1.4 Các nguyên nhân gây suy giảm số lƣợng ong mật

Có nhi u yếu tố có thể giải th ch cho sự sụt giảm số lượng đàn ong mật trên thế giới Giống như c c động vật h c ong mật cũng dễ dàng mắc một số bệnh và b nhi u động vật h c tấn c ng Bệnh tật đại d ch nếu ở m c độ nhẹ thì làm cho đàn ong suy yếu giảm số quân giảm năng suất mật còn nếu ở

m c độ nặng thì làm cho đàn ong b chết hoặc bỏ tổ, bốc bay gây thiệt hại inh tế rất lớn C c nguyên nhân gây bệnh thường xảy ra đồng thời Ph t hiện

và phòng trừ p thời nh ng bệnh trên ong là một trong nh ng yếu tố quyết

đ nh hiệu quả inh tế của ngành nu i ong

1.4 1 Một số bệnh do các tác nhân không phải virus

Ngoài virus ong mật thường b một số bệnh như: thối ấu trùng châu Mỹ (do

Paenibacillus alvei gây ra), thối ấu trùng châu Âu (Melisococcus pluton), bệnh do Nosema và bệnh nhiễm trùng máu ở ong trưởng thành, một số bệnh do ve ký sinh

(chí lớn, chí nhỏ)

Bệnh thối ấu trùng Châu Âu (European foulbrood)

Bệnh thối ấu tr ng Châu Âu do vi huẩn Mellisococcus pluton (M pluton) gây ra M Pluton hình c u hai đ u hơi éo dài như mũi gi o bắt màu Gram

dương và có ch thước hoảng 0.5-0,7 х 1 μm Vi huẩn h ng có hả năng sinh nha bào chúng thường đ ng đơn lẻ thành cặp hoặc tạo thành chuỗi dài [37] Khi bệnh xảy ra thường thấy sự có mặt một số vi khuẩn như

Paenibacillus alvei và Brevibacillus laterosporus Tuy nhiên người ta mới

chỉ x c đ nh được M pluton là tác nhân chính còn các vi khuẩn khác chỉ là nguyên nhân th phát [35] M pluton chiếm đoạt th c ăn của ấu trùng, nên

nhu c u ăn của ấu tr ng tăng cao buộc ong nu i dưỡng phải cho ấu tr ng ăn

nhi u l n Đây cũng là nguyên nhân làm lây lan M pluton trong đàn ong

Trước hi bước vào vụ mật, số lượng ấu tr ng có trong đàn tăng lên nhanh, nhưng lượng ong nu i dưỡng h ng đủ nên ấu trùng b đói bệnh dễ bùng

phát và biểu hiện rõ M pluton có khả năng tồn tại trên c u ong khoảng 1

năm và hi gặp đi u kiện thuận lợi nó lại tiếp tục gây bệnh cho đàn ong [12]

Bệnh thối ấu trùng châu Mỹ (TATCM)

Bệnh thối ấu tr ng châu Mỹ còn gọi là bệnh thối ấu tr ng c t nh do vi

huẩn Paenibacillus larvae (P lavae) gây ra vi huẩn có hả năng sinh nha bào P larvae là tên gọi được phân loại lại từ tên ban đ u là Bacillus larvae

P larvae có ch thước 2 5- 5 μm x 0,5-0,8 μm Nha bào có ch thước 1 3 μm

x 0.6 μm [37] P larvae gây bệnh ở tất cả c c giai đoạn của ấu tr ng ong nhưng

ấu tr ng non mẫn cảm với P larvae hơn c c ấu tr ng già Mỗi ấu tr ng

nhiễm bệnh sau hi chết ch a hoảng 2 5 tỷ nha bào Nha bào có hả năng nảy m m sau nhi u năm tồn tr Nha bào có s c chống ch u với m i trường nhiệt độ cao và cả tia UV Nó vẫn có hả năng sống sót hi b xử l bằng formaldehyde 10% trong 5 giờ

Ấu tr ng b nhiễm P larvae từ nguồn th c ăn th ng qua ong nu i dưỡng

hoặc từ ong thợ mang nha bào hi làm vệ sinh tổ [17] Sau hoảng 1 ngày ấu

tr ng ăn phải nha bào nha bào nảy m m trong ruột gi a của ấu tr ng và nhân lên với tốc độ rất nhanh di chuyển từ ruột ra hắp c c m Sự sinh s i nảy nở của vi huẩn gây bệnh nhanh đến m c ấu tr ng b chết trong vòng vài ngày thường là sau hi lỗ tổ đã được v t nắp làm cho c c c u nhộng h ng đồng

đ u màu b sậm lại trên mặt c u nhộng xuất hiện nh ng ấu tr ng b bệnh nắp v t b lõm xuống h ng bình thường

Ấu trùng b bệnh chủ yếu là ấu trùng 5-6 ngày tuổi song cũng có trường hợp b nhiễm ở tuổi lớn hơn Bệnh có 2 dạng ẩn và rõ: Dạng ẩn là khi ấu trùng mắc bệnh chưa rõ triệu ch ng lâm sàng chưa phân biệt được ấu trùng lành và ấu trùng bệnh Dạng rõ là khi ấu tr ng đã b nhiễm một lượng vi khuẩn đủ gây bệnh; nếu b nhẹ ấu trùng vẫn sinh trưởng cho đến khi thành nhộng mới chết; nếu b nặng ấu trùng chết ở dạng còn nhỏ có khi còn ở dạng vành khuyên

