Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β galactosidase từ bacillus subtilis VTCC DVN 12 01 phân lập ở việt nam bằng kỹ thuật ep RCA và đột biến điểm định hướng

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA -GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THỊ THẢO

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA

-GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis

VTCC-DVN-12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ

ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Nguyễn Thị Thảo

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ

GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA

-GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis

VTCC-DVN-12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Quyền Đình Thi

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2017

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cố PGS TS Quyền Đình Thi, nguyên Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, nguyên Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, biên tập bản thảo bài báo và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị cũng như kinh phí để hoàn thành Luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh, Trưởng phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã sửa các bản thảo bài báo và cho tôi sử dụng số liệu trong khuôn khổ đề tài “Nâng cao hoạt tính xúc tác của enzyme tái tổ hợp β-galactosidase bằng kỹ thuật sao chép lỗi DNA vòng và đột biến điểm trực tiếp” thuộc đề tài Nghiên cứu cơ bản 2011-2012 của Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia do TS làm chủ nhiệm

Tôi xin cảm ơn GS TS Trương Nam Hải, nguyên Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ hướng dẫn phân tích cấu trúc enzyme

Tôi xin cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, phụ trách phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã giúp tôi hoàn thành các thủ tục để bảo vệ Luận án ở các cấp Tôi cũng xin cảm ơn tập thể Phòng CNSH Enzyme, đã tạo điều kiện về thời gian, chia sẻ chuyên môn và giúp đỡ tận tình trong suốt quá trình thực hiện Luận án

Tôi xin cảm ơn Phòng quản lý tổng hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, các cán bộ tại cơ sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất, máy móc và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017

Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

Tôi xin cam đoan:

1 Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác;

2 Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả;

3 Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017

Tác giả

Nguyễn Thị Thảo

BOD Biochemical oxygen demand (Nhu cầu oxy sinh hóa)

BSA Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò)

cfu Colony forming unit (Đơn vị xác định số lượng tế bào riêng rẽ

của vi khuẩn hoặc nấm) COD Chemical oxygen demand (Nhu cầu oxy hóa học)

DNA Deoxyribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic)

ep-RCA Error prone rolling circle amplification (Sao chép vòng tạo lỗi) Gal Galactose (đường galactozơ)

Glc Glucose (đường glucozơ)

GHF Glycoside hydrolase family (Họ các enzym thủy phân liên kết

glycozit) GOS Galactose-oligossacharide

IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

kb Kilo base (Đơn vị đo kích thước của phân tử ADN)

kDa Kilo Dalton (Đơn vị đo khối lượng của phân tử protein)

PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

oNPG Ortho-Nitrophenyl--D-galactopyranoside

pNPG/pNP-gal para-Nitrophenyl--D-galactopyranoside

pNP-fuc para-Nitrophenyl--D-fucopyranoside

rpm Round per minute (Vòng/phút)

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

(Điện di gel polyacrylamit có bổ sung sodium dodecyl sulfate) SOC Super optimal broth (Môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn)

TIM Triose-phosphate isomerase

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC PHỤ LỤC xi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Thông tin chung về -galactosidase 4

1.1.1 Định nghĩa 4

1.1.2 Nguồn gốc và phân loại 4

1.1.3 Cấu trúc 8

1.1.4 Cơ chế phản ứng 15

1.2 Ứng dụng 18

1.2.1 Trong công nghiệp chế biến sữa 19

1.2.2 Trong xử lý whey 20

1.2.3 Trong y dược 23

1.2.4 Một số ứng dụng khác 24

1.3 Tình hình nghiên cứu β-galactosidase trong và ngoài nước 25

1.3.1 Các hướng nghiên cứu trên thế giới 25

1.3.2 Các nghiên cứu trong nước 31

1.3.3 Hướng nghiên cứu của đề tài 32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Vật liệu và hóa chất 35

2.1.1 Vật liệu 35

2.1.2 Hóa chất và dung dịch 36

2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu 38

2.2.3 Tạo đột biến điểm và đột biến điểm suy biến 42

2.2.4 Xây dựng và phân tích cấu trúc enzyme 43

2.2.5 Sàng lọc hoạt tính -galactosidase từ các dòng mang gen lacA đột biến 43

2.2.6 Tách DNA plasmid 44

2.2.7 Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn 45

2.2.8 Điện di agarose 45

2.2.9 Xác định trình tự DNA 45

2.2.10 Biểu hiện và tinh sạch LacA tái tổ hợp 45

2.2.11 Điện di SDS-PAGE 46

2.2.12 Xác định hàm lượng protein 47

2.2.13 Xác định hoạt tính thủy phân của -galactosidase 48

2.2.14 Xác định khả năng chuyển hóa glycoside của -galactosidase 49

2.2.15 Đặc điểm của LacA tự nhiên và đột biến 50

2.2.16 Xử lý số liệu 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53

3.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên 54

3.1.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA 54

3.1.2 Tạo thư viện các dòng mang gen lacA đột biến và sàng lọc hoạt tính 57

3.1.3 Phân tích trình tự các dòng đột biến 59

3.1.4 Xác định điểm đột biến làm thay đổi hoạt tính LacA 60

3.2 Tạo đột biến điểm suy biến 66

3.2.1 Xác định vùng liên kết cơ chất của LacA 67

3.2.2 Tạo thư viện đột biến điểm suy biến 68

3.2.3 Sàng lọc hoạt tính và chọn dòng 69

3.2.4 Phân tích trình tự các dòng đột biến 69

3.2.5 Tinh sạch và xác định hoạt tính riêng của LacA đột biến điểm suy biến 72

3.3 Đánh giá tính chất lý hóa của các LacA đột biến 77

3.3.1 Nhiệt độ hoạt động tối ưu 78

3.3.2 pH hoạt động tối ưu 79

3.3.3 Ảnh hưởng của pH đến độ bền LacA tự nhiên và đột biến 80

3.3.6 Ảnh hưởng của đột biến đến khả năng tạo oligosaccharide 86

3.4 Phân tích sự ảnh hưởng của các đột biến đến cấu trúc của LacA 88

3.4.1 Ảnh hưởng của vị trí Ala301 đến cấu trúc của LacA 88

3.4.2 Ảnh hưởng của vị trí Phe361 đến cấu trúc của LacA 91

3.4.3 Ảnh hưởng của vị trí Leu373 đến cấu trúc của LacA 93

CHƯƠNG 4 THẢO LUẬN 97

4.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen lacA 97

4.2 Đánh giá ảnh hưởng của các vị trí đột biến tìm được trên LacA 98

4.2.1 Ảnh hưởng của axit amin Ala301 99

4.2.2 Ảnh hưởng của các axit amin dự đoán liên kết với cơ chất 103

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112

CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 113

THESIS ABSTRACT 114

TÀI LỆU THAM KHẢO 121

PHỤ LỤC 1

Hình 1.1 Cấu trúc -galactosidase của E coli thuộc họ GHF-2 .10

Hình 1.2 Cấu trúc của -galactosidase từ K lactis .10

Hình 1.3 So sánh cấu trúc -galactosidase từ người với một số vi sinh vật khác 11

Hình 1.4 Cấu trúc của -galactosidase từ B circulans ATCC 31382 .12

Hình 1.5 Cấu trúc không gian 3 chiều và vùng trung tâm hoạt động của LacA 14

Hình 1.6 Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase 16

Hình 1.7 Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase với hai axit glutamic trong trung tâm hoạt động .

17 Hình 1.8 Sự tổng hợp oligosaccharide .22

Hình 1.9 Sơ đồ so sánh phương pháp error prone-RCA với các phương pháp đột biến ngẫu nhiên khác .

33 Hình 2.1 Cơ chế tạo đột biến ngẫu nhiên bằng sao chép lỗi vòng DNA 40

Hình 2.2 Các bước trong quá trình tạo đột biến định hướng 42

Hình 2.3 Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford 48

Hình 2.4 Sự thủy phân của oNPG bởi -galactosidase 49

Hình 2.5 Đồ thị Lineawever-Burk 51

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm plasmid pELacA sau phản ứng ep-RCA 55

Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pELacA từ các dòng trong thư viện đột biến ngẫu nhiên bằng BamHI và NotI

57 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR khuôn pELacA với các cặp mồi đột biến 60

Hình 3.4A Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Glu62 trên LacA 61

Hình 3.4B Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Arg77 trên LacA 61

Hình 3.4C Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala191 trên LacA 62

Hình 3.4D Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin A301 trên LacA 62

Hình 3.4E Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Phe361 trên LacA 62

Hình 3.4F Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala429 trên LacA 63

Hình 3.4G Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Ala524 trên LacA 63

Hình 3.5 SDS-PAGE protein tổng số của các dòng đột biến điểm biểu hiện LacA 64

Hình 3.6 SDS-PAGE LacA tinh sạch từ các dòng đột biến điểm 64

Hình 3.7 Kết quả dự đoán các vị trí axit amin tương tác với cơ chất theo chương trình SWISS-MODEL .

