ứng dụng enzyme trong sản xuất phân hữu cơ sinh học

Mở đầu Hiện nay, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học và các loại n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

- -CÔNG NGHỆ ENZYME

ĐỀ TÀI

ỨNG DỤNG ENZYME TRONG SẢN XUẤT PHÂN HỮU CƠ SINH HỌC

GVHD: Đỗ Thị Hiền

TP HCM, tháng 5 năm 2017

MỤC LỤC

1 Mở đầu

Hiện nay, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao với việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo

vệ thực vật hóa học và các loại nông dược nhằm mục đích khai thác, chạy theo năng suất và sản lượng Nhu cầu phân bón hằng năm của nước ta từ 7.5 – 8 triệu tấn, trong đó nhập khẩu đến 50% Việc sử dụng ngày càng nhiều phân hóa học

đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không dự báo trước

Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụng chế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu hướng chung của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung Việc sử

dụng phân bón hữu cơ (hữu cơ truyền, hữu cơ sinh học, hữu cơ-khoáng, hữu cơ

vi sinh) không những giải quyết được các vấn đề về thoái hóa đất, tránh được ô

nhiễm môi trường mà còn mang lại năng suất kinh tế cao cho nền kinh tế nông nghiệp

2 Phân hữu cơ sinh học

2.1 Khái niệm phân hữu cơ sinh học

Phân hữu cơ sinh học là loại phân bón sử dụng quá trình lên men vi sinh vật để hoạt hóa than bùn (rác thải) rồi trộn với các phân bón hóa học (N, P, K), các nguyên tố vi lượng, trung

lượng cùng các chất điều hòa kích thích tăng trưởng cho cây trồng

2.2 Ưu nhược điểm của phân hữu cơ sinh học

Ưu điểm

- Giảm thiểu ô nhiễm

- Diệt các mầm bệnh nguy hiểm do trong quá trình phân hủy sinh học, nhiệt độ có khi lên đến 70-80oC làm tiêu hủy trứng, ấu trùng, nấm bệnh trong chất thải Phân sau ủ có thể được sử dụng an toàn hơn phân tươi

- Tăng độ ẩm cần thiết cho đất trồng, giảm thiểu sự rửa trôi khoáng chất do các thành phần vô cơ không hòa tan trong phân

Nhược điểm

- Phần lớn vi khuẩn bị tiêu diệt nhưng không phải hoàn toàn, đặc biệt khi ủ phân hữu cơ không đồng đều về thời gian, phương pháp, lượng ủ… Một số mầm bệnh tồn tại có thể gây nguy hiểm cho người dùng

- Thành phần phân ủ thường không ổn định về chất lượng do thành phần nguyên liệu đưa vào không đồng đều

- Phải tốn thêm công ủ và diện tích, việc ủ phân thường ở dạng thủ công và lộ thiên tạo sự phản cảm về mỹ quan và phát tán mùi hôi

2.3 Nguyên liệu sản xuất phân hữu cơ

1 Nhóm phân động vật bao gồm phân gà, vịt, lợn, trâu bò, phân dơi v.v các loại phân này có hàm lượng dinh dưỡng cao

và phong phú Ngoài các chất dinh dưỡng đa lượng như đạm (N), lân (P2O5), kali (K2O) còn có các chất canxi (Ca), magie (Mg), lưu huỳnh (S), silic (SiO2) (chất trung lượng) và các chất vi lượng

Molipden (Mo), Coban (Co) Đây là loại phân bón quý có thành phần và hàm lượng dinh dưỡng khá cân đối và đầy đủ Bằng công nghệ vi sinh sẽ tạo ra các loại phân bón hữu cơ tốt an toàn cho cây trồng và môi trường đất

2 Nhóm phụ phế phẩm nông nghiệp như rơm rạ, vỏ trấu, thân cây lạc, đỗ, ngô, bã mía, vỏ cà phê, bã ép dầu đậu tương, đậu lạc (đậu phụng), bã thải sau trồng nấm, v.v… Các phụ phế phẩm này có hàm lượng dinh dưỡng cũng khá phong phú, dinh dưỡng ở dạng dễ tiêu cây trồng sử dụng dễ dàng Công nghệ xử

lý các nguyên liệu này thành phân bón khá đơn giản, có thể hướng dẫn cho nông dân ứng dụng một cách dễ dàng

