Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thu thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường

LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường” e

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS NGUYỄN PHÚC HƯNG (Trường ĐHSP Hà Nội)

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường” em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt

tình của các thầy cô, các anh chị và các bạn tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: TS Nguyễn Phúc Hưng, người đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN cùng các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, những người thân, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất Nhưng do buổi đầu em được làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót mà bản thân chưa thấy được Em rất mong được sự đóng góp của quý thầy cô và các bạn để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

(Kí và ghi rõ họ tên)

Trần Thị Hồng Ngân

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Khóa luận “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường” là

công trình nghiên cứu của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn của

TS Nguyễn Phúc Hưng Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt Các kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực, khách quan và chưa được công bố trong bất

kỳ công trình nào trước đây Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2016

Sinh viên

(Kí và ghi rõ họ tên)

Trần Thị Hồng Ngân

Cao nấm men Cộng sự Đại học Sư phạmMôi trường 1Môi trường 2Môi trường 3

Cellulose thực vật Tiến sĩ

Mật độ quang phổ Nhà xuất bản

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK 5

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình nuôi cấy thu nhận CVK 22

Hình 2.2: Đồ thị đường chuẩn Cur OD 427nm 24

Hình 3.1: Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trường CNM 28

Hình 3.2: Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trường nước Dừa già 29

Hình 3.3: Hình ảnh màng CVK lên men từ môi trường nước vo Gạo 29 Hình 3.4: Màng CVK với thời gian nuôi cấy khác nhau 31

(a): Màng CVK thu ở ngày nuôi cấy thứ 4 (dày 0,3cm) 31

(b): Màng CVK thu ở ngày nuôi cấy thứ 6 (dày 0,5cm 31

Hình 3.5: Màng CVK ngâm với NaOH 3% 32

Hình 3.6: Màng CVK ngâm với HCl 3% 32

Hình 3.7: Màng CVK ngâm với nước cất 33

Hình 3.8: Màng CVK sau khi tinh chế 33

Hình 3.9: Kết quả thử sự hiện diện của đường glucose 34

Hình 3.10: Màng CVK lên men từ môi trường CNM đang hấp thụ thuốc Cur 35

Hình 3.11: Màng CVK lên men từ môi trường nước Dừa già đang hấp thụ thuốc Cur 35

Hình 3.12: màng CVK lên men từ môi trường nước vo Gạo đang hấp thụ thuốc Cur 36

Hình 3.13: Màng CVK sau khi hấp thụ Cur 40

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già 8

Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo 9

Bảng 2.1: Môi trường lên men tạo màng CVK 20

Bảng 2.2: Bảng nồng độ Cur và giá trị OD427 nm (n = 3) 23

Bảng 3.1: Kết quả thu màng VCK ở các độ dày khác nhau 30

Bảng 3.2: Giá trị OD hấp thụ thuốc Cur của màng CVK ( n = 3) 36

Bảng 3.3: Khối lượng Cur được hấp thụ, tỷ lệ hấp thụ và cường độ hấp thụ Cur của màng CVK (n =3) 38

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Phạm vi nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Một vài đặc điểm của màng CVK 4

1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum 4

Họ: Pseudomonadaceae 4

1.1.2 Vi khuẩn sản sinh ra CVK 4

1.1.3 Đặc điểm cấu trúc của CVK 4

1.1.4 Đặc tính của màng CVK 6

1.1.5 Tính chất độc đáo của CVK 6

1.1.6 Sinh tổng hợp CVK 7

1.1.7 Ứng dụng của màng CVK 7

1.1.8 Môi trường nuôi cấy A xylinum 8

1.1.9 Các phương pháp sản xuất CVK từ A xylinum 9

1.1.9.1 Lên men tĩnh 9

1.2 Tổng quan về Curcumin 10

1.2.1 Công thức cấu tạo 10

1.2.2 Tính chất vật lí 12

1.3.3 Tính chất hóa học của curcumin 12

1.2.4 Dược tính 13

1.2.5 Sinh khả dụng của Curcumin 14

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Giống vi khuẩn 18

2.1.2 Nguyên liệu - hóa chất 18

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp tạo màng và xử lí màng CVK 19