67 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại khuôn pElacA với các cặp mồi đột biến 68

viii

Hình 3.10 Trình tự bộ ba nucleotide tại vị trí mã hóa cho axit amin Leu373 trên LacA-WT

và các LacA đột biến

72 Hình 3.11 SDS-PAGE protein tổng số của một số dòng đột biến điểm biểu hiện LacA 73

Hình 3.12 SDS-PAGE LacA tinh sạch từ một số dòng đột biến điểm 74

Hình 3.13 Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến 78

Hình 3.14 pH hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến 79

Hình 3.15 Ảnh hưởng pH đến độ bền LacA-WT và các LacA đột biến ở pH 4 81

Hình 3.16 Độ bền của LacA-WT và các LacA đột biến ở 45 và 50C 82

Hình 3.17 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính LacA và các đột biến 85

Hình 3.18A Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột biến tại vị trí 301 .

87 Hình 3.18B Sắc ký bản mỏng sản phẩm chuyển hóa của LacA-WT và các LacA đột biến tại vị trí Phe361 và Leu373 .

88 Hình 3.19 Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến ở vị trí Ala301 89

Hình 3.20 Mối tương tác với cơ chất trong vùng xúc tác của LacA-WT và các đột biến tại Ala301 .

90 Hình 3.21 Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến Phe361Tyr 91

Hình 3.22 Kết quả phân tích cấu trúc 3D của LacA-WT và LacA-361Tyr 92

Hình 3.23 Kết quả phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và LacA-361Tyr .

92 Hình 3.24 Một phần cấu trúc bậc hai của LacA-WT và LacA đột biến tại Leu373 94

Hình 3.25 Kết quả phân tích mối tương tác với cơ chất trong vùng trung tâm LacA-WT và LacA đột biến tại Leu373 .

95 Hình 4.1 Sự phân bố của các đột biến nucleotide trên gen lacA .97

Hình 4.2 Trình tự một phần của -galactosidase thuộc họ 42 từ các loài khác nhau 100

Bảng 1.1 Nguồn -galactosidase từ vi sinh vật 6

Bảng 1.2 Độ tương đồng về trình tự axit amin của LacA với một số -galactosidase khác 15

Bảng 1.3 Các vị trí axit amin của LacA được dự đoán liên kết với cơ chất 15

Bảng 1.4 Tính chất của một số -galactosidase từ vi sinh vật 19

Bảng 1.5 β-Galactosidase hoạt động ở nhiệt độ thấp và độ bền nhiệt 25

Bảng 2.1 Các cặp mồi tạo đột biến điểm 35

Bảng 2.2 Các cặp mồi đột biến điểm suy biến 36

Bảng 2.3 Các hóa chất thí nghiệm chính 36

Bảng 2.4 Thành phần các loại đệm và dung dịch 37

Bảng 2.5 Các thiết bị thí nghiệm 38

Bảng 2.6 Thành phần gel cô và gel tách 47

Bảng 2.7 Quan hệ giữ 1/V và 1/[S] 51

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ MnCl2 đến khả năng khuếch đại DNA trong phản ứng RCA 55

Bảng 3.2 Tần suất đột biến nucleotide trên gen lacA ở các nồng độ MnCl2 khác nhau 56

Bảng 3.3 Các dạng đột biến nucleotide trong phản ứng RCA ở nồng độ 1,5 mM MnCl 2 56

Bảng 3.4 Sàng lọc hoạt tính LacA của các dòng có khả năng mang gen lacA đột biến 58

Bảng 3.5 Hoạt tính LacA còn lại của một số dòng LacA đột biến sau khi ủ ở 50C 59

Bảng 3.6 Các axit amin đột biến của LacA từ một số dòng có hoạt tính thay đổi so với dòng ban đầu 59

Bảng 3.7 Các bước tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến ngẫu nhiên từ E coli JM109(DE3) 65

Bảng 3.8 Hoạt tính của LacA ban đầu và LacA đột biến 66

Bảng 3.9 Sàng lọc hoạt tính các dòng đột biến 69

Bảng 3.10 Đột biến thay thế axit amin khác nhau tại một số vị trí trên LacA 71

Bảng 3.11 Tinh sạch LacA-WT và các LacA đột biến điểm suy biến từ E coli JM109(DE3) 75

Bảng 3.12 Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG 77

Bảng 3.13 Độ bền pH của LacA-WT và các LacA đột biến 80

Bảng 3.14 Thời gian bán hủy của LacA-WT và các LacA đột biến 84

Bảng 3.15 Các thông số động học của LacA-WT và đột biến với cơ chất oNPG 86

Bảng 3.16 Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí Ala301 89 Bảng 3.17 So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất ở LacA 90

Bảng 3.20 Sự thay đổi số lượng liên kết với cơ chất và ion kim loại của các axit amin trong

vùng trung tâm xúc tác của LacA đột biến tại vị trí 373 94

Bảng 3.21 So sánh sự tương tác của các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất khi Tyr

thay thế cho Phe ở vị trí 373 95

Phụ lục 1 Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 120 trên gen lacA của một số dòng đột biến 1

Phụ lục 2 Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí W331 trên gen lacA của một số dòng đột biến 1

Phụ lục 3 Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 361 trên gen lacA 2

Phụ lục 4 Trình tự nucleotide thay đổi tại vị trí 371, 373 và 374 của một số dòng đột biến 2

Phụ lục 5 Hoạt tính đặc hiệu của LacA ban đầu và LacA đột biến với cơ chất oNPG 3

Phụ lục 6 Nhiệt độ hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến 3

Phụ lục 7 pH hoạt động tối ưu của LacA-WT và các LacA đột biến 4

Phụ lục 8 Độ bền pH của LacA-WT 5

Phụ lục 9 Độ bền pH của LacA đột biến A301E 6

Phụ lục 10 Độ bền pH của LacA đột biến A301Y 7

Phụ lục 11 Độ bền pH của LacA đột biến A301V 8

Phụ lục 12 Độ bền pH của LacA đột biến F361Y 9

Phụ lục 13 Độ bền pH của LacA đột biến L373C 10

Phụ lục 14 Độ bền pH của LacA đột biến L373M 11

Phụ lục 15 Độ bền nhiệt của LacA-WT và các LacA đột biến ở 30 và 40C 12

Phụ lục 16 Độ bền nhiệt của LacA-WT ở các nồng độ cơ chất khác nhau 14

Phụ lục 17 Độ bền nhiệt của LacA-301E ở các nồng độ cơ chất khác nhau 15

Phụ lục 18 Độ bền nhiệt của LacA-301V ở các nồng độ cơ chất khác nhau 16

Phụ lục 19 Độ bền nhiệt của LacA-301Y ở các nồng độ cơ chất khác nhau 17

Phụ lục 20 Độ bền nhiệt của LacA đột biến Y361F ở các nồng độ cơ chất khác nhau 18

Phụ lục 21 Độ bền nhiệt của LacA đột biến L373C ở các nồng độ cơ chất khác nhau 20

Phụ lục 22 Độ bền nhiệt của LacA đột biến L373M ở các nồng độ cơ chất khác nhau 21

Phụ lục 23 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính của LacA-WT và biến thể 22

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

-Galactosidase (hay còn gọi là lactase), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa saccharide, cắt các gốc -D-galactose từ đầu không khử của các -galactoside galactoside của các poly- và oligosaccharide hoặc các sản phẩm chuyển hóa bậc hai Enzyme này phổ biến trong tự nhiên và được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật, động vật và người Trong đó, -galactosidase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi sinh vật như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn và đây cũng là nguồn enzyme có giá trị thương mại hơn so với từ thực vật và động vật vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và năng suất tổng hợp cao

-Galactosidase được ứng dụng nhiều trong y dược, môi trường, công nghệ sinh học và đặc biệt là công nghiệp chế biến sữa Với 75% dân số trên thế giới thiếu hụt enzyme lactase để phân giải lactose của sữa, nên đây được xem là một ứng dụng quan trọng của -galactosidase trong ngành công nghiệp này Ngoài ra -galactosidase còn được bổ sung vào quá trình lên men bơ sữa để tránh sự kết tinh của lactose ở nhiệt độ thấp và tăng độ ngọt cho sản phẩm Đặc biệt gần đây, -galactosidase đã được khai thác mạnh vào việc sản xuất thực phẩm chức năng là tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS) nhờ hoạt tính chuyển gốc glycosyl trong quá trình thủy phân lactose trong sữa để tạo thành các oligosaccharide GOS được

sử dụng như nguồn thức ăn không tiêu hóa (prebiotic) để kích thích hệ vi khuẩn hữu ích đã hiện diện trong đường ruột Để đáp ứng nhu cầu trong ngành công nghiệp này, -galactosidase từ rất nhiều nguồn vi sinh vật đã được nghiên cứu khai thác

Trong số này -galactosidase từ B subtilis cũng rất được chú ý bởi khả năng hoạt

động tối ưu trong khoảng pH 6-7, bền ở nhiệt độ 30-40C rất thích hợp cho ứng

dụng thủy phân lactose trong sữa cũng như trong các sản phẩm chế biến khác từ sữa

Đây cũng là một enzyme có tiềm năng để ứng dụng trong một số lĩnh vực khác và

B subtilis cũng đã được biết là một chủng an toàn được sử dụng rộng rãi trong công

nghiệp thực phẩm

Bên cạnh đó, để chủ động hơn trong việc ứng dụng cũng như lĩnh vực ứng dụng, ngoài việc sàng lọc và tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp các enzyme mới có hiệu suất xúc tác cao và tính chất như mong đợi, sự phát triển của công nghệ DNA cũng cho phép chúng ta có thể chủ động hơn trong việc cải biến protein/enzyme để nâng cao hiệu suất xúc tác cũng như phát triển các tính chất mới của enzyme Phương

pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trong in vitro hoặc in vivo cùng với việc lựa chọn di

truyền và phương pháp sàng lọc nhanh, là những công cụ mạnh để phát triển enzyme với những đặc tính mới so với ban đầu

Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai trò

của một số gốc axit amin đối với tính chất của β-galactosidase từ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 phân lập ở Việt Nam bằng kỹ thuật ep-RCA và đột biến điểm định hướng”

2 Mục đích nghiên cứu

- Xác định vai trò của một số axit amin quan trọng của -galactosidase (LacA)

từ B subtilis VTCC-DVN-12-01

- Tìm được LacA đột biến có tính chất mới so với enzyme ban đầu

3 Nội dung nghiên cứu

- Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa -galactosidase từ

B subtilis VTCC DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA (error prone rolling circle

amplification, sao chép lỗi DNA vòng) và sàng lọc các dòng mang gen lacA đột

biến có hoạt tính tăng hoặc có các tính chất mới như nhiệt độ hoạt động, độ bền nhiệt độ so với LacA ban đầu

- Sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc protein/enzyme, kết hợp với so sánh trình tự axit amin với các -galactosidase trong cùng họ đã được xác định cấu trúc

để dự đoán một số axit amin quan trọng tham gia trực tiếp trong quá trình thủy phân

cơ chất của LacA để từ đó tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo ra các LacA có các tính chất mới so với enzyme ban đầu

4 Những đóng góp mới của luận án

(i) Xây dựng được thư viện đột biến ngẫu nhiên gen lacA mã hóa galactosidase của B subtilis VTCC-DVN-12-01 bằng phương pháp ep-RCA với tần

beta-suất đột biến đạt 2,7 đột biến/kb

(ii) Xác định được 6 vị trí axit amin quyết định đến hoạt tính của LacA gồm Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 và His374

(iii) Xác định được một số thay đổi axit amin ở vị trí Ala301, Phe361 làm tăng độ bền LacA và một số thay đổi tại vị trí Leu373 làm tăng nhiệt độ hoạt động của LacA

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Về khoa học: Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên trên gen bằng phương pháp lỗi DNA vòng, đột biến điểm suy biến Kết quả cũng cung cấp thông tin về vai trò quan trọng của

một số axit amin của -galactosidase từ B subtilis VTCC DVN-12-01 ảnh hưởng

đến hoạt tính và tính chất của enzyme

Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết quả thu được có thể áp dụng để cải biến các β-galactosidase khác trong cùng họ enzyme thủy phân liên kết glycoside GHF-42 (Glycoside Hydrolase Family 42) nhằm thay đổi hoạt tính cũng như phát triển các tính chất mới của enzyme

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Thông tin chung về -galactosidase

1.1.1 Định nghĩa

-Galactosidase (-D-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23), thuộc nhóm các enzyme chuyển hóa saccharide trong họ các enzyme thủy phân, cắt các gốc -D-galactose từ đầu không khử của các -galactoside (CAZy, http://www.cazy.org/)

Ngoài ra, β-galactosidase còn được gọi là enzyme tiêu hóa lactose hay lactase có mặt trong ruột non ở hầu hết động vật có vú giúp thủy phân lactose

-Galactosidase đầu tiên ở thực vật được tìm thấy là ở những cây họ hoa hồng như

mơ, đào, táo (Wallenfels and Malhotra, 1961) Gần đây, người ta cũng tìm thấy enzyme này ở một số hệ thực vật khác và các gen mã hóa tương tự nhau hoặc có độ tương đồng cao Một số nghiên cứu về các quá trình sinh học đã cho thấy β-

galactosidase tham gia vào sự sinh trưởng của tế bào (Dopico et al., 1990; Gomez et

al., 1995), quá trình chín của quả (Ali et al., 1995; Carey et al., 1995) và huy động

khả năng dự trữ, nảy mầm của hạt (Buckeridge and Reid, 1994; Alcântara et al., 1999; Kim et al., 2003) Chúng cũng liên quan đến việc giải phóng năng lượng dự

trữ trong quá trình sinh trưởng nhanh, giải phóng galactose tự do trong chu trình chuyển hóa bình thường của galactolipid, glycoprotein và trong việc tạo thành của

tế bào (Smith and Gross, 2000)

Ở động vật, người ta tìm thấy β-galactosidase ở ruột cá rô phi (Taniguchi and

Takano, 2004), ở động vật có vú như dê (Gaur et al., 2000) và người Chúng có

nhiều ở thành ruột non của hầu hết động vật có vú và người, đặc biệt là ở trẻ em hàm lượng enzyme cao hơn vì chức năng chính là phân giải lactose

Ở vi sinh vật, β-galactosidase được tìm thấy ở nấm men, nấm mốc và vi khuẩn Nguồn enzyme từ vi khuẩn có giá trị thương mại hơn so với từ thực vật và động vật

vì dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh và năng suất tổng hợp cao Một lượng lớn các loài vi sinh vật đã được biết đến như một nguồn cung cấp β-galactosidase

thương mại tiềm năng (Bảng 1.1) (Panesar et al., 2010)

β-Galactosidase có thể được tổng hợp ở nhiều loại vi khuẩn khác nhau, nhưng

trong đó Streptococcus thermophilus và Bacillus stearothermophilus được coi như

nguồn enzyme tiềm năng Ở nấm mốc β-galactosidase thường hoạt động tối ưu trong khoảng pH từ 2,5 đến 5,4 Do đó, chúng rất thích hợp cho công nghệ sản xuất các sản phẩm sữa lên men Nhiệt độ tối ưu cho các enzyme này rất cao và có thể được ứng dụng trong điều kiện sản xuất ở nhiệt độ lên tới 50C Một số nguồn

enzyme từ nấm mốc như Asperilus niger và Asperilus oryae đã được sử dụng trong công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa Đặc biệt enzyme từ Crytococcuss

laurentii và Sterigmatomyces elviae có hoạt tính chuyển gốc galactosyl cao do vậy

được ứng dụng để sản xuất galacto-oligosaccaride từ lactose (Panesar et al., 2010)

Nấm men được coi là một trong những nguồn tổng hơp -galactosidase quan trọng trong ngành công nghiệp Với pH tối ưu trung tính, đây là điều kiện rất thích hợp cho quá trình thủy phân lactose trong sữa và được chấp nhận rộng rãi vì tính an toàn khi sử dụng trong công nghiệp thực phẩm Nhiều công trình nghiên cứu sản xuất -galactosidase từ các chủng nấm men khác nhau được thực hiện vì tiềm năng ứng dụng cao của nó Các sản phẩm thương mại -galactosidase từ nguồn nấm men

như Maxilact (Hà Lan), Lactase (Ý) được tách chiết từ Kluyveromyces lactis và Lactozym (Đan Mạch) từ Kluyveromyces fragilis (Roy and Gupta, 2003)

Bảng 1.1 Nguồn -galactosidase từ vi sinh vật

Nguồn: (Panesar et al., 2010)

Nguồn Vi sinh vật

Vi khuẩn

Alicyclobacillus acidocaldarius, Arthrobacter sp

Bacillus acidocaldarius, B circulans, B coagulans, B subtilis,

B megaterum, B stearothermophilus

Bacteriodes polypragmatus

Bifidobacterium bifidum, B infantis

Clostridium acetobutylicum, C thermosulfurogens

Corynebacterium murisepticum

Enterobacter agglomerans, E cloaceae, Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Lactobacillus acidophilus, L bulgaricus, L delbrueckii, L helviticus,

L kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L themophilus,

Leuconostoc citrovorum

Pediococcus acidilacti, P pento

Propioionibacterium shermanii

Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis

Streptococcus cremoris, S lactis, S thermophius

Sulfolobus solfatarius

Thermoanaerobacter sp

Thermus rubus, T aquaticus

Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris

Nấm mốc

Alternaria alternate, A palmi

Aspergillus foelidis, A fonsecaeus, A fonsecaeus, A carbonarius, A oryzae Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis

Fusarium monilliforme, F oxysporum

Mucor meihei, M pusillus

Neurospora crassa

Penicillum canescens, P chrysogenum, P expansum

Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp

Streptomyces violaceus

Nấm men

Bullera singularis

Candida pseudotropicalis

Saccharomyces anamensis, S lactis, S fragilis

Kluyveromyces bulgaricus, K fragilis, K lactis, K marxianus

1.1.2.2 Phân loại

Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử Quốc tế (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology - NC-IUBMB), enzyme được phân lớp (EC – Enzyme Classification) dựa vào phản ứng hóa học và đặc hiệu cơ chất của enzyme Theo tiêu chí này, β-galactosidase thuộc phân lớp EC 3.2.1.23:

- Lớp: enzyme thủy phân (3),

sự tương đồng về chức năng Tuy nhiên, hiện nay trên hệ thống CAZy (Carbohydrate-active Enzymes), ngoài 4 họ trên, β-galactosidase còn có thêm nhóm

mới trong họ GHF-59 là β-galactosidase từ Clostridium cellulolyticum Mặc dù vậy,

sự phân nhóm này cũng chưa rõ ràng vì enzyme này có thể thủy phân nhiều cơ chất khác nhau như cellobiose, cellotriose, cellotetraose, p-nitrophenyl-beta-glucopyranoside, lactose và o-nitrophenyl-beta-galactopyranoside, trong đó hiệu suất xúc tác Kcat/Km với cơ chất cellodextrin cao hơn 2-4 lần so với lactose và Kcat/Km

với cellodextrin và cũng cao hơn cellobiose, cellotriose, cellotetraose nên được đề

nghị cellodextrin glucohydrolase (EC 3.2.1.74), họ GHF-1 (Liu et al., 2010)

GHF-42 đã được công nhận là một nhóm khác biệt vào 1993 Dựa vào trình tự, các enzyme GHF-42 có một cấu trúc trung tâm Triose phosphate isomerase (TIM) (α/β)8 và axit amino đóng vai trò chất cho proton và ái nhân nằm trên các chuỗi β số

4 và 7 của trung tâm TIM nên những enzyme này thuộc dưới họ 4/7 (Jenkins et al.,

1995) Theo nhìn nhận ban đầu, cấu trúc của β-galactosidase nhóm GHF-42 có domain trung tâm (α/β)8 giống với các enzyme của nhóm GHF-2, nhưng toàn bộ

cấu trúc bậc 4 lại không giống nhau (Hidaka et al., 2002)

β-Galactosidase từ eukaryote được phân vào nhóm GHF-35, ngoại trừ

β-galactosidase từ K lactis và K marxianus Hai enzyme này được xếp vào họ GHF-2 cùng với β-galactosidase từ Arthrobacter sp và E coli Trong khi họ

GHF-42 chỉ gồm β-galactosidase từ các sinh vật đơn bào (chủ yếu là vi khuẩn), một

số từ vi khuẩn cổ và nấm Các β-galactosidase thuộc họ GHF-42 có hoạt tính thủy

phân lactose (Kang et al., 2005b, a; Yuan et al., 2008) và chuyển gốc galactosyl để

tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS)

1.1.3 Cấu trúc

1.1.3.1 Cấu trúc chung của -galactosidase

-Galactosidase có khối lượng phân tử rất khác nhau và cấu trúc đa dạng ở các

loài -Galactosidase tách chiết từ quả kiwi gồm ba tiểu phần khoảng 59 kDa (Ross

et al., 1993) Ở lúa mạch -galactosidase gồm hai tiểu phần là 45 kDa và 33 kDa, ở

củ cải gồm hai tiểu phần 46 kDa và 33 kDa và ở hạt Vông nem (Erythrina indica) cũng có hai tiểu phần 74 kDa và 78 kDa (Kotake et al., 2005; Rakesh and Shobhana,

2007) Ở người, -galactosidase ở người có 1927 axit amin gồm bốn tiểu phần và ở

thỏ có 1926 axit amin (Mantei et al., 1988)

Riêng ở vi sinh vật -galactosidase cũng rất đa dạng về cấu trúc bậc một, cấu trúc bậc bốn và khối lượng phân tử Từ các protein đơn phân có khối lượng

75 kDa như ở B subtilis đến các -galactosidase gồm nhiều dưới đơn vị có khối lượng lớn (hơn 700 kDa) như T aquaticus YT-1 (Berger et al., 1997)

-Galactosidase từ nấm men cũng có những khác biệt về mặt cấu trúc cũng như về

khối lượng phân tử như -galactosidase của S lactis chỉ có một tiểu đơn vị với khối lượng 124 kDa, trong khi ở S fragilis enzyme này lại có hai tiểu đơn vị với khối

lượng phân tử là 90 kDa và 120 kDa

Với các cấu trúc đại diện từ tất cả 4 họ GHF-1, GHF-2, GHF-35 và GHF-42 của

các -galactosidase đã được xác định như S pyogenes (Stepper et al., 2013) thuộc

họ GHF-1; E coli (Juers et al., 2001; Matthews, 2005), Arthrobacter sp (Skalova

et al., 2005) thuộc họ GHF-2; T reesei (Hypocrea jecorina) (Maksimainen et al.,

2011) và Penicillium sp (Rojas et al., 2004) thuộc nhóm GHF-35; Thermus sp (Hidaka et al., 2002), B circulans sp alkalophilus (Maksimainen et al., 2012),

B circulans ATCC 31382 (Ishikawa et al., 2015) thuộc họ GHF-42 cho thấy chúng

đều có một đặc điểm chung trong cấu trúc của nhóm enzyme này là được phân chia thành các domain khác nhau bao quanh một domain trung tâm có cấu trúc xoắn (/)8, hay còn gọi là đơn vị TIM (gồm 8 chuỗi xoắn  và 8 chuỗi xoắn gấp nếp ) Đây cũng là cấu trúc đặc trưng của họ enzyme thủy phân liên kết glycoside Cấu trúc của các domain còn lại đều ở dạng chuỗi gấp nếp  Cũng như những enzyme

đã biết khác có chứa đơn vị TIM, vị trí hoạt động của -galactosidase nằm phần cuối đầu C của domain trung tâm Đối với -galactosidase có cấu trúc gồm nhiều tiểu phần, mỗi tiểu phần cũng đều có dạng cấu trúc như trên và trung tâm hoạt động

có thể nằm trên hai hay nhiều tiểu phần

Cấu trúc không gian ba chiều của -galactosidase được nghiên cứu đầy đủ nhất là

từ E coli Trình tự của -galactosidase ở E coli đã được xác định đầu tiên vào năm

1970 với 1023 axit amin và tới năm 1994, cấu trúc của enzyme này được xác định

với kích thước 464 kDa (Jacobson et al., 1994) -Galactosidase có 4 tiểu đơn vị với

điểm đối xứng ở vị trí 222, mỗi tiểu đơn vị được tạo thành từ một chuỗi polypeptide

khối lượng 116 kDa với 1023 axit amin (Hình 1.1A) (Juers et al., 2001)

Các axit amin trong chuỗi gấp nếp thành năm domain liên tiếp xếp xung quanh domain thứ ba có cấu trúc dạng kết hợp giữa xoắn  và gấp nếp  (/) ở trung tâm Các domain còn lại đều cuộn xoắn kiểu gấp nếp beta, nhưng có cấu trúc khác nhau Domain 1 cuộn xoắn theo kiểu vòng tròn linh động, domain 2 và 4 lại ở dạng kết hợp globulin và domain 5 cuộn theo kiểu -sandwich (Hình 1.1B) (Matthews, 2005) Phần trung tâm hoạt động gồm bốn domain khác nhau nằm trên hai tiểu đơn vị liền kề, tạo thành hình một túi nhỏ có kích thước vừa khít với kích thước phân tử lactose Trung tâm này nằm ở ngay đầu của domain 3, kết hợp với các gốc của domain 1 và domain 5

trên cùng một tiểu đơn vị và của domain 2 trên tiểu đơn vị khác (Juers et al., 2001)

Hình 1.1 Cấu trúc -galactosidase của E coli thuộc họ GHF-2

Nguồn: A (Juers et al., 2001); B (Matthews, 2005)

Hình 1.2 Cấu trúc của -galactosidase từ K lactis

Cấu trúc bậc 3 (A) và cấu trúc monomer (B) của -galactosidase từ K lactis

Nguồn: (Pereira-Rodríguez et al., 2012)

Vùng xúc tác

Vị trí hoạt động

Hoạt động bề mặt

Vị trí hoạt động

-Galactosidase từ K lactis (thuộc GHF-2) cũng có cấu trúc gồm nhiều tiểu

phần đã được xác định Cấu trúc này gồm 4 tiểu phần (Hình 1.2A) và mỗi tiểu phần được cuộn xoắn thành 5 domain khác nhau (Hình 1.2B) Domain 1 (từ axit amin 32 đến 204) cuộn xoắn kiểu vòng tròn linh động Domain 2 (205-332) và 4 (643-720) hình thành cấu trúc dạng liên kết globulin, giống các domain -sandwich Domain 3 (333-642) cuộn xoắn thành một đơn vị TIM quanh trung tâm xúc tác Domain 5 (741-1025) được xem như một chuỗi nhỏ của β-galactosidase Có hai vùng không cuộn xoắn mà ở dạng chuỗi dài là vùng đầu N (từ axit amin 2 đến 31) và một chuỗi nhỏ (từ axit amin 721-740) nối giữa domain 4 và 5 Trung tâm hoạt động gồm hai axit amin

Glu482 và Glu551 (Pereira-Rodríguez et al., 2012)

-Galactosidase ở người hay còn gọi là lactase-phlorizin hydrolase (LPH), thuộc GHF-35, cũng được nghiên cứu kỹ về cấu trúc và chức năng LPH là một enzyme đặc biệt của đường ruột gồm 1927 axit amin Sản phẩm chuyển hóa đầu tiên của LPH là ở dạng pre-pro-LPH dài 1927 axit amin và phần tín hiệu gồm 23 axit amin

Hình 1.3 So sánh cấu trúc -galactosidase từ người với một số vi sinh vật khác

Nguồn: (Ohto et al., 2012)

Cấu trúc monomer của LPH được cuộn xoắn thành 3 domain là domain trung tâm TIM hay chuỗi cuộn xoắn (α/β)8 từ 1-359, domain β-1 từ 397-514 và domain β-2 từ 545-647 (Hình 1.3) Domain trung tâm TIM cũng được hình thành bởi cấu trúc gấp nếp gồm 8 chuỗi xoắn α và 8 chuỗi xoắn gấp nếp β Domain 1 được tạo thành từ

4 chuỗi β, còn domain 2 được tạo thành từ 6 chuỗi β Domain trung tâm TIM và domain β-1 được nối với một vòng lặp khoảng 50 Å (từ axit amin 360-396, sau này được coi là vòng TIM- β1) Vòng này vắt ngang qua domain 2 và phần axit amin

372-384 của vòng được thêm vào cấu trúc chuỗi β của domain 2 (Ohto et al., 2012)

Cấu trúc monomer của LPH cũng tương đồng với các -galactosidase khác

thuộc họ GH35 là Penicillium sp (Psp β-Gal) và T reesei (Tri β-Gal) với domain

trung tâm TIM có cấu trúc cuộn xoắn (α/β)8 (Hình 1.3) Psp β-Gal (1011 axit amin, monomer) tương đồng 23% và Tri β-Gal (1023 axit amin, monomer) tương đồng 16% so với LPH

Gần đây, Ishikawa và CS (2015) đã xác định cấu trúc tinh thể của

-galactosidase (BgaD) từ B circulans ATCC 31382 thuộc họ GHF-42 BgaD cấu

tạo chỉ có một tiểu phần và được chia thành năm domain khác nhau, trong đó domain 1 và 2 là domain Glyco_hydro_2_N (liên kết với đường), một domain xúc tác chứa đơn vị TIM với phần dưới cùng tạo thành một túi nhỏ được cho là phù hợp với các phân tử disaccharide và vị trí của túi này không bị ảnh hưởng bởi cấu trúc của các domain khác (Hình 1.4) Trung tâm xúc tác của BgaD gồm ba axit amin là Glu447, Tyr511 và Glu532, trong đó hai axit Glu447 và Glu532 đóng vai trò

axit/base (cho và nhận proton trong quá trình xúc tác) (Ishikawa et al., 2015)

Hình 1.4 Cấu trúc của -galactosidase từ B circulans ATCC 31382

Nguồn: (Ishikawa et al., 2015)

Đầu N

Đầu C

Trung tâm hoạt động

Domain chưa xác định (638-732) Domain BID_1

(733-847)

1.1.3.2 Cấu trúc -galactosidase từ B subtilis

Cho đến nay chưa có công bố nào nghiên cứu về cấu trúc tinh thể của

-galactosidase từ B subtilis Tuy nhiên với sự hỗ trợ của công nghệ tin học trong

sinh học, một số chương trình phần mềm như SWISS-MODEL, MODELLER, Geno3D, Phyre và Phyre2, đã được phát triển để xây dựng cấu trúc dự đoán của protein/enzyme dựa vào cấu trúc của các protein/enzyme tương đồng đã được xác định cấu trúc tinh thể

Cấu trúc -galactosidase (yesZ, mã số O31529, gồm 663 axit amin) từ

B subtilis 168 đã được xây dựng theo chương trình phân tích tự động

SWISS-MODEL (dựa vào sự kết hợp các đoạn/vùng tương tự của cấu trúc đã xác định) và kết quả cho thấy trung tâm hoạt động gồm hai axit amin là Glu145 đóng vai trò cho proton và Glu296 đóng vai trò nhận proton (http://www.uniprot.org/uniprot/O31529), Arg106 và Asn144 liên kết trực tiếp với cơ chất GanA (mã số O07012, gồm 672

axit amin) từ B subtilis 168 cũng được dự đoán cấu trúc theo SWISS-MODEL và

hai axit amin Glu144 và Glu308 được xác định đóng vai trò cho và nhận proton trong trung tâm hoạt động, các axit amin Arg105, Asn143 và Trp316 liên kết trực tiếp với cơ chất (http://www.uniprot.org/uniprot/O07012)

Cấu trúc của LacA từ B subtilis VTCC-DVN-12-01 cũng được tính toán xây

dựng bằng chương trình phân tích tự động Phyre2 Phyre2 xây dựng dự đoán cấu trúc dựa vào các trình tự axit amin tương đồng, mối liên kết, cấu trúc 3D của protei/enzyme cùng loại trong cùng họ và cả khác họ Kết quả phân tích trình tự axit amin của LacA với trình tự axit amin của một số -galactosidase cũng như một số enzyme thủy phân liên kết -glycosid đã biết cấu trúc trên PDB bằng Phyre2 cho thấy LacA có độ tương đồng cao nhất với các -galactosidase trong họ GHF-42

(19-76%), trong đó tương đồng 76% với -galactosidase của Geobaicllus

stearothermophilus và 49% với -galactosidase của Rahnella sp Với một số

-galactosidase trong họ GHF-35 và -glucosidase trong họ GHF-1, LacA có độ tương đồng thấp hơn, chỉ tương đồng 14-19% (Bảng 1.2) Dựa vào sự tương đồng

này, cấu trúc LacA xây dựng được chia thành các vùng khác nhau từ đỏ, da cam, vàng, lục, lam theo chiều từ đầu N  C bao quanh vùng trung tâm (Hình 1.5A)

(Kelley et al., 2015) Trong vùng trung tâm của LacA, các axit amin Arg120,

Asn158, Trp331, Phe361 và Glu371 được dự đoán liên kết với cơ chất bằng chương

trình 3DLigandSite (Hình 1.5B) (Wass et al., 2010) Trong đó vị trí Arg120,

Glu159 và Phe361 được dự đoán liên kết trực tiếp với cơ chất Các vị trí còn lại có thể tương tác với cơ chất qua các liên kết khác như ion, Val-der-Waal Hai axit amin Glu159 và Glu323 là trung tâm xúc tác của LacA

Hình 1.5 Cấu trúc không gian 3 chiều và vùng trung tâm hoạt động của LacA

A Cấu trúc không gian 3 chiều của LacA được xây dựng bằng chương trình Phyre2 Cấu trúc được chia thành các vùng từ đỏ, da cam, vàng, xanh, xanh lam theo chiều từ đầu

N  C (Kelley et al., 2015)

B Vùng trung tâm xúc tác của LacA với các mối tương tác giữa các axit amin được dự đoán liên kết với cơ chất trong quá trình thủy phân (màu xanh lam); mối tương tác giữa các axit amin khác trong phân tử LacA, ion Ca 2+ với glucose và galactose (màu vàng và xanh lục)

Ca

Bảng 1.2 Độ tương đồng về trình tự axit amin của LacA với một số -galactosidase khác

Nguồn: (Kelley et al., 2015)

Bảng 1.3 Các vị trí axit amin của LacA được dự đoán liên kết với cơ chất

và chuyển gốc galactosyl Lactase thủy phân kết (1-3) và (1-4) galactoside của lactose và mô hình thủy phân lactose đã được giải thích bằng -galactosidase từ

E coli Quá trình thủy phân cơ chất của -galactosidase được chia thành 2 bước với sự

tham gia của nhóm ái nhân trong enzyme

Hình 1.6 Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase

Phản ứng thủy phân với nhóm sulphudryl của cystein và imidazol của histidine trong trung tâm hoạt động (A) và phản ứng chuyển gốc galactosyl của -galactosidase với nhóm sulphudryl của cysteine và imidazol của histidine trong trung tâm hoạt động (B)

Nguồn: (Richmond et al., 1981)

Theo nghiên cứu trước đây, trong trung tâm hoạt động của -galactosidase có cysteine (đóng vai trò là chất cho proton) và histidine (đóng vai trò như chất nhận proton) Cysteine có nhóm sulphudryl làm nhiệm vụ cho proton và histidine có nhóm imidazol đóng vai trò làm nhóm ái nhân và tấn công vào vị trí C1 để phân cắt liên kết glycoside giải phóng glucose tự do và hình thành một phức chất trung gian enzyme-galactosyl nhờ

A

B

liên kết đồng hóa trị (Hình 1.6A) (Mahoney, 1998; Zhou and Chen, 2001)

Bước phản ứng thứ hai trong phản ứng thủy phân lactose là chuyển gốc galactosyl (transgalactosyl) Trong bước phản ứng này, -galactosidase chuyển phần galactosyl từ sản phẩm trung gian tới chất nhận chứa nhóm hydroxyl Galactose sau đó tách khỏi enzyme nhờ sự hấp thụ một proton từ chất nhận bởi anion sulfohydryl đóng vai trò như một base và giúp cho nhóm OH tấn công vào vị trí C1 (Hình 1.6B) Khi chất nhận là nước, galactose được tạo thành Mặc dù vậy, dưới một số điều kiện nhất định, các phân tử đường khác có thể đóng vai trò là chất nhận dẫn đến sự hình thành oligosaccharide (Mahoney, 1998)

Tuy nhiên, những nghiên cứu sau này về các enzyme thủy phân liên kết glycoside khác (glycosidase) cho thấy các liên kết galactoside được cắt bởi một nhóm carboxyl tận cùng trên chuỗi gốc của axit glutamic ở trung tâm hoạt động Trong đó, hai nhóm carboxyl mới thực sự tham gia vào việc phân cắt liên kết, một nhóm đóng vai trò là gốc ái nhân và một nhóm đóng vai trò là axit để cho proton (Hình 1.7) (Juers, 2000)

Hình 1.7 Động học phản ứng thủy phân lactose của -galactosidase với hai axit glutamic

trong trung tâm hoạt động

Nguồn: (Juers, 2000)

Trung tâm hoạt động của tất cả các thành viên trong họ -galactosidase đều có

hai axit amin là axit gluctamic Ở E coli, gốc ái nhân được xác định là Glu537 và

Glu461 là một axit đóng vai trò như một trung tâm hoạt động (Juers, 2000) Ở

L lactis gốc ái nhân là Glu384 và Glu429 (Ryoo et al., 2002); B subtilis (O07012)

có gốc ái nhân Glu308, Glu144; A oryzae có 2 gốc Glu201 và Glu298 (El-Masry et

al., 2001); Penicillium sp là gốc Glu200, Glu299 (Rojas et al., 2004) Còn ở người,

gốc ái nhân của phản ứng thủy phân là Glu268 (McCarter et al., 1997)

Ngoài ra, quá trình xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất của -galactosidase cũng phụ thuộc vào sự tham gia của các axit amin khác trong vùng trung tâm hoạt động, vùng liên kết cơ chất cũng như một số ion kim loại Nhiều nghiên cứu cho thấy sự

tham gia của các axit amin khác tới quá trình thủy phân cơ chất Ở E coli, các axit

amin His357, Asn460, Tyr503, His540, Try999 trong vùng liên kết cơ chất cũng

tham gia quá trình thủy phân cơ chất (Juers et al., 2001) A oryzae có Tyr138, Tyr201 và Tyr260 đóng vai trò quan trọng trong vùng liên kết cơ chất Penicillium

sp có sự tham gia của Glu142, Asn199, Glu200, Tyr261, Glu299 và Tyr365 với cơ

chất khi phản ứng (Rojas et al., 2004) Mg2+ đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính

thủy phân của -galactosidase ở S thermophilus, lactobacilli, bifidobacteria, E coli (Juers, 2000) và L lactis (Ryoo et al., 2002)

1.2 Ứng dụng

-Galactosidase có khả năng thủy phân lactose và sự thủy phân lactose bằng enzyme đưa đến một số lợi ích và thuận tiện cho các ứng dụng công nghiệp như phát triển các sản phẩm đã thủy phân lactose để hạn chế hiện tượng không dung nạp lactose (một hiện tượng phổ biến chiếm hơn một nửa dân số thế giới), hay tạo các sản phẩm GOS từ quá trình thủy phân lactose để giúp cho vi sinh vật có lợi ở đường ruột phát triển Bên cạnh đó, các sản phẩm chứa lactose được thủy phân còn làm tăng các đặc tính công nghệ và cảm quan của thực phẩm như tăng độ hòa tan, độ ngọt Sự hình thành các monosaccharide sẽ làm cho các sản phẩm như sữa chua dễ lên men hơn và giảm phản ứng Maillard (phản ứng giữa axit amin và đường khử) Ngoài ra, các chất thải trong công nghiệp sữa đã được thủy phân lactose sẽ được vi sinh vật phân giải tốt hơn

-Galactosidase, đặc biệt là từ vi sinh vật được tổng hợp với năng suất cao hơn

so với từ thực vật và động vật là nguồn enzyme thích hợp cho các ứng dụng công

nghiệp Các tính chất, tính đặc hiệu và cấu trúc của -galactosidase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau là rất khác nhau (Bảng 1.4) (Michová and Rosenberg, 2006) Vì vậy, việc lựa chọn nguồn -galactosidase phù hợp cho ứng dụng dựa vào điều kiện phản ứng thủy phân lactose

Bảng 1.4 Tính chất của một số -galactosidase từ vi sinh vật

Vi sinh vật Enzyme pH tối

E coli 7,2 40

L thermophilus 6,2 55

L citrovorum 6,5 66

1.2.1 Trong công nghiệp chế biến sữa

Sữa là nguồn dinh dưỡng quan trọng đối với con người Tuy nhiên một số lượng lớn đáng kể dân số bị triệu chứng khó tiêu, đầy hơi và tiêu chảy khi uống sữa do không phân giải được lactose trong sữa và nguyên nhân là do thiếu hụt di truyền enzyme phân giải lactose hay lactase Theo thống kê, ước tính có khoảng 75% người trưởng thành trên thế giới thiếu hụt enzyme này, trong đó khoảng 5% ở Bắc

Âu và 71% ở Nam Âu Ở một số nước châu Á và châu Phi, tỷ lệ bị chứng này lên

tới trên 90%, cao nhất là ở Đông Á (Bulhões et al., 2007)

Lactose được tìm thấy ở dạng tự nhiên với nồng độ cao chỉ ở trong các sản phẩm sữa Trong sữa bò, lactose chiếm 4,5-5%, chiếm trên 1/3 chất rắn trong sữa, 20% trong kem và khoảng 72% trong các chất rắn của whey (thành phần còn lại của sữa

sau khi sản xuất phomat) (Maldonado et al., 1998) Chính vì vậy việc sử dụng

enzyme phân giải lactose trong sữa để chế biến các sản phẩm sữa không lactose là rất cần thiết -Galactosidase có khả năng phân giải lactose nên giữ vai trò quan

trọng trong công nghiệp chế biến sữa để thủy phân đường lactose thành các đường đơn là glucose và galactose để dễ dàng hấp thụ ở ruột

Mặt khác, lactose có độ hòa tan thấp nên dễ bị kết tinh lactose trong các sản phẩm sữa không được lên men như kem và sữa cô đặc sẽ tạo nhiều bọt, cát hoặc sạn Khi lactose được thủy phân, các sản phẩm sữa có độ mịn hơn, được tiêu hóa tốt hơn và các sản phẩm lên men từ sữa (như pho-mát làm từ sữa đã loại bỏ kem, sữa chua) sẽ dễ dàng hơn và rút ngắn được thời gian lên men Ngoài ra, glucose và galactose được tạo ra khi thủy phân lactose làm tăng độ ngọt của sản phẩm (khoảng 50%) Do đó, lượng đường

bổ sung vào trong sản phẩm giảm và sản phẩm cuối cùng ít kalo hơn (Shah et al., 1993)

1.2.2 Trong xử lý whey

Whey là một chất thải trong công nghiệp sản xuất phomat, gây ra một số vấn đề về kinh tế và môi trường Quá trình sản xuất phomat trên thế giới tạo ra một lượng lớn sản phẩm phụ là whey (khoảng 150 triệu tấn/năm), trong đó thành phần chính là lactose (44

- 52 g/L), protein (6 - 8 g/L) và các chất khoáng (4,3 - 9,5 g/L) (Johansen et al., 2002)

Một phần đáng kể whey được xử lý bằng siêu lọc để sản xuất chất giàu protein (whey protein) Mặc dù vậy, sản phẩm còn lại của quá trình này vẫn còn 4-5% lactose (whey-lactose) Ngoài ra, một phần whey và whey-lactose có thể được tinh sạch bằng kết tinh và sử dụng như một loại thực phẩm bổ sung hoặc được sử dụng như một chất dẫn thuốc trong dược phẩm Tuy vậy, khoảng 47% whey không được

sử dụng và thải vào nước và đất dẫn đến ô nhiễm nguồn nước với BOD/COD cao Hơn 90% BOD whey được xác định là do lactose Vì vậy, cần thiết phải xử lý lactose trong whey để hạn chế chất thải làm ô nhiễm môi trường

Một số hướng được nghiên cứu để xử lý whey là sử dụng làm nguyên liệu để lên men các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp ethanol hoặc sử sụng whey để tổng hợp GOS 1.2.2.1 Sản xuất ethanol

Để nâng cao năng suất tổng hợp ethanol, -galactosidase hoặc chủng vi sinh vật

có khả năng tổng hợp -galactosidase được bổ sung vào trong quá trình lên men cùng với nguyên liệu là whey

Một số tác giả đã sử dụng -galactosidase gắn cùng với tế bào S cerevisiae như

một sự lựa chọn cho việc lên men whey (Hahn-Hägerdal, 1985; Roukas T, 1991)

Hahn-Hägerdal, đã gắn -galactosidase cùng với S cervisiase trong hạt calcium

alginate và đã làm tăng năng suất tổng hợp ethanol lên 52 g/L (4,5 g/L/giờ) trong

quá trình lên men liên tục với nồng độ whey là 15% Và khi gắn với K fagilis, năng

suất tổng hợp đạt 13 g/L (1,1 g/L/giờ) Một mô hình xúc tác sinh học tương tự cũng

đã được áp dụng trong hệ thống kết hợp lên men whey và tổng hợp ethanol

(Lewandowska and Kujawski, 2007; Staniszewski et al., 2009) Rosenberg và CS

đã sử dụng tế bào thẩm thấu K marxianus như một nguồn -galactosidase để tăng

sự thủy phân lactose của whey trong quá trình lên men S cervisiase và kết quả

đã làm tăng tổng hợp ethanol so với việc lên men trực tiếp K marxianus

(Rosenberg et al., 1995)

Trong một nghiên cứu khác, động học quá trình lên men alcohol từ lactose của

chủng tái tổ hợp S cerevisiae NCYC869-A3/T1, biểu hiện đồng thời cả gen lac4 (mã hóa cho -galactosidase) và gen lac12 (lactose permease) của K lactis đã được

phân tích Lactose được sử dụng hoàn toàn trong quá trình lên men và ethanol được tổng hợp tăng khi nồng độ lactose ban đầu tăng từ 5 tới 200 g/L Ethanol được tổng hợp tăng tuyến tính đến nồng độ lactose ban đầu sử dụng là 150 g/L, đạt 1,23

g/L/giờ (Guimaraes et al., 2005)

1.2.2.2 Trong tổng hợp galacto-oligosaccharide

Galacto-oligosaccharideđược tạo thành nhờ khả năng chuyển gốc galactosyl của

-galactosidase trong quá trình thủy phân lactose Quá trình chuyển hóa tạo thành GOS gồm 3 bước chính Thứ nhất, -galactosidase xúc tác thủy phân lactose tạo thành glucose tự do và phức hợp enzyme-galactosyl cho phản ứng tiếp theo (Hình 1.8) Bước thứ hai, phức hợp enzyme-galactosyl được chuyển tới một chất nhận (acceptor) có chứa một nhóm hydroxyl (H2O hoặc các saccharide khác) Bước thứ

ba là bước tạo thành galactose hoặc GOS phụ thuộc vào nồng độ lactose Nếu trong dung dịch có nồng độ lactose thấp, chất nhận là H2O và sản phẩm tạo thành là galactose Trong trường hợp dung dịch lactose có nồng độ cao, phân tử lactose đóng

vai trò là chất nhận và liên kết với phức hợp enzyme-galactosyl để tạo thành galactosyl-oligosaccharide Hoạt tính chuyển hóa gốc galactosyl của

-galactosidase tăng khi nồng độ lactose ban đầu cao hơn (Hansen et al., 2001)

Sản phẩm GOS thương mại có thể được sản xuất ở dạng bột hoặc dạng dịch và

là hỗn hợp gồm một vài dạng GOS (lớn hơn 50%), lactose (20%), glucose (20%) và một lượng nhỏ galactose GOS thường được tổng hợp dựa vào nguồn

-galactosidase tự nhiên từ vi sinh vật và -galactosidase tái tổ hợp

Hình 1.8 Sự tổng hợp oligosaccharide

E: -galactosidase; Nu: nucleophil-saccharide; k: hằng số phản ứng

Nguồn: (Hansen et al., 2001)

Hsu và CS (2007) đã nghiên cứu sự tổng hợp GOS nhờ phản ứng chuyển gốc

galactosyl của -galactosidase từ B longum BCRC 15708 Hai dạng GOS là tri- và

tetrasaccharide được tạo thành sau phản ứng của enzyme với 40% lactose và trong

đó dạng trisaccharide chiếm chủ yếu Năng suất tạo GOS cao nhất đạt được là 32,5% (w/w) trong dung dịch 40% lactose ở 45C, pH 6,8 với hiệu suất chuyển hóa

lactose là 59,4% GOS được tổng hợp đạt 13 g/L/giờ (Hsu et al., 2007)

Năm 2008, Jung và Lee đã cho thấy -galactosidase tái tổ hợp từ B infantis biểu hiện trong P pastoris có khả năng tổng hợp GOS từ dung dịch 36% lactose Tỉ lệ

chuyển hóa gốc glycosyl là 25,2% với 83,1% lactose ban đầu được chuyển hóa và năng suất tạo GOS cao nhất đạt 40,6% Dung dịch GOS gồm 13,43% GOS, 5,06% lactose và 8,76% monosaccharide Sản phẩm GOS này đã kích thích sự sinh trưởng

của B breve ATCC 15700 và L acidophilus ATCC 33323 (Jung and Lee, 2008)

Li và CS (2009) đã nhân dòng gen mã hóa -galactosidase mới (BGase) có khả

năng chuyển hóa gốc galactosyl từ P expansum F3 và đã biểu hiện trên bề mặt tế bào S cerevisiae EBY-100, cảm ứng bằng galactose Tế bào nấm men có BGase

trên bề mặt có thể sử dụng trực tiếp lactose để tổng hợp GOS đồng thời tạo ra glucose cũng như một lượng nhỏ galactose Lượng glucose này được nấm men sử dụng và galactose để cảm ứng biểu hiện enzyme, dẫn đến nâng cao khả năng tổng hợp GOS Năng suất tổng hợp GOS đạt 43,64% khi môi trường lên men chủng

S cerevisiae EBY-100 tái tổ hợp có nitrogen base-casamino acid và nồng độ lactose

ban đầu là 100 g/L, ở 25C trong 5 ngày (Li et al., 2009a) Ngoài ra tác giả và CS trong một nghiên cứu khác còn tìm được một -galactosidase mới BgaBM từ B

megaterium có khả năng chuyển gốc galactosyl từ chất cho là oNPG đến nhiều chất

nhận khác nhau như pentose, hexose, hydroxyl và alkyl alcohol (Li et al., 2009b)

Trong nghiên cứu của Lu và CS (2009), sản phẩm chuyển hóa GOS đã được tổng hợp với năng suất 55% từ 275 g/L lactose ở 55C sau 12 giờ khi sử dụng

-galactosidase từ E cloacae Trong phản ứng chuyển gốc glycosyl, enzyme này có

thể chuyển gốc galactosyl từ cơ chất oNPG đến các chất nhận khác nhau như galactose, glucose, fructose, arabinose, mannose, sorbose, rhamnose, xylose, cellobiose, sucrose, trehalose, melibiose, inositol, mannitol, sorbitol và salicin, tạo

thành các saccharide mới với năng suất từ 0,8% đến 23,5% (Lu et al., 2009)

Iqbal và CS (2010) đã tạo được -galactosidase tái tổ hợp từ Lactobacillus

plantarum có hoạt tính chuyển gốc galactosyl cao để sử dụng tổng hợp prebiotic

GOS Năng suất tạo GOS đạt cao nhất là 41% (w/w) đường tổng số với sự chuyển hóa 85% lactose ở nồng độ lactose ban đầu là 600 mM Trong đó, sản phẩm chính được tạo thành là -D-Galp(1-6)-D-Lac (chiếm 34% GOS tổng số) và -D-Galp(1-

6)-D-Glc (chiếm 29% tổng số GOS) (Iqbal et al., 2010)

1.2.3 Trong y dược

-Galactosidase dùng làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa Người bệnh thiếu lactase có thể uống sữa đã được thủy phân lactose, sữa được bổ sung -galactosidase hoặc uống thuốc dạng viên chứa -galactosidase ngay trước khi uống sữa Những viên thuốc

này thường chứa -galactosidase từ các chủng Aspergillus (hoạt động ở pH thấp) để

phù hợp với điều kiện trong dạ dày ở người

Gần đây, -galactosidase từ nấm sợi mesoacidophlic Bispora sp MEY-1 cho

thấy có độ bền tốt hơn và tỉ lệ thủy phân lactose >80% so với -galactosidase thương

mại từ A oryzae ATCC 20432 trong điều kiện phản ứng mô phỏng giống các điều

kiện như ở dạ dày Do đó, -galactosidase này có thể dùng làm thuốc bổ sung hỗ trợ

tiêu hóa tốt hơn, làm giảm ảnh hưởng của việc thiếu hụt lactase (Wang et al., 2009)

Anderson và CS (2005) đã tìm được một endo--galactosidase (EABase) từ

Clostridium perfringens ATCC 10543 có khả năng giải phóng cả trisaccharide A

(A-Tri) và trisaccharide B (B-Tri) từ phức hợp glycol ở hồng cầu của nhóm máu tương ứng là A và B EABase tái tổ hợp cũng phá hủy kháng nguyên nhóm máu A

và B ở người dạng erythrocyte A và B EABase cũng giải phóng A-Tri và B-Tri từ nhóm máu A+ và B+ có các phức với nhóm hợp glycol Tính đặc hiệu đặc biệt của

-galactosidase này đã được sử dụng cho việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của

nhóm máu A, B có phức hợp glycol (Anderson et al., 2005) Năm 2009,

endo--galactosidase tái tổ hợp (ABase) có khả năng giải phóng kháng nguyên A/B đã được phát triển ABase loại bỏ 82% kháng nguyên A và 95% kháng nguyên B của các tế bào hồng cầu A/B ở người và ngăn cản sự liên kết với kháng thể kháng A/B

Enzyme này vẫn có thể duy trì hoạt tính ở 4C Sự kết hợp in vivo với nhóm máu A

đã cho thấy mức độ biểu hiện kháng nguyên A trong tiểu cầu thận giảm (85% sau 1 giờ, 9% sau 4 giờ và 13% sau 24 giờ) và thay đổi theo hình sine ở gan (47% sau 1 giờ, 1% sau 4 giờ và 3% sau 24 giờ) trong điều kiện không chịu những ảnh hưởng bất lợi Kết quả này có thể sử dụng để loại bỏ đến mức thấp nhất kháng thể và ngăn cản miễn dịch trong liệu pháp điều trị chống thải loại do không phù hợp nhóm máu

khi cấy ghép thận, gan và tim (Kobayashi et al., 2009)

lượng lactose trong các mẫu sữa thương mại, cũng như để xác định sự có mặt của

glucose (Marrakchi et al., 2008)

Theo một hướng khác, Sanchez-Aparicio và CS đã phát triển -D-galactosidase tái tổ hợp phù hợp với một hoặc hai peptide khác nhau từ protein 3B (protein không phải cấu trúc) của virus gây bệnh lở mồm long móng (foot-and-mouth disease virus, FMDV) Điều này cho phép phân biệt giữa huyết thanh của gia súc, cừu bị nhiễm FMDV với huyết thanh của những vật nuôi này không nhiễm bệnh để tiêm phòng bệnh Bộ cảm biến sinh học đặc hiệu với FMDV có thể cung cấp một giải pháp toàn diện cho việc phân

biệt huyết thanh của những động vật nhiễm FMDV (Sánchez-Aparicio et al., 2009)

Trong công nghệ sinh học, gen mã hóa -galactosidase là gen chỉ thị có vai trò quan trọng trong chọn dòng và biểu hiện các gen ngoại lai Sự có mặt của gen đánh dấu này giúp phân biệt plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn và plasmid không mang gen

1.3 Tình hình nghiên cứu β-galactosidase trong và ngoài nước

1.3.1 Các hướng nghiên cứu trên thế giới

1.3.1.1 Tìm kiếm β-galactosidase có đặc tính mới

Trong thời gian gần đây, những nghiên cứu về β-galactosidase thường tập trung theo hướng tìm kiếm các β-galactosidase có tính chất mới như có thể hoạt động ở điều kiện lạnh hoặc nhiệt độ cao, bền nhiệt hay có những đặc tính mới để mở rộng ứng dụng của β-galactosidase vào một số lĩnh vực như công nghiệp sữa, sản xuất ethanol, y dược và thú y

Các β-galactosidase hoạt động và bền ở điều kiện lạnh rất được quan tâm trong việc loại bỏ lactose trong sữa, các sản phẩm từ sữa ở điều kiện nhiệt độ thấp, hay trong whey để sản xuất phomat và sản xuất ethanol sinh học (Bảng 1.5) Những enzyme hoạt động ở điều kiện này đã được biết đến như β-galactosidase từ

Arthrobacter sp 32c ở Nam cực có hoạt tính tối ưu ở 50C, nhưng hoạt tính vẫn đạt

được 60% ở 25C và 15% ở 0C (Hildebrandt et al., 2009) Tương tự ở LacA từ

B subtilis G1 cũng có nhiệt độ tối ưu ở 50C và hoạt tính ở 20-25C bằng 60% so

với hoạt tính tối ưu (Quyen et al., 2011) β-Galactosidase tái tổ hợp từ chủng

Arthrobacter psychrolactophilus ở E coli tương tự với enzyme tự nhiên, có hoạt

tính cao ở 0C và hoạt tính tốt nhất ở 10C (Nakagawa et al., 2007) Năm 2001, Hoyoux và CS đã tinh sạch β-galactosidase từ vi khuẩn Gram âm P haloplanktis TAE 79 có hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ thấp (Hoyoux et al., 2001) Liu và CS (2008) cũng đã tinh sạch β-galactosidase từ Rahnella aqatilis có hoạt tính tối ưu ở điều kiện nhiệt độ thấp (35C) và ở 15C hoạt tính còn 40% (Liu et al., 2008)

Trong trường hợp hàm lượng lactose trong sữa thấp, một lợi thế quan trọng là có thể dùng β-galactosidase ưa nhiệt để thủy phân lactose trong quá trình thanh trùng

sữa β-Galactosidase từ Thermoanaerobacter ethanolicus có hoạt tính cao nhất ở

75-80C và khi được cố định trong aldehyde silochrome chúng còn có hoạt tính cao

hơn và bền nhiệt hơn (Volkov et al., 2005) Lauro và CS đã biểu hiện β-galactosidase từ vi khuẩn ưa nhiệt A acidocaldarius có hoạt tính tối ưu và bền ở 65C (Di Lauro et al., 2008), hay β-galactosidase tái tổ hợp từ

B stearothermophilus có hoạt tính tối ưu ở 70C (Chen et al., 2008)

Bảng 1.5 β-Galactosidase hoạt động ở nhiệt độ thấp và độ bền nhiệt

Các sản phẩm β-galactosidase Độ bền nhiệt của

enzyme (C)

Tài liệu tham khảo

P hloplanktis TAE 79 0-40 Hoyoux et al., 2001

Arthrobacter psychrolactophilus F2 0-50 Nakagawa et al., 2007

Rahnella aqatilis 15-40 Liu et al., 2008

Arthrobacter sp 32c 0-60 Hildebrandt et al., 2009

Thermoanaerobacter ethanolicus 40-80 Volkov et al., 2005

B stearothermophilus 45-80 Chen et al., 2008

Alicyclobacillus acidocldarius 40-90 Lauro et al., 2008

1.3.1.2 Nghiên cứu β-galactosidase tái tổ hợp và cố định

Bên cạnh việc khai thác β-galactosidase tự nhiên có đặc tính mới, một số nghiên cứu khác tập trung theo hướng tạo enzyme tái tổ hợp và cố định enzyme để thay đổi tính chất và nâng cao độ bền của enzyme

β-Galactosidase ưa lạnh từ Alkalilactibacillus ikkense biểu hiện trong E coli có

hoạt tính và độ bền cao hơn ở nhiệt độ thấp Enzyme tái tổ hợp duy trì hơn 60%

hoạt tính ở 0C và bền (hơn 100 giờ) ở 10C hoặc ở nhiệt độ thấp hơn khi không sử dụng thêm yếu tố hỗ trợ tăng độ bền (Schmidt and Stougaard, 2010) Chen và CS

(2008) đã biểu hiện β-galactosidase (BgaB) bền nhiệt từ B stearothermophilus trong B subtilis WB600 và đã khắc phục được thời gian bán hủy thấp ở 60C (chỉ 0,5 giờ) của enzyme này khi biểu hiện ở E coli trong nghiên cứu trước đây và

β-galactosidase tái tổ hợp hoạt tính đặc hiệu cao hơn 45 lần so với enzyme tự nhiên

từ B stearothermophilus (Chen et al., 2008) Một β-galactosidase bền nhiệt khác từ

A acidocaldarius cũng đã được nhân dòng và biểu hiện trong E coli kết hợp với

protein GST (glutathione S-transferase) Khoảng 10 mg protein tinh sạch có hoạt

tính tối ưu và bền ở 65°C thu được từ 1 L dịch nuôi cấy E coli tái tổ hợp, trong khi

20 L dịch nuôi cấy A acidocaldarius mới thu được 5 mg enzyme tự nhiên tinh sạch

Sau khi loại bỏ GST, enzyme tái tổ hợp có hoạt tính đặc hiệu cao hơn 1,5 lần so với

enzyme tự nhiên (Di Lauro et al., 2008) Với mục đích nâng cao khả năng tổng hợp LacS (một β-galactosidase ưa nhiệt từ S solfataricus), Yu và CS (2014) đã tối ưu codon và biểu hiện gen lacS trong L lactis LM230 Năng suất chuyển hóa tạo GOS

của enzyme tái tổ hợp đạt 197 g/L trong dung dịch 40% lactose ở pH 6,0 và 85°C (Yu and O'Sullivan, 2014)

β-Galactosidase từ tế bào K lactis đã được hấp thụ lên chất mang

cellulose-gelatin, có độ bền tăng đáng kể so với enzyme tự do (Numanoglu and Sungur, 2004) Khi sử dụng hạt gel calcium alginate (CA), K-carrageenan và gellan-xanthan

(GX) để cố định tế bào S thermophilus chứa β-galactosidase đã làm tăng độ bền của enzyme ở nhiệt độ cao hơn (> 55C) (Goel et al., 2006) β-Galactosidase tái tổ hợp từ B stearothermophilus khi được cố định trong chitosan với Tris-

hydroxymethyl-phosphine (THP) có hoạt tính và độ bền nhiệt cao hơn enzyme khi

cố định với glutaraldehyde và enzyme tự do trong quá trình thủy phân lactose sữa Enzyme cố định với THP cho thấy hoạt tính cao hơn trong sự có mặt của Ca2+ và bền trong 6 tuần ở 4C, trong khi enzyme tự do bị mất 31% hoạt tính so với ban đầu

(Chen et al., 2009) Mariotti và CS đã cố định β-galactosidase từ A oryzae trên silica Kết quả gắn tốt nhất khi sử dụng glutaraldehyde để hoạt hóa chất mang và