Nghiên cứu sự khác biệt về di truyền ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm làm cơ sở cho chọn giống sớm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP NGUYỄN VIỆT TÙNG NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT VỀ DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ GIỮA CÁC GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI SINH TRƯỞNG N

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

NGUYỄN VIỆT TÙNG

NGHIÊN CỨU SỰ KHÁC BIỆT VỀ DI TRUYỀN Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ GIỮA CÁC GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI SINH TRƯỞNG NHANH VÀ CHẬM LÀM CƠ SỞ CHO CHỌN GIỐNG SỚM

CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC

MÃ SỐ: 60.62.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC LÂM NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN VIỆT CƯỜNG

TS NGUYỄN VĂN VIỆT

Hà Nội, 2015

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và có kế thừa số liệu sinh trưởng và

sử dụng số liệu của hai đề tài nghiên cứu khoa học: “ Nghiên cứu lai tạo giống một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông” và “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai bằng chỉ thị phân tử”

Nếu nội dung nghiên cứu của tôi trùng lặp với bất kỳ công trình nghiên cứu nào đã công bố, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ kết luận đánh giá luận văn của Hội đồng khoa học

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Người cam đoan

Nguyễn Việt Tùng

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Việt Cường – Bộ môn Lai Giống – Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp đã tận tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm việc, học tập và hoàn thành luận văn

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tôi đã nhận được rất nhiều hướng dẫn, giúp đỡ từ phía các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè trong

và ngoài cơ quan, nhà trường Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cô, chú, các anh, chị và các bạn đồng nghiệp trong bộ môn Lai Giống và Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp, TS Nguyễn Văn Việt

– Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp đã

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc và học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè luôn hết lòng ủng hộ, động viên tôi trong những năm qua

Luận văn này là một phần của đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai bằng chỉ thị phân tử” và có kế thừa số liệu nghiên cứu của đề tài “Nghiên

cứu lai tạo giống một số loài bạch đàn, keo, tràm, thông”

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Nguyễn Việt Tùng

MỤC LỤC

Trang Trang phu ̣ bìa

Lờ i cam đoan i

Lờ i cảm ơn ii

Mục lu ̣c iii

Danh mục các ký hiê ̣u, các chữ viết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Những nghiên cứu về tuyển chọn giống bạch đàn năng suất cao 3

1.1.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài 3

1.1.2 Các nghiên cứu ở trong nước 5

1.2 Cơ sở khoa học và ứng dụng của kỹ thuật phân tử trong chọn giống cây trồng 7

1.3 Nghiên cứu, phát triển chỉ thị phân tử trong chọn giống cây lâm nghiệp 12

1.3.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài 13

1.3.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam 18

Chương 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1.Mục tiêu nghiên cứu 25

2.2.Đối tượng và phạm vi, địa điểm nghiên cứu 25

2.3.Nội dung nghiên cứu 25

2.4.Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1.Tách chiết ADN tổng số 26

2.4.2.Điện di ADN tổng số và sản phẩm PCR 27

2.4.3.Phương pháp kiểm tra chất lượn nồng độ ADN bằng máy quang

phổ 31

2.4.4.Phương pháp PCR 32

2.4.5.Phương pháp khảo nghiệm giống, thu thập và phân tích số liệu 34

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1.Đánh giá sinh trưởng các giống bạch đàn lai được lựa chọn 36

3.2.Xác định chỉ thị SSR đa hình 46

3.2.1.Tách chiết ADN tổng số 46

3.2.2.Sàng lọc chỉ thị SSR đa hình 49

3.3.Phân tích sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai 52 3.3.1.Điện di sản phẩm PCR với chỉ thị đa hình và ghi nhận số liệu 52

3.3.2.Sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh, sinh trưởng chậm 57

3.4.Phân tích sự khác biệt về di truyền giữa các giống bạch đàn lai 63

3.4.1.Quan hệ di truyền giữa 10 tổ hợp bạch đàn lai 63

3.4.2.Quan hệ di truyền giữa các dòng bạch đàn lai 66

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 71

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

AFLP Amplified fragment length polymorphism

APS Amonium Persulfate

ARN Axit Ribonucleic

EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid

ISSR Inter-Simple sequence repeat

MAS Marker Assisted Selection

PCR polymerase chain reaction

PU Dòng bạch đàn lai giữa E pellita và E urophylla

QTL Quantitative trait locus

RAPD Random Amplified Polymosphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNase Ribonuclease

SNP Single nucleotide polymorphism

SSR Simple sequence repeats

UC Dòng bạch đàn lai giữa E urophylla và E camaldunensis

UE Dòng bạch đàn lai E urophylla và E exserta

UP Dòng bạch đàn lai giữa E urophylla và E pellita

3.19 Khoảng cách di truyền nhóm bạch đàn lai sinh trưởng

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

3.3 Kết quả tách ADN tổng số mẫu lá bạch đàn lai sau 1 năm

3.5 Điện di sản phẩm PCR tìm chỉ thị đa hình trên gel

3.6

Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA223,

EMBRA225 trên gel polyacrylamide với 14 mẫu bạch

đàn lai

53

3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA116 trên gel

3.8

Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA102,

EMBRA153 trên gel polyacrylamide với 14 mẫu bạch

đàn lai

54

3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA206 trên gel

3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR của EMBRA229 trên gel

3.11 Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 10 tổ hợp bạch đàn lai 65 3.12 Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 14 dòng bạch đàn lai 67

3.13 Biểu đồ quan hệ di truyền nhóm bạch đàn lai sinh trưởng

3.14 Biểu đồ quan hệ di truyền nhóm bạch đàn lai sinh trưởng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bạch đàn là nhóm loài có khả năng thích nghi với nhiều vùng sinh thái nên bạch đàn là một trong số những loài cây dẫn đầu trong trồng rừng sản suất trên thế giới ở sáu châu lục và trên 100 quốc gia với tổng diện tích đạt 20,07 triệu ha nhưng khoảng 90-95% giống bạch đàn trồng sản xuất trên thế giới thuộc chín loài trong phân chi Symphyomyrtus (Brooker, 2000) và giống lai giữa chúng (Harwood, 2011) [32], [42], [43] Gỗ bạch đàn được sử dụng cho ngành xây dựng, đóng đồ nội thất, nguyên liệu chế biến ván ép, ván dăm và ngành công nghiệp giấy cũng như sản phẩm sinh khối cho ngành năng lượng

Bạch đàn lai là tên gọi chung cho sản phẩm lai tạo giữa hai hay nhiều loài bạch đàn khác nhau Bạch đàn lai đang được quan tâm với những ưu điểm vượt trội về năng suất, chất lượng và tính chống chịu với điều kiện bất lợi so với giống cây bố mẹ Cho đến nay, bạch đàn lai là lựa chọn ưu tiên trong trồng rừng sản xuất ở Việt Nam cũng như các quốc gia có nền lâm nghiệp phát triển trên thế giới: Brazil, Úc, Ấn Độ, Trung Quốc Bằng phương pháp chọn tạo giống truyền thống, từ giai đoạn năm 1990 đến nay các nhà khoa học Việt Nam đã lai tạo thành công nhiều giống bạch đàn lai được công nhận là giống quốc gia và giống tiến bộ kỹ thuật

Nhờ sự phát triển và tính ứng dụng cao của các kỹ thuật sinh học phân

tử, nhiều hướng nghiên cứu mới trong chọn tạo giống cây trồng lâm nghiệp đã được triển khai trong những năm gần đây Kỹ thuật sinh học phân tử là công

cụ hữu hiệu, trợ giúp đắc lực cho chọn giống cây trồng nhằm khắc phục những trở ngại trong công tác chọn giống truyền thống Đặc biệt, sự phát triển nhanh chóng về số lượng các chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống khỏi một khối lượng công việc đồ sộ khi phải chọn lọc, phát hiện số lượng nhỏ những cá thể quan tâm trong vô số các cá thể khác nhờ việc xác định sự

có mặt hay vắng mặt của những chỉ thị phân tử liên kết với các allele đặc hiệu

mà không cần đánh giá kiểu hình [8]

Ở Việt Nam, thời gian để một giống lai nhân tạo được công nhận bằng phương pháp chọn giống truyền thống phải mất ít nhất từ 6 – 7 năm cùng với quy mô khảo nghiệm lớn tại nhiều lập địa khác nhau Trong khi đó, dựa trên thành quả của những nghiên cứu đạt được từ chọn giống truyền thống và kết hợp việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử có thể tiết kiệm thời gian chọn giống mới và quy mô khảo nghiệm giống Đây là hướng đi mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu tìm ra giống mới sớm đưa vào

sản xuất Từ các cơ sở trên, luận văn “Nghiên cứu sự khác biệt về di truyền

ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm làm cơ sở cho chọn giống sớm” được đề xuất và thực hiện Đây là nghiên

cứu cần thiết làm cơ sở xác định sự khác biệt di truyền cho một số giống bạch đàn lai bằng kỹ thuật Simple sequence repeats (SSR)

