Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β galactosidase từ bacillus subtilis VTCC DVN 12 01 phân lập ở việt nam bằng kỹ thuật ep RCA và đột biến điểm định hướng tt

Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai tròcủa một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis DVN-12-01 phân lập ở Việ

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUY N TH TH O Ễ Ị Ả

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ

GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA

PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ

ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 01 16

TÓM T T LU N ÁN TI N SĨ SINH H C Ắ Ậ Ế Ọ

Hà Nội - 2017

Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Quyền Đình Thi

Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1:

………

Phản biện 2:

………

Phản biện 3:

………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên chính thức Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi giờ , ngày tháng năm 201

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Viện Công nghệ sinh học

- Webside: http://luanvan.moet.gov.vn

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

β-Galactosidase (hay còn gọi là lactase), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóasaccharide, cắt các gốc β-D-galactose từ đầu không khử của các β-galactosidegalactoside của các poly- và oligosaccharide hoặc các sản phẩm chuyển hóa bậchai Enzyme này phổ biến trong tự nhiên và được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật,động vật và người Trong đó, β-galactosidase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi sinhvật như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn và đây cũng là nguồn enzyme có giá trịthương mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởngnhanh và năng suất tổng hợp cao

β-Galactosidase được ứng dụng nhiều trong y dược, môi trường, công nghệsinh học và đặc biệt là công nghiệp chế biến sữa Với 75% dân số trên thế giớithiếu hụt enzyme lactase để phân giải lactose của sữa, nên đây được xem là mộtứng dụng quan trọng của β-galactosidase trong ngành công nghiệp này Ngoài ra β-galactosidase còn được bổ sung vào quá trình lên men bơ sữa để tránh sự kết tinhcủa lactose ở nhiệt độ thấp và tăng độ ngọt cho sản phẩm Đặc biệt gần đây,

β-galactosidase đã được khai thác mạnh vào việc sản xuất thực phẩm chức năng làtổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS) nhờ hoạt tính chuyển gốc glycosyl trongquá trình thủy phân lactose trong sữa để tạo thành các oligosaccharide GOS được

sử dụng như nguồn thức ăn không tiêu hóa (prebiotic) để kích thích hệ vi khuẩnhữu ích đã hiện diện trong đường ruột Để đáp ứng nhu cầu trong ngành côngnghiệp này, β-galactosidase từ rất nhiều nguồn vi sinh vật đã được nghiên cứu khaithác Trong số này β-galactosidase từ B subtilis đang rất được chú ý bởi khả năng

hoạt động tối ưu trong khoảng pH 6-7, bền ở nhiệt độ 30-40°C rất thích hợp choứng dụng thủy phân lactose trong sữa cũng như trong các sản phẩm chế biến khác

từ sữa Đây cũng là một enzyme có tiềm năng để ứng dụng trong một số lĩnh vực khác và B subtilis cũng đã được biết là một chủng an toàn được sử dụng rộng rãi

trong công nghiệp thực phẩm

Bên cạnh đó, để chủ động hơn trong việc ứng dụng cũng như lĩnh vực ứngdụng, bên cạnh việc sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp các enzymemới có hiệu suất xúc tác cao và tính chất như mong đợi, sự phát triển của côngnghệ DNA cũng cho phép chúng ta có thể chủ động hơn trong việc cải biếnprotein/enzyme để nâng cao hiệu suất xúc tác cũng như phát triển các tính chất mới

của enzyme Phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trong in vitro hoặc in vivo cùng

với việc lựa chọn di truyền cùng với phương pháp sàng lọc nhanh, là những công

cụ mạnh để phát triển enzyme với những đặc tính mới so với ban đầu

Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai trò

của một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam bằng kỹ thuật ep-RCA và đột biến điểm định hướng”.