Ấu trùng b bệnh sẽ đổi màu: từ màu sáng chuyển hơi đục, không còn nếp nhăn B mặt da từ trắng xám chuyển nâu xám rồi nâu sẫm, b rách, khối sinh chất d nh như hồ và kéo nhằng ra Ấu trùng chết nằm dọc theo chi u sâu của

lỗ tổ, dùng panh gắp ấu trùng thì khối sinh chất kéo dài thành sợi Trong lỗ tổ khối sinh chất thành vẩy b m vào thành và đ y lỗ tổ rất chặt, ong rất khó làm

vệ sinh Nếu không phá lỗ tổ khó làm sạch các vẩy này

Ấu trùng b bệnh lúc đ u không mùi, khi ấu tr ng đã chết thành màu sẫm

có mùi keo da trâu (hoặc móng trâu) Nắp vít có màu tối do đ u ấu trùng khi chết xẹp lại và kéo nắp xuống làm cho nắp thủng thành lỗ nhỏ Khi b bệnh nhẹ ong làm vệ sinh thay ấu tr ng đi để lại nh ng lỗ trống xen kẽ trên bánh

tổ Khi b nặng sinh chất trong lỗ tổ khô quánh, ong không thể dọn sạch và đàn ong c tiếp tục b bệnh h ng có ong non ra đời, d n d n đàn ong b tiêu diệt

Bệnh ấu trùng vôi (Chalkbrood)

Bệnh ấu tr ng v i ở ong mật gây ra bởi nấm Ascosphaera apis (A.apis)

Nha bào nấm có dạng quả màu xanh nâu thẫm Cấu tạo của một nang nha bào ( ch thước hoảng 47 – 140 µm) gồm nhi u bóng nha bào (9- 19µm), trên mỗi bóng lại có rất nhi u nha bào nấm có ch thước 3.0 – 4.0 × 1.4 – 2.0µm Bệnh được tìm thấy ở châu Âu Scandinavia ở Nga New Zealand Mỹ Canada Argentina Nhật Bản Philippines Trung Mỹ và Mexico [24] Ấu

trùng nhiễm nha bào A apis từ th c ăn Nha bào nảy m m trong lumen của

ruột ấu tr ng đặc biệt là ở vùng cuối cơ thể ấu trùng Hệ sợi nấm sau đó ph hủy thành ruột và thậm chí phá vỡ cả ph n cuối cơ thể ấu trùng, ph n đ u của

ấu trùng ít b ảnh hưởng Sau đó chúng bắt đ u phát triển bên ngoài ấu trùng Bệnh thường xảy ra trên ấu tr ng ong thợ và ong đực Ấu tr ng chết sau

hi đã được v t nắp hoảng 2 ngày Trên c c c u nhộng xuất hiện lỗ thủng trên nắp v t của ấu tr ng Khi chưa được v t nắp nh ng ấu tr ng chết lúc đ u

được phủ một lớp phấn trắng căng phồng như bọt biển và chiếm hết lỗ tổ

Sau đó chúng trở nên c ng h và có hình dạng giống như x c ướp Thường

nh ng x c ấu tr ng chết vẫn gi nguyên màu trắng nếu chúng chỉ b một chủng nấm sinh nhưng nếu có hai chủng nấm sinh thì chúng sẽ chuyển sang màu x m và đen Ở giai đoạn này ấu tr ng bệnh sẽ được ong loại bỏ ra ngoài

Bệnh do kí sinh trùng Nosema

Nosema apis là loài động vật nguyên sinh (đơn bào) gây ỉa chảy cho ong

trưởng thành nên bệnh này còn được gọi là bệnh ỉa chảy [26] Nha bào Nosema apis có hình oval lớn ch thước 4-6 x 2.4µm và chúng chỉ ph t triển trong tế bào biểu m hệ tiêu hóa của ong trưởng thành

Bệnh gây hại phổ biến trên c c đàn ong nu i ở nhi u nước trên thế giới

cả c c nước n đới và ở c c nước nhiệt đới Ong mật ở c c nước n đới thường nhiễm bệnh Nosema hi c c đàn ong vào vụ đ ng h ng có nguồn hoa tự nhiên Ngược lại ở c c nước nhiệt đới có h hậu nóng và nguồn hoa quanh năm bệnh Nosema xuất hiện thường xuyên hơn vào tất cả c c th ng trong năm

Varroa dectructor (Chí lớn)

Thuộc họ Varrodiac có nguồn gốc từ ong Châu Á Apis cerana nhưng t

gây t c động cho loại ong này Ve sinh trên nhộng ong đực rất t thấy sinh trên nhộng ong thợ Do vòng đời ong thợ ngắn ấu tr ng ong thợ chỉ nằm trong lỗ tổ v t nắp 11 ngày mặt h c do ong thợ có tập t nh tự dọn vệ sinh cho nhau cắn và tiêu diệt ve Khi nhộng ong đực b ve sinh nhi u thì đàn ong

