Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN --- NGUYỄN THỊ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRONG MÔI TRƯỜNG BỔ SUNG TẢO XOẮN SPIR

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT

CÓ KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRONG MÔI TRƯỜNG BỔ SUNG TẢO XOẮN SPIRULINA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh học

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

Hà Nội, 2017

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm

Hà Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu

Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 05 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Phương

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật Đây là kết quả nghiên cứu của riêng em Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua sử lí thống kê, không có số liệu nào sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố

Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, ngày 03 tháng05 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Phương

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

6 Điểm mới của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter 4

1.2 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa của Gluconacetobacter 4

1.3 Biocellulose (BC) 5

1.3.1 Cấu trúc màng Biocellulose 5

1.3.2 Một số tính chất của màng Biocellulose 5

1.3.3 Quá trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter 6

1.3.4 Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter 8

1.3.5 Ứng dụng của Biocellulose 8

1.3.6 Mặt nạ dưỡng da (Biocellulose mask) 9

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay 10

1.4.1.Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới 10

1.4.2 Tình hình nghiên cứu màng BC ở trong nước 10

1.5 Sơ lược về tảo xoắn Spirulina 10

1.5.1 Phân loại tảo Spirulina 11

1.5.2 Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina 11

1.5.3 Cấu tạo tảo Spirulina 12

1.5.4 Sinh sản của tảo Spirulina 13

1.5.5 Nghiên cứu ứng dụng 14

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 15

2.1.1 Vi sinh vật 15

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 15

2.1.3 Môi trường 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp vi sinh 17

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 20

2.2.3 Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng 22

2.2.4 Phương pháp thống kê và xử lí số liệu 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina 24

3.1.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina 24

3.1.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina 26

3.2 Khảo sát khả năng tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus T3 và ứng dụng chế tạo mặt nạ dưỡng da 35

3.2.1 Khảo sát khả năng tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter xylinus T3 35

3.2.2 Ứng dụng làm mặt nạ dưỡng da 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Quá trình hình thành cellulose trong tế bào vi khuẩn

Gluconacetobacter 7

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter 8

Hình 1.3 Hình dạng của tảo xoắn Spirulina 12

Hình 1.4 Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi 12

Hình1.5 Khuẩn lạc vi khuẩn giấm của 2 mẫu phân lập trên môi trường 25

thạch đĩa 25

Hình 1.6.Vi khuẩn giấm của 2 mẫu phân lập trên môi trường thạch nghiêng 25

Hình 1.7 Khả năng oxy hóa acid acetic của vi khuẩn giấm 27

Hình 1.8 Đặc điểm màng của 6 chủng Gluconacetobacter 29

Hình 1.9 Vi khuẩn của 3 chủng Gluconacetobacter T3, T7, M3 trên môi trường thạch nghiêng 32

Hình 1.10 Hình thái tế bào 3 chủng Gluconacetobacter T3,T7 và M3 32

(Độ phóng đại x 1000) 32

Hình 1.11 Hoạt tính catalase 34

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men 17 Bảng 3.1 Nguồn gốc đặc điểm các chủng vi khuẩn giấm trong mẫu phân lập được 24 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thành màng cellulose của 6 chủng

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Như chúng ta đã biết thế kỉ XX là thế kỉ của ngành công nghệ thông tin

thì thế kỉ XXI là thế kỉ của của ngành công nghệ sinh học Ngày nay, công

nghệ sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo và chiếm giữ một vị trí cao của nhiều quốc gia trên thế giới Là một bộ phận của ngành công nghệ sinh học, công nghệ vi sinh đã và đang phát triển mạnh mẽ với những thành tựu lớn có ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành như: Công nghiệp, nông nghiệp, y học, Cho đến ngày nay một trong những nguồn nguyên liệu đã và đang được quan tâm gần đây đó là cellulose vi khuẩn hay

Biocellulose (BC) Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mới

có tiềm năng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo Trên thế

giới việc nghiên cứu Gluconacetobacter và quá trình sinh tổng hợp BC cũng

như ứng dụng của BC bắt đầu từ rất sớm Những nghiên cứu đầu tiên là của Brown A.J và cộng sự năm (1886) Trải qua hơn 1 thế kỷ nhưng cho đến nay