VTCC-2 Mục đích nghiên cứu

- Xác định vai trò của một số axit amin quan trọng của β-galactosidase (LacA)

từ B subtilis VTCC-DVN-12-01

- Tìm được LacA đột biến có tính chất mới so với enzyme ban đầu

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa β-galactosidase từ

B subtilis VTCC-DVN-12-01 bằng phương pháp sao chép lỗi DNA vòng (error

prone rolling circle amplification, ep-RCA) và sàng lọc các dòng mang gen lacA

đột biến có hoạt tính tăng hoặc có các tính chất mới như nhiệt độ hoạt động, độ bềnnhiệt độ so với LacA ban đầu

- Sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc protein/enzyme, kết hợp với so sánhtrình tự axit amin với các β-galactosidase trong cùng họ đã được xác định cấu trúc

để dự đoán một số axit amin quan trọng tham gia trực tiếp trong quá trình thủyphân cơ chất của LacA để từ đó tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo ra cácLacA có các tính chất mới so với enzyme ban đầu

4 Những đóng góp mới của luận án

(i) Xây dựng được thư viện đột biến ngẫu nhiên gen lacA mã hóa

β-galactosidase của B subtilis VTCC-DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA với

tần suất đột biến đạt 2,7 đột biến/kb

(ii) Xác định được sáu vị trí axit amin quyết định đến hoạt tính của LacA gồmArg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 và His374

(iii) Xác định được một số thay đổi axit amin ở vị trí Ala301, Phe361 làm tăng độbền LacA và một số thay đổi tại vị trí Leu373 làm tăng nhiệt độ hoạt động của LacA

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Về khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học vềphương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen bằng phương pháp lỗi DNA vòng,đột biến điểm suy biến Kết quả cũng cung cấp thông tin về vai trò quan trọng củamột số axit amin của β-galactosidase từ B subtilis VTCC DVN-12-01 ảnh hưởng

đến hoạt tính và tính chất của enzyme

Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết quả thu được có thể áp dụng để cải biến các β-galactosidase khác trong cùng họ enzyme thủy phân liên kết glycoside GHF-42(Glycoside Hydrolase Family 42) nhằm thay đổi hoạt tính cũng như phát triển các

tính chất mới của enzyme

* Cấu trúc luận án:

Luận án gồm 130 trang (cả tài liệu tham khảo), 21 bảng và 28 hình được chiathành các chương, phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu 31 trang;Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (18 trang); Chương 3: Kết quảnghiên cứu (44 trang); Chương 4: Bàn luận (15 trang); Kết luận và đề nghị (1trang); Tóm tắt tiếng Anh (7 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án(1 trang); Tài liệu tham khảo (10 trang, gồm 5 tài liệu tiếng Việt và 119 tài liệutiếng Anh); Phụ lục (23 trang)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆULuận án đã tham khảo 5 tài liệu tiếng Việt và 119 tài liệu tiếng Anh để tổng kếtcác nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Thông tin chung về β-galactosidase;(Nguồn gốc và phân loại, Cấu trúc, Cơ chế phản ứng); (2) Ứng dụng; (3) Tình hìnhnghiên cứu trong, ngoài nước và hướng nghiên cứu của đề tài

β-Galactosidase (β-D-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23), thuộc nhóm cácenzyme chuyển hóa saccharide trong họ các enzyme thủy phân, cắt các gốc β-D-galactose từ đầu không khử của các β-galactoside (CAZy, http://www.cazy.org/).Ngoài ra, β-galactosidase còn được gọi là enzyme tiêu hóa lactose hay lactase cómặt trong ruột non ở hầu hết động vật có vú giúp thủy phân lactose Enzyme nàyđược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp chế biến sữa, xử lýwhey (một chất thải trong công nghiệp sản xuất bơ với thành phần chính là lactose)

để sản xuất ethanol, tổng hợp oligo-saccharide (GOS), trong công nghệ sinh học vàtrong y dược