A cerana bỏ tổ bốc bay để lại c c ấu tr ng có sinh nên nguồn bệnh còn rất

t Khi đàn ong b nhiễm ch và đặc biệt nhộng b nhiễm ch thì đàn ong trưởng thành nở ra b c c loại huyết tật như: thân hình nhỏ què chân xoăn

c nh Có hoảng 80 – 100% tỷ lệ trại ong b nhiễm ch lớn Ong Châu Á có

hả năng loại bỏ ve sinh tốt hơn ong A mellifera C c đàn ong h ng được

đi u tr ve sinh Varroa thường b chết trong vòng từ 1 – 3 năm

đi u tra ngành ong 2010 đi u tra tình hình nhiễm ch nhỏ tại một số tỉnh chăn nu i ong ph t triển 95 – 100% trại ong b nhiễm ch nhỏ [4]

1.4.2 Bệnh do virus gây ra

Virus gây bệnh trên ong l n đ u được x c đ nh vào thế kỉ 20, là một trong

nh ng tác nhân làm giảm năng suất và chất lượng đàn ong, thậm chí có thể hủy diệt cả đàn ong Virus gây thối ấu trùng là virus đ u tiên được nhà khoa học người Mỹ phát hiện gây bệnh trên ong mật Kể từ đó 22 loại virus gây bệnh trên ong l n lượt được phát hiện Trong 3 thập kỉ qua nh ng nghiên c u

v virus gây bệnh trên ong ngày càng được mở rộng đem đến cho người nuôi ong nhi u lợi ích trong việc nhận biết bệnh từ nh ng triệu ch ng từ đó có biện pháp phòng trừ hiệu quả

Virus là ký sinh trùng nội bào bắt buộc, chỉ có thể nhân lên trong tế bào vật chủ sống, sử dụng m y móc trao đổi chất của tế bào chủ Virus gây bệnh trên ong mật thường xâm nhập vào vật chủ th ng qua đường tiêu hóa trong

th c ăn hoặc chấn thương trên b mặt cơ thể, mặc d chúng cũng có thể trực tiếp đi vào tu n hoàn máu qua vết cắn của ve varroa hoặc c n tr ng h c Để tồn tại, virus phải có c ch để xâm nhập vào vật chủ và được truy n từ một vật chủ khác Virus có thể tấn công ở c c giai đoạn phát triển khác nhau của ong

mật, bao gồm tr ng, ấu trùng, nhộng, ong thợ trưởng thành và ong chúa Số lượng cá thể trong đàn lớn và tỷ lệ tiếp xúc cao gi a các thành viên tạo đi u kiện thuận lợi m i trường l tưởng cho việc truy n các tác nhân gây bệnh Virus được lây truy n theo chi u ngang (gi a nh ng con ong, thông qua thực phẩm b nhiễm khuẩn /phân hoặc bởi sâu bệnh, chủ yếu ve varroa), hoặc theo chi u dọc (chuyển từ ong chúa cho con cái) Mặc d virus thường tồn tại trong ong một cách ti m ẩn và không giết chết ong ngay cũng h ng làm xuất hiện lập t c dấu hiệu của bệnh Tuy nhiên trong nh ng đi u kiện nhất đ nh chúng có thể ảnh hưởng đ ng ể s c khỏe con ong mật và rút ngắn cuộc sống của nh ng con ong b nhiễm bệnh Trên thực tế, virus chọn con đường truy n thích hợp dựa trên c c đi u kiện phát triển, sinh lý, sinh thái và d ch tễ học Khi c c đàn ong đang trong tình trạng không cạnh tranh và khỏe mạnh, virus

có thể tồn tại ti m ẩn trong đàn ong qua truy n thẳng đ ng Tuy nhiên, trong

đi u kiện có biến động, chẳng hạn như sự xâm nhập của bọ ve varroa đồng

nhiễm tác nhân gây bệnh h c như N apis, hoặc sự suy giảm trong nguồn

cung cấp thực phẩm, virus chuyển sang truy n ngang và bắt đ u nhân rộng Ngoài ra các yếu tố m i trường h c như nhiệt độ lạnh và đi u kiện bay không thuận lợi trong thời gian dài làm tất cả nh ng con ong ở lại trong tổ ong có thể dẫn đến lắng đọng phân làm virus nhân lên trong c c con ong Đây

có thể là một nguyên nhân chính gây lây lan nhanh chóng của bệnh trong cộng đồng và có thể làm chết toàn bộ đàn ong

C c ết quả nghiên c u g n đây cho thấy virus là nguyên nhân chủ yếu lây nhiễm và gây chết ong t nhất có 22 loại virus h c nhau đã được ph t hiện trên ong [8 12] tuy nhiên h u hết c c bệnh ở ong đ u do 6 loại virus

ch nh sau đây gây nên bao gồm: Sacbrood virus (SBV), Deformed wing virus (DWV), Acute bee paralysis virus (ABPV), Black queen cell virus (BQCV),

Chronic bee paralysis virus (CBPV), và Kashmir bee virus (KBV) [14]

Trong đó SBV là virus có sự phân bố rộng nhất [16] và cũng là virus gây bệnh trên ong nhi u nhất được ph t hiện trên thế giới [8 19]

Acute bee paralysis virus (ABPV)