Gluconacetobacter và màng BC vẫn đang thu hút được sự chú ý của rất nhiều

nhà khoa học trên thế giới Ở Việt Nam, nghiên cứu về Gluconacetobacter,

màng BC và ứng dụng của nó còn là vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới được quan tâm gần đây Các nghiên cứu và công bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn Các nghiên cứu hiện mới dừng ở nghiên cứu quá trình tạo màng BC ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, làm giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm

màng trị bỏng Nhằm bổ sung những hiểu biết về Gluconacetobacter và quá

trình tạo màng BC định hướng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng màng BC

sau này, tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả

năng tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina”

2 Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose

trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng Biocellulose trong môi trường bổ sung tảo xoắn Spirulina

3.2 Nghiên cứu khả năng tạo màng Biocellulose của chủng vi khuẩn

Gluconacetobacter xylinus T3 được tuyển chọn và ứng dụng làm mặt nạ

dưỡng da

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

Một số chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng Biocellulose trên nguồn nguyên liệu tảo xoắn Spirulina

4.2 Phạm vi nghiên cứu

Nguồn tảo xoắn Spirulina tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật khoa Sinh -

KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu sự đa dạng của các chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng Biocellulose trên nguồn nguyên liệu tảo xoắn Spirulina Qua đó phân lập, tuyển chọn và định loại sơ bộ một số chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng có chất lượng tốt, thích hợp để tạo màng Biocellulose

đồng thời định hướng ứng dụng cho chủng nghiên cứu

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo màng Biocellulose trên môi trường tảo xoắn Spirulina có triển

vọng ứng dụng vào trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực thẩm mỹ dưỡng da, trong quá công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo

6 Điểm mới của đề tài

Tuyển chọn chủng vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus T3 có khả năng

tạo màng mỏng, dai, bề mặt nhẵn sử dụng làm mặt nạ dưỡng da Khảo sát khả

năng tạo màng Biocellulose, tìm môi trường và điều kiện thích hợp cho chủng

vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus T3 sinh trưởng và phát triển tốt rút ngắn

được thời gian tạo màng

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter

Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter thuộc họ Acetobacteraceae Họ này gồm 6 chi: Acetobacter, Gluconacetobacter,

Gluconobacter, Acidomonas, Asaia, Kozakia [20] Gluconacetobacter thuộc

nhóm vi khuẩn acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên

Mỗi tế bào Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tử glucose thành

cellulose trong 1 giờ [20]

Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn

Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau Vì vậy,

vấn đề này vẫn đang gây nhiều tranh cãi, đòi hỏi cần có nhiều hơn những nghiên cứu tiếp theo

Gluconacetobacter là trực khuẩn có dạng hình que, thẳng hay hơi cong,

có thể di động hay không di động, không sinh bào tử Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay

do điều kiện môi trường Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi Trên môi trường thiếu thức ăn hay môi trường nuôi cấy đã lâu,

Gluconacetobacter dễ dàng sinh ra những tế bào có hình thái đặc biệt (tế bào

có thể phình to hoặc kéo dài, đôi khi lại có dạng phân nhánh) Tế bào thường được tìm thấy nhiều trong dịch hoa quả, giấm, dịch rượu, trong đất [17]

1.2 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa của Gluconacetobacter

Vi khuẩn Gluconacetobacter sinh trưởng, phát triển ở điều kiện

nhiệt độ 25oC - 35oC; pH: 4 - 6 Các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh

trưởng được trong điều kiện pH thấp, vì vậy có thể bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ

Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter bao

gồm: Oxy hóa ethanol thành acetic, CO2, H2O; Phản ứng catalase dương

1.3 Biocellulose (BC)

1.3.1 Cấu trúc màng Biocellulose

Biocellulose có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực

vật (PC - plant cellulose) Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi

cấy tĩnh, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành nên lớp màng có bản chất là

cellulose, được tập hợp bởi nhiều bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi

là màng Biocellulose hay màng BC Cấu trúc của màng Biocellulose: Được

cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4 glucopynanose mạch thẳng Có thành phần hóa học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng khác nhau về cấu trúc, đặc tính [17]

Chuỗi polyme β - 1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau

tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5 nm Những sợi nhỏ kết kinh tạo thành sợi lớn hơn - sợi vĩ mô (microfibril) (Jonas and Farah, 1998) [29],

những sợi kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanakaet.al 2000) [38] Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1 – 9 nm Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hidro hoặc lực Van Der Waals tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy

1.3.2 Một số tính chất của màng Biocellulose

Brown A.J (1886), đã nghiên cứu lớp màng đặc do vi khuẩn

Gluconacetobacter tạo ra trên môi trường nuôi cấy và thấy có bản chất là

hemicellulose Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm tính [19]

Một số tính chất của màng Biocellulose:

 Độ tinh sạch: Màng BC có độ tinh sạch tốt hơn nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn

 Độ bền cơ học: Màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước

 Tính hút nước: Màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%),

có tính xốp, độ ẩm cao

1.3.3 Quá trình tổng hợp Biocellulose từ vi khuẩn Gluconacetobacter

Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn

dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbonhydrat, vitamin B1, B2, B12… và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài vào cơ thể, một phần để cơ thể sinh trưởng và phát triển, một phần để tổng hợp cellulose và thải ra môi trường Ta thấy các sợi nhỏ phát triển ngày càng dài hướng từ đáy lên bề mặt trong môi trường nuôi cấy [22] Thiaman (1962) đã giải thích cách

tạo thành cellulose như sau: Các tế bào Gx khi sống trong môi trường lỏng sẽ

thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng bằng cách hấp thụ đường glucose, kết hợp đường với acid béo để tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào Tiền chất này được tiết ra ngoài nhờ hệ thống lỗ nằm ở trên màng tế bào cùng với một enzyme có thể polymer hóa glucose thành cellulose

Hình 1.1 Quá trình hình thành cellulose trong tế bào vi khuẩn

Gluconacetobacter

Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác và protein điều hòa (hình 1.1)

Theo Alaban C.A và cộng sự (1967) [17] các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp cellulose và vi khuẩn gồm:

1PFK: Fructose-1-phosphate kinase PG1: Phosphoglucoisomerase PGM: Phosphoglucomutase PTS: Hệ thống phosphotranferrase UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase Fru-6-phosphate

Fru-bi-P: Fructose-1,6-diphosphate Glc-6-P: Glucose-6-phosphate Glc-1-P: Glucose-1-phosphate PGA: Phosphogluconic acid

UDPGlc: Uridine diphosphoglucose CS: Cellulose synthase

FBP: fructose-1,6-diphosphate phosphatase

G6PDH: glucose-6-phosphate dehydrogenase

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn

Gluconacetobacter 1.3.4 Chức năng của cellulose với vi khuẩn Gluconacetobacter

Màng Biocellulose nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trước

các nhân tố có hại của môi trường Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế bào

Gluconacetobacter được bao bọc bởi Biocellulose sống sót sau 1 giờ xử lí

bằng tia cực tím Khi tách Biocellulose ra khỏi tế bào, khả năng sống của

chúng giảm đáng kể, chỉ còn 3% [31]

Ngoài ra, màng Biocellulose còn là giá thể chống đỡ cho các tế bào vi

khuẩn đồng thời cũng giúp chúng lấy chất dinh dưỡng từ môi trường một cách dễ dàng hơn so với khi ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose

1.3.5 Ứng dụng của Biocellulose

Màng Biocellulose đã thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học

trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Trong công nghệ môi

trường, các nhà khoa học đã dùng màng Biocellulose làm màng phân tách để

xử lý nước, làm chất mang đặc biệt cho pin và tế bào năng lượng Brown, (1999), Jonas và Farad (1998) đã dùng màng như một chất đặc biệt để biến đổi độ nhớt, làm các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học

Trong công nghiệp giấy, màng Biocellulose được sử dụng để sản xuất giấy

điện tử có chất lượng cao Trong công nghiệp thực phẩm, nó được ứng dụng

để sản xuất thạch dừa, một món ăn được ưa chuộng ở Đông Nam Á, làm vỏ

bao xúc xích,…Trong y học và dược phẩm, màng Biocellulose được dùng để

trị bỏng, làm da nhân tạo, mặt nạ dưỡng da,…

1.3.6 Mặt nạ dưỡng da (Biocellulose mask)

Hiện nay trên thế giới xu hướng làm đẹp từ các sản phẩm tự nhiên không chứa chất hóa học đang thịnh hành Hàng loạt các hãng mỹ phẩm lớn đều tập trung nghiên cứu cho ra những sản phẩm làm đẹp có nguồn gốc tự nhiên không có hoặc rất ít tác dụng phụ trong đó có mặt nạ dưỡng da