Trong những năm gần đây, β-galactosidase được nghiên cứu tập trung vào bahướng chính là tìm kiếm các β-galactosidase có đặc tính mới, tạo enzyme tái tổhợp, cố định enzyme để nâng cao độ bền và hướng quan tâm nhất là cải biến

enzyme để tạo tính mới Feng và CS (2005) đã cải biến β-glycosidase từ Thermus

thermophilus bằng đột biến ngẫu nhiên (error prone PCR) kết hợp với đột biến

điểm định hướng suy biến (site-saturation mutagenesis) làm tăng hiệu suất tổnghợp trisaccharide lên 50 và 74%, trong khi enzyme ban đầu chỉ tổng hợp khôngquá 8% Placier và CS (2009) đã tạo đột biến gen mã hóa β-galactosidase (BgaB)

từ Geobacillus stearothermophilus KVE39 cũng làm tăng hiệu suất tổng hợp

trisaccharide 5-11 lần so với ban đầu Dong và CS (2011) gây đột biến BgaB từ

G stearothermophilus tại một số axit amin tham gia liên kết trực tiếp với cơ chất

và tìm thấy đột biến thay thế Glu thành Tyr tại vị trí 351 của BgaB đã làm tăng

hoạt tính thủy phân lên 3,5 lần với cơ chất oNPG.

Cho đến nay, ở Việt Nam cũng đã có một số công trình nghiên cứu về β-galactosidase ở vi vinh vật và tập trung chủ yếu theo hướng thu nhận enzyme tựnhiên và tái tổ hợp Năm 2007, Đặng Thị Thu và CS đã tuyển chọn được ba chủng

nhất đạt 1325,6 mU/g tế bào sau khi tối ưu Nguyễn Thị Vân Linh và CS (2012) đã

nghiên cứu thu nhận và tinh sạch β-galactosidase từ Lactobacillus acidophilus có

khối lượng phân tử 40 kDa với hiệu suất thu hồi đạt 89,9% Năm 2003, TrươngNam Hải và CS đã lần đầu tiên nghiên cứu tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền

để sinh tổng hiểu hiện β-galactosidase tái tổ hợp trong Escherichia coli ATTC 1105

có hiệu suất cao để ứng dụng trong thực phẩm Nguyễn Quỳnh Uyên và CS (2012)cũng đã nghiên cứu biểu hiện thành công β-galactosidase tái tổ hợp trong

B subtilis PY79 dưới sự điều khiển của promoter PrrnO-RBS Gen mã hóa

β-galactosidase được cài vào genome của B subtilis bằng cách thay thế gen mã hóa

amylase của vật chủ

Để phát triển một hướng nghiên cứu mới với β-galactosidase ở Việt Nam,trong đề tài này chúng tôi ứng dụng kỹ thuật sao chép lỗi vòng DNA và đột biếnđiểm định hướng tại một số vị trí axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất nhằm

tạo ra tính chất của LacA từ B subtilis VTCC-DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam Trong một nghiên cứu trước đây về LacA tái tổ hợp trong E coli BL21, Quyền

Đình Thi và CS (2011) cho thấy LacA tuy có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 50°Cnhưng vẫn hoạt động tốt ở nhiệt độ thấp, hoạt tính vẫn đạt được 60% so với nhiệt

độ tối ưu ở 20-25°C Bên cạnh đó LacA còn hoạt động tối ưu trong khoảng pHtrung tính 6-7,0 và bền ở nhiệt độ 30-40°C Đây là một enzyme tiềm năng cho ứngdụng thủy phân lactose trong sữa và các sản phẩm chế biến khác từ sữa

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1.1Vật liệu và hóa chất nghiên cứu

Gen lacA (2061 bp, mã số EU585783) mã hóa cho β-galactosidase (LacA) từ

B subtilis VTCC-DVN-12-01 (B subtilis G1) đã được đưa vào pET22b(+) bằng BamHI và NotI tạo thành plasmid tái tổ hợp pElacA đã được tạo ra theo nghiên cứu

trước đây Plasmid pElacA được sử dụng để tạo các thể đột biến LacA bằng saochép lỗi DNA vòng

Chủng Escherichia coli JM109(DE3) [endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk-,

mk+), relA1, supE44, λ-, ∆(lac-proAB), [F’, traD36, proAB, lacIqZ∆M15], IDE3](Promega Corp, Madison, WI) dùng để biểu hiện LacA ban đầu và các LacA đột biến

Hóa chất trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết được mua từ các hãng hóachất có uy tín như Sigma, Invitrogen, Thermo (Mỹ), Qiagen, Bio basic (Canada),Merck (Đức) Các dung dịch và đệm dùng cho thí nghiệm được pha theo hướngdẫn của các bài thí nghiệm chuẩn.

Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm đều có độ chính xác cao thuộcPhòng Công nghệ sinh học Enzyme và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệGen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

1.2Phương pháp nghiên cứu

1.2.1 Phương pháp vi sinh vật

Thư viện các dòng E coli mang gen lacA đột biến được tạo dòng trên môi

trường LB có bổ sung 50 µg/ml ampicillin; Dòng E coli tái tổ hợp mang gen lacA

và các lacA đột biến được nuôi cấy biểu hiện trong LB có bổ sung 50 µg/mlampicillin và cảm ứng bằng 1 mM IPTG

1.2.2 Phương pháp hóa sinh

Tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến bằng sắc ký ái lực qua cột ProBondresin (Invitrogen); Chạy điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) theo phươngpháp của Lemmli (1970); Điện di agarose; Xác định hàm lượng protein theophương pháp Bradford (1975); Xác định hoạt tính β-galactosidase theo phươngpháp của Miller (1959); Nghiên cứu đặc điểm của LacA-WT và các LacA đột biến(Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính của enzyme; Ảnh hưởng của nhiệt độ

và pH đến độ bền của enzyme; Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến độ bềnenzyme; Động học phản ứng của enzyme); Đánh giá khả năng chuyển hóaglycoside của LacA bằng sắc ký lớp mỏng TLC

1.2.3 Phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp sao chép lỗi vòng DNA ep-RCA được sử dụng để tạo đột biến

ngẫu nhiên trên gen lacA bằng phản ứng RCA có bổ sung Mn2+ để làm giảm tínhđặc hiệu của DNA polymerase Phản ứng RCA được thực hiện bằng kitamplification TempliPhi 100 (Healthecare)

Đột biến điểm định hướng sử dụng cặp mồi có bộ ba suy biến 3 nucleotide

‘NNK’ tại vị trí cần gây đột biến trong phản ứng PCR

Các phương pháp sinh học phân tử khác như tách chiết, tinh sạch plasmid; Biến nạpplasmid hóa học, biến nạp xung điện; Các kỹ thuật cắt, nối DNA; được tham khảo theoSambrook và Ruessell (2001) Giải trình tự và phân tích gen theo Sanger (1975)

1.2.4 Phương pháp phân tích số liệu

Phần mềm Microsoft Excel được xử dụng để xử lý số liệu thu được trong quá

trình thực nghiệm, tính giá trị tham số thống kê Phần mềm Dolphin 1D được dùng

để phân tích và đánh giá mức độ biểu hiện và tinh sạch Chương trình DNA starđược dùng để phân tích và so sánh trình tự nucleotide của các chủng β-

galactosidase tự nhiên và đột biến Chương trình Phyre2 (Kelley et al., 2015) dùng

để phân tích cấu trúc và 3DligandSite (Wass et al., 2010) phân tích mối tương tác

trong vùng xúc tác của LacA và các LacA đột biến

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ

1.3Tạo đột biến ngẫu nhiên

1.3.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA

Gen lacA mã hóa β-galactosidase (LacA) từ B subtilis VTCC-DVN-12-01 đã

được đưa vào plasmid pET22b(+) tạo thành plasmid tái tổ hợp pELacA và biểu

hiện ở dạng thể tan trong E coli BL21 trong một nghiên cứu trước đây (Quyen et

al., 2011) Trong nghiên cứu này, plasmid pELacA được dùng làm khuôn để tạo đột

biến ngẫu nhiên trên gen lacA trong phản ứng ep-RCA có sự tham gia của Φ29polymerase và ion Mn2+ (yếu tố tạo đột biến) Mn2+ được bổ sung vào phản ứng vớicác nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2 mM Sản phẩm ep-RCA chỉ được tạo ra ở phản ứng