Chương 1

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Những nghiên cứu về tuyển chọn giống bạch đàn năng suất cao

1.1.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chiến lược cải thiện giống nhóm loài bạch đàn Mặc dù, nhiều loài bạch đàn có biên

độ sinh thái rộng nhưng khi được trồng trên nhiều quốc gia khác nhau thì bạch đàn có sự phân hóa mạnh về sinh trưởng Các chương trình khảo nghiệm bạch đàn được chú trọng ở một số quốc gia như Công Gô (1970 - 1981) với

trên 100 xuất xứ của loài E urophylla Tại Pakistan, Hafeez và cộng sự (1972) đã khảo nghiệm 22 xuất xứ của loài E camaldulensis với nguồn hạt

giống được nhập từ Úc, qua khảo nghiệm tác giả đã chọn ra được 6 xuất xứ thích hợp và nhập nội hạt giống để trồng trên quy mô lớn

Tại Nam Phi, từ năm 1973 đến năm 1980, Darrow đã tiến hành 9 khảo

nghiệm phối hợp 26 xuất xứ E camaldulensis và 23 xuất xứ của E

tereticornis, E grandis Kết quả cho thấy, ở những vùng ẩm thì E grandis

cho năng suất cao nhất, sau đó đến E tereticornis Còn ở những vùng khô hạn

và có sương giá thì E camaldulensis lại cho năng suất cao hơn [31]

Hiện nay, việc tạo ra giống bạch đàn lai có ưu thế từ các phương pháp lai giống đang được các nhà chọn giống quan tâm Tại Brazil, chương trình cải thiện giống bạch đàn dựa trên phép lai đôi và lai ba cũng đã được thực

hiện Sinh trưởng về thể tích ở tuổi 7 của cá thể lai ba E urophylla x (E

camaldulensis x E grandis) vượt trội các cây lai tốt nhất của các tổ hợp lai

đôi E grandis x E urophylla, E grandis x E camaldulensis, E urophylla x

E camaldulensis và E urophylla x E grandis [23]

Năm 1975, Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã

lai giữa E saligna với E exserta tạo ra được một số tổ hợp lai có khả năng vượt trội hơn loài E exserta tới 82% về thể tích thân cây, trong đó tổ hợp lai nghịch E exserta x E saligna có sinh trưởng nhanh hơn tổ hợp lai thuận E

saligna x E exserta Hiện các giống lai được trồng chủ yếu ở các vùng ven

biển vì chúng có khả năng chịu gió bão tốt đồng thời sinh trưởng nhanh [46]

Chew T.K (1980) đã khảo nghiệm 10 loài tại 3 địa điểm khác nhau trên bán đảo Malaysia Sau 10 năm trồng, tác giả nhận thấy sinh trưởng tốt

nhất là loài E camaldulensis (2 xuất xứ Bắc Úc) và E degluta; các loài triển vọng khác là E brassiana, E urophylla và E tereticornis [29]

Rao D.V (1984) tiến hành khảo nghiệm nhiều xuất xứ khác nhau của

E camaldulensis, E.tereticornis tại các vùng Pradesh, Maharastra và Haryana

của Ấn Độ Qua điều tra sinh trưởng cho thấy có 10 xuất xứ E camaldulensis

và 5 xuất xứ E tereticornis sinh trưởng tốt [44]

Ngoài ra, từ những năm 1980 - 1990 có nhiều tác giả nghiên cứu về chọn loài và xuất xứ bạch đàn ở nhiều nước khác nhau như: Agpaoa A.C (1986) khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn tại Philippine Watanabe H

(1987) tiến hành khảo nghiệm các xuất xứ của loài E.camaldulensis tại Thái

Lan Sun và Dickinson (1997) thí nghiệm tuyển chọn 28 loài trên đất mặn và đất không mặn tại miền Đông Bắc nhiệt đới khô ở Úc [21], [47], [53]

Từ năm 1989, Viện lâm nghiệp nhiệt đới của Trung Quốc cũng tạo ra

204 cây lai từ các cặp bố mẹ giữa E urophylla với các loài E tereticornis, E

camaldulensis, E exserta, E grandis, E saligna và E pellita Trong đó một

số cá thể cây lai từ các tổ hợp E.urophylla x E tereticornis và E urophylla x

E camaldulensis đã có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với bố mẹ của

chúng, cây lai có thể tích vượt bố mẹ với các trị số tương ứng là 120,7% và 89,4% [46]

Ở Brazil, số liệu theo dõi sinh trưởng trong một số lô thí nghiệm 6 – 8 tuổi của rừng trồng bạch đàn cho năng suất tăng trưởng 70 – 90 m3/ha/năm, một số giống lai trong công thức thí nghiệm cho năng suất trên 100

m3/ha/năm (Eldrige, 1993) [33] Tại rừng thí nghiệm 5,5 tuổi của dòng lai E

Grandis x E urophylla có năng suất bình quân 70 m3/ha/năm Ngoài việc nâng cao năng suất về sinh khối thì tính trạng khối lượng riêng của gỗ bạch đàn tăng từ 480 lên 490 kg/m3, năng suất bột giấy từ 47% lên 49%, hàm lượng vỏ giảm từ 18% xuống còn 12% [48] Các tổ hợp lai thuận nghịch giữa

E urophylla x E grandis cũng đã được tạo ra ở Trung Quốc, Brazil và ở

Indonesia Hiện các giống này đang được trồng phổ biến tại Trung Quốc,

năng suất các giống này cao gấp 1,5 lần các giống E urophylla thuần [24],

[45], [52]

Thông thường ưu thế lai thể hiện rõ hơn trong những điều kiện môi trường sống bất lợi và chúng có phạm vi thích ứng rộng hơn mức bình thường Nghiên cứu của Verryn (2000) cho thấy những tổ hợp lai có khả năng

chống chịu với điều kiện môi trường bất lợi tốt là E grandis x E

camaldulensis, E grandis x E tereticornis, E grandis x E urophylla [50]

Nghiên cứu ưu thế lai về năng suất được thực hiện trên các tổ hợp E grandis

x E urophylla, E pellita x E urophylla, kết quả cho thấy chúng là những tổ

hợp lai có ưu thế lai vượt hơn các loài thuần và là giống sản xuất ở Brazil và Congo [24] Ngoài ra, ưu thế lai về sinh trưởng và tính chịu lạnh được tìm

thấy ở tổ hợp lai E grandis x E nitens, còn ưu thế lai về sinh trưởng và chống chịu bệnh loét thân thể hiện ở tổ hợp lai E grandis x E urophylla [50]

1.1.2 Các nghiên cứu ở trong nước

Bạch đàn được du nhập vào nước ta từ những năm 1930, ban đầu các loài bạch đàn chủ yếu được lựa chọn để làm nguyên liệu giấy nhưng với

những ưu điểm cùng tính đa dụng và những đòi hỏi của thị trường gỗ thì đến nay bạch đàn đã trở thành loài cây trồng kinh tế trên khắp cả nước

Từ năm 1991, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã tiến hành chọn

lọc cây trội và ghép một số cây E urophylla (U), E.camaldulensis (C) và E

exserta (E) Trong các năm 1996 – 2000, Trung tâm đã nghiên cứu và tiến

hành lai giống thuận nghịch cho ba loài nói trên bằng phương pháp thụ phấn

có kiểm soát và tạo ra nhiều tổ hợp lai UC, CU, UE, EU, CE, EC và UU Qua khảo nghiệm đã chọn lọc được 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai đều có sinh trưởng nhanh hơn các loài bố mẹ [9], [39], [40]

Dựa trên kết quả nghiên cứu các giai đoạn trước đã chứng tỏ một số

loài bạch đàn có triển vọng trong trồng rừng là E urophylla cho các tỉnh miền Bắc, E camaldulensis và E tereticornis chủ yếu cho các tỉnh miền Trung và

miền Nam, các loài bạch đàn có triển vọng này đã được xây dựng rừng giống

và vườn giống tại nhiều vùng sinh thái phù hợp sinh trưởng phát triển của mỗi loài [10], [15]

Nguyễn Hoàng Nghĩa (2005) thực hiện đề tài nghiên cứu chọn giống bạch đàn theo hướng sinh trưởng và kháng bệnh Kết quả cho thấy 3 loài bạch