Đây là loại virus gây bệnh trên ong được tìm thấy phổ biến rộng rãi ở h u hết c c quốc gia trong liên minh châu Âu và 1 số nước h c như Nam Tư Mĩ [15, 20] ABPV ảnh hưởng đến ong trưởng thành hỏe mạnh gây run và tê liệt trong vòng vài ngày sau khi b nhiễm bệnh và thường đồng nhiễm với ve Varroa Một mặt loài ve này là vật trung gian lây nhiễm virus cho ong, mặt

h c nó làm cho ong suy yếu và dễ nhiễm c c loại virus ABPV chưa bao giờ được phát hiện ở ong trưởng thành đã chết hoặc ấu trùng bằng phương ph p miễn d ch [9] Phương ph p tối ưu được sử dụng để phát hiện virus này là kỹ thuật sinh học phân tử [13] ABPV ban đ u được phát hiện trong phòng thí nghiệm khi các nhà khoa học nghiên c u x c đ nh các tác nhân gây bệnh ong

tê liệt (paralysis) do virus tê liệt mãn tính (CBPV) [10] Các thí nghiệm sau

đó cho thấy khi cho ăn, phun trực tiếp, hoặc tiêm vào nh ng con ong trưởng thành khỏe mạnh, cả ABPV và CBPV đ u gây bệnh cho ong với triệu ch ng run và b tê liệt sau vài ngày Tuy nhiên nh ng con ong b nhiễm ABPV chết sớm (gây liệt cấp tính) hơn nh ng con ong b nhiễm CBPV (tê liệt mãn tính) Ong b tiêm khoảng 100 hạt virus ABPV đ u tiên xuất hiện triệu ch ng tê liệt, run rẩy bất thường của đ i c nh và cơ thể trong vòng 2-4 ngày và sau đó chết trong vòng 1 hoặc 2 ngày Mặc dù ABPV phổ biến rộng rãi ở các nước châu

Âu nhưng nó không phải là virus rất phổ biến gây bệnh trên ong và thường chỉ xuất hiện theo mùa Ong nhiễm ABPV thường không có biểu hiện và ảnh hưởng rõ ràng, và sự lây nhiễm và gây chết ong có thể liên quan chặt chẽ với nhiễm với ve Varoa

ABPV có bộ gen RNA sợi đơn dương, với ch thước 9.470 nucleotide

h ng bao gồm đu i poly A Hệ gen chia làm 2 hung đọc mở (ORF) Khung đọc mở ORF1 mã hóa cho c c protein phi cấu trúc như: helicase RNA phụ thuộc RNA polymerase và protease Khung đọc mở ORF2 mã hóa cho 3 protein cấu trúc có trọng lượng phân tử l n lượt là 35 33 24 Da ngoài ra còn

1 protein nhỏ 9.4 Da ABPV được xem là một nhóm virus gây bệnh c n trùng mới, hệ gen dài hơn so với virus cổ điển và có sự h c nhau trong tổ

ch c gen [21]

Black queen cell virus (BQCV)

Virus gây bệnh thối đen mũ chúa (BQCV) một loại virus giống như picorna ở ong mật, g n đây đã được phân loại trong chi mới Cripavirus (họ Dicistroviridae) [30] L n đ u tiên nó được phân lập từ ấu trùng ong chúa chết và nhộng, khi b bệnh thành tế bào xuất hiện các mảng v có màu đen, chính đi u đó liên quan đến tên gọi của loại virus này [11] Trong giai đoạn

đ u của bệnh, ấu trùng nhiễm bệnh có xuất hiện màu vàng nhạt và hó hăn khi chui ra khỏi kén BQCV phổ biến ở các con ong trưởng thành Tuy nhiên,

nó lại ảnh hưởng lâm sàng chủ yếu ở giai đoạn ti n nhộng hoặc nhộng của ong chúa đặc biệt là trong mùa xuân và đ u mùa hè Nhộng b nhiễm biến đổi thành màu đen và chết nhanh chóng Thành tế bào của mũ chúa cuối cùng trở thành màu đen là một triệu ch ng đặc trưng của bệnh BQCV Ong thợ cũng

có thể b nhiễm BQCV nhưng thường không biểu hiện triệu ch ng bệnh ra ngoài

BQCV có hình dạng giống Picornavirus, là một thành viên thuộc họ

Dicistroviridae, chi Cripavirus Hạt virus có đường nh 30nm h ng có vỏ

bọc bao ngoài, hệ gen là RNA sợi đơn có ch thước hoảng 8 5 b h ng

bao gồm đu i polyA Bộ gen ch a một tỷ lệ cao của Adenin (A) và Uracin

(U), bao gồm 29,2% A, 30,6% U, 18,5% C và 21,6% G Virus có hai khung đọc mở (ORF) mã hóa một protein không cấu trúc ở đ u 5 'ORF và một protein cấu trúc ở đ u 3' ORF Ở đ u 5′ ORF (ORF1) tìm thấy có bộ ba khởi

đ u là AUG từ v trí nucleotid 658 đến 660 và bộ ba kết thúc là UAG từ v trí nucleotid 5623 đến 5625, mã hóa protein không cấu trúc (helicase, protease, RNA polymerase) Ở đ u 3′ ORF (ORF2) tìm thấy có bộ ba khởi đ u là AUG

từ v trí nucleotid 5942 đến 5944 và bộ ba kết thúc là UAA từ v trí nucleotid

8393 đến 8395, mã hóa protein cấu trúc (Protein capsid) Các protein này được kí hiệu là VP1, VP2, VP3, VP4 với ch thước l n lượt là 43, 42, 29 và 6kDa [27]