có bổ sung MnCl2 ở nồng độ từ 0,5-1,5 mM Sản phẩm khuếch đại nằm trong vùng

có kích thước từ 1000 đến trên 10.000 bp, trong đó chủ yếu tập chung thành băng

có kích thước lớn hơn 10.000 bp (Hình 3.1, làn 1-3) Những đoạn DNA này có thể

có hai hoặc nhiều hơn các trình tự pELacA được lặp lại (multimer) Nồng độ Mn2+

càng tăng thì sản phẩm ep-RCA càng giảm và ở nồng độ 2 mM, Φ29 polymerase bị

ức chế hoàn toàn nên sản phẩm ep-RCA không được tạo ra (Hình 3.1, làn 4) Sau

24 giờ ủ ở 30°C, 25 pg khuôn pELacA ban đầu đã được khuếch đại và có hàmlượng từ 52,3-25,5 ng/µl tương ứng với nồng độ 0,5-1,5 mM MnCl2 bổ sung trongphản ứng

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm plasmid

pELacA sau phản ứng ep-RCA.

Phản ứng ep-RCA được bổ sung 0,5

mM Mn 2+ (làn 1); 1 mM (làn 2) và 1,5

mM (làn 3); thang DNA chuẩn (M)

Tần suất xuất hiện đột biến trên gen lacA cao nhất ở nồng độ 1,5 mM MnCl2,đạt 2,7 ± 2,1 đột biến/kb Trong đó có hai dạng đột biến là đột biến thay thế các

10.000 →

1000 →

bp M 1 2 3 4

nucleotide (chiếm 94,7%) và đột biến chèn thêm nucleotide (chiếm 5,3%) Nhưvậy, nồng độ 1,5 mM MnCl2 là thích hợp nhất để bổ sung vào phản ứng ep-RCA

để tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA.

1.3.2 Tạo thư viện các dòng mang gen lacA đột biến và sàng lọc hoạt tính

Sản phẩm ep-RCA được cắt với MluI (enzyme giới hạn có điểm cắt duy nhất

trong vector pET22b+) và đóng vòng bằng T4 ligase để tạo thành các đơn vịplasmid đơn lẻ hoàn chỉnh, sau đó biến nạp vào JM109(DE3) để tạo thư viện các

dòng mang gen lacA đột biến.

Các dòng trong thư viện đột biến được nhặt nuôi, biểu hiện trong môi trường LBtrên các đĩa nuôi cấy 96 giếng để sàng lọc hoạt tính Dịch nuôi cấy (gồm cả tế bào)được sử dụng như nguồn enzyme để xác định hoạt tính thủy phân với cơ chất oNPG.Thống kê kết quả sàng lọc hoạt tính từ 10.000 dòng trong thư viện đột biến ngẫunhiên cho thấy 7563 các dòng có hoạt tính không thay đổi (chiếm 75,63%), 1950dòng mất hoạt tính (chiếm 19,5%) và 487 dòng giảm mạnh hoạt tính (chiếm 4,87%) Bên cạnh hướng sàng lọc hoạt tính để tìm dòng đột biến có hoạt tính LacAtăng so với ban đầu, các dòng trong thư viện cũng được kiểm tra độ bền nhiệt củaenzyme nhằm tìm kiếm các LacA đột biến bền nhiệt hơn so với LacA ban đầu(LacA-WT) Theo nghiên cứu của Quyen và CS (2011), LacA hoạt động tối ưu ở

55°C và không bền ở nhiệt độ trên 40°C, do đó dịch enzyme của các dòng trên được

ủ ở 50°C trong 1 giờ sau đó xác định hoạt tính còn lại Kết quả sàng lọc cho thấymặc dù hoạt tính dòng 3.259 giảm còn 51,9% so với dòng tự nhiên nhưng vẫn giữđược 92,5% hoạt tính sau 1 giờ ủ ở 50°C Dòng 2.461 hoạt tính cũng chỉ bằng36,2% so với dòng tự nhiên nhưng cũng giữ được 40,4% hoạt tính so với trước khi

ủ Kết quả này cho thấy LacA của hai dòng 2.461 và 3.259 có thể có các đột biếnlàm tăng độ bền enzyme