(Biocellulose mask) Biocellulose mask được sản xuất bằng công nghệ vi sinh

và nguồn nguyên liệu chính là nước dừa Màng thu được xử lí thành phẩm và

bổ sung thêm các hoạt chất với các hướng ứng dụng khác nhau như: Làm trắng da, trị mụn hay làm mờ vết nám

Ở Việt Nam, mặt nạ Biocellulose từ nước dừa lần đầu tiên được sản

xuất tại tỉnh Bến Tre được kiểm nghiệm nhiều lần tại trung tâm kiểm nghiệm dược và mỹ phẩm Bến Tre và được sở y tế chấp nhận (Số công bố 013/11 CBMP-BT do sở y tế Bến Tre cấp) Đây là lần đầu tiên mặt nạ 100% thiên nhiên xuất hiện ở nước ta mà chưa có sản phẩm nào trên thị trường có Có nguồn gốc từ nước dừa, hoàn toàn không cần dùng khăn giấy hay sợi để làm khuôn định hình như các loại mặt nạ thường thấy trên thị trường Khác với các mặt nạ hóa chất trên thị trường có tác dụng ngay lập tức và không tốt về lâu dài cho da mặt Mặt nạ từ nước dừa có công dụng mang đến làn da trắng sáng, mịn màng một cách tự nhiên và đẹp nhất Mỗi tấm mặt nạ được đóng riêng trong từng túi nhôm kín, độ dày 1 mm, 2 mm, 3 mm, trọng lượng 60 g [43]

1.4 Tình hình nghiên cứu và sản xuất BC hiện nay

1.4.1.Tình hình nghiên cứu màng BC trên thế giới

Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter và màng BC đã thu hút được sự

chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới Màng BC được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, điển hình như: Trong công nghệ thực phẩm sử dụng màng BC

để bảo quản thực phẩm, sản xuất thạch dừa; Trong công nghiệp giấy, màng

BC sử dụng để sản xuất giấy chất lượng cao; Trong lĩnh vực y học, màng BC bước đầu nghiên cứu sử dụng làm màng trị bỏng, làm da nhân tạo Hiện nay màng BC ngày càng chiếm ưu thế là sản phẩm thân thiện với môi trường thay thế cho túi ni lông

1.4.2 Tình hình nghiên cứu màng BC ở trong nước

Tại Việt Nam, việc nghiên cứu và sử dụng màng BC đã thu hút được

sự chú ý của nhiều tác giả quan tâm Điển hình như nghiên cứu đặc tính cấu trúc màng BC làm cơ sở sản xuất thạch dừa của tác giả Nguyễn Thúy Hương, trường đại học Bách Khoa Tp.HCM [6]; Nghiên cứu màng trị bỏng sinh học

có tẩm dầu mủ u bằng phương pháp lên men của tác giả Nguyễn Văn Thanh

và cộng sự, đại học Y Dược TP.HCM [7]; Bước đầu sử dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu của tác giả Trần Thị Tưởng An, Nguyễn Thúy Hương trường đại học Quốc Gia TP.HCM [6];

Nghiên cứu một số đặc tính của chủng vi khuẩn Gluconacetobacterbước đầu ứng dụng màng BC làm bao bì bảo quản thực phẩm, túi thay thế túi ni lông của Đinh Thị Kim Nhung và cộng sự [10]

1.5 Sơ lược về tảo xoắn Spirulina

Tảo Spirulina hay tảo xoắn Spirulina là tên gọi do nhà tảo học Deurben

(Đức) đặt vào năm 1827 dựa trên hình thái tảo Spirulina có dạng sợi xoắn ốc Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo Spirulina từ

nguồn nước tự nhiên Năm 1963, giáo sư Clement (người Pháp) đã nghiên

cứu thành công việc nuôi Spirulina ở qui mô công nghiệp Do hình dạng “lò

xo xoắn” với khoảng 5 - 7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển

vi nên được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt

nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là

thuộc chi Spirulina Thực ra đây không phải là sinh vật thuộc tảo (algae) vì tảo thuộc sinh vật có nhân thật (Eukaryota) Spirulina thuộc vi khuẩn lam (Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy

(Prokaryote)

Năm 1973, Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO) và Tổ chức Y tế Thế

giới (WHO) đã chính thức công nhận tảo xoắn Spirulina là nguồn dinh dưỡng

và dược liệu quý, đặc biệt trong chống suy dinh dưỡng và chống lão hóa Năm 1977, Viện sinh vật học là nơi tiên phong trong việc nuôi trồng

