Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC để nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc với một số loại thuốc có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI- 2017

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Xuân Thành

và các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ để em hoàn thiện được khóa luận này

Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến những thầy cô giáo đã giảng dạy em trong bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất Nhưng do lần đầu em được làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót mà bản thân chưa thấy được Em rất mong được sự đóng góp của quý thầy cô và các bạn để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

Trần Phương Lan

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của em trong suốt thời gian qua, những kết quả và số liệu trong khóa luận được em thực hiện tại “Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2”

Những số liệu đạt được không hề sao chép hay trùng lặp với bất kỳ tài liệu nào và cũng chưa từng được công bố trên bất kỳ phương tiện truyền thông nào

Hà Nội, ngày 21 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

Trần Phương Lan

BẢNG VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng Việt

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Nội dung nghiên cứu 3

5 Vật liệu nghiên cứu 4

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 5

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

1.2 Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 7

1.2.1 Đặc điểm phân loại của A xylinum 7

1.2.2 Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A xylinum 9

1.3 Sơ lược về Curcumin 12

1.4 Tình hình nghiên cứu về Curcumin 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp dựng đường chuẩn 21

2.2.2 Chuẩn bị màng BC 23

2.2.3 Chuẩn bị môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline)-PBS 1X 26

2.2.4 Chế tạo màng BC 26

2.2.5 Xác định lượng Curcumin nạp vào màng BC 27

2.2.6 Khảo sát lượng thuốc giải phóng của màng BC ở các độ dày màng 0,3cm và 1cm, trong các môi trường pH khác nhau 28

2.2.7 Xác định lượng thuốc giải phóng của màng BC đã nạp thuốc Curcumin.

29

2.2.8 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Nghiên cứu về độ dày màng 30

3.2 Tinh chế màng BC 31

3.3 Thu màng BC nạp Curcumin 33

3.4 Giải phóng thuốc từ màng BC 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1 Kết luận 45

2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trong nước vo gạo 11

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Curcumin 14

Bảng 2.1 Bảng nồng độ Curcumin 30% ở giá trị đo OD=427 (n=3) 22

Bảng 2.2 Môi trường lên men tạo màng BC 23

Bảng 2.3 Môi trường đệm PBS 26

Bảng 3.1 Kết quả thu màng BC tươi 30

Bảng 3.2 Khối lượng Curcumin nạp vào màng BC (n=3) 34

Bảng 3.3 Giá trị đo quang phổ UV-Vis khi giải phóng thuốc (n=3) 37

Bảng 3.4 Tỉ lệ giải phóng thuốc Curcumin (n=3) 39

Bảng 3.5 Hệ số tương quan bình phương (R2), tốc độ giải phóng (K) và trị số số mũ giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau của hai độ dày màng BC 43

DANH MỤC HÌNH

Hình1.1 Cấu trúc hóa học cơ bản của BC: chuỗi polime ß-1,4-glucopyranose

không phân nhánh 9

Hình 2.1 Phương trình đường chuẩn của Curcumin 20% 22

Bảng 2.3 Môi trường đệm PBS 26

Hình 3.1 Màng BC khi lên men 30

Hình 3.2 Màng BC ngâm trong NAOH 3% 32

Hình 3.3 Màng BC ngâm HCL 3% 32

Hình 3.4 Màng BC tinh chế 33

Hình 3.5 Màng BC sau khi nạp thuốc curcumin sấy loại bớt 30% nước 34

Bảng 3.3 Giá trị đo quang phổ UV-Vis khi giải phóng thuốc (n=3) 37

Hình 3.9 Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc của màng BC 40

Hình 3.10 Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng ở pH=2 41

Hình 3.11 Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng ở pH=6 41

Hình 3.12 Biểu đồ tỉ lệ dược chất giải phóng ở pH=12 42

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Hiện nay, Acetobacter xylinum (A xylinum) cũng như bacterial

cellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài Theo kết quả nghiên cứu cho thấy màng

BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy

mô công nghiệp BC là sản phẩm của một số loài vi khuẩn, đặc biệt là chủng

A xylinum BC được tạo thành từ A xylinum có cấu trúc hóa học rất giống

cellulose của thực vật nhưng có một số tính chất lý hóa đặc biệt như: độ bền

cơ học và khả năng thấm hút nước cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước và hướng, đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao và độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm ban đầu, có thể bị phân hủy bởi enzyme [1],… Vì vậy BC là một loại nguyên liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, công nghệ giấy, mỹ phẩm,… đặc biệt trong lĩnh vực y học

Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC để nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc với một số loại thuốc có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường Việc sử dụng màng BC cho việc hấp thụ và giải phóng của hàng loạt các loại thuốc đã được nghiên cứu, cụ thể là lidocaine, ibuprophen, caffeine, diclofenac và sulfadiazine bạc cho kết quả tích cực Các kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có độ bền và trương nở tương tự như da người, hỗ trợ sự phát triển, lây lan, và di chuyển của tế bào

da của con người

Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC hấp thụ thuốc là khả năng chữa lành vết thương, đặc tính bảo vệ, khả năng hấp thụ dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan Do đó, một hệ thống hấp thụ có khả

năng giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí

Nghệ (tên khoa học Curcuma longa) có tác dụng cho gan và tiêu hóa,

rối loạn kinh nguyệt và chuột rút, vàng da, và là một tác nhân chống viêm tốt Thành phần hoạt chất chính giúp Nghệ phát huy tác dụng chăm sóc sức khỏe toàn diện là Curcumin Những năm gần đây, Curcumin nổi lên như một hoạt chất của thời đại với số lượng trên 1000 nghiên cứu và trên 6000 bài báo viết

về tác dụng Kết quả các nghiên cứu khẳng định, Curcumin là một trong những tinh chất thiên nhiên tốt nhất cho sức khỏe Tại Hoa Kỳ, Curcumin đã được cấp "Chứng nhận An toàn " (GRAS) theo FDA Thư viện Pubmed có tới

5612 bài báo nghiên cứu về tác dụng của hoạt chất Curcumin Từ năm 2008,

đã có rất nhiều thử nghiệm lâm sàng trên người để nghiên cứu về tác dụng của Curcumin Curcumin đã được các nhà khoa học khẳng định hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính, nan y như: ung thư, viêm loét dạ dày

(Curcumin có tác dụng diệt 65 chủng lâm sàng vi khuẩn Helicobacter pylori,

ức chế chất gây viêm COX2 [28], tăng tái tạo mạch máu chống thiếu máu cục

bộ [20], tăng tiết chất nhày dạ dày) Tuy nhiên, rào cản lớn khiến tinh chất nghệ Curcumin chưa được ứng dụng rộng rãi là do Curcumin ít tan trong nước, sinh khả dụng thấp [18] Curcumin có nhiều tác dụng trong việc điều trị ung thư, đau dạ dày, có khả năng mạnh mẽ giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ và làm tăng hồng cầu,… Ngoài ra Curcumin còn là một trong những chất chống viêm, chống oxi hóa điển hình Nó không chỉ điều trị đắc lực cho các bệnh ung thư, đau dạ dày, tá tràng,… mà còn điều trị vừa nhẹ nhàng vừa hiệu quả cao các bệnh rối loạn hệ miễn dịch như viêm toàn thân, viêm đa khớp, viêm lõi cầu khớp, bệnh đa sơ cứng, bệnh cứng bì, loãng xương,… Tuy nhiên, Curcumin cũng giống như các chất oxi hóa khác, là con dao hai lưỡi có nhiều tác dụng thì cũng có nhiều hạn chế Cần thiết kế hệ thống hấp thụ và giải

phóng thuốc Curcumin để giúp thuốc giải phóng một cách kéo dài, từ đó có thể tăng khả dụng sinh học của thuốc

Với mục đích nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc dựa trên màng BC giúp Curcumin giải phóng một cách kéo dài, từ đó có thể làm tăng

khả dụng sinh học của thuốc trong điều trị bệnh, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy và thu sản phẩm BC từ A xylinum từ đó

nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc dựa trên màng BC nhằm khắc phục được hạn chế của thuốc, giúp thuốc giải phóng kéo dài, có thể giúp tăng lượng thuốc hấp thụ vào cơ thể để thuốc phát huy được hiệu quả tốt nhất trong việc chữa trị bệnh, từ đó có thể làm tăng sinh khả dụng của thuốc, tăng hiệu quả điều trị của thuốc

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc Curcumin của màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu in vitro (nghiên cứu ngoài cơ thể)

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm sinh lý người và động vật, Khoa Sinh-KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường ĐHSP Hà Nội 2

4 Nội dung nghiên cứu

- Thiết kế, tạo màng BC, nạp Curcumin vào màng

-Thử nghiệm tác dụng của màng BC nạp Curcumin trong quá trình giải phóng thuốc Đánh giá sự hấp thụ và giải phóng thuốc của màng BC

5 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ môi trường nước vo gạo, thuốc