1.3.3 Phân tích trình tự các dòng đột biến

Kết quả phân tích trình tự gen lacA ở dòng 2.461 giảm hoạt tính còn 36,2% và

dòng 3.259 giảm còn 51,9% so với WT đều có các đột biến làm thay đổi một sốaxit amin trên LacA Dòng 2.461 có các đột biến Glu62Val, Arg77Trp,Ala191Val và Ala301Val Dòng 3.259 có các đột biến Phe361Tyr,Ala429Val và Ala524Thr

1.3.4 Xác định điểm đột biến làm thay đổi hoạt tính LacA

3.1.4.1 Tạo dòng mang gen lacA có các điểm đột biến

Từ các điểm đột biến thu được sau khi phân tích trình tự ở dòng 2.461 và 3.259,chúng tôi đã thiết kế các cặp mồi tại từng vị trí đột biến để tạo đột biến điểm nhằm tìm

chính xác điểm đột biến ảnh hưởng đến hoạt tính cũng như độ bền nhiệt của LacA.Khuôn plasmid pELacA được dung làm khuôn để khuếch đại toàn bộ khuônpELacA với từng cặp mồi đột biến đã thiết kế với bộ ba nucleotide thay đổi mã hóacho các axit amin cần thay thế tại các vị trí Glu62Val, Arg77Trp, Ala191Val,Aal301Val, Tyr361Val, Ala429Val và Ala524Thr Sản phẩm khuếch đại plasmidpELacA có một băng kích thước khoảng 7500 bp, đúng với kích thước tính toán

(gồm pET22b+ có kích thước 5493 bp và gen lacA có kích thước 2061 bp) và ngang với băng DNA của khuôn pELacA được cắt mở vòng với MluI (Hình 3.3).

Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR khuôn pELacA với các cặp mồi đột biến.

Glu62Val (1), Arg77Trp (2), Ala191Val (3), Ala301Val (4), Phe361Tyr (5), Ala429Val (6) và Ala524Thr (7), đối chứng khuôn pELacA cắt mở vòng với MluI (8), thang DNA chuẩn 1kb (M)

Sản phẩm pELacA sau khi khuếch đại với mỗi cặp mồi đột biến được đóng vòngtrở lại bằng T4 ligase và biến nạp vào JM109(DE3) Các khuẩn lạc thu được từ mỗi vị

trí gây đột biến được nhặt nuôi, tách plasmid để kiểm tra lại trình tự gen lacA Kết quả đọc trình tự gen lacA từ các dòng đột biến cho thấy các bộ ba nucleotide mã hóa cho

các axit amin ở các vị trí Glu62, Arg77, Ala191, Ala301, Phe361, Ala429 và Ala524 đãđược thay thế thành các bộ ba mã hóa cho các axit amin mong muốn (Hình 3.4)

Wild-type Ala429Val

Hình 3.4F Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala429 trên LacA

Hình 3.4G Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala524 trên LacA

3.1.4.2 Biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính riêng của LacA đột biến

Trong cùng điều kiện nuôi biểu hiện, các đột biến Glu62Val, Arg77Trp,Ala191Val, Aal301Val, Tyr361Val, Ala429Val và Ala524Thr không làm ảnh hưởngđến mức độ biểu hiện của LacA Mức độ biểu hiện đạt 18,86% - 19,27% proteintổng số của tế bào khi phân tích bằng phần mềm Dolphin 1D LacA-WT cũng nhưcác LacA đột biến từ các dòng được tinh sạch 4,08 đến 4,98 lần qua cột sắc ký ái lực

Ni2+ và hiệu suất thu hồi đạt từ 71 đến 84,1% LacA-WT và các LacA đều cho mộtbăng duy nhất có kích thước khoảng 70 kDa trên điện di đồ, đúng với kíchthước theo tính toán của LacA (Hình 3.6) và có độ sạch trên 98% (theo phân tíchcủa phần mềm Dolphin 1D)

Hình 3.6 SDS-PAGE LacA tinh

sạch từ các dòng đột biến điểm.

WT (1), Glu62Val (2), Arg77Trp (3), Ala191Val (4), Ala301Val (5), Phe361Tyr (6), Ala429Val (7) và Ala524Thr (8), thang protein chuẩn (M)