đàn là E camaldulensis, E brassiana và E tereticornis có nhiều xuất xứ sinh

trưởng khá, có khả năng kháng bệnh hại cao, đề tài chọn được một số dòng có sinh trưởng nhanh và kháng bệnh cao Qua nghiên cứu và kế thừa ở các giai đoạn trước đề tài đã có được nhiều kết quả: Tuyển chọn được 8 dòng bạch đàn có chỉ số bệnh thấp, sinh trưởng nhanh từ khu khảo nghiệm 50 dòng ở Sông Mây, trong đó 2 dòng SM16 và SM23 đã được công nhận là giống tiến

bộ kỹ thuật Hai dòng này sinh trưởng nhanh đạt năng suất trên 25 m3/ha/năm

và chống chịu tốt với bệnh hại lá tại Bình Dương và Bình Phước [12]

Trong khuôn khổ dự án Sida – SAREC về nghiên cứu cải thiện giống cây rừng, Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã thực hiện trên đối tượng

nghiên cứu là E urophylla và E pellita (P) Kết quả trong giai đoạn 2005 –

2009 đã tạo ra trên 60 tổ hợp lai UP và PU và một số khảo nghiệm giống lai tại Hà Nội, Nghệ An, Quảng Trị và Quảng Bình Đánh giá sinh trưởng ở 30 tháng tuổi cho thấy tổ hợp lai giữa hai loài này có triển vọng cho trồng rừng ở miền Bắc và Bắc Trung bộ nhưng trên lập địa cho thấy sự khác biệt rất lớn về sinh trưởng của các tổ hợp lai và điều này khẳng định có sự ảnh hưởng rất lớn giữa kiểu gene và môi trường Tại Ba Vì – Hà Nội có ba tổ hợp lai triển vọng U70P28, U87P22, U87P8; và tại Đông Hà – Quảng Trị là 2 tổ hợp U87P22, U70P48 So với giống đối chứng U6 và PN14 thì những tổ hợp lai này có sinh trưởng tốt hơn rõ rệt với độ vượt trung bình về thể tích từ 20 – 50% [11]

Nguyễn Việt Cường (2005- 2009) nghiên cứu lai tạo giống một số loài bạch đàn, keo, tràm thông đã chọn được 19 dòng bạch đàn lai CU89, UE35, UE52, GU94, UE34, UE46, UE69, UC80, UE27, UE30, UE73, UU9, UE24, UE3, UE85, UE23, UC2, UU80 có sinh trưởng nhanh hơn đối chứng U6, GU8, PN2 và PN14 ở giai đoạn từ tuổi 2 đến tuổi 6 Trong 19 dòng bạch đàn lai đã có UE24, UC80 được công nhận là giống quốc gia và UE3, UE23, UE27, UE33, UC1, UC2, CU91, UE73 là giống tiến bộ kỹ thuật [4]

Nhìn chung, các công trình nghiên cứu trên đều cho thấy bạch đàn lai

giữa các loài E urophylla, E.camaldulensis, E exserta, E grandis, E

pellita thích nghi tốt với điều kiện hoàn cảnh gây trồng khác nhau, có năng

suất cao đã mang lại giá trị kinh tế trong trồng rừng sản xuất tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới

1.2 Cơ sở khoa học và ứng dụng của kỹ thuật phân tử trong chọn

giống cây trồng

Ngoài các phương pháp chọn giống truyền thông thì những tính trạng quan tâm cũng có thể được chọn lọc gián tiếp thông qua các chỉ thị Khi chỉ thị được xác định liên kết với tính trạng, chỉ thị đó cho biết sự có mặt hay

vắng mặt của gene hoặc tính trạng số lượng (Quantitative trait locus - QTL) quan tâm và không ảnh hưởng đến kiểu hình Chỉ thị chia thành hai loại: chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử (CTPT) Chỉ thị hình thái biểu hiện như kiểu hình ở giai đoạn trưởng thành, các sản phẩm tương tác giữa gene và môi trường, kiểu hình của chỉ thị hình thái phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của thực vật tại thời điểm thí nghiệm Trong khi đó, CTPT được xác định ở cấp

độ dưới mức tế bào, có thể được kiểm tra trong giai đoạn cây con nhờ các kỹ thuật phân tử cần thiết Hai dạng chỉ thị mang lại những ứng dụng hiệu quả cho Marker assisted selection (MAS): (1) loại chỉ thị được định vị ngay trên phạm vi gene/QTL quan tâm tại vị trí 0 cM, đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm kiếm loại chỉ thị này; (2) nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng gene/QTL quan tâm Mối liên kết chỉ thị - gene được nhận biết khi gene và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau, chọn lọc dựa trên loại chỉ thị này gọi là dựa trên liên kết không cân bằng (Linkage disequilibrium – LD) [8]

CTPT là những đặc tính sinh học được xác định bằng dạng hình allele hoặc locus gene và có thể được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, do đó chúng có thể được sử dụng như thiết bị dò để theo dõi cá thể, mô, tế bào, nhân, nhiễm sắc thể (NST) hoặc gene CTPT là đoạn ADN biểu thị các biến

dị, có thể được sử dụng để xác định đa hình giữa các kiểu gene hoặc các allele khác nhau của cùng một gene, các đoạn ADN này có mối liên kết tại một vị trí nhất định trong hệ gene và được xác định bằng công nghệ phân tử CTPT

là tiểu vùng của trình tự ADN biểu hiện tính đa hình, dựa vào việc mất đoạn, thêm đoạn hoặc thay thế đoạn giữa các cá thể khác nhau

CTPT được phát triển thành nhiều hệ thống dựa trên phương pháp và các kỹ thuật phát hiện đa hình khác nhau: Restriction fragment length polymorphism (RFLP), Amplified fragment length polymorphism (AFLP),

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), simple sequence repeat (SSR), Single-nucleotide polymorphism (SNP) [8] Về nguyên tắc, một CTPT lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ dàng Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một CTPT nào có thể thỏa mãn tất cả những điều kiện trên Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống chỉ thị nhằm thỏa mãn một số điều kiện [1] Bên cạnh đó chỉ thị phân tử ADN có những ưu điểm vượt trội so với chỉ thị hình thái ở một

số đặc tính:

- Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền;

- Có nhiều chỉ thị trong quần thể;

- Đo lường không chi phối ảnh hưởng của môi trường và ảnh hưởng có tính chất phát triển

Chỉ thị phân tử được chia làm ba loại chính:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: RFLP

- Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: RAPD, AFLP, STS (Sequence Tagged Site), RGA (Resistance Gene Analog), SNPs

- Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại Nhóm chỉ thị này thực ra cũng dựa trên cơ sở nhân bội ADN nhưng do chúng có bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp vào một nhóm riêng: Minisatellite, SSR

Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gene sinh vật sử dụng các chỉ thị phân tử được phát triển nhanh chóng Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gene thông qua việc xác định các trình tự nhất định của các gene hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gene mang các tính trạng mong muốn Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gene, khắc phục ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện được các gene mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình

Trên rất nhiều loại cây trồng hiện nay người ta đã thiết lập bản đồ chi tiết về các chỉ thị ADN liên kết với nhiều gene quy định các tính trạng nông sinh học khác nhau, trên cơ sở đó đã tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này Nhờ vào những ưu điểm của chỉ thị phân tử:

- Tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gene nhất định nào đó trong quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một mẫu ADN đánh dấu liên kết chặt với gene đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó

- Đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật

- Loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các allele khác nhau của một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng

- Tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính trạng khó biểu hiện ra kiểu hình

- Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống

phân biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các allele, các chủng sinh lý gây bệnh

- Là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm

Cơ sở di truyền của các tính trạng tăng trưởng đã được nghiên cứu rộng rãi trong cây rừng Nhiều nghiên cứu QTL đã nhấn mạnh sự hiện diện của cả hai vùng gene ổn định và không ổn định, đóng vai trò sản xuất sinh khối ở mỗi cấp tuổi cây rừng và nền tảng di truyền nhưng kết quả vẫn còn hạn chế về

sự tương tác giữa QTL và môi trường Mục tiêu chính trong các nghiên cứu

này là phân tích cấu trúc di truyền với quỹ đạo tăng trưởng và nhấn mạnh vào

sự tương tác kiểu gene với môi trường bằng cách đo đường kính, chiều cao tại các thời điểm rồi kết hợp mức tăng trưởng giữa các thời điểm để tìm tính tương quan với các giá trị môi trường thay đổi [35], hay có thể hiểu là mức độ liên kết của chỉ thị và các gene/QTL kiểm soát tính trạng số lượng [8]