Curcumin dạng tinh khiết 95%

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

❖ Ý nghĩa khoa học: Tăng thêm hiểu biết về ứng dụng của màng BC

Về mặt khoa học thì việc nghiên cứu ứng dụng màng BC vào việc khắc phục hạn chế của thuốc Curcumin sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không chỉ dừng lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng trên nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển hơn Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của màng BC

để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả màng BC, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh vực khác nhau Tiếp tục mở rộng nghiên cứu tiềm năng của màng BC để áp dụng loại màng này vào nhiều các lĩnh vực khác nhau trong thực tiễn đời sống Từ kết quả nghiên cứu trên, mở ra những hướng nghiên cứu mới về khả năng hấp thụ

và giải phóng thuốc của màng BC trên nhiều các loại thuốc khác nhau nhằm tăng khả dụng sinh học của các loại thuốc đó

❖ Ý nghĩa thực tiễn

+ Xây dựng được quy trình tạo màng BC từ chủng A xylinum

+ Từ màng BC đã được tạo ra được dùng nghiên cứu khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc nhằm khắc phục tối đa những hạn chế của Curcumin, từ đó có thể làm tăng sinh khả dụng của thuốc

+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới màng BC đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau Tác giả Brown (1989), dùng màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin

và năng lượng cho tế bào Brown (1989), Jonas và Farad (1998) dùng màng như là một chất để chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [7] Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con người [7]

Tính đến cuối năm 2014 trên thế giới chỉ có 18 nghiên cứu ứng dụng

BC trong hấp thụ và giải phóng thuốc đã được báo cáo [21], trong đó có 9 nghiên cứu với màng BC tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng

BC và 7 với các vật liệu Nanocomposite Như vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục được tiến hành nghiên cứu

Một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm hệ thống hấp thụ và giải phóng thuốc qua da với một số loại thuốc đã cho thấy có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường [7] Nghiên cứu của Wei B và cộng sự (2011) cho thấy màng khô BC thu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn, Merck KGaA, Darmstadt, Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo

dài ít nhất 24 giờ chống lại hoạt động của S aureus và B subtilis Sợi BC với

các hạt Nano bạc đã sản xuất thành công lên đến 99,99% hoạt tính kháng

khuẩn chống lại E coli và S aureus [26] Nghiên cứu khác cho thấy việc sử

dụng Nanocomposites bạc với BC đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao [24] Các S-enantiomer của propranolol, một loại thuốc chống cao huyết áp, có được giải phóng từ một lớp composite của BC với methacrylate, và đã thử nghiệm

in vivo cho kết quả tốt [6, 8] Một miếng dán có thể giải phóng thuốc

enantiomeric đã được chứng minh bằng cách sử dụng một bể chứa gel và polyme in dấu phân tử (MIP) màng Nghiên cứu về gel miếng dán gồm của chitosan và poloxamer chứng minh rằng sau 8 giờ, Cmax của S-propranolol đã đạt được (8,0 ± 1,0ng/ml) từ một hồ chứa 1,5mg propranolol racemic [23] Tiềm năng hấp thụ và giải phóng thuốc của màng BC qua da đã được nghiên cứu bằng cách tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không được chiếu xạ BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so với ảnh hưởng của BC chiếu xạ Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BC không chỉ có khả năng hấp thụ mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóng thuốc qua màng [21] Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể là lidocaine [14, 15], ibuprophen [15], caffeine [12], diclofenac [11] và sulfadiazine bạc [10] cho kết quả tích cực Các kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ ẩm cho bề mặt da Tất cả 5 loại thuốc trên đã được

thử nghiệm in vitro cho thẩm thấu qua da [23] và so sánh với cách thức thông

thường Kết quả cho thấy ibuprofen là chất ưu mỡ thấm qua màng BC cao hơn gần ba lần những quan sát trong gel hoặc các giải pháp PEG400, lidocaine hydrochloride thẩm thấu qua màng chậm hơn ibuprofen, do màng

BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch tán của thuốc được kéo dài và làm giảm tỷ lệ giải phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông thường, đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của thuốc

mà không gây tình trạng quá mẫn [15] Luan J et al (2012) [10], đã nghiên cứu màng BC cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng Nó đã được chứng minh rằng sau khi sử dụng màng BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine,

hoạt động kháng khuẩn đối với P aeruginosa, E coli và S aureus đạt hiệu

quả tốt hơn dạng kem bôi thông thường

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm

Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật-Vi sinh Trường

Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A xylinum có

khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ

chủng A xylinum có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo

ra màng trị bỏng cho người [1]