3 Nhóm cây phân xanh như bèo hoa dâu, lục bình (bèo tây), cốt khí, cúc quỳ (quỳ dại), điền thanh, vông, đậu mèo đen

và xanh (mucuna), koodzu, muồng các loại có khả năng nhân sinh khối mạnh, hàm lượng dinh dưỡng cao, nhất là đạm ở dạng

dễ tiêu cây trồng sử dụng dễ dàng

4 Nhóm rong tảo biển, cũng được khai thác và xử lý thành phân bón sinh học khá đơn giản và hiệu quả Nhóm nguyên liệu này với trữ lượng lớn và thành phần dinh dưỡng khá đầy đủ, chủ yếu cung cấp đạm, lân, canxi và các chất vi lượng

và các acid amin, các chất kích thích sinh trưởng thực vật

5 Nhóm các vật liệu trầm tích, hóa thạch: Apatit, phosphorit, dolomite, zeolite., cacbonate canxi, cacbonate magie, silicate Các vật liệu này chứa các chất dinh dưỡng ở dạng khó tiêu, cần được nghiền nhỏ bón cho cây trồng và cải tạo đất ở dạng các khoáng chất bổ sung, các chất này có hiệu lực tồn dư lâu dài, có vai trò cải tạo đất tốt

6 Than bùn: Một loại trầm tích khác được liệt vào dạng tài nguyên khá phong phú, nằm rãi rác ở nhiều vùng Trong phạm

vi các tỉnh miền Nam, có thể kể đến các vỉa than bùn ởrừng U Minh Thượng, U Minh Hạ (Kiên Giang), Đồng Tháp, Tây Ninh, Đồng Nai, Lâm Đồng và các tỉnh ở Tây Nguyên Than bùn có chứa hàm lượng hữu cơ 35-57%, đặc biệt là hàm lượng các axit humíc, axít fulvic và humin Vì vậy hàm lượng N, P vào loại khá, kali hơi ít

7 Nhóm vỏ các loài nhuyễn thể như vỏ sò, nghêu, ốc vv cung cấp các khoáng trung, vi lượng như canxi, magie, lưu huỳnh, kẽm, sắt Các loại nguyên liệu này chế biến cũng khá đơn giản, hoặc nghiền sống hoặc nung lên và nghiền nhỏ bón trực tiếp cho cây trồng

8 Nhóm vỏ các loài giáp xác: như tôm, cua, ghẹ nhóm nguyên liệu này ngoài việc cung cấp các chất khoáng canxi, magie, kẽm, sắt, coban, nó còn cung cấp một chất rất quan trọng đó là chitosan Chất này có vai trò như một chất kích kháng cho cây trồng, đồng thời là hoạt chất sinh học hữu ích trong việc bảo vệ cây trồng chống lại một số bệnh nấm, vi khuẩn, thậm chí tăng tính kháng giúp cây trồng hạn chế sự xâm nhập phá hại của virus gây bệnh

9 Nhóm tro: tận dụng các loại tro bếp hoặc tro sau khi đốt các tàn dư thực vật để làm nguyên liệu cung cấp kali, silic

10 Nhóm mật rỉ đường: cung cấp các dưỡng chất cho vi sinh vật phát triển, nhân mật sốcủa chúng trong quần thể để phân hủy các chất hữu cơthành các khoáng chất đơn giản dễ tiêu

11 Nhóm phân trùn: việc nuôi trùn để sản xuất thực phẩm giàu đạm cung cấp cho con người, làm thức ăn gia súc, gia cầm đã tạo ra một khối lượng sản phẩm phụ rất lớn đó là

Nguồn enzyme

Nguyên liệu hữu cơ (than bùn, chế phụ phẩm nông nghiệp…)

Dinh dưỡng Phối trộn Xử lý sơ bộ, điều chỉnh độ ẩm, pH

Ủ Đảo trộn Kiểm tra chất lượng

Phân bón hữu cơ sinh học

phân trùn giàu dinh dưỡng hoàn toàn tự nhiên và thân thiện với

môi trường

12 Nhóm phụ phế phẩm của lò giết mổ gia súc, gia cầm

và chế biến thủy sản: nhóm phụ phế phẩm này rất phong phú

và đa dạng như xương, lông, da, máu, đầu cá, xương cá, vây,

ruột cá, các nguyên liệu này được xử lý bằng phương pháp lên

men thủy phân với chủng vi sinh vật chức năng chuyên biệt để

phân hủy các protein, lipit thành các amino acid có cấu trúc

phân tử đơn giản hoặc mono-amino acid giúp cây trồng hấp thu

dễ dàng, nhất là hấp thu qua lá Ngoài ra xác bã của quá trình

lên men này được tận thu cho vào ủ phân với các nguyên liệu

khác như phụ phế phẩm nông nghiệp, phân xanh, các nguyên

liệu có nguồn gốc trầm tích, hóa thạch

2.4 Quy trình tổng quát sản xuất phân hữu cơ sinh

học

3 Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình sản xuất phân bón hữu cơ giàu protein từ phế phẩm cá Labeo rohita