2.3.2 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK 23

2.3.3.Phương pháp xác định hàm lượng Cur 23

2.3.4.Tạo màng CVK nạp Cur 25

2.3.5 Phương pháp xác định lượng Cur nạp vào màng CVK 25

2.3.6 Phương pháp xử lý thống kê 26

2.4 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Tạo màng CVK của A xylinum từ các môi trường khác nhau 28

3.2 Độ dày màng CVK trong các điều kện nuôi cấy 29

3.4 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK 33

3.5 Khả năng hấp thụ thuốc Cur của màng CVK 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên, việc phát triển các hoạt chất có nguồn gốc thảo dược ngày càng trở thành mối quan tâm lớn đối với ngành Y dược Việt Nam Một trong những hoạt chất có nguồn gốc thảo dược được quan tâm nhiều hiện nay đó là Curcumin

Curcumin (Cur) là một hoạt chất polyphenol của thân rễ cây Nghệ vàng

(Curcuma longa L.) là thảo dược nâu năm thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) được

trồng rộng rãi ở khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới chủ yếu là khu vực Nam Á và Đông Nam Á Cur đã được sử dung rộng rãi trong suốt hơn 5000 năm qua trong nhiều bài thuốc y học cổ truyền ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt là tại Ấn Độ, Trung Quốc,… và Việt Nam [1] Chúng được sử dụng như một chất tạo màu, làm đẹp da và liền sẹo, cũng như dùng trong chế biến các món ăn Theo y học phương Đông, nghệ có tác dụng làm lành vết thương, trị các chứng viêm loét, đau dạ dày, giải độc gan, vàng da, hoạt huyết, làm tan máu bầm, giúp co hồi tử cung sau sinh,… Trong đó, Cur là thành phần có hoạt tính sinh học nhất của củ nghệ Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng Cur có nhiều tính chất dược lý quan trọng như chống oxy hóa, kháng khối u, kháng viêm, kháng nấm, kháng vi khuẩn, kháng virus, chữa các bệnh tim mạch thần kinh,… và đặc biệt là khả năng kháng nhiều loại bệnh ung thư khác nhau [16] Gần đây, nhiều công trình nghiên cứu

đã chỉ ra rằng Cur có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào trên nhiều dòng tế bào

ung thư in vitro và đã được dùng để ngăn ngừa và điều trị nhiều bệnh ung thư in vivo [1] Quan trọng hơn, Cur không độc hại với các tế bào khỏe mạnh Tuy

nhiên, rào cản lớn khiến tinh chất nghệ Cur chưa được ứng dụng rộng rãi là do Cur tan rất ít trong nước, sinh khả dụng thấp, sự chuyển hóa nhanh và sự đào thải lớn khi vào cơ thể [24]

Trong tự nhiên có một số vi khuẩn có khả năng sinh ra màng cellulose Khi nuôi cấy những vi khuẩn này trong môi trường chứa glucose, glycerol hoặc một

số nguồn cacbon hữu cơ khác nhau chúng có khả năng hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose sinh học thuần khiết và được gọi là màng cellulose vi khuẩn (CVK)

Nét cấu trúc quan trọng trong cơ thể kết tinh khác hẳn với cellulose ở thực vật (PC) ở chỗ chúng không có sự kết hợp hemicellulose, lignin, hay những thành phần phụ khác, mà được cấu tạo từ những sợi microfibril tạo nên những

bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose với độ bền cơ học cao, độ tinh khiết cao, khả năng thấm hút lớn, đường kính sợi nhỏ, khả năng polymer hóa và trạng thái tinh khiết lớn Ngoài ra, màng CVK còn chứa nhiều dưỡng chất, axit hữu cơ đồng thời là một hàng rào cản oxi và các sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và ngăn cản tác động của UV [5,7,19]

Nhờ những đặc tính độc đáo trên mà màng PC được coi là một nguồn polymer mới, là một giải pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện nay Nó