Năng suất là một tính trạng số lượng phức tạp, về cơ bản nó là tổng hợp của nhiều tính trạng khác nhau Năng suất có hệ số di truyền thấp, ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường Sự khác biệt về năng suất không phải do sự phân li của một hoặc hai gene mà là do sự phân li của rất nhiều gene, với ảnh hưởng của mỗi gene là nhỏ Tính trạng số lượng không phân li thành các nhóm cụ thể do đó ta không thể đơn giản chỉ sử dụng các nguyên lí di truyền Mendel để nghiên cứu Thay vào đó, giải pháp cho nghiên cứu các tính trạng này là xác định vị trí các locus của tính trạng số lượng dựa trên sự liên kết với marker phân tử (QTL mapping) Ở thực vật, có hai phương pháp chính trong QTL mapping:

- Phương pháp1: Sử dụng các quần thể tạo ra từ các phép lai được kiểm soát (ví dụ như quần thể F2, quần thể lai trở lại ) phù hợp cho các loài có vòng đời ngắn, dễ lai tạo và tạo nhiều hạt ở thế hệ sau, đồng thời có phương thức tính toán đơn giản hơn

- Phương pháp 2: Sử dụng các quần thể tự nhiên, giao phấn tự do không kiểm soát (phương pháp này còn được gọi là lập bản đồ kết hợp - association mapping) Có lợi thế là không phải tạo ra quần thể phân li, phù hợp cho các loài giao phấn, vòng đời dài và có thể phân tích được nhiều allele cùng một lúc [6]

1.3 Nghiên cứu, phát triển chỉ thị phân tử trong chọn giống cây lâm

nghiệp

Chỉ thị phân tử có thể được sử dụng để nghiên cứu mô hình của di truyền, biến dị di truyền, hiện tượng tiến hóa và chọn lọc, các mối liên kết allele - allele và các liên kết allele - kiểu hình Ứng dụng chỉ thị phân tử phụ thuộc vào tính chất vật lý của chỉ thị và vị trí của hệ gene, các chi phí liên quan, dễ sử dụng, và mức độ công suất cần thiết Chỉ thị phân tử đã được áp dụng thành công trong khoa học thực vật đối với việc lập bản đồ di truyền và vật lý của hệ gene, xác định các gene kiểm soát quá trình khác nhau và kiểu hình (liên kết tính trạng), đa dạng di truyền và phân tích tiến hóa, chỉ thị còn

hỗ trợ quá trình sinh sản nâng cao chất lượng giống cây trồng

Trước đây, vị trí của một CTPT thường không rõ và không cần thiết cho mục đích của sự đa dạng, phân tích tiến hóa và các ứng dụng về giống Với những tiến bộ trong công nghệ giải mã bộ gene, CTPT với sự hiểu biết về

vị trí gene và môi trường đang trở nên phổ biến hơn và được áp dụng cho phạm vi ngày càng rộng và thông lượng cao của mục tiêu Đánh dấu chuỗi dựa trên ADN vốn đã có thể nắm bắt một lượng lớn các biến thể ở độ phân giải đơn giản, làm cho chúng đặc biệt hữu ích cho việc phát hiện các dấu hiệu hoàn hảo (đa hình ADN là nguyên nhân của liên kết các tính trạng quan tâm)

và phát hiện, phân tích của các allele tham gia [37] Nghiên cứu và phát triển nguồn giống cây bạch đàn đã tăng gấp bốn lần năng suất trồng trước đây, với chỉ tiêu hiện tại của 40 m3/ha/năm (ABRAF, 2013) và khả năng lên đến 100

m3/ha/năm với quản lý chuyên sâu (Evans và Turnbull, 2004) [19], [34] Hiệu quả trong chiến lược chọn giống và dòng vô tính đã được triển khai nhằm phát triển rừng trồng sản xuất Các nỗ lực trong chọn giống nhờ kỹ thuật sinh học phân tử và phân tích di truyền học phân tử đang được tiến hành mạnh mẽ

ở bạch đàn trong sản xuất và bảo tồn Mỗi loại chỉ thị phân tử khác nhau được

sử dụng với mục đích khác nhau, trong đó bao gồm cả di truyền quần thể MAS Một trong những chỉ thị phân tử thường xuyên nhất được sử dụng trong bạch đàn từ năm 1996 là chỉ thị SSR (Byrne et al., 1996) SSRs có đặc điểm như phân bố ở khắp mọi nơi trong hệ gene, locus đặc hiệu, trội, đa allele, tỷ lệ đột biến cao, dị hợp tử, có thể ứng dụng giữa các loài và liên kết với các biểu hiện gene và chức năng Do đó, những dấu hiệu này được coi là

lý tưởng cho việc bảo tồn tính di truyền, đánh giá đa dạng di truyền, bảo vệ đa dạng, và xây dựng bản đồ di truyền có độ phân giải cao để liên kết kiểu hình

và kiểu gene biến đổi [41]

1.3.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Cho đến nay, có nhiều loài bạch đàn sản xuất bao gồm cả bạch đàn lai đang được trồng thương mại chính đã được lập bản đồ liên kết di truyền và đây là nguồn dữ liệu phân tử rất lớn để các nghiên cứu về giống bạch đàn ở Việt Nam khai thác và ứng dụng

Tầm quan trọng của SSR để phân tích bộ gene cây trồng đã được nhấn mạnh nhiều lần [49] Trước đó, SSR trong hệ gene (gSSRs) đã được phát triển bằng việc tách nhỏ thành các đoạn và giải trình tự các đoạn có chứa đựng những vùng SSR giả định, việc này gây lãng phí tiền và tốn thời gian Sau đó, phát triển cơ sở dữ liệu trực tuyến như GenBank dẫn đến việc tạo ra EST có nguồn gốc từ SSR (eSSRs), chỉ thị có mặt ở các vùng phiên mã của gene Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, một lượng lớn dữ liệu về gSSRs và eSSRs được xác định thông qua phương pháp Next generation sequencing (NGS) [54], đây là phương pháp có thể sử dụng dễ dàng trong di truyền quần thể và các ứng dụng chọn giống Trong bạch đàn, SSRs của bộ gene đã được phát

triển cho rất ít loài thương mại quan trọng như E urophylla, E grandis, E

globulus và E nitens Tuy nhiên, tính đồng nhất cao của bộ gene giữa các loài

bạch đàn đã hỗ trợ những dữ liệu ADN còn thiếu đối với những loài chưa có,

do đó SSR là chỉ thị vượt trội hơn cả trong việc ứng dụng để nghiên cứu các loài bạch đàn [20], [30] SSRs đã được sử dụng trong cây bạch đàn cho nhiều mục đích như nhận dạng các loài, phát sinh loài, lai xác thực, các nghiên cứu

đa dạng di truyền, lập bản đồ di truyền và xác định vị trí QTL [36]

Năm 1996, Grattapaglia và cộng sự công bố sử dụng chỉ thị RAPD để

lập bản đồ của các tính trạng năng suất trên đối tượng là gia đình E grandis

được thụ phấn tự do chỉ biết cây mẹ (half-sib) Nghiên cứu này tập trung vào sinh trưởng về thể tích nên cần số lượng lớn mẫu phân tích để lập bản đồ QTL với kiểu gene được chọn lọc và phân tích sự phân ly Tuy hệ số di truyền của các tính trạng này thấp và sự thiếu đồng nhất của nền tảng di truyền nhưng chúng vẫn được tác giả sử dụng để lập bản đồ Ba QTL của tính trạng sinh trưởng về thể tích được tìm thấy đóng góp 13,7% về biến dị kiểu hình, 43,7% biến dị di truyền; năm QTL kiểm soát trọng lượng riêng của gỗ với đóng góp 24,7% về biến dị kiểu hình tương ứng với nó là 49% biến dị di truyền Sau đó, nhiều bản đồ liên kết gene đã được xây dựng với mục đích liên kết bản đồ và phân tích QTL liên quan [35]

Khoa Tế bào sinh học của trường Đại học Brasilia (Brazil) đã nghiên

cứu phát triển lập bản đồ gene liên kết sử dụng chỉ thị SSR cho E grandis và

E urophylla Nghiên cứu này xây dựng một số lượng lớn các chỉ thị SSR có

thể sử dụng được đối với các loài bạch đàn, các chỉ thị SSR này chứa đựng rất nhiều thông tin hữu ích cho việc thiết lập bản đồ và xác định các đặc điểm cá thể và đã chứng minh được khả năng xây dựng một bản đồ liên kết dựa vào các chỉ thị SSR một cách hoàn thiện Họ đã xây dựng được một bộ bao gồm

70 chỉ thị SSR ký hiệu từ EMBRA1 đến EMBRA70 (Eucalyptus microsatelites from Brazil) với tính đa hình cao khi sử dụng với E grandis và

E urophylla [25], [26]