Tại Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Văn Thanh cùng nhóm nghiên cứu đã thành công với đề tài “Nghiên cứu chế tạo màng

cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”

Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [3] đã tiến hành nuôi cấy, tinh

chế và thu màng BC từ A xylinum đạt hiệu quả cao Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong ứng dụng màng BC điều

trị bỏng với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh

mô tốt hơn hẳn

Mong muốn khắc phục được một số tác dụng phụ của thuốc Curcumin trong việc làm đẹp, nâng cao tối đa hiệu quả của thuốc mà tiết kiệm được chi phí Màng BC có thể tự sản xuất trong nước từ những nguồn nguyên liệu dễ kiếm và giá thành thấp, có những đặc tính phù hợp trong việc thiết kế, chế tạo

hệ thống hấp thụ và giải phóng thuốc Curcumin

1.2 Tổng quan về đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu

1.2.1 Đặc điểm phân loại của A xylinum

1.2.1.1 Vị trí phân loại của A xylinum

A xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic, chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae [14]

Là loại hiếu khí bắt buộc, có chu mao và sản xuất cellulose ngoại bào

Theo khóa phân loại của Bergey, A xylinum thuộc [14]:

• Lớp: Schizomycetes

• Bộ: Pseudomonadales

• Bộ phụ: Pseudomonadieae

• Họ: Pseudomonadaceae

1.2.1.2 Đặc điểm vi khuẩn A xylinum

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang

khoảng 0,6-0,8µm, dài khoảng 2-3µm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm, không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già hay do điều kiện môi trường nuôi cấy, hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [25]

Trong môi trường nuôi cấy rắn, sau khoảng từ 3-7 ngày nuôi cấy, sẽ thu được khuẩn lạc nhỏ rồi lớn dần, đường kính hạt từ 2-5mm, tròn, nhày, rìa mép trơn, có màu kem, hơi trong Nhưng sau một tuần khuẩn lạc to, đục, có màu cafe sữa rồi khô dần [25]

1.2.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn A xylinum

A xylinum là loài vi khuẩn hiếu khí Nhiệt độ tối ưu cho vi khuẩn phát

triển từ 25-30°C Ở nhiệt độ 37°C tế bào sẽ bị suy thoái hoàn toàn Nhiệt độ thích hợp nhất là 25°C [9]

Vi khuẩn tăng trưởng trong khoảng pH từ 3-8, pH tối ưu để sản xuất cellulose là 5,5

Nghiên cứu gần đây của Maccormick và cộng sự cho rằng A xylinum

có khả năng chịu được hàm lượng EtOH lên đến 10% A xylinum sử dụng

cacbon từ nhiều loại đường khác nhau, tùy thuộc vào chủng mà lượng đường

có thể thay đổi, nhưng đường hay được sử dụng và cho hiệu suất cao là: glucose, fructose, manitol, sorbitol, nguồn đường cho hiệu suất thấp hơn là glycerol, galactose, sucrose, maltose [9]

A xylinum có thể tích tụ acid acetic trong môi trường nuôi cấy Các tế

bào vi khuẩn kháng lại được sự thay đổi pH của môi trường Trong lúc nuôi cấy môi trường có thể giảm đi từ 1-2 đơn vị do sự tạo ra acid acetic, acid gluconic, do đó khi nuôi cấy, để tránh nhiễm các loài vi khuẩn lạ, người ta thường bổ sung acid acetic vào môi trường [9]

Trong môi trường nuôi cấy lỏng, vi khuẩn sử dụng đường để chuyển hóa thành cellulose tạo lớp màng dày trên bề mặt của môi trường Sau 36-48 giờ lớp màng dày, trong và đạt đến độ dày nhất định sau 7-10 ngày [9]

1.2.2 Cấu trúc đặc tính của màng BC tạo bởi A.xylinum

1.2.2.1 Cấu trúc

Cellulose vi khuẩn cấu tạo bởi những chuỗi polimer glucopyranose không phân nhánh Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của BC giống cellulose của thực vật (plant cellulose-PC), tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [13]

Hình1.1 Cấu trúc hóa học cơ bản của BC: chuỗi polime

ß-1,4-glucopyranose không phân nhánh

Theo AJ Brown (1886), BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ có bản chất là hemicellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3-8nm [13]

Đặc tính cấu trúc của BC phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy (Watanabe et al.,1998a; Yamanaka et al.,2000)

Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh, A xylinum tạo ra cellulose nhiều

hơn và tạo thành màng dày trên bề mặt môi trường Màng BC thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng BC được tạo ra từ phương pháp nuôi cấy tĩnh gọi là S-BC (S-BC: Static-Bacterial cellulose) trong đó chuỗi ß-1,4-glucogan xếp song song quanh trục Các sợi cellulose sơ cấp được đẩy ra từ các lỗ nằm trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, các sợi sơ cấp này

kết tinh lại thành các vi sợi được đẩy ra bên ngoài môi trường nuôi cấy và các dãy cellulose tạo nên các mặt phẳng song song có vai trò chống đỡ cho tế bào

A xylinum [13]

1.2.2.2 Đặc tính của màng BC

Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0,01-0,5nm Sản phẩm này có những tính chất rất đặc biệt như: độ tinh sạch cao, khả năng đàn hồi tốt, độ kết tinh

và độ bền cơ học cao, có thể bị phân hủy sinh học, bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thường, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt, đặc biệt

là khả năng cản khuẩn Với các tính chất này BC được ứng dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp khác nhau trong đó có y học [1]

1.2.2.3 Chức năng sinh lý của BC

A xylinum là vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ngoại bào, những tế

bào vi khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt môi trường và thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn không nằm trong mạng lưới polymer [1]

Cellulose có các đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và hút cao,

trạng thái kết tinh giúp A xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường như

việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do lượng

nước bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra [1]

1.2.2.4 Môi trường nuôi cấy A xylinum

Môi trường nuôi cấy A xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn

dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [9]

A xylinum là loài có khả năng tổng hợp cellulose từ nguồn

cacbonhydrat Nguồn cacbonhydrat mà A xylinum sử dụng là glucose,

fructose, manitol, sorbitol nếu sử dụng glycerol, glactose, lactose, sucrose cho hiệu suất thấp hơn, không nên sử dụng mannose, cellobiose, erythriol, acetate Việc sử dụng các loại đường cũng như nồng độ các loại đường trong môi

trường còn phụ thuộc vào những chủng A xylinum khác nhau [9]

Nhu cầu sử dụng đường của A xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan

trọng trong quá trình tổng hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường,

nước dừa già, nước mía, để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A xylinum Trong đó nước gạo được xem là môi trường kinh điển trong nuôi cấy A

xylinum

Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước gạo có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các vitamin như cacbonhydrat,

sắt, vitamin C, vitamin B, Vì vậy A xylinum rất thích hợp phát triển trong

môi trường nước gạo, thành phần dinh dưỡng của nước gạo được thể hiện ở bảng 1.1:

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng trong nước vo gạo

1.3 Sơ lược về Curcumin

1.3.1 Tìm hiểu về Curcumin

Tên IUPAC: (1E, dion

6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-metoxyphenyl)-1,6-heptadien-3,5-Công thức phân tử: C21H20O6

Phân tử khối: 368,38g/mol

Curcumin là tinh thể nâu đỏ ánh tím, không tan trong nước, tan trong rượu, ete, clorofoc, dung dịch có huỳnh quang màu xanh Hiện tại người ta tìm thấy Curcumin tồn tại ở 4 dạng hợp chất:

+ Curcumin là hợp chất chính chiếm 60%:

Curcumin + Demetoxy-curcumin chiếm 24% có công thức cấu tạo sau:

Demetoxy-curcumin + Bis-demetoxy-curcumin chiếm 14%:

Bis-demetoxy-curcumin

+ Và một số hợp chất mới phát hiện là xiclocurcumin chiếm khoảng 1%:

và trung tính, tan trong môi trường kiềm

- Dung dịch Curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng khoảng từ 420-430nm

- Curcumin có thể phản ứng được với acid boric tạo nên hợp chất có màu đỏ cam nên được ứng dụng dùng để nhận biết muối của nguyên tố Bo Chính vì Curcumin là sắc tố tạo nên màu vàng sáng nên Curcumin được dùng làm chất phụ gia thực phẩm Trong chất phụ gia thực phẩm Curcumin được kí hiệu dưới ám số E100 [27]

1.3.3 Tính chất hóa học của Curcumin

dung dịch chuyển sang đỏ Giá trị hằng số phân ly pKa của 3 proton dạng acid của Curcumin (dạng H2A-, HA-2, A3-) được xác định tương ứng là 7,8; 8,5 và 9,0