đã và đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay từ nửa sau thế kỉ XIX và hiện được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: Trong công nghiệp giấy màu CVK được dùng để sản xuất giấy điện tử chất lượng cao; Trong công nghiệp môi trường đã sử dụng màng CVK làm màng phân tách để xử lí nước và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998) Ngoài

ra, màng CVK còn được dùng làm chất màng đặc biệt cho các sợi pin và tế bào năng lượng (Brown, 1989), làm các sợi truyền quang, là môi trường cơ chất trong sinh học sử dụng để cố định protein hay cho sắc kí Trong lĩnh vực mỹ phẩm màng CVK được sử dụng làm mặt nạ dưỡng da Trong lĩnh vực dược phẩm, lợi dụng những đặc tính quý báu của màng CVK để tăng khả năng hấp thụ của thuốc, đáng chú ý nhất là trong khả năng hấp thụ thuốc Cur [5] Tuy

nhiên khả năng hấp thụ thuốc Cur của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một

số môi trường (chuẩn, nước vo gạo, nước dừa già) lại có những điểm khác nhau

Từ các nghiên cứu về màng CVK và một số hạn chế của Cur trong quá trình điều trị, Với mục đích làm tăng khả năng hấp thụ thuốc dựa trên màng CV giúp Cur có thể khắc phục tính khả dụng sinh học, xét thấy đây là hướng nghiên cứu

mới và triển vọng Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường”

2 Mục đích nghiên cứu

 Tạo ra hệ thống màng CVK nạp thuốc Cur từ một số môi trường

 Thiết kế hệ thống CVK hấp thụ thuốc Cur

 So sánh tìm hiểu khả năng hấp thụ thuốc Cur của màng cellulose vi khuẩn lên men từ một số môi trường, để tìm ra trường hợp hấp thụ thuốc được tốt nhất

3 Phạm vi nghiên cứu

 Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí

nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

 Ý nghĩa khoa học: Tăng thêm hiểu biết về tiềm năng hấp thụ thuốc và ứng dụng của màng CVK

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

 Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum

 Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng để nghiên cứu, so sánh khả năng hấp thụ thuốc Cur của màng CVK lên men từ một số môi trường để chọn ra được trường hợp hấp thụ tốt nhất

 Từ kết quả nghiên cứu được có thể nâng cao hiệu quả sử dụng của thuốc, định hướng cải thiện nhược điểm của thuốc để áp dụng vào thực tiễn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Một vài đặc điểm của màng CVK

1.1.1 Vị trí phân loại của Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum (A xylinum) thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, là loại hiếu khí bắt buộc, có nhu mao và

sản xuất cellulose ngoại bào [10]

Theo khóa phân loại của Bergey [3], A xylinum thuộc:

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang

khoảng 0,6 - 0,8µm, dài khoảng 2 - 3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [23]

1.1.3 Đặc điểm cấu trúc của CVK

Cellulose là một polymer không phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β-1,4-glucan Các nghiên cứu cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của CVK giống hệt cellulose của thực vật (plant

cellulose - PC) Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và tính chất của CVK khác với PC [5] Chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thông là 30,000 – 75,000nm trong khi những dải vi sợi celluose có chiều dài từ 1 – 9µm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen [9]

Hình 1.1: Cấu trúc hóa học cơ bản của CVK

Đặc tính cấu trúc của CVK phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy:

 Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - CVK: Static-Bacterial Cellulose),

A xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày trên bề mặt

môi trường Màng CVK thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng

 Khi nuôi cấy động (A - CVK: Agitated-Bacterial Cellulose), một lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng hyền phù phân tán trong đó chuỗi β-1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên CVK được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy động dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cấy

 Lượng CVK được sinh ra giữa hai phương pháp nuôi cấy động và tĩnh cũng khác nhau: khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động nhỏ hơn so với nuôi cấy tĩnh [9,25]

1.1.4 Đặc tính của màng CVK

Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01-0,5nm Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ 11 thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt là khả năng cản khuẩn Với các tính chất này CVK được ứng dụng rất nhiều trong

các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học [9]

1.1.5 Tính chất độc đáo của CVK

Độ tinh khiết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp không

có chứa ligin hay hemicellulose Do đó CVK có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn toàn [16]

Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhỏ, độ bền đáng kể [14,30]

Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: màng cellulose vi khuẩn có khả năng giữ nước rất lớn, có thể hút 600-700 lần trọng nước của nó [31] Màng cellulose được hình thành trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Có khả năng hình thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục

Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì có thể làm thay đổi những thuộc tính của CVK Nếu cho thuốc nhuộm vào môi trường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lí của cellulose trong quá trình tổng hợp [9,21]

Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng cellulose, khiểm soát trọng lượng phân tử cellulose

1.1.6 Sinh tổng hợp CVK

Các vị trí tổng hợp cellulose của A xylinum là những lỗ nằm trên bề

mặt tế bào, có đường kính 3,5nm sắp xếp song song trên đường thẳng trục dọc của vi khuẩn Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10nm chứa các enzym có chức năng trong sự polyme hóa để tổng hợp cellulose và các protein hỗ trợ liên quan đến các chức năng khác [9]

A xylinum hấp thu đường glucose vào trong tế bào, kết hợp với một

acid béo tạo thành tiền chất nằm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này được tiết ra ngoài tế bào cùng với enzym để thực hiện quá trình polyme hóa tạo cellulose Các sợi siêu nhỏ 1,5nm tạo nên các dãy glucan tạo thành các sợi, sau đó kết hợp với nhau thành bó sợi nhỏ Các bó sợi này sẽ được phun vào môi trường nuôi cấy [9]

1.1.7 Ứng dụng của màng CVK

Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều những công trình nghiên cứu ứng dụng màng CVK trên nhiều các lĩnh vực khác nhau như: lĩnh vực thực phẩm (màng bảo quản trái cây, chất ổn định thực phẩm,…) Gần đây, người ta sử dụng màng CVK làm vật liệu mang thuốc Curcumin để nhận biết sự thay đổi pH của sản phẩm thủy sản bằng cách đánh giá cảm quan sự thay đổi màu sắc của Curcumin [19] Trong lĩnh vực y học người ta ứng dụng màng CVK để: tạo ruột giả, màng trị bỏng, mạch máu nhân tạo trong điều trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da [9]

Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng được thực nghiệm ở thỏ Kết quả cho thấy 10 rằng màng CVK giúp vết thương mau lành và ngăn không cho vết thương nhiễm trùng [11] Ngoài ra, màng CVK còn được ứng dụng trong ghép mô, cơ quan nội tạng, làm tác nhân vận chuyển thuốc

Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng CVK trong vận tải và phân phối thuốc đã được báo cáo [21], trong đó có 9 nghiên cứu với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng CVK và 7 với các vật liệu nanocomposite Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu

1.1.8 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [9]

A xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn cacbonhydrat Nguồn cacbonhydrat mà A xylinum sử dụng là glucose,

fructose, maninol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, galactose, lactose, sucrose cho hiệu suất thập hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong

môi trường còn phụ thuộc vào những chủng A xylinum khác nhau [6]

Nhu cầu sử dụng đương ở A xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong

quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm: rỉ đường, chất thải trong công nghiệp sản xuất khoai tây và

pho mát, nước dừa già và nước mía, để làm nguyên liêu nuôi cấy A xylinum Ngoài môi trường chuẩn thì môi trường nước dừa già và nước vo gạo cũng được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A xylinum [9]

Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già và nước vo gạo được trình bày trong bảng 1.1, 1.2 [9]

Bảng 1.1: Thành phần của nước dừa già

Protein (%) 0,72 Đồng (mg/100g) 0,04 Chất béo toàn phần (%) 0,72 Mangan (mg/100g) 0,142

1.1.9 Các phương pháp sản xuất CVK từ A xylinum

1.1.9.1 Lên men tĩnh

Môi trường dinh dưỡng để lên men A xylinum được cho vào các khay

bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30ᴼC Sợi cellulose mới được tổng hợp

sẽ di chuyển lên bề mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên Sau 7-10 ngày có thể thu CVK [9,22]

1.1.9.2 Lên men động

Vi khuẩn A xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy

lắc Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy

đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở 28-30ᴼC, 180-200 vòng/phút CVK được tạo ra từ môi trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong môi trường Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng

và khả năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A xylinum Do đó, quá trình lên

men đạt hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để

lên men [9,22]

1.2 Tổng quan về Curcumin

Curumin (Cur) là thành phần của củ nghệ vàng curcuma longa L Cur có

dạng bột màu vàng, là thành phần chủ yếu tạo nên màu vàng của nghệ Cùng với tinh dầu, các hợp chất curcuminoid tạo nên vị cay và mùi hăng đặc trưng cho củ nghệ Cur tương đối trơ và không gây độc