Spirulina ở Việt Nam theo mô hình ngoài trời, không mái che, có sục khí

1.5.2 Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina

Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5 - 7 vòng đều nhau không

phân nhánh Đường kính xoắn khoảng 35 - 50 micromet, bước xoắn 60

micromet, chiều dài thay đổi có thể đạt 0,25 mm Nhiều trường hợp tảo xoắn

Spirulina có kích thước lớn hơn Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhân

thực Người ta cho rằng tảo Spirulina giống với vi khuẩn hơn, do đó tảo

Spirulina còn có tên là vi khuẩn lam

Tảo có khả năng vận chuyển theo hình thức trượt xung quanh trục của chúng Vận tốc vận chuyển của chúng có thể đạt 5 micron/giây [44]

Hình 1.3 Hình dạng của tảo xoắn

Spirulina

Hình 1.4 Hình dạng tảo Spirulina quan sát dưới kính hiển vi 1.5.3 Cấu tạo tảo Spirulina

Là tảo lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh Mỗi tế bào của sợi có chiều rộng 5 micromet, dài 2 mm Không có lục lạp mà chỉ chứa thylacoid phân bố đều trong tế bào Không có không bào Không có nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa DNA ( Hedeskog và Hifsten A.1980) Thành tế bào tảo gồm các lớp lipopolysaccharide, các sợi nhỏ protein và các phân tử peptidoglucan Màng tế bào nằm sát ngay dưới

thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm

Bộ máy quang hợp của tảo xoắn Spirulina: Phycobilisome: chứa

phycobiliprotein và protein liên kết được gắn vào bề mặt ngoài của thylacoid Phycobilisome có khối lượng khoảng 7 triệu dalton và có thể tách nguyên vẹn

để nghiên cứu Đối với phycobilisome có cả phycoerythin và phycocyanin thì lớp ngoài cùng là phycoerythin, tiếp theo là phycocyanin và phần trong cùng

là allophycocyanin Phycobilisome hoạt động như một anten thu nhận năng lượng mặt trời để chuyển vào PS II Con đường truyền năng lượng bắt đầu từ phycoerythin sang phycocyanin và cuối cùng đến allophycocyanin trước khi

đạt tới PS II Có khoảng 50% năng lượng ánh sáng mặt trời Spirulina nhận

được nhờ phycobilisome

Các sắc tố quang hợp gồm chlorophylla, carotenoid, phycocyanin, allophycocyanin và thường có carotenoid - glycoside như myxoxanthophyll,

oscillaxanthin Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính: Chlorophyll hấp thụ

ánh sáng lam và đỏ Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục Phycobillin hấp thụ ánh sáng lục, vàng và da cam [44]

1.5.4 Sinh sản của tảo Spirulina

Tảo lam là vi sinh vật xuất hiện cùng lúc với vi khuẩn trên trái đất

(Cifferi O, Tiboni O, 1985) Hiện nay, người ta biết khoảng 2500 loài Tảo lam phân bố rất rộng và có khả năng chịu nhiệt rất cao Người ta phát hiện chúng sống ở những suối nước nóng đến 690C Tảo Spirulina có phương thức

sinh sản vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng thành (gọi là trichome), tự phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một số vòng xoắn (2 - 4 tế bào, gọi là

hormogonia) Để tạo thành các hormogonia, sợi Spirulina sẽ hình thành các

tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn necridia) Các necridia hình thành các đĩa lõm ở hai mặt và tạo ra hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa Khi đã phát triển, dần dần phần đầu hormogonia bị tiêu giảm và trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản lặp lại để đảm bảo vòng đời của

Spirulina

Thông thường, Spirulina sinh sản bằng cách gãy ra từng khúc Trong

trường hợp gặp điều kiện không thuận lợi, Spirulina cũng có khả năng tạo bào tử giống như ở vi khuẩn Chu kì phát triển của Spirulina rất ngắn Chu kì này thường diễn ra trong 24 h như của tảo Chlorella [44]

1.5.5 Nghiên cứu ứng dụng

Tảo xoắn Spirulina đã được nghiên cứu sản xuất và được ứng dụng

trong nhiều lĩnh vực khác nhau ở các nước trên thế giới và được nghiên cứu

ứng dụng trong ngành thực phẩm và mỹ phẩm Spirulina được nghiên cứu bổ

sung vào rất nhiều sản phẩm thực phẩm như: mì sợi, yaourt, kẹo, trà xanh, bánh quy, bánh mì, bia…Các sản phẩm này được bán ở siêu thị của nhiều nước như: Chi Lê, Đan Mạch, Hà Lan, Mỹ, Úc, New Zealand…