Một nghiên cứu tiếp tục của nhóm tác giả Brondani và cộng sự (2006),

từ 380 chỉ thị SSR ban đầu được nghiên cứu đánh giá, có trên 230 chỉ thị SSR

có tính đa hình cao, ký hiệu từ EMBRA71 đếnEMBRA395 có thể dễ dàng dùng để giải thích cho các kiểu gene, các kiểu gene này có thể sử dụng để đánh dấu các cá thể độc lập và lập bản đồ gene liên kết Trong số các chỉ thị

SSR này, đã có 48 chỉ thị phát triển riêng cho E globulus (đặt tên là EMCRC), 8 chỉ thị phát triển cho E nitens (ký hiệu EMEn), 8 chỉ thị cho E

sieberi (ký hiệu EMEs), 13 chỉ thị cho E leucoxyon (ký hiệu EMEl) Và gần

đây đã có thêm 35 chỉ thị SSR được phát triển dựa vào chuỗi ADN lục lạp

(cp-DNA) của E globulus Với trên 230 chỉ thị SSR, một bản đồ liên kết

được xây dựng trên 11 nhiễm sắc thể bao phủ gần 90% bộ gene của bạch đàn tương đương với 1.568 cM và khoảng cách trung bình giữa các chỉ thị SSR là 8,4 cM và trong những năm tiếp theo bộ chỉ thị này đã được mở rộng đáng kể nhờ sử dụng công nghệ đánh dấu có độ chính xác cao hơn nhiều [27], [38]

Một bản đồ liên kết gene cho E camaldulensis đã được xây dựng bằng

cách sử dụng dữ liệu sự phân ly từ 92 đối tượng là cây con với sự kiểm soát

về bố mẹ của chúng (full-sib) Bản đồ liên kết được xây dựng bằng việc sử dụng 168 chỉ thị RAPD, RFLP và SSR Kết quả phân tích cho thấy 168 chỉ thị

bao phủ một khoảng 1.236 cM của bộ gene, trong khi đó, của E urophylla là 1.156 cM, của E grandis 1.620 cM (Grattapaglia et al., 1994), 1.462 cM ở E

nintens (Byrne et al., 1995) và từ khoảng 1.277 cM đến 1.133 cM cho từng

cây bố mẹ của E globulus Số lượng các nhóm liên kết được xác định là

tương đương với số lượng nhiễm sắc thể đơn bội (n = 11) của bạch đàn Bản

đồ này có thể được sử dụng để xác định các khu vực của bộ gene có liên quan

với những đặc điểm quan trọng trong E camaldulensis và các loài bạch đàn

khác như gỗ và chất lượng dầu Trong số 18 chỉ thị SSR sử dụng để nghiên cứu phân tích đã có tới 14 chỉ thị là EMBRA1, EMBRA2, EMBRA3,

EMBRA5, EMBRA8, EMBRA9, EMBRA10, EMBRA11, EMBRA14, EMBRA15, EMBRA16, EMBRA17, EMBRA19 và EMBRA20 được dùng

để lập bản đồ gene liên kết Với 14 chỉ thị SSR này nằm rải rác trên 11 nhiễm sắc thể cùng với các chỉ thị phân tử khác đã mang lại những thông tin rất có ý

nghĩa trên bản đồ gene của E camaldulensis [22]

Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây đã sử dụng chuỗi trình tự để tạo ra ESTs và thành SNPs Sử dụng một phần của cDNA từ các tế bào và kiểu gene

khác nhau của E grandis, gần 150 Mbp trình tự thể hiện có thể được lắp ráp

Hơn nữa, sự liên kết của các trình tự từ các kiểu gene khác nhau cho phép phát hiện hơn 23.000 SNPs (Novaes et al., 2008) Trong một nghiên cứu

khác, 23 gene từ các cá thể của E globulus, E nitens, E camaldulensis, E

loxophleba được giải trình tự nhận biết hơn 8.500 SNPs, với E camaldulensis

trung bình cứ một SNP trên 16bp cho các gene mã trình tự (Kulheim et al., 2009) Cuối cùng, bằng cách sử dụng một 1,2 triệu dữ liệu EST gồm trình tự

từ sáu loài bạch đàn (đại diện cho ba phần của phân chi Symphyomyrtus) đã phát triển một tập hợp gồm 768 SNPs trên genome (Grattapaglia et al., 2011) Chúng được thử nghiệm ở bạch đàn bằng cách sử dụng công nghệ phân tích kiểu gene Golden Gate, độ tin cậy của SNPs là rất cao [43]

Dựa trên các tài liệu được công bố, có đến 505 gSSRs và 758 SSRs (eSSRs), 35 chloroplast SSRs (cpSSRS) và 8 gene based SSRs (CG-SS1Rs) được ứng dụng ở nhiều loài bạch đàn khác nhau Các chi tiết về mã chỉ thị SSR, loài và nguồn số SSRs phát triển được tập hợp thành một bộ sưu

EST-tập lớn nhất của cả hai gSSRs và eSSRs (~ 300 SSR) đã được phát triển từ E

grandis và E urophylla với ký hiệu là EMBRA (Brondani et al., 1998, 2002,

2006; Faria et al., 2010, 2011) Một bộ chỉ thị khác với ký hiệu Emcrc (40

SSRs) phát triển từ E globulus (Steane et al., 2001), E corymbia variegata (Jones et al., 2001) và E orymbia citriodora (Shepherd et al., 2006) Các chỉ

thị với ký hiệu tiền tố En, Es, Eg và El đã được phát triển từ các loài như E

nitens (8 SSR), E sieberi (8 SSR), E globulus (26 SSR) và E leucoxylon (13

SSR) (Byrne et al., 1996; Glaubitz et al., 2001; Ottewell et al., 2005) Một tập hợp gồm của 35 SSR ADN lục lạp được phát triển dựa trên trình tự cp-DNA

đầy đủ của E globulus (Steane et al 2005) Bằng việc áp dụng phương pháp NGS lên 454 trình tự để phân lập mười SSRs từ E victrix (Nevill et al.,

2013) Một nghiên cứu của Ranade và cộng sự năm 2014 cho thấy số lượng

SSR chiếm khoảng 0,6% toàn hệ gene bạch đàn Trong khi đó, bộ gene của E

camaldulensis và E grandis đã được giải mã bởi Viện nghiên cứu DNA

Kazusa của Nhật Bản và Viện Joint Genome DOE (JGI) của Hoa Kỳ phối hợp với các thành viên của Eucalyptus Genome Network (EUCAGEN) (Hirakawa

et al., 2011; Myburg et al., 2014) Hơn nữa, các phân tử ARN được tạo ra từ các mô khác nhau bao gồm mạch gỗ, mạch libe, rễ, chồi, lá và các tế bào sinh

sản của E grandis, E gunnii, E globulus, E camaldulensis và E tereticornis

(Mizrachi et al., 2010; http://web.up.ac.za/eucagen/; http://eucgenie.org/; Healey et al., 2014) thúc đẩy sự phát triển của các chỉ thị SSR và nhiều trong

số đó đã được sử dụng cho các mục đích khác nhau giữa các loài bạch đàn (Ceresini et al., 2005; Rabello et al., 2005; Yasodha et al., 2008; Rengel et al.,

2009 He et al., 2012; Zhou et al., 2014) Gần đây, các chỉ thị SSR đặc biệt

được phát triển từ E grandis, E globulus và E gomphocephala (Acuna et al.,

2012; Bradbury et al., 2013) Tần số xuất hiện của microsatellite bạch đàn đã thay đổi trong nhiều cơ sở dữ liệu khác nhau, 12,9% trong cơ sở dữ liệu NCBI (Yasodha et al., 2008) 13,3% trong EUCAWOOD (Rengel et al 2009), 25,5% và 29% trong cơ sở dữ liệu FOREST (Rabello et al., 2005; Ceresini et al., 2005) Các loại SSRs tìm thấy trong ESTs khác nhau giữa các phân tử ARN phân tích Một nghiên cứu về chỉ thị SSR khác, từ 22.298 EST của bạch đàn có thể thiết kế được 1.244 SSR, trong đó 182 chỉ thị đã được lựa chọn

dựa trên tình trạng đa hình giữa các loài (Grattapaglia et al., 2014) Việc ứng dụng chéo chỉ thị cung cấp khả năng xác định các chỉ thị đồng trội cho nhiều loài có liên quan và tạo điều kiện cho các nghiên cứu bảo tồn tiến hóa, sinh thái Nhiều nghiên cứu nhằm xác định lợi ích của các chỉ thị SSR trên cây bạch đàn được thực hiện sau khi thông tin về khả năng sử dụng chéo các chỉ thị này là rất cao được công bố [41]