Chronic bee paralysis virus (CBPV)

Virus này lây nhiễm ong ở giai đoạn trưởng thành ấu tr ng và nhộng

CBPV l n đ u tiên được phân lập vào năm 1963 CBPV có bộ gen là RNA bao gồm hai sợi riêng biệt của RNA tương ng được gọi là RNA1 dài 3674

bp và RNA2 dài 2305 bp; không bao gồm đu i poly A [32]

Ong hi b nhiễm CBPV đ u tiên sẽ xuất hiện màu đen h ng có l ng bóng nhờn Ong b nhiễm bệnh chậm chạp và thường b tấn công bởi nh ng con ong bình thường khác Tiếp theo ong không có khả năng bay run rẩy, tê liệt hàng loạt và cuối cùng là chết

Kashmir bee virus (KBV)

KBV được ph t hiện l n đ u tiên vào nh ng năm 1980 tại Anh sau đó được ph t hiện tại Bắc Mĩ vào năm 1995 trong một cuộc hảo s t nhỏ của Mỹ trong bảy tiểu bang: California, Florida, Maine, Minnesota, New York, Texas,

và Washington và được x c đ nh có mặt h u hết c c đàn ong của Bắc Mỹ Ve

là t c nhân truy n và lây lan KBV cho ong Ấu tr ng ong thường là đối tượng

ch nh b lây nhiễm KBV

KBV thuộc họ Dicistroviridae, chi Cripavirus Hệ gen bao gồm 2 hung

đọc mở hung đọc mở 1 mã hóa cho protein phi cấu trúc đ u 5‟ ngăn c ch với 1 hung đọc mở mã hóa cho protein cấu trúc đ u 3‟ bởi một v ng h ng

mã hóa Bộ gen có đu i poly A ph a 3‟ Hệ gen của KBV giống với ABPV tới 70% tuy nhiên vẫn có sự h c biệt ở nh ng v ng mã hóa Ở ph a protein phi cấu trúc có 42% sự sai h c nucleotide Gi a v ng helicase và 3‟C protease

có sự sai h c tới 57% aa Trong 1 đoạn 90 aa có sự sai h c tới 33% v trình

tự aa Khoảng c ch di truy n của KBV và ABPV trên cây tiến hóa x c đ nh chúng là 2 loài khác nhau [18]

Sacbrood virus (SBV)

Bệnh virus ấu tr ng túi (Sacbrood virus - SBV) được nghiên c u đ u

tiên bởi nhà hoa học White người Mỹ vào năm 1917 Đây là bệnh truy n

nhiễm do virus có tên hoa học là Morator aetotulas Holmes gây ra Ban đ u virus này được xếp vào họ Picornaviridae đến năm 2002 được ICTV xếp vào đơn v phân loại mới là chi Iflavirus thuộc siêu họ Picornavirus-like Virus có

bộ m y di truy n là RNA có đường nh 28nm h ng có màng, hình tròn và

h ng có biểu hiện đặc biệt hi xâm nhập SBV có bộ gen RNA bao gồm 8.832 nucleotide hung đọc mở lớn (179 đến 8752 nu) mã hóa cho chuỗi protein 2858 acid amin bao gồm: protein cấu trúc protein helicase enzyme protease và ARN polymerase K ch thước phân tử của protein capsid h ng

được đo đạc ch nh xác 5ۥ-VP3- VP4- VP1- VP2-3‟[23]

Triệu chứng và lây lan

Bệnh ấu trùng túi do SBV là một bệnh thường gặp ở ong mật Bệnh làm chết hàng loạt ấu trùng ở trước giai đoạn hóa nhộng Ấu trùng khỏe mạnh thường phát triển thành nhộng trong vòng 4 ngày sau hi chúng được vít nắp, nhưng nếu ấu trùng b bệnh do SBV thì không thể hình thành nhộng Dấu hiệu ban đ u khi mới nhiễm SBV là tổ b bít kín, toàn bộ cơ thể ấu trùng b biến dạng như một cái túi, phía trên nhọn ph a dưới ch a một chất lỏng trong suốt có màu hơi vàng Ấu trùng chết không có mùi chua Màu sắc thay đổi từ mày trắng đục sang màu vàng, ấu trùng chết b khô d n đóng vảy nâu Bệnh

d ch bùng phát vào mùa xuân khi mà các ấu trùng bắt đ u nở Từ hi được phát hiện đến nay, bệnh đã lan truy n nhanh chóng và rộng rãi tới h u hết tất cả mọi nước trên thế giới có ngành nu i ong mật trong đó có Việt Nam Chính vì vậy

mà bệnh do SBV đã được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên c u Đã

có nhi u chuỗi gen và hệ gen của SBV được giải mã và phân t ch Tuy nhiên

cho đến nay còn rất t th ng tin v sinh học phân tử hệ gen SBV đặc biệt là nghiên c u đ y đủ v đặc điểm di truy n và d ch tễ học phân tử của virus này trên ong mật Việt Nam

1.4.3 Deformed Wing Virus ( DWV)

Deformed Wing Virus (DWW) gây bệnh xoăn c nh có vật chất di truy n

là RNA Phân lớp virus thuộc họ Iflaviridae, chi Iflavirus Virus này l n đ u

được phân lập từ ong mật có triệu ch ng từ Nhật Bản vào đ u nh ng năm

1980 và hiện nay đang phổ biến trên toàn thế giới bất c nơi nào tìm thấy ve Varroa[8] DWV cũng đã được phát hiện bằng xét nghiệm huyết thanh trong

ong lùn A florae và ong mật châu Á A cerana và bằng RT- PCR trong ong

vò vẽ [22]