bằng nấm đột biến Aspergillus niger AB 100

3.1 Tổng quan

Vảy cá – phế phẩm chính của ngành công nghiệp chế biến

cá, được thủy phân bằng enzyme protease của Aspergillus niger

AB 100 để sản xuất ra protein hòa tan, sử dụng làm phân bón hữu

cơ Các chất dinh dưỡng vô cơ tối ưu được tìm thấy là: MgSO4

0.75%; K2HPO4 0.2%; Và KCl 0.075% A niger AB 100 có FeSO4.7H2O (5 μg/ml) và ZnSO4.7H2O (15 μg/ml) cho sản lượng protease cao hơn Nồng độ tối ưu cho các chất dinh dưỡng có hiệu quả về kinh tế để sản xuất protease là: bã Bột đậu nành 0.2%; Peptone 0.3%; và Ngô-rượu mạnh 0.2% Tăng trưởng sinh khối không liên quan đến tỉ lệ trong sản xuất enzyme và sự hòa tan protein nhưng sản xuất protease cho thấy mối tương quan tốt với sự thủy phân tạo protein hòa tan

Với sự tiến bộ nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về thực phẩm protein có chi phí thấp đang dần tăng lên Các sản phẩm chất thải từ các ngành công nghiệp thực phẩm có các nguyên liệu thô đã là đề tài cho các nhà nhà nghiên cứu khám phá các nguồn protein phi thường Các nghiên cứu đã được thực hiện để

sử dụng chất thải của các ngành công nghiệp chế biến thực phẩm như nông nghiệp, gia cầm, thịt và cá để thu nhận protein Hàng năm trên 100 triệu tấn cá được thu hoạch trên toàn thế giới, và khoảng một nửa số lượng đánh bắt được loại bỏ như rác thải chế biến Từ năm 1987 đến năm 1996, tăng sản lượng nuôi trồng thủy sản là: Thế giới 148%; và Ấn Độ là 126% Trong trường hợp Labeo rohita – cá trôi Ấn Độ (chiếm 23,9% tổng sản lượng cá ở Ấn Độ) đã có 131% tăng sản xuất Ở loài này, đối với

mỗi kg cá tiêu thụ, 60g có chứa protein chủ yếu dưới dạng collagen và chất icthylpeden có ít Ca, Mg và P cùng với các vết

Na và S10 bị lãng phí Một số quy trình khai thác và thủy phân enzyme được nghiên cứu để thu nhận protein từ cá Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu về sự thu nhận của vi khuẩn đối với protein từ cá

Protease của vi khuẩn có thể thủy phân các protein từ thực vật, cá hoặc động vật để thủy phân các tiểu trình peptide được

xác định rõ ràng, chẳng hạn như protease của Bacillus

amyloliquefaciens tạo ra protein hydrolysat giàu đạm

methionine từ protein đậu xanh, protease alkaline Bacillus

subtilis tạo ra protein tập trung từ lông vũ thải từ gia cầm,

protease alkaline keratinolytic được sử dụng trong công nghệ

thức ăn cho sản xuất peptide từ chất thải keratin , Aspergillus

niger và Trichophyton simii sản xuất protein hòa tan từ chất thải

da bằng protease của đột biến A niger Nghiên cứu này trình

bày hiệu quả của các chất dinh dưỡng khác nhau về chi phí, yêu cầu của các kim loại và các chất dinh dưỡng vô cơ thiết yếu trên

một dòng đột biến A niger AB 100 cho sản lượng protease cao hơn và sản xuất protein hòa tan từ phế phẩm cá

3.2 Vật liệu và phương pháp

3.2.1 Vi sinh vật

Loài A niger của được phân lập từ vùng Bắc-Bengal và

được dùng ethylene-imine và tia X (35 KV & 10 Ma) để tạo ra dòng đột biến A niger AB100 Giống đột biến này được nuôi cấy trong 15 thế hệ trên các thạch agar Czapek dox Trong quá trình thí nghiệm, nuôi cấy được chuyển đến các môi trường agar trung bình của mạch nha và nấm men và ủ ở 28°C trong 7 ngày để có đủ bào tử Hệ thống huyền phù Spore được thu bằng

cách rửa các thanh trượt bằng 10 ml nước cất vô trùng và lọc các kết quả bào tử bào tử qua một vài lớp bông cotton Mật độ được điều chỉnh đến 1,4 x 107 bào tử/ml Dung dịch (5 ml) này được sử dụng như là mẫu cấy trong quá trình lên men

3.2.2 Chế biến cá

Trong nghiên cứu này, vẩy cá của L.rohita được thu gom từ chợ và rửa bằng nước khử ion, sấy khô bằng máy sấy cơ học trong 12 giờ ở 100°C Sau đó, sau bổ sung lượng nước cất cần thiết (1g/ml nước), hấp chín trong 30 phút trước khi lên men Điều này là cần thiết vì sự biến tính của cấu trúc collagen giúp hấp thu độ ẩm và cải thiện sự khuếch tán của enzyme trong bề mặt quy mô để tăng tính nhạy cảm cho quá trình thủy phân Sau khi hấp, vẩy được làm khô bằng máy sấy cơ học và sau đó nghiền nhỏ thành bột Vẩy nghiền (2,5 g) được sử dụng trong thí nghiệm lên men