1.3.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Trong lĩnh vực lâm nghiệp ở Việt Nam, việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu còn rất hạn chế Cho đến nay, một số công trình nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn, keo ở Việt Nam đã và đang được thực hiện Bên cạnh đó, đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết xuất xứ, nhận biết con lai

và bố mẹ, xác định quan hệ họ hàng giữa các loài được thực hiện

Tổ chức Khoa học và Công nghệ Australia (CSIRO) phối hợp với Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp (2004) để ứng dụng chỉ thị di truyền nghiên cứu hệ thống giao phấn cận huyết trong rừng giống làm nguyên nhân thay đổi tỷ lệ giao phấn cận huyết trong quần thể rừng giống, vườn giống keo tai tượng [28]

Ứng dụng chỉ thị phân tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội Keo tai tượng được tuyển chọn tại 5 lâm trường tại Tuyên Quang (trong đó có 34 cây trội và 6 dòng là các xuất xứ Ingham, Mossman, Carwell, Wipim, Pongaki, Iron Range) Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD: OPC10, OPC18, OPC19, OPC20 và OPB17 và 1 gene lục lạp trnL Kết quả cho thấy 40 dòng Keo tai tượng nghiên cứu có mức độ đa dạng

di truyền thấp [2] Từ kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền của các cây trội, có thể ứng dụng để lựa chọn và bố trí các cặp bố mẹ có quan hệ di truyền

xa nhau khi xây dựng vườn giống, nhằm giảm thiểu thụ phấn cận huyết

Trong giai đoạn 2006-2010, đề tài do Nguyễn Việt Cường làm chủ nhiệm đã ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp nghiên cứu quan

hệ di truyền của một số xuất xứ Tràm ta (M cajuputi) Đề tài đã nghiên cứu

12 mẫu cây Tràm ta ở 12 lập địa khác nhau của Việt Nam bằng các chỉ thị RAPD và chỉ thị lục lạp Nghiên cứu các mẫu trên với các chỉ thị RAPD đã phát hiện được 100 băng đa hình Đối với các gene lục lạp để phân tích đa hình tác giả đã cắt các sản phẩm PCR của các mồi lục lạp trnH-trnK, trnD-trnT, psbC- trnS, rbcL- psbUA với các enzym giới hạn Himf1, Taq1 thu được 59 băng đa hình Các số liệu đa hình này được xử lý theo chương trình NTSYS pc để xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền giữa các xuất xứ tràm, kết quả cho thấy: các xuất xứ tràm ở Việt Nam rất đa dạng về mặt di truyền, các xuất xứ tràm ở miền Bắc (Thái Nguyên, Đại Lải – Vĩnh Phúc) có sự khác biệt về di truyền lớn so với các xuất xứ tràm ở miền Trung và miền Nam Các xuất xứ Quảng Trị vùng đồi và Quảng Trị vùng cát, Đồng Hới và Huế,

Đà Lạt và Vũng Tàu có thể là các cặp xuất xứ có cùng nguồn Cũng trong đề tài này một nghiên cứu khác là bước đầu ứng dụng chỉ thị phân tử RAPD trong đánh giá sinh trưởng của các giống bạch đàn lai, vật liệu nghiên cứu là

5 dòng bạch đàn trong đó có 4 dòng được đánh là sinh trưởng nhanh sau khảo nghiệm hậu thế (các dòng này đều được công nhận giống tiến bộ kỹ thuật PN2, PN14, U6 và công nhận giống quốc gia UE24) và 1 dòng UE4 luôn luôn có sinh trưởng tương đối thấp từ năm thứ nhất đến năm thứ 6 Mục tiêu nghiên cứu là tìm ra một số chỉ thị phân tử có liên quan đến tính trạng sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm Qua nghiên cứu tác giả đã tìm ra được 2 chỉ thị là OPC9 và OPB8 cho những phân đoạn có sự khác biệt giữa các dòng sinh trưởng nhanh và chậm Với mồi OPB8 các mẫu cây bạch đàn sinh trưởng nhanh (UE24, U6, PN2, PN14) đều cho 7 băng, trong khi cây sinh trưởng chậm (UE4) chỉ cho 1 băng (500bp) Tương tự với mồi OPC9 ở

các cây sinh trưởng nhanh đều cho 2 băng (1.300bp và 1.400bp), nhưng ở cây sinh trưởng chậm chỉ cho 1 băng (1.300bp) Như vậy, có thể dùng hai mồi OPB8, OPC9 có thể phân biệt được cây sinh trưởng nhanh và chậm Tuy nhiên để kết luận được chính xác cần thiết phải tách dòng và đọc trình

tự các băng khác biệt này để tìm ra các gene liên quan đến quá trình sinh trưởng và phát triển ở cây bạch đàn, chạy thêm các mồi chỉ thị phân tử, tăng cường số mẫu cây để tăng thêm độ tin cậy và phát hiện thêm sự sai khác di truyền giữa các cây sinh trưởng nhanh và chậm [4]

Ứng dụng của chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu

đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận, tên địa

phương là cây Cóc hành (Azadirachta excelsa) được tuyển chọn trong rừng

khộp tự nhiên khô hạn ở 6 xã của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Ái thuộc tỉnh Ninh Thuận Chỉ thị phân tử sử dụng là các mồi RAPD: OPC10, OPC18,

OPC14, OPC20, OPB17, OPC13 và 2 mồi lục lạp gồm rnH - trnK và atpB -

rbcL Kết quả cho thấy 40 dòng cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận

(Azadirachta excelsa) có mức độ đa dạng di truyền thấp, mặc dù các cây trội

được chọn lọc đều ở rừng tự nhiên và có khoảng cách về không gian khá xa

Từ hệ số tương đồng của các dòng cây trội, có thể lựa chọn các cặp bố mẹ có quan hệ di truyền xa nhau khi xây dựng vườn giống nhằm nâng cao khả năng tái tổ hợp những tính trạng có lợi của các cây trong vườn giống khi giao phấn với nhau Các dòng có quan hệ di truyền quá gần gũi cần phải loại bỏ là X11, X22, X35, X37, X43, X50 Như vậy 34 dòng còn lại vẫn đáp ứng được tiêu chuẩn công nhận giống cây lâm nghiệp TCN 147 -2006 về xây dựng vườn giống [3]

Ở đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Keo lá tràm cho vùng Nam bộ” do Vương Đình Tuấn là chủ nhiệm giai đoạn 2005-2009 Đây là nghiên cứu đầu tiên tổng kết về ứng dụng chỉ thị phân tử

trong chọn giống cây rừng nói chung và Keo lá tràm nói riêng ở Việt Nam Nghiên cứu sử dụng 33 chỉ thị SSR của Keo tai tượng, 12 chỉ thị RAPD và 3 chỉ thị liên quan sinh trưởng nhanh C1, C2, R3; 2 chỉ thị liên quan đến sinh trưởng chậm P1, OS1 để phân tích 100 cá thể Keo lá tràm Nhưng kết quả của nghiên cứu chưa tìm được chỉ thị SSR liên kết chặt với tính trạng sinh trưởng,

và 5 chỉ thị liên quan đến sinh trưởng được sử dụng để nghiên cứu trong quần thể đã cho kết quả không như mục tiêu đặt ra [17]

Năm 2006-2010, đề tài “Nghiên cứu phát triển và ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Bạch đàn uro” do Trần Hồ Quang làm chủ nhiệm đề tài đã phân tích tương quan tính trạng sinh trưởng là đường kính

ngang ngực cho dãy allele đơn của 306 cây E urophylla tại vườn giống với

14 chỉ thị SSR và tìm ra chỉ thị EMBRA57 ở cả hai nhóm allele tương quan

có ý nghĩa với tính trạng đường kính cây (EMBRA57_1: có tương quan r = 0,27; mức ý nghĩa P = 0,009; F tính = 6,92; EMBRA57_2: có r = 0,21; P = 0,002; F tính = 9,66) Nhưng khi tác giả gộp hai nhóm allele để xác định mức

độ tương quan giữa chỉ thị EMBRA57 với đường kính ngang ngực năm thứ

13 thì tương quan có ý nghĩa (F tính = 9,95; P = 0,003) với tương quan thấp (r = 0,24) Với mức tương quan này, EMBRA57 đóng góp 5,76% trong tổng

phương sai kiểu hình về đường kính trong quần thể nghiên cứu Phân tích tương quan giữa 14 chỉ thị SSR trong nghiên cứu này với tỷ trọng gỗ cũng cho kết quả mức độ tương quan rất thấp (r < 0,1) Trong thí nghiệm kiểm chứng mối tương quan giữa chỉ thị EMBRA57 với đường kính ngang ngực của nhóm sinh trưởng nhanh nhất và chậm nhất thuộc hai tổ hợp lai khảo nghiệm tại Cầu Hai – Phú Thọ cho kết quả tương quan thấp và không có ý nghĩa Cũng trong nghiên cứu này tác giả đã tách dòng và xác định được trình

tự 2 gene sinh tổng hợp lignin (EuCCR và EuCAD2), xác định được các chỉ

thị SNP khác biệt giữa 2 nhóm cây có hàm lượng lignin cao và thấp: 6 SNP

khác biệt gene EuCCR và 4 SNP khác biệt cho gene EuCAD2 Xác định được

6 SNP khác biệt giữa hai nhóm cây có hàm lượng xenlulose cao và thấp Theo tác giả, các chỉ thị SNP này rất có ý nghĩa trong trợ giúp chọn giống sớm về

hàm lượng lignin thấp cho E urophylla [13]

