tính toán, thiết kế quá trình lọc màng để cô đặc protease kiềm từ bacillus licheniformis từ dịch nổi sau ly tâm loại sinh khối với năng suất 200 tấn năm

Trong số các quá trình tách màng khác nhau, siêu lọc là một trong những quá trình chức năng theo gradient áp suất mà chủ yếu được sử dụng để tách và tinh chế các sản phẩm bao gồm các enz

PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG



MÔN HỌC

KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC

TÍNH TOÁN, THIẾT KẾ QUÁ TRÌNH LỌC MÀNG ĐỂ CÔ ĐẶC PROTEASE KIỀM TỪ

BACILLUS LICHENIFORMIS TỪ DỊCH NỔI

SAU LY TÂM LOẠI SINH KHỐI VỚI NĂNG

SUẤT 200 TẤN/NĂM

GVHD: NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

Sinh viên thực hiện:

1 Nguyễn Thị Kim Tiền 2008140318

2 Nguyễn Thị Thu Trang 2008139005

3 Võ Nữ Quỳnh Thương 2008139006

4 T’Sằn Hồng Vỹ 2008140396

5 Nguyễn Minh Thái 2008140262

TP.HCM, tháng 5 năm 2017

MỤC LỤC

I GIỚI THIỆU 3

II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

1.1 Chủng vi khuẩn 4

1.2 Nguồn phân lập chủng Bacillus licheniformis 4

1.3 Tiêm chủng và nuôi cấy gián đoạn 5

1.4 Kỹ thuật phục hồi protease kiềm từ nước lên men 6

1.5 Thiết kế quá tr nh ọ m ng để đ prot s iềm ủ i us i h ni ormis từ ị h nổi sau ly tâm: 7

III KẾT QUẢ TÌNH TOÁN 12

IV KẾT LUẬN 15

V TÀI LIỆU THAM KHẢO 16

I GIỚI THIỆU

Các quá trình tách màng là phổ biến nhất trong lĩnh vực công nghệ sinh học, và chúng

dễ dàng vận hành và nhân rộng so với các quá trình phân tách khác như sắc ký và điện di Trong số các quá trình tách màng khác nhau, siêu lọc là một trong những quá trình chức năng theo gradient áp suất mà chủ yếu được sử dụng để tách và tinh chế các sản phẩm bao gồm các enzym và protein khác hoặc để phục hồi sản phẩm vi sinh vật (tế bào và các bào tử) hiện diện trong Một môi trường nuôi cấy Do lượng enzyme thấp trong dịch lọc không có tế bào nên việc loại bỏ nước là một mục tiêu chính Lọc siêu lọc là một kỹ thuật hiệu quả đã được sử dụng chủ yếu để phục hồi các enzym và, nói chung, là một giải pháp thay thế ưa thích cho sự bốc hơi Quá trình tách ly áp lực này không tốn kém và cũng cho kết quả đáng khích lệ với việc giảm hoạt động của enzym Quá trình này cung cấp cả tập trung và thanh lọc Tuy nhiên, việc áp dụng các quy trình màng nói chung có một số vấn

đề cụ thể như tắc nghẽn màng hoặc do các kết tủa tạo thành bởi sản phẩm cuối cùng và / hoặc lắng đọng các hạt rắn trên màng Nếu dòng chất lỏng chảy về phía màng lớn hơn chất tan đi qua màng, dung môi tích tụ trên bề mặt màng, sự tích tụ này tạo thành một lớp nồng độ được gọi là phân cực nồng độ Lọc luồng dòng chảy là lựa chọn mạnh mẽ và thuận lợi hơn so với lọc dòng bình thường như là lọc dòng tiếp tuyến sẽ làm giảm đáng

kể bẩn của màng Sự tắc nghẽn hoặc bẩn thường có thể được giảm bớt hoặc khắc phục bằng cách xử lý các chất tẩy rửa, proteases, axit hoặc kiềm Trong thực tế, quá trình siêu lọc đã được hiệu quả trong sử dụng cho việc thu hồi các hợp chất hữu cơ từ một số phương tiện truyền thông tổng hợp