1.2.1 Công thức cấu tạo

Tên IUPAC: (1E, 6E)-1,7-bis 3,5- dion

(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)-1,6-heptadien- Công thức phân tử: C21H20O6

 Phân tử khối: 368,38 g / mol

 Nhiệt độ nóng chảy: 183°C (361 K)

 Cur là tinh thể màu nâu đỏ là hoạt chất được chiết ra từ củ nghệ vàng thuộc họ gừng Hiện tại người ta tìm thấy Cur tồn tại ở 4 dạng hợp chất[16]: + Cur là hợp chất chính chiếm 60%:

Curcumin

+ Demetoxy – Curcumin chiếm 24% có công thức cấu tạo như sau:

Demetoxy – Curcumin + Bis - Demetoxy - Curcumin chiếm 14%:

Bis – Demetoxy – Curcumin + Và một hợp chất mới phát hiện là Xiclocurcumin chiếm khoảng 1%

Xiclocurcumin

 Dung dịch Cur trong dung môi hữu cơ có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng khoảng 420- 430nm

1.3.3 Tính chất hóa học của curcumin

 Năm 1913, cấu trúc hóa học của Cur được Lampe xác định qua một loạt

cơ chế phản ứng [11]

 Khi đun Cur với kiềm tạo thành vanilic acid và ferulic acid

 Cur nóng chảy với kiềm cho protocatechuic acid

 Oxy hóa bằng permanganat tạo thành vanilin

 Tác dụng với hydroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol

 Hydro hóa dẫn xuất diacetyl của Cur cho hỗn hợp dẫn xuất haxahydro và tetrahydro

 Các curcuminoit là các polyphenol và là chất tạo màu vàng cho củ nghệ Cur có thể tồn tại ít nhất ở 2 dạng tautome là keto và enol

1.2.4 Dược tính

Hiện nay, trong y học Cur được sử dụng nhiều nhất trong điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng, phòng chống ung thư, làm đẹp cho phụ nữ sau sinh Cur có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy, Cur tốt cho tiêu hóa, não bộ, thần kinh, viêm khớp, hỗ trợ ngăn ngừa ung thư, giảm lipit máu [1,6]

Cur là chất hủy diệt ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế hủy diệt từng bước các tế bào ác tính Chúng làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn không cho hình thành các tế bào ung thư mới Trong khi đó các tế bào lành tính không bị ảnh hưởng Cur được coi là chất tiêu biểu nhất cho thế hệ mới các chất chống ung thư vừa rất hiệu lực vừa an toàn [2,10,11] Cur có khả năng mạnh mẽ giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ làm tăng hồng cầu, loại bỏ cholesterol xấu, điều hòa huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn chặn béo phì, xóa bỏ tàn nhang, đồi mồi, trứng

cá chống rụng tóc giúp mau chóng mọc tóc, làm cho da dẻ hồng hào, tăng cường sắc đẹp, Cur là một trong những chất chống viêm, chống ôxi hóa điển hình

Nó không chỉ góp phần vào điều trị ung thư, loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, yếu gan mật, mà còn điều trị vừa nhẹ nhàng vừa hiệu quả các bệnh rối loạn hệ miễn dịch như viêm toàn thân, viêm đa khớp, viêm lõi đầu khớp, đau hệ tiêu

hóa, rối loạn tuyến giáp, hỗ trợ điều trị bệnh Parkison, nhũn não [2,10,11] Cur

có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn như virus HP, viêm gan B, rất cao [2,10,11]

Tuy nhiên, rào cản lớn khiến tinh chất nghệ Cur chưa được ứng dụng rộng rãi là do Cur tan rất ít trong nước, sinh khả dụng thấp, sự chuyển hóa nhanh và

sự đào thải lớn khi vào cơ thể

1.2.5 Sinh khả dụng của Curcumin

Cur được hấp thụ một lượng rất nhỏ sau khi ăn Cur không bền vững trong ruột và chỉ một lượng nhỏ đi qua đường tiêu hóa và nhanh chóng bị thoái hóa hoặc liên hợp thành glucuronidation