Curcumin không tan ở môi trường nước ở pH acid và trung tính, nhưng tan tốt trong pH kiềm Nghiên cứu ở kĩ thuật HPLC cho kết quả điện li theo

pH của Curcumin [12] được trình bày ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của pH lên màu và dạng tồn tại của Curcumin

c Phản ứng phân hủy trong môi trường kiềm

Curcumin tương đối bền ở pH acid, nhưng lại nhanh chóng bị phân hủy

ở pH kiềm Đầu tiên ferulic acid và ferulolymethane được tạo thành Sau đó, eruolylmethane nhanh chóng tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu vàng đến vàng nâu Tiếp theo, eruolylmethane tiếp tục thủy phân tạo ra vanillin và acetone và lượng các chất này tăng theo thời gian ủ [16]

d Phân hủy dưới tác dụng ánh sang

Curcumin không bền ánh sáng, đặc biệt ở trạng thái dung dịch Curcumin bị phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng ngay cả ở dạng rắn

Sản phẩm phân hủy là vanillin, vanillin acid, ferulic aldehyde và ferulic acid [29] Khi bị chiếu xạ, Curcumin bị đóng vòng hoặc phân hủy thành vanillin acid, vanillin và ferulic acid (Sasaki et al, 1998) [16] Khi có mặt của oxy và ánh sáng, Curcumin bị phân hủy tạo thành 4-vinyl guaialcol và vanillin

e Phản ứng tạo phức với kim loại

Curcumin là hợp chất β - diketone nên cũng có tính chất hóa học của một

β - diketone Protone của nhóm methyl ở dạng keto và proton của nhóm hydroxyl ở dạng enol của hợp chất β - diketone có tính acid Khi các hydro này bứt ra, diketone sẽ tạo thành anion 1,3 - diketoneate Diketone anion này

có thể tạo phức vòng càng với các kim loại chuyển tiếp và những nguyên tố phân nhóm chính Muối kim loại thường được sử dụng cho phản ứng tạo phức

là muối acetate, clorua, nitrate, sunfate, carbonate của các kim loại chuyển tiếp như: Cu, Fe, Mn, Zn, V, Ga, In, Ni, Co, Pd, Hg [17] Các phức này cũng

có hoạt tính loại bỏ gốc tự do được ứng dụng trong ngành dược

f Phản ứng của nhóm phenolic OH

Một trong những hoạt tính đáng chú ý của Curcumin là khả năng loại bỏ gốc oxygen hoạt động và các gốc nitrogen tự do Đó là do Curcumin có 2 nhóm o - methoxy phenolic OH đính vào mạch hetadience - dione Các electron chưa liên kết của nhóm OH liên hợp với vòng benzen làm cho H của nhóm này linh động hơn Điều đó giải thích cho tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của Curcumin [17]

1.3.4 Dược tính của Curcumin

Curcumin có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa dọn sạch gốc tự do điển hình gấp 300 lần vitamin E Curcumin tốt cho tiêu hóa, não bộ, thần kinh, viêm khớp, hỗ trợ ngăn ngừa ung thư, giảm lipit máu, tiểu đường,… Hiện nay, trong y học Curcumin được sử dụng nhiều nhất trong

điều trị viêm loét dạ dày, tá tràng, phòng chống ung thư, làm đẹp cho phụ nữ sau sinh [3, 4, 5]

Curcumin là chất hủy diệt ung thư vào loại mạnh nhất theo cơ chế hủy diệt từng bước các tế bào ác tính Chúng làm vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn không cho hình thành các tế bào ung thư mới Trong khi đó các tế bào lành tính không bị ảnh hưởng Curcumin được coi là chất tiêu biểu nhất cho thế hệ mới các chất chống ung thư vừa rất hiệu lực vừa an toàn [3, 4, 5]

Curcumin có khả năng mạnh mẽ giải độc và bảo vệ gan, bảo vệ làm tăng hồng cầu, loại bỏ cholesterol xấu, điều hòa huyết áp, hạ mỡ máu, ngăn chặn béo phì, xóa bỏ tàn nhang, đồi mồi, trứng cá chống rụng tóc giúp mau chóng mọc tóc, làm cho da dẻ hồng hào, tăng cường sắc đẹp,

Curcumin là một trong những chất chống viêm, chống ôxi hóa điển hình Nó không chỉ góp phần vào điều trị ung thư, loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, yếu gan mật, mà còn điều trị vừa nhẹ nhàng vừa hiệu quả các bệnh rối loạn hệ miễn dịch như viêm toàn thân, viêm đa khớp, viêm lõi đầu khớp, đau hệ tiêu hóa, rối loạn tuyến giáp, hỗ trợ điều trị bệnh Parkison, nhũn não [3, 4, 5]