Năm 2010, Trần Đức Vượng đã sử dụng 7 chỉ thị SSR trong nghiên cứu so sánh tỉ lệ thụ phấn chéo giữa Keo tai tượng nhị bội và tứ bội tại vườn giống Bầu Bàng – Bình Dương Các chỉ thị này đều hoạt động tốt cho cả 2 loài tứ bội và nhị bội Kết quả cũng cho thấy có sự khác biệt về tỉ lệ giao phấn giữa các dòng nhị bội (97% giao phấn chéo) và tứ bội (2% giao phấn chéo) [18]

Nghiên cứu đánh giá tính đa dạng di truyền của các vườn giống vô tính keo tai tượng cũng đã được Lê Sơn (2012) tiến hành với 8 chỉ thị để đánh giá tính đa dạng di truyền của 100 dòng vô tính thuộc 8 xuất xứ trong các vườn giống Keo tai tượng tại Ba vì (Hà Nội) và Cầu Hai (Phú Thọ) Kết quả cho thấy các xuất xứ trong vườn giống có tính đa dạng di truyền với số allele trung bình là 3,078, số allele hữu hiệu là 2,731 Tỉ lệ giao phối cận huyết trong các vườn giống chỉ khoảng 14% [14]

Năm 2009-2012, đề tài nghiên cứu của Trần Thanh Trăng “Chọn giống

Bạch đàn trắng (Eucalyptus camaldulensis) kháng bệnh đốm lá (Cryptosporiopsis eucalypti) bằng chỉ thị phân tử” cũng đã thu được một số

kết quả nhất định Tuy nhiên, trong vấn đề chọn giống kháng bệnh tác giả chưa làm rõ được các tính trạng nghiên cứu có khả năng di truyền được cho thế hệ sau không Đây cũng là hạn chế của đề tài [16]

Nghiên cứu đánh giá các xuất xứ Keo lá tràm bằng kĩ thuật DNA finger printing (Vuong, 2013) với các dòng Keo lá tràm được tiến hành tại vườn giống Fortip Ba Vì Kết quả cho thấy tỉ lệ đa hình với các locus đạt 100%,

xuất xứ trong vườn giống có tính đa dạng di truyền với số allele trung bình là

10 allele/locus, tỉ lệ di hợp tử mong đợi He = 0,745 [51]

Trong một nghiên cứu năm 2013, Nguyễn Việt Cường và cộng sự đã sử dụng 14 chỉ thị SSR EMBRA để nghiên cứu khả năng sử dụng các chỉ thị này trong chọn lọc sớm các dòng bạch đàn lai Đối tượng nghiên cứu là dòng lai UE24, UE27, UE3, UC2, UC80, CU91 đã được công nhận là giống quốc gia

và giống tiến bộ kỹ thuật, UC78 là dòng sinh trưởng chậm ở ba địa điểm khảo nghiệm, các dòng UG54, UG38, UT64, CP4, UCM48 mới khảo nghiệm tại

một địa điểm, các dòng kiểm chứng là E urophylla thuần U6, PN14, PN47

Trong số 14 chỉ thị SSR thì 12 chỉ thị cho kết quả đa hình (trừ EMBRA70 và EMBRA87) và có sự khác biệt rõ rệt giữa các đối tượng Kết quả bước đầu trong nghiên cứu này là các chỉ thị EMBRA28, EMBRA80, EMBRA93, EMBRA111, EMBRA187, EMBRA361 có thể sử dụng để phân biệt giữa các dòng sinh trưởng nhanh và chậm cho tổ hợp lai UE, UC, CU [5]

Một nghiên cứu khác của Đặng Thái Dương trên đối tượng Keo lá liềm, tác giả đã sử dụng 28 chỉ thị SSR nhưng chỉ 14 chỉ thị SSR cho kết quả tốt Phân tích 14 chỉ thị này trên 53 đối tượng thu được 52 allele khác nhau, 19,23% allele đơn hình, 80,77% allele đa hình Số allele/locus dao động từ 2 – 10, trung bình 3,71 allele/locus, hệ số tương đồng di truyền giữa các giống dao động từ 0,63 đến 0,98 với mức tương đồng di truyền 84%, từ đó đã chọn được 9 dòng ưu tú dựa vào chỉ thị phân tử phù hợp với

9 dòng ưu tú ở vườn ươm đã chọn có những đặc điểm về chỉ thị phân tử, chịu nóng, chịu hạn Cũng trong nghiên cứu này, với 30 chỉ thị RAPD tác giả đã xác định được 14 chỉ thị cho kết quả đa hình với chất lượng tốt, thu được 2.928 băng ADN với 78 allele (41 allele đa hình, 37 allele đơn hình), trung bình có 209,14 băng/chỉ thị Kích thước phân tử của allele nhỏ nhất

là 250bp, allele lớn nhất 2.200bp Đặc biệt, xuất hiện 9 allele ADN cá biệt

(chỉ xuất hiện duy nhất trên 1 mẫu nghiên cứu) và dựa vào các allele cá biệt này cùng với đánh giá kiểu hình tại lập địa tác giả đã đưa ra kết luận chỉ thị OPN5, OPN14, OPN16, OPO20, S256 có thể nhận biết 9 giống trong nghiên cứu có khả năng chống chịu hạn [7]

Các nghiên cứu về giống cây trồng lâm nghiệp trong nước và quốc tế

đã có những thành công nhất định, với khả năng ứng dụng rộng rãi của kỹ thuật sinh học phân tử trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau: đa dạng

di truyền, phân tích tỷ lệ thụ phấn chéo, bảo tồn nguồn gene nhưng hướng nghiên cứu chọn giống mang tính trạng năng suất, chất lượng mà các nhà khoa học mong muốn đang nhận được nhiều sự quan Điều này buộc các nhà nghiên cứu phải xác định được mối quan hệ giữa chỉ thị phân

tử với các tính trạng

Chương 2

MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được khác biệt về di truyền ở mức độ phân tử giữa các giống bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm làm cơ sở cho chọn giống sớm

2.2 Đối tượng và phạm vi, địa điểm nghiên cứu

- 14 dòng bạch đàn thuộc 10 tổ hợp lai giữa E urophylla và E

camaldulensis thuộc đề tài “Nghiên cứu lai giống một số loài bạch đàn, keo,

tràm và thông” được chọn để nghiên cứu Đây là các dòng đã khảo nghiệm hậu thế dòng vô tính tại hiện trường thuộc tỉnh Phú Thọ, Bình Dương, Bình Phước, Cà mau Trong đó, 6 dòng được công nhận giống quốc gia và tiến bộ

kỹ thuật tại các lập địa cụ thể

- 70 chỉ thị phân tử SSR được chọn trong bộ 300 chỉ thị EMBRA đã công bố, theo bản đồ liên kết các chỉ thị này được phân bố trên 11 nhiễm sắc thể (phụ lục 1)

- Các nội dung nghiên cứu trong phòng thí nghiệm được tiến hành tại Viện nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá sinh trưởng các giống bạch đàn lai được lựa chọn

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết ADN tổng số

- Mẫu lá thu hái trên đối tượng nghiên cứu là mẫu lá sạch, hạn chế tối

đa mẫu thu hái từ cây bị sâu bệnh Mẫu thu hái không quá non và không quá già (lá bánh tẻ)

- Mẫu lá sau khi lấy về được bảo quản theo hai cách:

+ Cách 1: Bảo quản khô bằng silicagel (hạt hút ẩm) ở nhiệt độ thường + Cách 2: Bảo quản lá tươi trong điều kiện nhiệt độ -20oC của tủ lạnh

- Tách chiết ADN tổng số từ lá bằng phương pháp cải tiến của

Keb-Llanes và cộng sự (2002)