Nghiên cứu của Shoba G, Joy D, Joseph T và các cộng sự tại khoa Dược, Đại học Y St John, Bangalore, Ấn Độ đã cho thấy hoạt chất piperine chiết xuất

từ hạt tiêu đen có tác dụng tăng hấp thu và giảm đào thải của Cur trong máu lên

rõ rệt Một nghiên cứu của nhóm này được đăng tải trên tạp chí Pubmed của Thư viện y khoa quốc gia và Viện sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ tháng 5 năm 1998 đã chứng minh được sinh khả dụng của Cur trên cơ thể người khi kết hợp với piperine từ hạt tiêu theo tỉ lệ 1% đã tăng lên tới 2000% so với khi không dùng piperine [14,23]

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bằng sáng chế đầu tiên về Cur dạng nano được mang mã số EP 103266A2 ngày 30/5/2001 (Ib - 8), và tài liệu nghiên cứu đầu tiên về nano Cur dành cho mục đích y học được công bố vào năm 2005 [21] Kể từ đó là sự bùng nổ các nghiên cứu và bằng phát minh về nano Cur (năm 2005 có 18 bằng thì đến năm

2010 đã lên đến gần 100 bằng) Để đánh giá tiềm năng ứng dụng của Cur dạng nano trong lĩnh vực y học, 254 bằng phát minh có liên quan đã được phân tích, cho thấy 24% bằng liên quan đến điều trị ung thư, sau đó là các bệnh tim mạch

13%, các chứng viêm 12%, bệnh tiểu đường 11%, bệnh khớp 10% và bệnh tiêu hóa 9%,… [21]

Theo các tài liệu trước đã thống kê đã có rất nhiều các bài báo khoa học và các bằng phát minh về Cur trên thế giới những tác giả đầu tiên đã nghiên cứu trên thực nghiệm để chứng minh tác dụng điều trị của Cur, đó là tác dụng chống tăng đường huyết (Srinivasan, M 1972), tác dụng chống viêm (Srimal, R.C 1973), tác dụng chống oxy hóa (Sharma, O.P 1976), tác dụng chống thấp khớp (Deodhar, S.D 1980), tác dụng bảo vệ gan (Kiso, Y 1983), tác dụng chống ung thư (Kuttun R 1985), tác dụng ức chế tắc mạch (Srivastava, R 1995), tác dụng phòng nhồi máu cơ tim (Dikshit, M 1995), tác dụng kháng khuẩn (Jordan, W.C 1996), tác dụng bảo vệ thận (Venkatesan, N 2000), tác dụng chống việm loét dạ dày (Ronita De, 2009),…[28]

Nghiên cứu năm 2011 của Bambang Kuwandi và cộng sự về Cur/CVK trong việc phát hiện sự hư hỏng của tôm [13] Công trình này sử dụng thuốc nhuộm tự nhiên của chất Cur như chất cảm biến để phát hiện các biến động vô

cơ và hữu cơ được sản xuất trong quá trình tăng trưởng của vi khuẩn trong mẫu tôm Cur được sử dụng như là thuốc thử cảm biến tự nhiên , là cố định trên CVK

sử dụng hấp thụ như một phương pháp đơn giản cho phép khối lượng sản xuất của bộ cảm biến chi phí thấp Như vậy, tất cả các vật liệu cảm biến có thể ăn được và phù hợp cho các ứng dụng thực phẩm Các chất Cur/CVK đã được sử dụng thành công như một cảm biến nhãn dán trên gói cho một phát hiện hình ảnh của tôm hư hỏng [13]

Nghiên cứu năm 2012 của Min Sun, Xun Su, Buyun Ding, Xiuli He, Xiuju Liu, Aihua Yu, Hongxiang Lou, Guangxi Zhai về những tiến bộ trong 15

hệ thống phân phối cho chất Cur dựa trên công nghệ nano [17]

Năm 2013, các nhà khoa học của Trung tâm Da Liễu, Đại học y khoa Rochester, New York, Hoa Kỳ đã nghiên cứu Cur về khả năng làm giảm

mức độ nghiêm trọng của biến chứng viêm da do trị xạ Và cũng vào năm đó, tại Viện giải phẫu, Đại học Munich, Đức các nhà khoa học Shakibaei M, Mobasheri A, Lueders C, Busch F, Shayan P, Goel A đã nghiên cứu Cur làm tăng tác dụng của hóa trị liệu chống lại tế bào ung thư đại trực tràng thông qua con đường NF-κB/PI-3K/Src Kết quả nghiên cứu cho thấy dùng Cur giảm đáng

kể cả hai tế bào HCT116 và CH3 Cur tiêu diệt tế bào ung thư bằng cách gây thoái hóa ty lạp thể và giải phóng cytochromec