Curcumin có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn như virus HP, viêm gan B, rất cao [3, 4, 5]

- Curcumin ở nhiều nước trên thế giới được coi như vừa là thuốc vừa là thực phẩm điều trị gần 20 loại ung thư khác nhau Riêng đối với ung thư máu các nhà khoa học cho biết Curcumin có tác dụng tăng hồng cầu, chống suy kiệt sức lực [12],…

1.3.5 Hạn chế của Curcumin

Theo Kawanishi et al (2005), Curcumin cũng giống như các chất chống oxy hóa khác, là con dao hai lưỡi Các nghiên cứu lâm sàng trên người với 2-12g Curcumin cho thấy các tác dụng phụ như buồn nôn, tiêu chảy, rối

loạn chuyển hóa sắt và chặn protein hepcidin, có khả năng gây ra thiếu sắt ở các bệnh nhân mẫn cảm

1.3.6 Sinh khả dụng của Curcumin

Một phần rất nhỏ Curcumin được hấp thụ sau khi ăn Curcumin không bền vững trong ruột và một lượng rất nhỏ đi qua đường tiêu hóa và nhanh chóng bị thoái hóa hoặc liên hợp thành glucuronidation Nghiên cứu của Shoba G., Joy D., Joseph T và các cộng sự tại khoa Dược, đại học Y St John, Bangalore, Ấn Độ đã cho thấy, hoạt chất Piperine chiết xuất từ hạt tiêu đen có tác dụng tăng hấp thụ và giảm đào thải của Curcumin trong máu lên rõ rệt Một nghiên cứu của nhóm này được đăng tải trên tạp chí Pubmed của Thư viện y khoa quốc gia và Viện Sức khỏe quốc gia Hoa Kỳ tháng 5 năm 1998

đã chứng minh được sinh khả dụng của Curcumin trên cơ thể người khi được kết hợp với Piperine từ hạt tiêu theo tỷ lệ 1% đã tăng lên tới 2000% so với không dùng Piperine [18, 19]

1.4 Tình hình nghiên cứu về Curcumin

1.4.1 Trên thế giới

Nghiên cứu năm 2007, tại Đại học Y khoa MaryLand khẳng định Curcumin giúp trị các rối loạn về da, mụn trứng cá, phát ban, mụn cóc nhờ cơ chế chống viêm, dọn sạch các tế bào gốc tự do Tiếp đó, năm 2010 theo tạp chí những tiến bộ trong y học thực nghiệm và nghiên cứu Đại học Y tế Bethesda, Mỹ chứng minh Curcurmin tác động lên lớp bề mặt da và sâu hơn giúp giảm tích tụ sắc tố, tăng đào thải hắc sắc tố melanin sinh ra nám và ngăn cản tác hại của tia tử ngoại, đồng thời kích thích quá trình trao đổi chất ở các mạch máu dưới da, nuôi dưỡng và đẩy nhanh quá trình tái tạo tế bào da tăng lắng đọng collagen giúp da căng mịn, hồng hào, tươi trẻ, trắng sáng hơn và xóa mờ vết nám một cách tự nhiên

Năm 2009 J Shaikh và cộng sự đã nghiên cứu so sánh khả năng hấp thụ của các dạng Curcumin như Curcumin thường, Curcumin Nano, Curcumin kết hợp với piperin Ở liều sử dụng Nano Curcumin 100mg/kg thể trọng chuột, 250mg/kg Curcumin thường và 250mg/kg Curcumin + 10mg/kg piperin kết quả là nồng độ Curcumin trong máu của lô dùng Nano Curcumin đạt cao nhất sau 2 giờ và đạt 260ng/ml, Curcumin thường chỉ đạt 90,3ng/msl,

và Curcumin kết hợp piperin đạt 121,2ng/ml sau 0,5-0,75 giờ Thời gian tồn tại Curcumin trong máu của lô chuột dùng Nano Cucumin duy trì sau 48 giờ

Bằng sáng chế đầu tiên về curcumin dạng nano được mang mã số EP 103266 A2 ngày 30/5/2001 (Ib-8), và tài liệu nghiên cứu đầu tiên về nano curcumin dành cho mục đích y học được công bố vào năm 2005 [Li L và cs: Cancer 2005,104(6),1322-1331] Từ đó là sự bùng nổ các nghiên cứu và bằng phát minh về nano curcumin: năm 2005 có 18 bằng thì đến năm 2010 đã lên đến

gần 100 Để đánh giá tiềm năng ứng dụng của curcumin dạng nano trong lĩnh vực y học, 254 bằng phát minh có liên quan đã được phân tích, cho thấy 24% bằng liên quan đến điều trị ung thư, sau đó là các bệnh tim mạch 13%, các chứng viêm 12%, bệnh tiểu đường 11%, bệnh khớp 10% và bệnh tiêu hóa 9%,…