Đặc điểm hệ gen

Virion là 30-nm hạt hình khối 20 mặt bao gồm bộ gen RNA sợi dương

Hệ gen bao gồm 10140 nucleotide không bao gồm đu i poly A ch a 1 khung đọc mở đơn mã hóa cho 1 polyprotein 328 kDa Thành ph n hệ gen gồm 29.5% Adenosine; 15.8% Cytosine; 22.4%G Guanine và 32.3% Uracil Phân tích sự sử dụng codon cho thấy 39.5% Uracil và 26.8% Adenosine nằm ở v trí base th 3

Bản đồ protein

Nằm ở ph a đ u N của chuỗi polyprotein có 3 protein cấu trúc chính là VP1 (44kDa), VP2 (32 kDa) và VP3 (28 kDa)

VP1 kéo dài từ amino acid 486 tới 880 Phân tích khối phổ cho thấy trình

tự ph a đ u N của VP1 (DNPSYQQSPRRF) tương ng từ v trí amino acid

486 đến 497 K ch thước protein VP1 của DWV lớn hơn so với ch thước của VP1 thuộc họ Iflaviruses họ này protein VP1 có ch thươc nhỏ hơn 35kDa Các phân tích chỉ ra rằng sự chèn amino acid trong protein VP1 h u như nằm ph a đ u C của protein với sự bảo toàn vùng protein nằm phía nửa

đ u N [28]

VP2 lại nằm ph a trước của VP1 kéo dài từ amino acid 256 tới 448 Trình

tự mã hóa của VP2 h ng được x c đ nh rõ ràng có thể là do sự ph c tạp trong cấu trúc bậc 2 ph a đ u N của chuỗi polyprotein Nằm ở đ u 5‟của VP2

là 1 trình tự peptide dẫn đ u (L protein) VP3 bắt đ u từ amino acid 902 tới

1064 Trình tự ph a đ u N của VP3 (GEESRNTTVLDT) được mã hóa ở trình

tự tương ng từ amino acid 902 tới 913

Ph n đ u C của chuỗi polyprotein ch a trình tự của các protein phi cấu trúc bao gồm: 1 helicase RNA, vùng 3C protease và 1 RNA polymerase phụ thuộc RNA Các vùng A, B và C của helicase được mã hóa bởi trình tự từ

1460 đến 1575 bao gồm trình tự bảo thủ của v trí bám Nucleoside Triphosphate VPg là một protein nhỏ (23 amino acid) phổ biến ở nhi u virus RNA, ch u trách nhiệm cho sự ổn đ nh ph a đ u 5‟ của hệ gen RNA trong quá trình sao chép và d ch mã Protein VPg nằm ngay đ u 5‟ của 3C protease Vùng 3C protease kéo dài từ amino acid 2183 tới 2327 bao gồm 244 amino acid Cuối cùng 8 vùng của RdRp được bao gồm 335 aa nằm vùng gi a amino acid 2493 và 2828 [28]

Tổ ch c bộ gen, hình thái capsid, và các d liệu so sánh trình tự chỉ ra

rằng DWV là một thành viên của Iflavirus chi mới được thành lập g n đây

Hình 1.3 Bản đồ genome DWV ( nguồn Lanzi G et al., 2006 )

Virus học

Virus tập trung ở đ u và bụng của con ong trưởng thành b nhiễm bệnh với hàm lượng giảm đ ng ể ở ph n ngực Bộ gen có thể phát hiện bằng phản

ng RT-PCR ở đ u, ngực, bụng và cánh của ong b nhiễm bệnh, chân không

phát hiện được virus [28]

Triệu chứng

Virus biến dạng cánh (DWV) b nghi ngờ là gây ra d tật cánh và bụng thường được tìm thấy trên loài ong mật đã trưởng thành ở c c đàn ong b nhiễm ve Varroa Nh ng triệu ch ng này bao gồm các ph n phụ b hư hỏng, đặc biệt cánh b rút ngắn, bụng tròn do đau bụng đ y hơi tê liệt dẫn tới không có khả năng bay Ong có triệu ch ng suy giảm nghiêm trọng tuổi thọ (thường ít hơn 48 giờ) và thường b trục xuất khỏi tổ Các triệu ch ng trên liên quan chặt chẽ với hiệu giá virus và chỉ quan sát thấy ở ong b nhiễm với hiệu giá virus cao, ở các con ong nhiễm virus nhưng hiệu giá thấp không biểu hiện triệu ch ng trên rõ ràng và khó có thể phát hiện bằng quan sát trực quan Trong trường hợp không có ve, ở trong các qu n thể ong có thể virus lây nhiễm kín, truy n bằng miệng gi a ong trưởng thành vì virus có thể được phát hiện trong d ch tiết hypopharyngeal (s a ong chúa) và th c ăn của cả đàn

và cũng theo chi u dọc thông qua các buồng tr ng của ong chúa và thông qua tinh trùng của ong đực