3.2.3 Điều kiện nuôi cấy

Việc lên men nuôi cấy bề mặt được tiến hành bằng cách sử dụng bình tam giác 150 ml chứa 30 ml môi trường lên men (FM) bao gồm: glucose 0.05; Urê 0.025; MgSO4.7H2O 0.01; và

KH2PO4, 0.01g/ml; vẩy cá chế biến 2.5 g; pH 4.0 Môi trường được cấy được ủ ở 28oC (± 0.5oC trong buồng ủ BOD) trong 14 ngày Dung dịch vô trùng của MgSO4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4, NaCl, KCl và CaCl2 được thêm riêng vào môi trường vô trùng giữ tất cả các yếu tố liên tục ngoại trừ một trong những hiệu ứng đó đang được điều tra Các dung dịch vô trùng của kim loại vi lượng được thêm vào riêng biệt với các dung dịch glucose, urê, MgSO4.7H2O và K2HPO4 Các hóa chất thu được từ Qualigen Excelar được phân loại và được tinh chế thêm từ các nguyên tố

vi lượng bằng phương pháp chiết chloroform Trong phương

pháp này, dung dịch nước cần thiết của mỗi dung dịch được trộn đều với 0,1 g 8-hydroxyquinone và chloroform trong một phễu tách, lần đầu tiên ở pH 5.2, sau đó ở pH 7.2 Các tạp chất hòa tan bằng chloroform đã được chiết ra Quá trình này được lặp lại ở hai pH khác nhau Các dung dịch được làm bằng chloroform tự do bằng cách đun nóng trong một bồn nước và khử trùng riêng Các chất dinh dưỡng phức hợp được thêm vào như dung dịch vô trùng dựa trên hàm lượng chất rắn

3.2.4 Xác định hàm lượng Nitơ

Hàm lượng Nitơ trong vẩy cá đã được đo trước và sau khi lên men bằng phương pháp tiêu hoá micro-kjeldahl đã được sửa đổi Tỷ lệ Nitơ hòa tan được tính toán so sánh giá trị Nitơ của quy mô bị suy thoái và không bị suy thoái Hàm lượng chất đạm đạt được bằng cách nhân hàm lượng nitơ với hệ số 6,25

3.2.5 Thử nghiệm Enzyme

Sau khi lên men, sợi nấm được tách ra khỏi FM bằng cách lọc qua Whatman no 1 giấy lọc và 0,5 ml dung dịch lọc pha loãng 1:10 đã được dùng để xác định hoạt tính protease Hoạt tính của enzym được xác định bằng quang phổ quang học bằng cách sử dụng casein làm chất nền Một đơn vị hoạt động enzyme được định nghĩa là lượng enzyme giải phóng một μ mole của tyrosine/ml/phút trong các điều kiện được xác định

3.2.6 Ước tính Protein và khối lượng sợi nấm khô

Protein được ước lượng bằng phương pháp Lowry sử dụng chất thử Folin-ciacalteau và albumin huyết thanh bò theo tiêu chuẩn Các sợi nấm, tách ra từ rượu lên men bằng cách lọc, rửa bằng nước cất và lọc lại một lần nữa qua một phễu Buchner, được sấy khô trong lò trong 24 giờ ở 80ºC

3.2.7 Phân tích thống kê

Phân tích thống kê của tất cả các dữ liệu đã được thực hiện theo phân phối t-student Mức độ quan trọng đối với kiểm tra two-tail test được xác định từ bảng với các giá trị quan trọng của t Số mẫu là 6,0 (n = 6)

Nồng độ

MgSO4.7H2

O

%

Độ hòa tan của protein cá*

%

Trọng lượng khô của nấm g/100 ml

Protein hòa tan FM g/l

Hoạt độ Enzymea

units/ml/ min 0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

2.00

36.0 ± 0.603 40.7 ± 0.266 39.0 ± 0.569 38.0 ± 0.443 36.1 ± 0.326 33.9 ± 0.418

3.00 3.20 3.20 3.25 3.30 3.30

5.10 9.50 7.90 7.00 5.20 3.30

1014.00 1280.00 1186.00 1140.00 1020.00 0910.00

* = Value are expressed as mean ± standard error, n = 6

a = protease activity was significantly different from each other (p < 0.001)

Hình 1: Ảnh hưởng của KH 2 PO 4 và K 2 HPO 4

Hình 2a: Ảnh hưởng của NaCl