Năm 2011 Hiroki Sasaki và cộng sự đã nghiên cứu xác định nồng độ Curcumin trong máu của người dùng Nano Curcumin và Curcumin thường ở cùng liều lượng là 30mg Kết quả cho thấy sau 1 giờ nhóm người dùng Nano Curcumin có nồng độ Curcumin trong máu là 30ng/ml, trong khi đó nhóm người dùng Curcumin thường chỉ đạt nồng độ cao nhất là 1,8ng/ml Đặc biệt nồng độ Curcumin cao trong máu của nhóm người dùng Nano Curcumin duy trì một thời gian dài trong khoảng 24 giờ Điều này đã chứng minh đặc điểm vượt trội của Nano Curcumin trong điều trị

Nhiều tài liệu đã công bố về hoạt tính sinh học của Curcumin đặc biệt

là hoạt tính hủy diệt tế bào ung thư theo nhiều cơ chế khác nhau Do vậy Curcumin có hiệu quả trị liệu ung thư ở các giai đoạn khác nhau của bệnh

Theo Ornchuma Naksuriya và cộng sự năm 2014 đã công bố kết quả nghiên cứu tác dụng làm giảm kích thước khối u gây mô hình động vật thực nghiêm khi cho uống ở liều 20mg/kg chuột sau 16 tuần theo dõi Cũng công trình này tác giả đã chứng minh khi phối hợp Nano Curcumin và các hoạt chất chữa ung thư khác như paclitaxel đã làm giảm liều sử dụng và làm tăng hiệu quả chữa trị ung thư đáng kể

1.4.2 Tại Việt Nam

Theo phó giáo sư Phạm Hữu Lý, nghiên cứu viên cao cấp, phó chủ tịch hội đồng khoa học, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam cho biết, bằng sáng chế đầu tiên trên thế giới về Nano Curcumin được công bố từ năm 2000, từ đó đến nay Nano Curcumin đã trở thành tâm điểm nghiên cứu của các nhà khoa học với 254 bằng phát minh Tại Việt Nam, rất nhiều các nhà khoa học tại các Viện nghiên cứu lớn cũng đang tiến hành thử nghiệm để chế tạo vật liệu Nano Curcumin từ củ nghệ vàng như Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện nghiên cứu triển khai khu công nghệ cao TP.Hồ Chí Minh, Đại học Dược Hà Nội Trong đó Viện hóa học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam là đơn vị đầu tiên chuyển giao thành công đề tài nghiên cứu để đưa Nano Curcumin ra thị trường

Tuy nhiên, hiện nay hướng nghiên cứu sử dụng màng BC để hấp thụ và giải phóng thuốc Curcumin thì chưa có công trình nào nghiên cứu về vấn đề này

1.5 Một số chế phẩm chứa Curcumin trên thị trường

Hiện nay, nguồn nguyên liệu Nano Curcumin đã được chuyển giao cho công ty dược trung ương sản xuất thành công viên nang mềm CumarGold và

được Bộ Y tế cấp Giấy phép đủ điều kiện lưu hành tại Việt Nam Ngoài ra, trên thị trường cũng có rất nhiều các sản phẩm được làm từ Curcumin như thực phẩm chức năng Cumasen, Nanocurcumin - tam thất -

xạ đen, BKA Cumin 95,…

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Curcumin (95%) được mua ở Ấn Độ

- Dung môi là etanol (96%) được mua tại Việt Nam

- Màng BC (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi khuẩn

A xylinum (Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường ĐHSP Hà Nội

2) lên men trong môi trường nước vo gạo

- Máy đo quang phổ UV-2450 (Shimadzu-Nhật Bản), Cân phân tích (Sartorius-Đức), Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA, Buồng cấy vô trùng (Haraeus), Tủ sấy, Tủ ấm (Binder-Đức), Khuấy từ gia nhiệt (IKA-Đức),

và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC:

Các hóa chất nêu trên đều đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp dựng đường chuẩn

Mẫu dung dịch chuẩn (6 mẫu): Chuẩn bị 100ml dung dịch Curcumin 30% được C1=30%

Tiếp tục pha loãng Curcumin ở các nồng độ C2, C3, C4, C5, C6 tương đương ở các nồng độ 25%, 20%, 15%, 10%, 5%