Hình 1.4 Ong bị bênh xoăn cánh do nhiễm DWV

1.5 Tình hình dịch bệnh và các phương pháp phát hiện bệnh trên ong mật Việt Nam

Nghiên c u v d ch bệnh trên ong mật chủ yếu chỉ tập trung vào bệnh ấu

tr ng túi do SBV gây ra Năm 1974 d ch bệnh ấu trùng túi đã b ng nổ ở nước

ta do nhập một số đàn ong cao sản của Viện ong Bắc Kinh vào đ a bàn Hà Nội Qua triệu ch ng lâm sàng, các chuyên gia bệnh ong đ u cho rằng trong tập hợp ấu trùng ong nội đ u có mặt bệnh ấu tr ng túi nhưng do h ng có

đi u kiện phân lập, phân tích bằng kính hiển vi điện tử nên các ý kiến chỉ dừng lại ở bước nghi ngờ Trên 90% đàn ong b huỷ diệt do nhiễm bệnh này Năm 1989 c c mẫu bệnh do Công ty ong TW thu thập được từ c c đàn ong nội đã được gửi tới phân tích tại trại thực nghiệm Roshamted nước Anh, kết quả là một số mẫu ong bệnh này có virus SBV

Ở Việt Nam, bệnh éo dài năm này qua năm h c ở các tỉnh phía Bắc và đang gây t c động mạnh ở các tỉnh phía Nam Hiện nay bệnh ấu trùng túi trên ong nội đang gây thiệt hại rất lớn cho người nuôi ong ở các tỉnh mi n Bắc Tỉ

lệ mắc bệnh năm 2001 ở Hưng Yên là 30 01% Sơn La là 24 91% Hải Hậu – Nam Đ nh 70%, Nà Hang - Tuyên Quang là 58,5% Từ năm 2006 đến nay, bệnh còn bùng phát mạnh ở c c đàn ong ngoại trên phạm vi cả nước [6, 33]

Nh ng năm g n đây ỹ thuật RT-PCR đã được sử dụng khá phổ biến để chẩn

đo n c c bệnh do virus hại thực vật và động vật nhưng đối với virus gây bệnh trên ong còn rất ít công trình công bố Năm 2004 l n đ u tiên Lê Thanh Hòa

và cộng sự đã gi m đ nh virus gây bệnh này bằng phương ph p sinh học phân

tử tại các trại ong ở Hòa Bình, Hải Hưng và giải trình tự toàn bộ hệ gen của Sacbrood virus [5, 29] Tại Trung tâm nghiên c u ong TW, Lê Quang Trung

và cộng sự (2008) đã bước đ u ng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR/RFLP

để chẩn đo n trên đàn ong nội tại Hòa Bình Phạm Hồng Thái và cộng sự (2011) đã sử dụng kỹ thuật RT – PCR để chẩn đo n SBV và DWV trên ong ngoại [33] Mặc d vậy c c nghiên c u mới chỉ tiến hành trên quy m nhỏ

c n thiết phải có nh ng nghiên c u ở quy m toàn quốc v d ch tễ học phân

tử của c c virus gây bệnh trên ong đồng thời ph t triển được phương ph p chẩn đo n có thể đồng thời ph t hiện được nhi u loại virus trên c ng một phản ng với độ nhậy và độ đặc hiệu cao Năm 2014 Đồng Văn Quy n và cộng sự cũng đã x c đ nh được sự có mặt của virus Black queen cell gây bệnh thối mũ chúa trên 7 tỉnh thành của Việt Nam [1]

Trên thế giới đã có 10 trình tự bộ gen hoàn chỉnh của DWV và trình tự

gen VP1 được công bố Các nghiên c u chỉ ra gen VP1 mã hóa cho protein vỏ

capsid của virus gen có sự biến đổi mạnh mẽ v trình tự nucleotide so với các gen cấu trúc còn lại Một số tác giả cũng đã sử dụng gen VP1 để x c đ nh nguồn gốc tiến hóa của các loài virus gây bệnh trên ong như Ka ugo virus (AB245506) Sacbrood virus (JX854436.1), Kashmir bee virus (AY661447) Trong khuôn khổ của đ tài chúng tôi sử dụng trình tự gen VP1 để phát hiện

sự có mặt của DWV tại các tỉnh thành của Việt Nam đồng thời x c đ nh nguồn gốc tiến hóa của virus

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

Ấu tr ng và ong trưởng thành được thu thập từ các trại nuôi ong mật ở 10 tỉnh thành tại Việt Nam trong năm 2014 bao gồm Bắc Giang (BG), Hòa Bình (HB) Hưng Yên (HY) Điện Biên (DB), Nghệ An (NA) Đồng Nai (DN), Bình Phước (BP) Lâm Đồng (LD), C n Thơ (CT), Ti n Giang (TG) Mỗi tỉnh thu mẫu tại 3 trại, mỗi trại cách nhau trong bán kính 10 km, khoảng cách

gi a các tỉnh là 100 km Tại mỗi trại chúng t i thu 3 đàn h c nhau, mỗi đàn thu 100 ấu tr ng và 100 ong trưởng thành Mẫu được ký hiệu như sau: TT là ong trưởng thành và AT là ấu trùng ong Mẫu được bảo quản trong ethanol 96% và gi -20oC cho đến hi d ng