Theo Ornchuma Naksuriya và cộng sự năm 2014 đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng làm giảm kích thước khối u gây mô hình động vật thực nghiêm khi cho uống ở liều 20mg/kg chuột sau 16 tuần theo dõi Cũng công trình này tác giả đã chứng minh khi phối hợp Nano Curcumin và các hoạt chất chữa ung thƣ khác như paclitaxel đã làm giảm liều sử dụng và làm tăng hiệu quả chữa trị ung thư đáng kể

Tóm lại, hệ thống phân phối thuốc mới làm sáng tỏ về sự phát triển của các công thức mới, trong khi đó, nghiên cứu sâu rộng hơn nên được thực hiện trong tương lai để giải quyết các vấn đề dược phẩm và làm đẹp

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu liên quan đến Cur nhưng chủ yếu là các công trình nghiên cứu liên quan đến tách chiết và chế tạo vật liệu Nano Cur từ củ nghệ vàng như Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Viêt Nam (Viện HLKHVCNVN), Trung tâm nghiên cứu triển khai Khu công nghệ cao TP.HCM, Đại học Dược Hà Nội Trong đó Viện hóa học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam là đơn vị đầu tiên chuyển giao thành

công đề tài nghiên cứu để đưa Nano Cur ra thị trường

Trịnh Hoàng Dương, Hà Diệu Ly,Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh đã nghiên cứu chiết xuất Cur từ củ nghệ vàng và xây dựng bộ dữ liệu chuẩn của Cur để thiết lập chất chuẩn chiết từ dược liệu [10] Hay

nhóm các nhà nghiên cứu Dương Thị Hồng Ánh, Phạm Văn Giang, Nguyễn Trần Linh Trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu bào chế tiểu phân nano Cur bằng phương pháp nghiền bi kết hợp với đồng nhất hóa tốc độ cao [2]

Phạm Hữu Lý thuộc Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng các cộng sự đã sản xuất thành công quy mô pilot nano Cur Sản phẩm 14 này được thương mại hóa với tên đăng ký là Curmanano - có kích thước dưới 100nm, tan tốt trong nước, hấp thụ nhanh qua màng tế bào, sinh khả dụng lên tới 80 - 95%, giúp mang lại hiệu quả điều trị gấp 40 lần Cur thường [13]

Các nghiên cứu về Cur trên thế giới và ở Việt Nam hầu như hướng tới nghiên cứu về nano Cur và ứng dụng trong điều trị các bệnh về ung thư là chủ yếu Do đó, đề tài mở ra một hướng đi mới trên cơ sở sử dụng màng CVK làm vật liệu hấp thụ thuốc để làm tăng sinh khả dụng của Cur, khắc phục các yếu điểm của thuốc trong điều trị bệnh Cũng như so sánh được khả năng hấp thụ thuốc Cur của màng cellulose vi khuẩn lên mem từ môi trường (môi trường chuẩn, nước vo gạo, nước dừa già), môi trường nào hấp thụ tốt nhất để ứng dụng

vào thực tiễn

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Giống vi khuẩn

Giống vi khuẩn A xylinum thuần chủng được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm

Vi sinh khoa sinh - KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2

2.1.2 Nguyên liệu - hóa chất

 Nguyên liệu: nước dừa, nước vo gạo, nước cất 2 lần, gạc vô trùng

 Hóa chất:

 Curcumin 95% xuất sứ từ Maharashtra, Ấn Độ

 Màng CVK (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi

khuẩn A xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trường ĐHSP Hà Nội 2)

lên men trong môi trường dinh dưỡng

 Dung môi là etanol 96% và chất phản ứng khác được cung cấp từ Viện Nghiên cức Khoa học và Ứng dụng Trường ĐHSP Hà Nội 2

 Đường glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali đihiđrophotphat, HCl, NaOH,… đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

2.1.3.1 Thiết bị

- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản)

- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ)

- Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S

- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA

- Buồng cấy vô trùng (Haraeus)

- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức)

- Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh)