Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại cơ chất đến sự hình thành thể quả nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ---*****--- ĐINH PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI CƠ CHẤT ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH THỂ QUẢ NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO Cordyce

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -***** -

ĐINH PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ

LOẠI CƠ CHẤT ĐẾN SỰ HÌNH THÀNH

THỂ QUẢ NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

(Cordyceps militaris)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học:

TS LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS La Việt Hồng- Khoa Sinh

KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này

Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình

của cô Mai Thị Hồng - Phòng thí nghiệm Sinh lý học thực vật đã giúp đỡ,

đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh

lí học thực vật, trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phương tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội, 20 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

ĐINH PHƯƠNG THẢO

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chưa được ai công bố

Hà Nội, 20 tháng 04 năm 2017

Sinh viên

ĐINH PHƯƠNG THẢO

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

NỘI DUNG 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về Đông trùng hạ thảo 3

1.1.1 Sơ lược về nấm Đông trùng hạ thảo 3

1.1.2 Sự phân bố và đặc điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo 4

1.1.3 Nghiên cứu lâm sàng của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps 5

1.2 Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo Cordycep militaris 9

1.2.1 Phân loại và mô tả nấm C militaris 9

1 hu tr nh sống củ nấm Cordyceps militaris 10

1.2.3.Thành phần hóa học và giá trị dược liệu của C militaris 10

1.3 Các bước cơ bản trong quá trình nuôi trồng nấm C militaris 13

1.4 Tình hình nghiên cứu C militaris trong và ngoài nước 15

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 16

1.5 Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam 17

1.5.1 ác điều kiện thích hợp cho nuôi trồng nấm C militaris ở Việt Nam 17

1.5.2 Tình hình sản xuất nấm C militaris ở Việt Nam 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu nghiên cứu 20

2.3 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 20

3.1 Thiết bị 20

3 Dụng cụ 20

2.4 Môi trường và điều kiện nuôi cấy 20

2.5.Phương pháp nghiên cứu 21

2.5.1.Bố trí thí nghiệm 21

2.5.2 Phân tích thống kê số liệu thực nghiệm 23

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Ảnh hưởng của nhộng tằm đến sự hình thành thể quả C militaris trên môi trường giá thể gạo tẻ 24

3.2 Ảnh hưởng của gạo tẻ đến sự hình thành thể quả nấm C militaris 26

3.3 Ảnh hưởng của gạo lứt đến sự hình thành thể quả nấm C militaris 28 3.4.Ảnh hưởng của ý dĩ đến sự hình thành thể quả nấm C militaris 30

3.5 Ảnh hưởng của một số chất khoáng vô cơ bổ sung đến sự hình thành thể quả nấm C militaris 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Công thức ảnh hưởng của nhộng tằm đến sự hình thành thể quả

C militaris trên môi trường giá thể gạo tẻ 21

Bảng 2.2: Công thức ảnh hưởng của gạo tẻ đến sự hình thành thể quả nấm

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nhộng tằmđến sự hình thành thể quả C militaris

trên môi trường giá thể gạo tẻ 25Bảng 3.2: Ảnh hưởng của gạo tẻ đến sự hình thành thể quả nấm

C militaris 27

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của gạo lứt đến sự hình thành thể quả nấm C militaris

29

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của ý dĩ đến sự hình thành thể quả nấm C militaris 31

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của một số chất khoáng vô cơ bổ sung đến sự hình thành

thể quả nấm C militaris 32

DANH MỤC HÌNH

Hinh 1.1: Đông trùng hạ thảo 3

Hình 3.1: Ảnh hưởng của nhộng tằm đến sự hình thành thể quả C militaris

trên môi trường giá thể gạo tẻ 26Hình 3.2: Thể quả sau 60 ngày nuôi trồng trên các loại cơ chất gạo 28Hình 3.3: Thể quả bị dị dạng 30

Hình 3.4: Ảnh hưởng của ý dĩ đến sự hình thành thể quả nấm C militaris 31

Hình 3.5: Ảnh hưởng của một số chất khoáng vô cơ bổ sung đến sự hình

thành thể quả nấm C militaris 33

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đông trùng hạ thảo có bản chất là dạng ký sinh của loài nấm thuộc

nhóm Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của các loài bướm trong chi

Thitarodes [6] Tên gọi “Đông trùng hạ thảo” xuất phát từ quan sát thực tế; khi thấy vào mùa đông, nấm xâm nhập và kí sinh trong con sâu non dưới đất,đến mùa hạ nấm kí sinh mọc chồi từ đầu sâu non, nhô lên khỏi mặt đất giống như một loài thực vật Đông trùng hạ thảo bao gồm phần sâu non và phần thân nấm hình trụ mọc ra từ đầu ấu trùng sâu gọi là thể quả Thể quả là phần quan trọng nhất của nấm Đông trùng hạ thảo, là nơi phát sinh bào tử và chứa dược tính cao nhất Đông trùng hạ thảo được xếp ngang với nhân sâm về công năng chữa bệnh - thuộc vào loại toàn diện nhất

Chi Cordyceps của Đông trùng hạ thảo có hơn 356 loài khác nhau,

riêng tại Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài Tuy nhiên, cho đến nay hai loài

được nghiên cứu nhiều nhất và đưa vào nuôi trồng nhiều là Cordyceps

sinensis và Cordyceps militaris [24], [22] C sinensis là một loại nấm dược

liệu có phân bố rất hạn chế trong tự nhiên và được nuôi trồng trong điều kiện hoang dã, loài nấm này hiện tại vẫn chưa được nuôi trồng thành công trong môi trường nhân tạo, do đó sản lượng nấm thu được không đáp ứng đủ nhu

cầu của thị trường [22], [38] Trong khi đó C militaris chứa các hợp chất hóa học tương tự như của C sinensis, nhưng có thể dễ dàng nuôi trồng trong môi

trường nhân tạo [11]

C militaris chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học như cordycepin,

adensin, sterol, mannitol, superoxide dismutase, các axit amin thiết yếu… nên

việc sử dụng nấm C militaris giúp ngăn ngừa và kìm hãm sự phát triển của

các tế bào ung thư [27], kháng viêm, kháng virut, điều hòa tim mạch, giải độc cho thận [42], bảo vệ gan [25], làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể [22],

[33], giảm cholesterol trong máu [20]…Trên thế giới, nấm C militaris đã

được các nhà khoa học nghiên cứu và thu được rất nhiều thành tựu có giá trị Với công nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước đã thành công trong việc nuôi

cấy chất nền Cordyceps và phát triển nền công nghiệp sản xuất C militaris Ở

Việt Nam, việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo mới bắt đầu trong một vài năm gần đây và còn gặp nhiều khó khăn cả về cơ sở vật chất và kiến thức

Để góp phần vào nghiên cứu môi trường thích hợp cho nấm Đông trùng hạ thảo nhằm tạo ra sản phẩm có chất lượng tốt, giá thành hợp lý, chúng tôi thực

hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại cơ chất đến sự hình

thành thể quả của nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)”

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá quá trình hình thành thể quả của nấm Cordyceps militaris

trên môi trường nhân tạo với một số loại cơ chất khác nhau

3 Nội dung nghiên cứu

- Ảnh hưởng của nhộng tằm đến sự hình thành thể quả của C militaris

trên môi trường giá thể gạo tẻ

- Ảnh hưởng của gạo tẻ đến sự hình thành thể quả nấm C militaris

- Ảnh hưởng của gạo lứt đến sự hình thành thể quả của nấm C militaris

- Ảnh hưởng của ý dĩ đến sự hình thành thể quả của nấm C militaris

- Ảnh hưởng của một số chất khoáng vô cơ bổ sung đến sự hình thành

thể quả của nấm C militaris

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Ý nghĩ kho học: Nhằm bổ sung vào nguồn tư liệu khoa học cho nuôi

cấy nấm trên quy mô phòng thí nghiệm

Ý nghĩ thực tiễn: Là cơ sở phục vụ cho nhu cầu tạo ra số lượng lớn

nấm Đông trùng hạ thảo Góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu, ứng dụng vào sản xuất nhằm tạo ra nấm với hiệu suất cao, chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị hiếu của con người

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Đông trùng hạ thảo

1.1.1 Sơ lược về nấm Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo

(ĐTHT) được các nhà khoa học

Trung Quốc xác định mới đầu xuất

hiện từ vùng núi cao nguyên Tây

Tạng, loại dược liệu này thực chất là

hiện tượng ấu trùng các loài bướm

thuộc chi Thitarodes bị nấm

Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc ký

sinensis ký sinh Vào cuối mùa thu các chất trên da của sâu non họ ngài đêm

(Noctuidae) tương tác với các bào tử nấm và tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm

đã đâm sâu vào ấu trùng, coi chúng là chất dinh dưỡng để phát triển Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát sinh mạnh và gây chết sâu, sau đó chúng hình thành chồi, phát triển chui ra khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu

Do đó nhiều người gọi là nấm Đông trùng hạ thảo bởi vì mùa đông nấm sống trong cơ thể côn trùng, mùa hè thì nấm phát triển ra ngoài cơ thể giống như cây cỏ (hình 1.1)

Đầu thế kỷ XVIII, những người truyền giáo Châu Âu đã đưa Đông trùng hạ thảo đến với nước Pháp để nghiên cứu, và họ coi nước Pháp là nước

có nền y học hiện đại Đến nay rất nhiều nước đã nghiên cứu, điều tra và thu

thập nấm Đông trùng hạ thảo C militaris ngoài tự nhiên để làm nguyên liệu

sản xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho người [44]

1.1.2 Sự phân bố và đặc điểm sinh học của nấm Đông trùng hạ thảo

Sự phân bố nấm Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo chủ yếu tìm thấy được vào mùa hè, ở vùng núi cao trên 4.000 m như cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam

Túc và Vân Nam, Theo các nhà khoa học thì chi nấm Cordyceps có tới 400

loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông trùng hạ thảo Tuy nhiên, cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu được 2

loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt

với con người

Loài nấm Cordyceps sinensis phân bố chủ yếu ở vùng núi cao thuộc

dãy núi Hymalaya có độ cao trên 4.000 m so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số vùng thuộc Nepan và Butan Loài Nấm

Cordyceps militaris phân bố ở vùng núi thấp hơn có độ cao từ 2000-3000 m

so với mực nước biển [5]

Đặc điểm sinh học nấm Đông trùng hạ thảo

Nấm Đông trùng hạ thảo khi còn sống, người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá Khi sấy khô, nó có mùi tanh như

cá, đốt lên có mùi thơm Phần "lá" hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4-11

cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non mà thành Đầu sâu non giống nhưcon tằm, dài chừng 3-5 cm, đường kính khoảng 0,3 - 0,8 cm Bên ngoài có màu vàng xẫm hoặc nâu vàng với khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn Phần đầu có màu nâu đỏ, đuôi giống như đuôi con tằm, có tất cả 8

cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất Chất đệm nấm hình que cong mọc ra

từ mình sâu non, dài hơn sâu non một chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng; chất đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà [10], [12]

1.1.3 Nghiên cứu lâm sàng củ nấm Đông trùng hạ thảo ordyceps

Các nhà y học cổ truyền ở Trung Quốc, đã nghiên cứu dùng nấm ĐTHT điều trị thành công khá nhiều bệnh như: Rối loạn lipid máu (hiệu quả đạt 76,2%), viêm phế quản mạn tính và hen phế quản, viêm thận mạn tính và suy thận (đạt hiệu quả từ 44,7-70%), rối loạn nhịp tim (đạt hiệu quả 74,5%), tăng huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính (đạt hiệu quả 70%), ung thư phổi (có tác dụng hỗ trợ) và thiểu năng sinh dục (đạt hiệu quả từ 31,57-64,15%) [12], [26] Viện nghiên cứu nội tiết Thượng Hải (Trung Quốc) cũng

đã dùng nấm ĐTHT để điều trị cho các bệnh nhân bị liệt dương, kết quả đạt

được khá tốt

Như vậy, có thể thấy rằng nấm ĐTHT là một trong những vị thuốc đông y có khả năng cải thiện đời sống tình dục trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tác dụng nâng đỡ bồi bổ cơ thể Điều này đã được các nhà y học cổ truyền biết đến từ rất sớm Theo các cuốn sách cổ xưa, nấm ĐTHT có vị ngọt, tính

ấm vào hai kinh thận và phế, có công năng dưỡng phế, bổ thận, ích tinh được dùng để trị phế hư khái xuyễn, thận suy dương nuy (liệt dương), di tinh, lưng đau gối mỏi Khó có thể kể hết các phương thuốc đông y có sử dụng ĐTHT

Trong đó có một số các nghiên cứu lâm sàng sau

ải thiện chức năng g n:

Các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu thực hiện trên 70 bệnh nhân viêm gan B mãn tính và xơ gan,khi sử dụng nấm ĐTHT hoặc là hỗn hợp thảo dược với thành phần chính là nấm linh chi, kết quả cho thấy có 68% người bệnh có phản ứng lâm sàng tốt (với nhóm sử dụng ĐTHT) và chỉ có

57% phản ứng tốt (với nhóm hổn hợp thảo dược chứa nấm Linh chi) Điều này cho thấy nấm Đông trùng hạ thảo tốt hơn nấm linh chi trong việc điều trị bệnh gan hay xơ gan cho người

Thí nghiệm khác cũng được thực hiện trên 22 bệnh nhân xơ gan ở liều lượng 6 g/ngày cũng cho kết quả rất khả quan khi thử nghiệm các chức năng gan sau thời gian điều trị bằng Đông trùng hạ thảo [44]

Giải độc cho thận:

Bác sĩ y học cổ truyền cho rằng nấm ĐTHT có tác dụng làm tăng chức năng thận Rất nhiều công trình y học hiện đại xác nhân là nhờ nấm có khả

năng làm tăng những loại hoocmon ở tuyến thượng thận và tuyến sinh dục

tiết Thực hiện trên 51 bệnh nhân bị hỏng thận mãn tính, theo liệu trình điều trị từ 3-5 g ĐTHT/ ngày, kết quả cho thấy chức năng thận được cải thiện đáng

kể Mặt khác chức năng của hệ miễn dịch cũng được nâng cao hơn so với nhóm đối chứng Một nghiên cứu khác trên 57 bệnh nhân bị hỏng thận do sử

dụng gentamixin , người ta quan sát thấy bệnh nhân có sử dụng nấm ĐTHT

với lượng 4,5 g/ngày thì thận được bảo vệ tốt hơn, 89% chức năng thận được hồi phục, giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chứng khi dùng giả dược hay sử dụng liệu pháp khác chỉ cho kết quả 45% Nghiên cứu ở

51 bệnh nhân bị suy thận có dùng nấm đông trùng hạ thảo với lượng 3-5 g/ngày thì nhận thấy chức năng thận và hệ miễn dịch được cải thiện Thử nghiệm trên 69 bệnh nhân ghép thận, kết quả là nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps đã làm giảm độc tính của Cyclosporine trên thận [44]

Hiệu quả giảm đường huyết:

Nấm ĐTHT có hiệu quả với hệ thống chuyển hóa glucose máu Các nhà khoa học nghiên cứu ngẫu nhiên có đến 95% bệnh nhân được cải thiện chỉ số đường huyết khi sử dụng 3 g nấm/ngày Hiệu quả này đạt được là do tác dụng của nấm ĐTHT trong việc tăng độ nhạy của chất insulin, và các

emzyme chuyển hóa glucose gan, glucokinase và hexokinasse Kết quả này

khẳng định rằng việc sử dụng nấm ĐTHT trong việc kiểm soát chỉ số đường huyết mà không gây ra các phản ứng phụ [10]

Bệnh phổi:

Tác dụng điều trị bệnh về đường hô hấp của nấm ĐTHT đã được Y văn

cổ ghi nhận từ hàng nghìn năm nay bao gồm các bệnh hen, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD) và bệnh viêm phế quản Nghiên cứu về lâm sàng tại trường Đại học Y Bắc Kinh trên 50 bệnh nhân hen suyễn khi được điều trị bằng nấm ĐTHT nhận thấy tình trạng bệnh nhân đã được cải thiện có khoảng 81,3% số bệnh nhân sau khi sử dụng nấm 5 ngày so với nhóm điều trị bằng

các thuốc kháng histamine thông thường [26]

Bệnh tim mạch:

Nấm ĐTHT thường dùng để điều trị rối loạn nhịp tim, ngoài ra nấm còn được sử dụng để điều trị bệnh tim, hay hồi phục sau khi đột quỵ Với các bệnh nhân suy tim mãn tính thì việc sử dụng nấm ĐTHTdài ngày và điều trị

thông thường với các loại thuốc như Dioxin, hydrochlorothiazide, Dopamine,

và Dobutamine sẽ thúc đẩy việc cải thiệnchất lượng cuộc sống nói chung, bao

gồm cả thể chất lẫn tinh thần, sinh lý và chức năng tim mạch

Nấm ĐTHT còn là loại nấm có khả năng làm giảm cholesterol, gia tăng

tỷ số HDL/LDL Cholesterol và giảm Triglyceride

Nâng c o khả năng miễn dịch:

Thí nghiệm ở 61 bệnh nhân bị bệnh lupus trong 5 năm kết quả cho thấy việc dùng nấm đông trùng hạ thảo với liều 3 g/ngày và chất Artesmisininevới

lượng 0,6 g/ngày đã làm giảm căn bệnh trên

Hỗ trợ điều trị ung thư:

Nhiều nghiên cứu lâm sàng được tiến hành tại Trung Quốc và Nhật Bản trên những bệnh nhân bị ung thư cho kết quả khả quan Nghiên cứu trên 50

bệnh nhân ung thư phổi đã được uống 6 g nấm ĐTHT/ngày, cùng với liệu pháp vật lý trị liệu thì khối u đã giảm đi ở 23 bệnh nhân chiếm 46% Nghiên cứu trên một số các bệnh nhân bị các dạng ung thư khác nhau, khi sử dụng nấm ĐTHT trong 2 tháng với liều lượng là 6 g/ngày, kết quả cho thấy có cải thiện về triệu chứng trên đa số bệnh nhân Số lượng tế bào máu trắng bằng hoặc cao hơn 3000 mm3; ngay cả khi sử dụng liệu pháp chiếu xạ hay hóa chất thì các tham số miễn dịch cơ thể đã không bị thay đổi đáng kể trong khi kích thước khối u giảm đi nhiều trên một nửa bệnh nhân Như vậy việc kết hợp sử dụng nấm ĐTHT vớicác liệu pháp hóa trị cho kết quả khả quan giảm tác dụng phụ của các liệu pháp trên [10], [12]

hống rối loạn tình dục:

Nấm ĐTHT dùng để điều trị rối loạn tình dục ở cả nam giới và nữ giới bao gồm giảm ham muốn, lãnh cảm hoặc liệt dương Nghiên cứu được tiến hành tại Trung Quốc với 756 bệnh nhân bị suy giảm ham muốn, sau 40 ngày

sử dụng 3 g ĐTHT/ ngày, thì có 64,8% bệnh nhân đã cải thiện được tình trạng tình dục Công trình nghiên cứu khác trên các đối tượng người cao tuổi, cả nam và nữ đều có triệu chứng giảm ham muốn, liệt dương và các bệnh suy giảm sinh l‎ý khác, sử dụng 3 g/ngày trong vòng 40 ngày, các chỉ số đo được như thời gian sống của tinh trùng, số lượng tinh trùng đã tăng lên, còn tỷ lệ khiếm khuyết của tinh trùng giảm xuống đối với đa số các đói tượng, hơn gấp đôi số người bị liệt dương cũng được ghi nhận có cải thiện về tình trạng tình dục Đối với nữ giới, chứng đa khí hư, tình trạng rối loạn kinh nguyệt, ham

muốn tình dục cũng được cải thiện

Tăng sức bền, chống mệt mỏi:

Theo báo điện tử thì khi sử dụng mỗi ngày liều 3 g nấm Đông trùng hạ thảo thì kết quả làm gia tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mãn tính Năm 2004, tại Mỹ các nhà khoa học đã thí nghiệm cho người

40-70 tuổi, nếu dùng nấm Đông trùng hạ thảo trong 12 tuần thì có sự gia tăng sức bền thể lực Sự gia tăng sức mạnh được thể hiện ở cả hai yếu tố đó là gia

tăng Adenosine Triphophate (ATP) và giải phóng năng lượng trong ty lạp thể

của tế bào cũng như hệ số sử dụng hiệu quả oxy của tế bào trong quá trình

giải phóng năng lượng [44]

hống lão hó :

Nấm ĐTHT chứa nhiều chất SOD (SuperoxideDismutase) là chất

chống oxy hóa cao, nên nó có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể

1.2 Tổng quan về nấm Đông trùng hạ thảo Cordycep militaris

1.2.1 Phân loại và mô tả nấm milit ris

a Phân loại

Cordyceps militaris là loài nấm thuộc họ Cordycipitaceae, giống Cordyceps Loài này được Carl Linnaeus mô tả vào năm 1753 với tên gọi Clavaria militaris Cordyceps Fr là chi đa dạng nhất trong họ Clavicipitaceae

về số lượng loài và phổ ký chủ ớc tính có hơn 400 loài trong giống này [19]

Nấm Cordyceps militaris thuộc giới Nấm, chi Ascomycota, lớp

Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Cordycipitaceae, giống Cordyceps và

loài C militaris Tên khoa học Cordyceps militaris (L.) Fr (1818)

b Mô tả nấm C militaris

Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh trên

bướm và sâu bướm, có màu cam, chiều dài 8-10 cm Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa Các nang bào tử dài từ 300-510 micro mét, bề rộng 4 micro mét Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thước 3,5-6 × 1-1,5 micro mét Các bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp [6]

Trong tự nhiên nấm C militaris phân bố rộng rãi hơn so với nấm

C sinensis Chúng phân bố ở nhiều vùng ở Châu Á (Trung Quốc, Taiwan,

Mông Cổ, Pakistan, …), Châu Âu, Bắc Mỹ và Nam Mỹ [28]

1.2.2 hu tr nh sống củ nấm Cordyceps militaris

Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C militaris là một loài

nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đông Bào tử nấm theo gió d nh vào bên ngoài ký chủ, sau đó từ bào tử h nh thành các ống nảy mầm có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ

và xâm nhập vào bên trong cơ thể Sau đó hệ sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thể và gây chết ký chủ Đến cuối hè hoặc thu quả thể nhô ra ngoài để phát tán bào tử vào không khí [19], [17] Các quả

thể nấm C militaris thường có màu vàng nhạt hoặc màu da cam [41]

Nấm Cordyceps militaris có các dạng bào tử khác nhau trong chu tr nh

sống của nấm Ở các điều kiện môi trường khác nhau, sự h nh thành các dạng bào tử cũng cho thấy sự khác biệt, như việc tạo bào tử tròn tạo ra trên môi trường nuôi cấy rắn hoặc các chồi bào tử tạo ra trên môi trường nuôi cấy lỏng

1.2.3.Thành phần hó học và giá trị dược liệu củ milit ris

a Thành phần hó học nấm militaris

Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm

C militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm

40,69% với sự có mặt của 17 loại axit min; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm), … Quan trọng hơn là trong

C militaris có nhiều chất hoạt động sinh học mà các nhà khoa học đang phát

hiện dần dần ra nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự nhiên

Trong đó phải kể đếnchất Cordiceptic acid, Cordycepin, Adenosine,

Hydroxyethyl-adenosine Đáng chú ý hơn cả là nhóm hoạt chất HEAA

(Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs) [29]

Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả thể nấm

C militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm

(69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm) Khối lượng

acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao

động từ 1,15-15,06 mg/g và 0,36-2,99 mg/g Thành phần acid amin của mỗi

loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g),

prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine

(5,18 mg/g) Số liệu phân tích của Chang và cs (2001) cho thấy phần lớn

trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và

tyrosine (1,57 mg/g) [9], [14]

Acid béo quả thể nấm C militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm

70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong

quả thể và 21,5% trong sinh khối Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic,

chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối [14]

Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm

C militaris Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối

nấm Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần

so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) [14]

Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm

C militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường

monosaccharide, mannose và galactose Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại

polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và

tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất Yan et al., 2008 cho rằng

tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ

nấm [37].

b ác hợp chất dược liệu

Các hợp chất dược liệu của loại nấm C militaris ứng dụng trong điều

trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá trị kinh tế

cao Nấm C militaris rất khan hiếm trong tự nhiên.Vì vậy, việc sản xuất ở

quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ

C militaris hiện đang là một vấn đề cấp thiết

á h p h t h ng ung th : Hợp chất cordycepin (3

-deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch [30]

- o t t nh háng o h : Các nghiên cứu cho thấy hợp chất

CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C militaris có t nh kháng DPPH, hoạt t nh

- n h vius m: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm

C militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị

cúm A Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào

- háng hu n háng n m v háng ung th : C militaris: protein

(CMP) tách chiết từ nấm có k ch thước 12 kDa, pI 5,1 và có hoạt t nh trong

khoảng pH 7-9 Protein này ức chế nấm Fusarium oxysporum và gây độc đối

với tế bào ung thư bàng quan [8] Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng

kháng vi khuẩn Clostridium Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi

ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụthuộc NF- B, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch

- n hu t h i: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm C militaris

có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người [15]

- nh háng vi m: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch

chiết từ quả thể nấm C militaris (CMWE) được thử nghiệm về tác dụng kiểm

soát lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm k ch th ch việc sản xuất nitric oxide), việc phóng th ch yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-

6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7 Các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết Những kết quả này cho thấy rằng CMWE

có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của

tế bào [35]

1.3 Các bước cơ bản trong quá trình nuôi trồng nấm C militaris

Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ, đã cho phép các

nhà khoa học phân lập và nuôi trồng thành công nấm C militaris trên môi trường nhân tạo.Trong điều kiện invitro, nấm C militaris sinh trưởng nhanh

hơn với hiệu suất cao do có điều kiện được đảm bảo ổn định hơn so với ngoài

tự nhiên

ác bước cơ bản trong quá trình nuôi trồng

- L u giữ và chu n bị gi ng cho nuôi c y: thông thường nấm được lưu

giữ trong môi trường PDA (khoai tây: 200 g/L, glucose: 20 g/L, agar: 20 g/L, nước cất: 1000 ml, pH = 7) Các giống nấm này trước khi được sử dụng làm giống cấy thường được hoạt hóa trên môi trường PDA trong thời gian 7 ngày

ở 25o

C.Và bảo quản lâu dài ở 4oC trong tủ lạnh [1]

Để chuẩn bị giống cho nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ta cấy giống vàomôi trường có các thành phần: glucose, cao nấm men, KH2PO4… trong box cấy vô trùng Bình nuôi cấy sau đó được chuyển sang máy lắc và lắc ở tốc độ 150 rpm trong điều kiện nhiệt độ 24 -25oC Thời gian nuôi giống là 5- 6 ngày

- Môi tr ờng nuôi c y nhân t o: có thể dùng nhộng tằm làm cơ chất

cho nuôi cấy nấm; hoặc dùng các loại tinh bột làm giá thể chính và có bổ sung nhộng tằm, các thành phần dinh dưỡng khác Đường được sử dụng là đường glucose Môi trường được hấp khử trùng ở 121o

C trong 30 phút [1]

- Thực hiện cấy giống đã chuẩn bị vào môi trường nhân tạo, để trong điều kiện tối Sau khi nấm đã lan khắp bề mặt môi trường thì chuyển ra ngoài ánh sáng và theo dõi

Điều kiện nuôi cấy

nh h ng nhiệt ộ: Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến

việc tạo quả thể trong nuôi trồng nấm Các nghiên cứu cho thấy khoảng nhiệt

độ 18-22 C là tối ưu cho sự sinh trưởng sinh khối nấm và năng suất quả thể Tuy nhiên, quá trình này sẽ giảm mạnh khi tăng nhiệt độ trên 25oC Do đó, cần lưu ý về yếu tố nhiệt độ môi trường khi trồng nấm và phải đảm bảo điều kiện này khi tiến hành nuôi trồng nấm ở khu vực có nhiệt độ môi trường không thích hợp, như sử dụng máy điều hòa [6]

nh h ng a y u t ánh sáng: Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng

lớn đến quá trình nuôi cấy tạo quả thể nấm Trong điều kiện che tối, việc tạo quả thể bị ức chế [13] Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của nấm có thể dao động tùy chủng nấm, tuy nhiên từ 500-1000 lux được xem là điều kiện th ch hợp nhất [13] Cần thiết kế các chế độ chiếu sáng phù hợp trong phòng nuôi khi nuôi trong điều kiện nhân tạo đối với nấm

C militaris

nh h ng c ộ thoáng h v m ộ: Độ thoáng kh tốt k ch thích sự

sinh trưởng của tơ nấm và tổng sinh khối nấm Các nghiên cứu cho thấy việc

sử dụng màng bao HFM (hydrophobic fluoropore Membrane) cho kết quả tốt

nhất về hiệu suất quả thể nấm C militaris [38] Khoảng ẩm độ th ch hợp cho

nấm dao động từ 70-90%, tương đương với độ ẩm không khí trong tự nhiên sẽ phù hợp cho việc tạo quả thể Khi độ ẩm thấp sẽ làm môi trường khô nhanh hạn chế sự phát triển của tơ nấm cũng như quả thể Do đó, trong phòng nấm cần bổ sung ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn

Ngoài độ thoáng khí và ẩm độ, dịch nuôi cấy C militaris cần được chú

ý duy tr pH trong khoảng 6.0-6.5, nhiệt độ 20-25 C và bổ sung các nguồn dinh dưỡng như carbohydrate, nitrogen và muối khoáng [6]

1.4 Tình hình nghiên cứu C militaris trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây, Đông trùng hạ thảo đặc biệt được quan tâm

và nghiên cứu nhiều Trong nước đã có nhiều bài báo và cơ sở nghiên cứu

công bố khả năng nuôi trồng thành công nấm C militaris Các cơ sở nghiên

cứu và sản xuất đều sử dụng gạo làm cơ chất chính cho nuôi trồng nấm

Theo Phạm Quang Thu (2015) môi trường sản xuất giống là môi trường Nhộng tằm, cơm 2% nhộng tằm tươi, pH giá thể từ 6,5-8, nhiệt độ nuôi cấy 20-25oC, ẩm độ không khí 85-90%, cường độ ánh sáng là 700 Lux thích hợp cho sự sinh trưởng của mầm thể quả và thể quả phát triển [43]

Các nghiên cứu của Phạm Quang Thu (2009), Hoàng Tiến Công (2010)

và Trần Văn Tú (2011) bước đầu đã xác định được thành phần môi trường

nhân giống (PDA + 10% nhộng tằm), nhiệt độ không khí (25°C), pH = 5-6 là

thích hợp đối với chủng giống nấm ĐTHT [5]

Trong nghiên cứu của Lương Thị Hương Lan hàm lượng thạch thích

hợp nhất cho môi trường nhân giống câp I nấm C militaris là 0,7% Và tỉ lệ

khối lượng cơ chất gạo lứt/thể tích nước (w/v) bằng 1:3 là tỉ lệ thích hợp nhất

trong quá trình nuôi trồng thu thể quả [2]

Nghiên cứu của Lê Văn Vẻ và cs cho thấy, nấm C militaris bị thoái

hóa từ thế hệ nấm F8 [7]

Bên cạnh đó còn một số công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh học và

các yếu tố ngoại cảnh trong quá trình nuôi trồng nấm C militaris Tuy nhiên

chưa có một công trình nào trong nước công bố rộng rãi chi tiếtvề quy trình

nuôi trồng nấm C militaris

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Nấm đông trùng hạ thảo được nghiên cứu khá phổ biến, đặc biệt là ở

Trung Quốc do có điều kiện khí hậu thích hợp Trên thế giới đã công bố nhiều

công trình rất có giá trị về nuôi trồng nấm C militaris

Năm 1941, Kobayasi đã nghiên cứu sự hình thành quả thể nấm

C militaris trên cơ chất gạo Kể từ đó, gạo được sử dụng như một thành phần

chủ yếu cho sự sinh trưởng thể quả của Đông trùng hạ thảo [34]

Theo Jae và cs (2006) cơ chất thích hợp nhất để nuôi Đông trùng hạ

thảo trên giá thể nhân tạo là gạo lứt [15] đây là loại gạo rất giàu dinh dưỡng

Bên cạnh đó, một số chất hữu cơ khác có thể được sử dụng để nuôi trồng nấm

C militaris bao gồm: bột đậu, hạt ngô, lõi ngô, vỏ hạt bông, kê, lúa mì, lúa

miến, ngũ cốc, hoa hướng dương [21], [40]

Theo Shrestha (2012), ngũ cốc và một số chất hữu cơ khác được chứng

minh là cơ chất tốt để thay thế côn trùng [31] Gạo trộn với nhộng tằm được chứng minh là cơ chất tốt nhất cho đến nay thường được sử dụng làm môi trường nuôi trồng [16], [40]

Yahagi (2004) cho rằng môi trường chứa agar không phù hợp cho sự

hình thành thể quả [36]

Trong nghiên cứu của Kang và cs, các nguyên tố khoáng KH2PO4,

NH4NO3 và MgSO4.7H2O góp phần làm tăng hiệu suất và tăng hàm lượng

cordycepin [18]

Với công nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước đã thành công trong

việcnuôi cấy chất nền Cordyceps và phát triển nền công nghiệp sản xuất

Cordyceps.Các nước như Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản, Malaysia đã

sản xuất được nấm Đông trùng hạ thảo trên quy mô công nghiệp từ những năm 1995, thế kỷ XX

Các kết quả này có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp các nhà nghiên cứu và sản xuất nấm nước ta kế thừa kinh nghiệm, tiết kiệm được thời gian và

kinh phí để đem lại hiệu quả cao trong việc nuôi trồng nấm C militaris trong

điều kiện Việt Nam

1.5 Điều kiện tự nhiên và tình hình sản xuất Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam

1.5.1 ác điều kiện thích hợp cho nuôi trồng nấm C militaris ở Việt Nam

Nhìn vào quy trình kỹ thuật trồng nấm C militaris ta nhận thấy yếu tố

quan trọng nhất cần có được lợi thế từ tự nhiên là nhiệt độ.Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nấm luôn đòi hỏi nhiệt độ khá thấp từ 15-25o

C Nằm ngoài nhiệt độ này nấm sinh trưởng kém (dưới 15oC) hoặc ngừng sinh trưởng và chết (nhiệt độ cao) Do vậy, ở bất kỳ nơi nào mà điều kiện tự nhiên

có khoảng dao động của nhiệt độ từ 15-25oC đều thích hợp cho nuôi trồng

nấm C militaris.