Trong số các enzyme công nghiệp, protease chiếm phần lớn doanh số bán hàng trên toàn thế giới, chiếm 1,3 tỷ US $ vào năm 1998 (Godfrey T 2001 ET Consulting, thay mặt cho Biocatalysts Ltd http://www.biocatalysts.com), với nhu cầu ngày càng tăng đối với các ứng dụng trong ngành da, mỹ phẩm, tẩy rửa, pha chế và thực phẩm Chỉ có một nhóm nhỏ các enzyme proteolytic có khả năng thủy phân keratin-scleroprotein (Scleroproteins hoặc protein dạng sợi ) không hòa tan của động vật có xương sống, tìm thấy trong lông vũ, tóc hoặc móng Vi khuẩn, actinomycetes (xạ khuẩn có khả năng tiết

protease), và nấm men có khả năng sản xuất các enzyme proteolytic chuyên biệt có tên keratinase Keratinase đã được sử dụng thành công để xử lý và tinh chế sợi len (Cegarra

và cộng sự., 1992) để cải biến lông và các vật liệu khác như nguồn thức ăn chăn nuôi (Onifade et al., 1998 ; Pal et al., 1996; Raju et al., 1996) cũng như một thành phần hoạt chất trong các loại kem (Greff D 1996 Các chế phẩm thẩm mỹ có chứa một chất chống oxy hoá là Ceramide và protease Frande Demande FR 2729079 A1 trang 12) và dầu gội đầu (Tanaka M, Tomizawa N 1986 Dầu gội đầu có chứa enzyme keratindrapering JP

62164611 A2 21 Jul 1987 Showa 4 trang)

Bacillus licheniformis strain ATCC 21424 đã được sử dụng trong nghiên cứu này Một môi trường nuôi cấy hoạt tính được duy trì bằng cách cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng (thành phần: 0,3% chiết xuất từ thịt bò, 0,5% peptone, và 2% agar) và ủ ở 35°C trong 48 giờ Các miếng được bảo quản ở 4 ° C để sử dụng sau này

Nước thải chế biến thịt của công ty cổ phần kỹ nghệ Vissan, đường Nơ Trang Long, quận Bình Thạnh, Tp HCM

Nước thải trên đều được lấy trong bể tiếp nhận nước thải sản xuất của nhà máy Nước thải tại đó được lưu giữ khoảng 2 ngày trước khi được đưa vào trạm xử lý hoặc thải ra môi trường

Nguyên liệu nghiên cứu

- Môi trường phân lập vi khuẩn (môi trường NA): peptone 1g/100ml, cao thịt 0,3g/100ml, NaCl 0,5g/100ml và agar 20g/1000ml

- Mẫu nước thải của các cơ sở chế biến thủy sản trên được gia nhiệt ở 80oC trong khoảng 20 phút, pha loãng và cấy trang trên môi trường NA, ủ ở 37 ± 1 oC trong 24 giờ, rồi cấy ria các khuẩn lạc thu được đến khi thuần nhất

 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp đục lỗ thạch trên môi trường NA Các chủng có khả năng phân giải protein mạnh cho đường kính vòng phân giải lớn xung quanh giếng thạch

 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính protease: lấy 1ml dịch chiết enzyme thô (sau ly tâm) từ dịch nuôi cấy sau các khoảng thời gian khác nhau (24 giờ,

48 giờ, 72 giờ, 96 giờ) tại 37 ± 1°C để xác định hoạt tính bằng phương pháp Anson cải tiến

 Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt tính protease: lấy 1ml dịch chiết enzyme thô sau khoảng thời gian nuôi cấy phù hợp đã xác định được ở trên ở 37 ± 1°C trong môi trường NB trước đó đã điều chỉnh pH về các giá trị 3, 5, 7, 9 bằng NaOH 1M hoặc HCl 1M để xác định hoạt tính bằng phương pháp Anson cải tiến