1 Cắt 0,3g lá thành từng phần thật nhỏ và loại bỏ gân lá

2 Nghiền lá thành bột mịn trong cối chày sứ sạch với nitơ lỏng

3 Bổ sung 300µl EBA, 900µl EBB (làm ấm ở 65oC) và 100µl SDS và nghiền nhẹ, sau đó cho vào ống 1,5ml

8 Li tâm 10.200 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

9 Bổ sung 500µl ethanol 70% và li tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút

10 Đổ bỏ dịch nổi, làm khô tủa ở nhiệt độ thường

11 Cho vào ống 300µl TE hòa tan rồi bổ sung 60µl sodium acetat 3M và

360µl isopropanol lạnh Ủ trong đá 20 phút

12 Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 12 phút thu tủa và làm khô trong bình

chứa silicagel

13 Hòa tan bằng 150µl TE và 3µl RNase (10 µg/ml), ủ ở 37oC trong 90

phút Bổ sung 200µl isopropanol lạnh, ủ trong đá 45 phút rồi li tâm 10.200 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi

14 Bổ sung 300µl ethanol 70% và li tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút

15 Đổ bỏ dịch nổi, làm khô tủa trong bình chứa silicagel ở nhiệt độ

thường Hòa tan bằng 150µl TE và giữ mẫu ở 4oC đến -20oC

16 Kiểm tra độ tinh sạch của ADN bằng điện di trên gel agarose 1% và đo

nồng độ ADN bằng phương pháp quang phổ

2.4.2.1 Gel agarose 1%

- Thành phần 100ml gel agarose 1%:

+ Đun sôi 1g agarose trong 100ml dung dịch đệm TBE 0,5X

+ Bổ sung 5l ethidium bromide 10mg/ml vào dung dịch agarose 1%

- 10X Dung dịch đệm TBE (Tris-Boric acid-EDTA):

+ 108g Tris- base

+ 55,2g Boric acid

+ 40ml EDTA 0,5M

+ Thêm nước khử ion cho đủ 1 lít

- 5X Loading buffer (cho 100ml)

- Điện di gel Agarose 1%: Các bước tiến hành:

1 Cân 1g agarose, đong 100ml TBE 0,5X cho vào bình thủy tinh

2 Đun trong lò vi sóng đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất (1-2 phút)

3 Để nguội đến khoảng 50 - 60oC, thêm 5l ethidium bromide và lắc đều

4 Chuẩn bị khay và lược Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không

để lại bọt khí Để gel đông lại trong khoảng 45 - 60 phút

5 Lắp đặt gel đã chuẩn bị vào bể điện di

6 Cho đệm TBE 0,5X vào bể điện di cho ngập gel Rút lược ra khỏi gel

7 Nạp mẫu ADN vào các giếng trên gel ( 4l ADN + 1l 5X Loading buffer)

8 Chạy điện di ở 100 – 125V và 100mA trong thời gian 20 - 30 phút

9 Soi gel và đọc gel dưới ánh sáng UV Chụp ảnh lưu kết quả

- Đánh giá chất lượng ADN:

Độ nguyên vẹn của ADN được xác định bằng độ sáng và nét của băng ADN sau khi chạy điện di trên gel agarose 1% Dưới ánh sáng tia UV các băng ADN được nhận biết dưới dạng băng sáng, băng càng sáng thì nồng độ ADN càng cao Nếu băng gọn thì ADN có chất lượng tốt, không bị đứt gẫy Nếu băng không gọn và phía trên theo chiều điện di (từ giếng đi ra) tạo thành vệt kéo dài thì ADN có chất lượng không tốt, bị đứt gẫy

2.4.2.2 Gel polyacrylamide biến tính 4,5%

- Dung dịch cố định: glacial acetic acid 10%

- Dung dịchnhuộm: 1,5g AgNO3; 1,5ml forrmaldehyde 37% rồi thêm H2O cho đủ 1.000ml dung dịch

- Dung dịch hiện: 30g natri cacbonat (Na2CO3) hòa tan trong nước với tổng thể tích 1.000ml và làm lạnh ở 4 - 8oC, khi sử dụng cho thêm 1,5ml formaldehyde 37% và 200l Sodium thiosulfate

- 10X Dung dịch đệm TBE (Tris-Boric acid-EDTA):

108g Tris- base

55,2g Boric acid

40ml EDTA 0,5M

Thêm nước khử ion cho đủ 1.000 ml dung dịch

- Dung dịch Sequencing stop solution biến tính sản phẩm PCR

3 Lau tấm kính dài với dung dịch tạo liên kết (Binding solution: 2l Binding Silane, 1ml ethanol 95%, 5l glacial acetic acid), để kính khô

4 Lau tiếp tấm kính dài bằng ethanol 95% ba lần

5 Lắp ghép 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp nhựa có độ dầy 0,4mm

6 Chuẩn bị dung dịch acrylamide 4,5% từ dung dịch gốc acrylamide 40% (19:1= acrylamide: bisacrylamide)

7 Đổ 60ml dung dịch acrylamide 4,5% vào cốc đong 100ml Thêm 600l APS 10% và 60l TEMED, trộn đều

8 Bơm dung dịch gel vào giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí

9 Cài lược vào giữa hai tấm kính (răng lược hướng ra phía ngoài) Dùng kẹp cố định lược

10 Để gel polymer hoá trong 2 giờ

11 Tháo lược và loại bỏ hết các mảnh gel thừa bám trên mặt tấm kính

12 Lắp ráp bộ điện di Đổ dung dịch TBE 1X vào buồng đệm trên và dưới

13 Chạy làm nóng với công suất là 100W cho đến khi đạt nhiệt độ 50oC

14 Trộn sản phẩm PCR với 5l Sequencing stop solution

15 Biến tính các sản phẩm PCR ở 95oC trong 5 phút, rồi đặt ngay vào

trong đá và phủ đá lên trên ít nhất khoảng 5 phút

16 Tra vào mỗi giếng 5l sản phẩm PCR đã được làm biến tính, và tra vào

giếng bất kỳ 5l chỉ thị trọng lượng phân tử (M: marker) để xác định kích thước băng ADN hiện trên bản gel

17 Tiến hành điện di với điện thế 80V, công suất 80W, thời gian 50-70

phút

18 Sau khi chạy điện di, tháo gỡ tấm kính chứa gel

19 Cố định gel: đặt tấm kính vào khay sao cho mặt bám gel hướng lên

trên, đổ dung dịch cố địnhvào và lắc nhẹ trong 30 phút Sau đó lấy gel

ra khỏi dung dịch, chú ý giữ lại dung dịch này để dùng cho bước sau

20 Rửa gel: đổ nước cất vào khay để rửa tấm kính chứa bản gel, lắc nhẹ

trong 20 – 30 giây Bước này lặp lại 2 lần

21 Nhuộm gel: cho bản gel vào khay chứa dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong

30 phút

22 Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nước cất trong 5 giây

23 Đưa gel vào dung dịch hiện và lắc nhẹ đến khi các băng xuất hiện

24 Cho gel vào dung dịch cố địnhtrong 1 - 2 phút

25 Rửa lại bản gel bằng nước cất

26 Để khô gel ở nhiệt độ phòng

27 Đánh dấu vị trí, xác định kích thước ADN xuất hiện với marker Đọc

kết quả và sao chụp bản gel

2.4.3 Phương pháp kiểm tra chất lượn nồng độ ADN bằng máy quang phổ

Sau khi kiểm tra chất lượng ADN tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose, để định lượng cho sản phẩm ADN tách chiết sử dụng phương pháp đo bằng máy quang phổ Máy đo quang phổ là máy NanoDrop

1000 Spectrophotometer của hãng Thermo scientific Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm của các base nitơ trong phân tử ADN, đo giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm (OD260nm – Optical Density 260 nm) cho phép xác định nồng độ ADN trong mẫu dựa vào phương trình Beer-Lambert được cài đặt sẵn trên phần mềm điều khiển của thiết bị trong máy tính, công thức (1):

c = (A × e)/b (1)

Trong đó:

A – chỉ số hấp thụ chất cần đo tại bước sóng nhất định

e – hệ số hấp phụ bước sóng của từng chất (ng-cm/µl)

b – độ dài đường dẫn của giá trị đo tại bước sóng nhất định (cm)

c – nồng độ của chất trong dung dịch đo (ng/µl)

Với một đơn vị OD ở bước sóng 260nm (OD260nm) tương ứng với nồng

độ là 50ng-cm/µl cho ADN mạch kép, 33ng-cm/µl cho ADN mạch đơn và 40ng-cm/µl cho ARN

Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, đo giá trị OD ở bước sóng 280nm (OD280nm) Ở bước sóng 280nm, các protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các axit nucleic và

do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ axit nucleic Một dung dịch ADN sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỉ số OD260nm/ OD280nm nằm trong khoảng 1,8 – 2,0

Từ kết quả đo nồng độ ADN đo được sẽ pha loãng bằng nước de-ion để ADN sử dụng trong phản ứng PCR có nồng độ là 25-30ng/µl theo công thức (2):