Nhiều giá trị dinh dưỡng và sinh học của tảo Spirulina được khám phá: Tảo Spirulina rất giàu protein (60 - 70% trọng lượng khô của tảo) trong khi

thịt bò chỉ có 21%, thịt gà ta 20,3% Các loại acid amin chủ yếu có tỉ lệ vượt trội so với chuẩn của tổ chức lương nông quốc tế (FAO) Hệ số tiêu hóa protein cũng rất cao với 80 - 85% protein được hấp thu sau 18 giờ

Tảo Spirulina có các vitamin nhóm B, hàm lượng vitamin B12 cao gấp

2 lần trong gan bò Caroten cao gấp 10 lần trong củ cà rốt Ngoài ra tảo

Spirulina còn chứa các khoáng vi lượng (coban, kẽm, sắt ), 11 vitamin cần

thiết cho cơ thể và chất chống oxi hóa: Betacaroten và carotenoid Đặc biệt - kẽm (Zn) và các acid amin có trong tảo giúp tăng cường khả năng hoạt động

tình dục ở nam giới Tảo Spirulina làm cân bằng dinh dưỡng, tổng hợp các

chất nội sinh, tăng hoocmon và điều hòa sinh lí [44]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vi sinh vật và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vi sinh vật

Nguồn vi sinh vật do phòng vi sinh vật học khoa Sinh - KTNN trường

Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp

- Cao thịt, cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4, NaNO3, NaNO2

- KH2PO4, CaCO3, MgSO4.7H2O, NaCl, NaOH

- Blue Bromphenol, lugol, fucshin, tím gentian, phenolphthalein

2.1.2.2 Thiết bị

- Nồi hấp Tommy (Nhật)

- Box vô trùng (Haraeus)

- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

- Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl - 10ml

- Máy so màu UV - vis (Nhật)

- Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ)

- Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

- Máy cất nước 2 lần (Hamilton - Anh)

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)

- Kính lúp soi nổi STEMI 2000 - C

Bột tảo xoắn Spirilina: 16 g

2.1.3.4 Môi trường lên men

Chúng tôi đã sử dụng một số môi trường có thành phần theo bảng sau:

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men

Chú ý: Acid acetic và rượu etylic bổ sung sau khi đã khử trùng môi trường

2.2 Phương pháp nghiên cứu

vô trùng cho vào ống nghiệm chứa nước cất vô trùng, vontex đều, thu được ống nghiệm chứa mẫu màng gốc

Sử dụng phương pháp pha loãng Pasteur: Chuẩn bị 10 ống nghiệm

có đậy nút bông sấy vô trùng, cho vào mỗi ống nghiệm 9 ml nước cất, đậy nút bông hấp thanh trùng trong nồi hấp giữ ở 1210 C, 1atm trong thời gian 20 phút Chuyển vào bốc cấy vô trùng, dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch từ ống nghiệm chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông, vontex trong 5 phút, thu được ống nghiệm chứa dịch pha loãng mức 10-1 Tiếp tục hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm thứ hai, thu được dịch pha loãng ở mức 10-2 Tiếp tục pha loãng ở các độ pha loãng

10-3 ,10-4,…10-10 Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có ở trong mẫu, chúng tôi chọn các mẫu ở độ pha loãng 10-2 - 10-5 để tiến hành các bước tiếp theo [3] Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa: Chuẩn bị môi trường, hấp khử trùng, đổ môi trường thạch đĩa Dùng pipet vô trùng hút 100

µl dịch màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10-2 -10-5) nhỏ vào các hộp lồng đã chứa môi trường thạch, dùng que trang thủy tinh trang đều trên khắp bề mặt thạch Đặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, giữ trong tủ ấm

300C, sau 3 - 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thước, màu sắc, viền mép khuẩn lạc, độ trơn bóng, vòng phân giải CaCO3)

Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng (đã loại bỏ CaCO3), tách các khuẩn lạc riêng rẽ từ hộp lồng, cấy chuyển vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C Sau 3 - 4 ngày, quan sát, làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram

2.2.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép

Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram

1 Tím gentian: 2 phút