 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính protease: tiến hành nuôi cấy các chủng vi sinh vật với khoảng thời gian và pH tối ưu đã xác định ở trên trong các điều kiện nhiệt độ lần lượt là 30 ± 1°C, 37 ± 1°C, 40 ± 1°C, 50 ± 1°C, 60 ± 1°C bằng thiết

bị điều nhiệt Sau đó, ly trích thu enzyme và xác định hoạt tính bằng phương pháp Anson cải tiến

2.3 Tiêm chủng và nuôi cấy gián đoạn

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

Một môi trường tăng trưởng phức tạp đã được tối ưu hóa đã được sử dụng cho các thí nghiệm lên men (nồng độ cuối cùng g/L-1) (Raninger, 2001): Để tránh phản ứng Maillard (phản ứng giữa đường và aa các hợp phần tham gia phản ứng là P hoặc các sản phẩm phân giải của chúng với glucid), dd A chứa: 14.52 peptone từ casein (Merck KGaA, Darmstadt, Germany), 2.41 (NH4)2SO4, 3,49 KH2PO4, và 3,25 Na2HPO4 × 2H20 được phân vô trùng riêng khỏi dung dịch B: chứa 10 glucoza, 0,67 sắt citrat, 4,52 MgSO4 × 7H2O, 0,11 MnSO4 x H2O và 26,9 dung dịch nguyên tố vi lượng SL-6 (DSMZ 2001 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen http: // www.dsmz.de/media/med027.htm) Cả hai dung dịch đều được hấp chín trong 30 phút ở 121°C, làm nguội và trộn lại trong các bình lắc dưới dòng chảy tầng Môi trường được đưa vào buồng lên men sử dụng kỹ thuật kết nối vô trùng

Nuôi cấy gián đoạn:

Thiết bị nuôi cấy được tiêm với tế bào tươi đem đi đo mật độ quang học OD đạt 0.1 (600 nm so với nước) và ủ ở 50°C trong 20 giờ trên máy lắc quay ở 120 vòng /phút (ném 2,7 cm) Đối với các thí nghiệm lên men được kiểm soát, quá trình nuôi cấy theo mẻ được thực hiện trong một MBR-Mini Bioreactor , và trong Giovanolla Bioreactors Các môi trường được duy trì ở pH 6,2 ± 0,1 bằng cách thêm NaOH (15%) hoặc H3PO4 (15%) Nhiệt độ được duy trì ở 50°C ± 0,2 đối với tất cả các quá trình lên men theo mẻ nngoại trừ các thí nghiệm thay đổi nhiệt độ Sự thông khí được đặt ở mức 0,5 vvm và tốc

độ khuấy được điều chỉnh từ 400 đến 900 vòng / phút để duy trì nồng độ oxy không hạn chế trong môi trường (> 10% giá trị bão hòa) Oxy tinh khiết đã được sử dụng khi cần thiết trong quá trình tăng trưởng ở pha log Để làm giảm bọt polypropylene glycol (PPG 2000) đã được thêm vào ở pha log Các chỉ số của pH, nhiệt độ, tốc độ khuấy, và nồng

độ oxy được kiểm soát và ghi lại trong suốt quá trình lên men

2.4 Kỹ thuật phục hồi protease kiềm từ nước lên men

 Ly tâm:

Nước dùng lên men được ly tâm ở mức 9000xg trong 30 phút theo thủ tục của Brar et al

Các lớp phủ sau khi ly tâm của nước lên men đã được thu thập và lưu trữ ở 4 ° C

Phương pháp lọc

2.5 Thiết kế quá tr nh ọ m ng để đ prot s iềm ủ i us

i h ni ormis từ ị h nổi s u y t m

Sơ đồ quá trình lọc

Một số yếu tố ảnh hưởng đến việc thiết kế một quy trình Trong số hàng đầu là tài sản của nguyên liệu ban đầu (thức ăn) và sản phẩm, và tổng thời gian cần thiết cho quy trình Hơn một phần ba tất cả các enzyme proteolytic được biết là protease serine Protease

từ B licheniformis ATCC 21424 là enzyme serine kiềm có khả năng chịu nhiệt và alkaline, vì nó ổn định ở pH kiềm và nhiệt độ cao

 Yêu cầu thời gian:

Các yêu cầu về thời gian để hoàn thành quá trình lọc siêu lọc sẽ khác nhau tùy theo yêu cầu và đặc điểm của hệ thống và có thể là một yếu tố quyết định cho tính kinh tế của quá trình cũng như tính ổn định của sản phẩm Như một chỉ dẫn chung, tổng thời gian cần thiết cho một phạm vi hoạt động điển hình thường từ 3 đến 8 giờ, bao gồm chuẩn bị hệ thống và dọn dẹp

• Chuẩn bị bộ lọc và hệ thống xử lý (lên đến 2 giờ)

• Tiến hành quá trình lọc (phụ thuộc vào ứng dụng)

• Dọn dẹp và xả nước cho hệ thống và lọc để bảo quản (tối đa 2 giờ)

2.5.2 Lựa chọn bộ lọc ( lọc siêu lọc )

Màng siêu lọc có kích thước lỗ rỗng trong khoảng từ 20 đến 100 nm và thường được đặc trưng bởi sự cắt giảm trọng lượng phân tử danh định (NMWC), đây là trọng lượng phân tử của protein hình cầu lớn nhất có thể đi qua màng

Giá trị NMWC dao động từ 1 đến 100 kD (kiloDalton) Các bộ lọc này được sử dụng

để tập trung và phân đoạn các dòng protein, nồng độ virus, khử muối và trao đổi đệm Mục tiêu của hầu hết các quy trình siêu lọc là giữ các đại phân tử hòa tan như các protein trên một kích thước nhất định, trong khi cho phép các phân tử nhỏ hơn như muối, axit amin, và các mono- hoặc disaccharides đi qua màng tế bào

 Lỗ bộ lọc

Tất cả các bộ lọc sẽ có khuynh hướng bị dính (bị chặn bởi vật liệu hạt tích tụ trong các lỗ lọc), đặc biệt là trong các ứng dụng như làm sạch lysate liên quan đến vật liệu bắt đầu từ hạt Fouling sẽ rút ngắn thời gian sử dụng bộ lọc trước khi phải được làm sạch, và

do đó hạn chế công suất chế biến tối đa cho mỗi lần chạy Việc lựa chọn kích thước lỗ lọc là rất quan trọng để giảm thiểu sự sói mòn của bộ lọc Nói chung, các bộ lọc với các

lỗ nhỏ hơn sẽ cho thấy xu hướng bẩn hơn vì vật liệu dạng hạt không thể xuyên qua và ngăn chặn các lỗ chân lông

 Kí h thước màng:

Các màng có trọng lượng phân tử (MWCO) là 10 kDa và 100 kDa đã được sử dụng trong nghiên cứu này (Millipore, vết thương xoắn ốc của TFF-1) Màng được tạo thành từ xenlulo tái sinh và có dạng xoắn ốc TFF-1 PLCC với diện tích bề mặt là 0,1 m2 Supernatant đã được thông qua đầu tiên thông qua màng 100 kDa để loại bỏ tất cả các tạp chất bùn khác và thấm cuối cùng đã được thu thập như là nguồn enzym để thực hiện các nghiên cứu tối ưu bằng cách sử dụng màng 10 kDa Enzyme cô đặc được sử dụng cho mục đích đặc tính

 Đ c tính màng lọc:

Bảng 1

2.5.3.Chuẩn bị bộ lọc

Chuẩn bị các bộ lọc cho một quá trình bao gồm rửa sạch để loại bỏ các giải pháp lưu trữ và điều chế bộ lọc với bộ đệm quá trình Đối với một số quy trình, bộ lọc có thể cần được khử trùng và depyrogen hóa trước khi sử dụng

Các bước chuẩn bị:

1 Rửa sạch và rửa bộ lọc

2 Hoà tan dung dịch từ 0,1 đến 0,5 M NaOH (pH 13) trong 30 đến 60 phút tại 30°C đến 50°C

3 Drain hệ thống kỹ lưỡng

4 Rửa bộ lọc bằng nước sạch trong 30 phút

 Nguyên lý hoạt động:

Thiết bị được sử dụng cho quá trình lọc siêu lọc có dạng lọc dòng chảy tiếp tuyến (PREP / SCALE-TFF, Cartridges Millipore) với tuần hoàn Chất lỏng được tiếp tuyến bơm dọc theo bề mặt của màng Áp lực đã được áp dụng để ép một phần của chất lỏng thông qua màng để bên permeate Các supernatant từ máy ly tâm đã được đưa vào thiết

bị siêu lọc bởi một máy bơm (Casy tải, Master Flex, Millipore) Các supernatant đã được đưa đến nhiệt độ phòng (25°C) để tiến hành nghiên cứu siêu lọc

Sau mỗi lần hoạt động siêu lọc, chất lỏng trong màng đã được thoát hoàn toàn Có tính đến loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu này (môi trường sinh học), nên sử dụng dung dịch kiềm (0,1 N NaOH) Dung dịch kiềm được truyền qua màng cho đến khi màng lọc được sạch Sau đó, màng đã được lấy ra và đảo ngược để tạo điều kiện rửa hoàn toàn

Độ bền của màng có thể được xác định bằng "trọng lượng thấm thấu bình thường (NWP)

do hiệu suất của màng phụ thuộc vào NWP

 Áp suất xuyên màng (TMP = 90kPa )

Áp lực có thể được theo dõi trong luồng thức ăn, dòng retentate hoặc permeate

suối Hai đo áp lực khác thường được sử dụng, ΔP và áp suất xuyên màng (TMP)

 ΔP = áp suất nạp - áp suất retentate

Áp suất nạp + áp suất retentate

 TMP = - Áp suất thẩm thấu

2

TMP là chức năng của áp lực của retentate và của thức ăn được điều chỉnh bằng áp kế

để có được các giá trị khác nhau của TMP Các giá trị TMP khác nhau đã được kiểm tra

từ 70 kPa đến 110 kPa để có được giá trị TMP tối ưu Tuy nhiên trong thực tế là hoạt tính protease không thể phát hiện trong tất cả các thấm Vì vậy, 83% hoạt động protease đã được hồi phục với TMP với 90 kPa

Vì vậy, rõ ràng là một số protease đã bị mất như là một tiền gửi trên màng tế bào và hoặc trong ống TMP cao hơn hoặc thấp hơn 90 kPa đã làm giảm các giá trị của hoạt động protease, protein hoà tan, tổng chất rắn và chất rắn lơ lửng Điều này có thể là do khi TMP thấp hơn giá trị tối ưu, áp suất thức ăn có thể không đủ để vượt qua dung dịch qua màng một cách hiệu quả và mất các thành phần có thể xảy ra trong ống hoặc trên bề mặt màng Khi TMP cao, áp suất cao này đã tạo ra bọt trong màng siêu lọc được giữ lại trong ống dẫn và cuối cùng các thành phần bị mất trên màng và trong các ống có thể xảy

ra ở dạng bọt vì chúng không thể giữ lại được trong thấm hoặc trong retentate Dòng chất tan trên màng chắc chắn dẫn đến sự tắc nghẽn của một số lỗ chân lông, tạo thêm bề mặt

để hấp phụ và bốc mùi Khi điều kiện nhẹ nhàng được yêu cầu để phục hồi các protein nguyên vẹn, sẽ rất khó để loại bỏ / phục hồi các protein này Các cơ chế khác nhau có thể tạo ra những tổn thất này thông qua màng siêu lọc, vì một số các thành phần mẫu gần với MWCO của màng Nguyên nhân chính gây mất protein enzyme thông qua màng tế bào là

sự phân bố kích thước lỗ rỗng, trong khi lực cắt cũng có thể đóng góp bằng cách tạo ra các mảnh nhỏ hơn Theo nguyên lý siêu lọc, dòng chảy tối thiểu của thấm sẽ dẫn đến tổn thất tối thiểu hoặc không mất chất tan (protease trong bối cảnh hiện tại) trong thấm và sẽ cho nồng độ cao trong retentate Lưu lượng tối thiểu của permeate có thể thu được với một giá trị tối ưu của TMP