Mười mẫu RNA dương t nh chuẩn (t ch từ ong nhiễm DWV) và 10 mẫu RNA từ ong hỏe mạnh và ong nhiễm c c loại virus h c do Trung tâm iểm

d ch động vật thực vật và thủy sản (QIA) Hàn Quốc cung cấp

2.2 Hóa chất và sinh phẩm

Hóa chất

Trizol, EDTA (Ethylendiamin tetraacetic acid), SDS (Sodium dodecyl sulphat), Chloroform, Iso amylalcohol, Phenol, Acetat natri, Acetat kali, Ethanol, Nacl, Tris-HCL, Acid acetic, NaOH, Agarose, EtBr, Glycerol, Bromophen-l Blue, được mua từ c c hãng uy t n như Sigma, Merck, Invitrogen

Sinh phẩm

Bộ sinh phẩm SuperSciptTMFirst-StrDNA Synthsis System (Invitrogen)

d ng để tổng hợp cDNA; bộ sinh phẩm GenJETTM

PCR Purification Kit (Fermentas) d ng để tinh sạch sản phẩm PCR

2.3 Trang thiết bị

Lò vi sóng, máy lắc ổn nhiệt 37oC, máy khuấy từ (RotoLab, OSI), tủ lạnh sâu -20oC, -75oC (Sanyo, Nhật Bản), máy khuấy trộn Vortex (RotoLab, OSI), máy hút chân không (Shimadzu, Nhật Bản), máy soi chụp ảnh gel (Bio-Rad),

bộ nguồn điện di (Bio-Rad), tủ cấy vô trùng (Sanyo, Nhật Bản), pipetman các loại (Gilson), máy ly tâm lạnh (Sorvall Biouge Fresco), máy PCR, máy xác

đ nh trình tự DNA tự động (ABI 3100, Applied Biosystems, Mỹ) m y đo quang phổ NanoDrop (Thermosicences)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số

Nguyên tắc: Do c c phân tử RNA h ng b n dễ b phân hủy bởi c c enzyme Rnase có mặt ở hắp mọi nơi ngay cả trên đ u ngón tay người thao

t c phân tử RNase có hoạt t nh rất cao và rất b n v ng với c c t c nhân th ng thường d ng để loại bỏ enzyme nên việc t ch chiết RNA đòi hỏi nhi u biện

ph p thận trọng để tr nh mọi tạp nhiễm bởi c c RNase từ m i trường

Quy trình t ch RNA bằng Trizol:

 Khử trùng dụng cụ nghi n mẫu

 Mỗi đàn lấy 10 ấu trùng, 10 ong trưởng thành rửa bằng nước đã hử DEPC

 Bổ sung 500µl Trizol mix đ u

 Hút d ch nổi và bổ sung Isopropanol với tỉ lệ 1:1

 Tủa ở nhiệt độ phòng trong 10 - 20 phút

 Ly tâm 12000 v/p ở 4oC trong 30 phút để thu tủa RNA

 Rửa tủa lại bằng 1 ml Ethanol 70%

C

 Làm khô RNA trong box

 Hòa lại cặn RNA trong 30 l nước v tr ng đã loại RNase

 X c đ nh độ tinh sạch và nồng độ RNA trong các mẫu RNA tổng số bằng quang phổ kế

2.4.2 Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ NanoDrop

Nguyên tắc của phương ph p này là dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng

tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pyrimidine M c độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm (A260) của mẫu cho phép x c đ nh nồng độ nucleic acid trong mẫu Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân

tố như: pH nhiệt độ cường độ ion Độ hấp thụ tăng lên hi ở trong môi trường axit hoặc ki m Trong thí nghiệm RNA được pha loãng trong dung

CRNA là nồng độ RNA , d là độ pha loãng mẫu

Tuy nhiên cách tính trên chỉ chính xác khi dung d ch nucleic acid sạch Trong mẫu nucleic acid thường có lẫn các tạp chất Nh ng tạp chất này làm tăng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm Vì vậy để đ nh gi m c độ sạch của dung d ch người ta tính tỉ số OD260/OD280 = T

Nếu T< 1,8 và T > 2,0 thì ch ng tỏ dung d ch acid nucleic có lẫn tạp chất

Nếu 1,8< T < 2,0 thì dung d ch acid nucleic đó được coi là sạch

2.4.3 Tổng hợp cDNA từ RNA với cặp mồi ngẫu nhiên

- Hỗn hợp trên được trộn đ u bằng pipet

- Ủ hỗn hợp trên 5 phút ở 65oC bằng m y PCR sau đó đặt trên đ t nhất 1 phút Bổ sung hỗn hợp A vào hỗn hợp B

Bảng 2.2.Thành phần phản ứng của hỗn hợp B

Thực hiện phản ng tổng hợp cDNA theo chu trình nhiệt của máy PCR

như sau: 50o

C trong 60 phút, 85oC trong 5 phút, bảo quản ở 4oC

2.4.4 Phương pháp khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR

Thiết kế mồi:

Dựa vào trình tự gen VP1 của DWV trên ngân hàng gen mã số AJ489744 chúng tôi thiết kế cặp mồi nhân đoạn VP1 có chi u dài 786 bp có trình tự như sau mồi xuôi DWV-VP1F 5‟-GTA GGT TAT GTG CCT GGT TTG A-3‟

5‟-GTTGCCAATGGTGCACGCATG-3‟ (Tm=56oC) K ch thước sản phẩm PCR là 786 bp