Protease được sử dụng nhiều nhất trong các lĩnh vực như : Ngành công nghiệp thực phẩm: Protease enzyme được sử dụng rộng rãi trong làm mềm thịt, tăng hương vị cho thịt, sản xuất nước t
Trang 1KHOA CNSH-KTMT MÔN: KỸ THUẬT CÁC QUÁ TRÌNH SINH HỌC
TIỂU LUẬN: TÍNH TOÁN, THIẾT KẾ BỂ
TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS VỚI
CÔNG SUẤT 200 TẤN/NĂM
GVHD: THS NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI
TP HCM – năm 2017
Trang 2Thiết kế bể phản ứng
TÍNH TOÁN, THIẾT KẾ BỂ PHẢN ỨNG SẢN XUẤT
PROTEASE KIỀM TỪ BACILLUS LICHENIFORMIS
VỚI CÔNG SUẤT 200 TẤN/NĂM
TÓM TẮT
Trong nhiều năm qua, protease đã có được tầm quan trọng đáng kể trong thị trường thế giới Trong số các proteases, protease vi khuẩn có ý nghĩa quan trọng hơn các protease
động vật và nấm Sản xuất protease kiềm từ Bacillus licheniformis đã được nghiên cứu và
mô tả khá rõ ràng Dựa trên những nghiên cứu đó nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành
thiết kế bể phản ứng sinh học để tiến hành sản xuất protease kiềm từ Bacillus
licheniformis với công suất (nhà máy) 200 tấn/năm Tiến hành lên men hiếu khí trong bể
lên men chìm có cánh khuấy Với thể tích của bể là 200 m3, chiều cao và đường kính bể tương ứng lá 13,2 m và 4,4 m Sự đảo trộn trong bể là rất cần thiết được thực hiện bởi 3 cánh khuấy trên 1 trục với đường kính là 1,76 m, chiều dài của trục khuấy 11,44 m
Trang 3Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất và
trên lông chim Là một loại vi khuẩn gram dương, hình que, ưa nhiệt Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 30°C Nhiệt độ tối ưu để sản sinh enzyme là 37oC Trong điều kiện môi trường khắc nghiệt, nghèo dinh dưỡng, đặc biệt trong đất, nó cũng có khả
năng tạo bào tử Các nội bào tử của Bacillus kháng nhiều hơn các tế bào thực vật với
nhiệt, khô hạn, làm khô, chất diệt khuẩn, và các tác nhân phá hủy khác và do đó có thể tồn tại trong nhiều thế kỷ Dưới những điều kiện tốt, các bào tử nảy mầm trở thành tế bào vi khuẩn thể hoạt động
B licheniformis có khả năng sản sinh nhiều enzyme, đặc biệt là amylase và
protease ngoại bào Enzyme này phân hủy các chất như carbonhydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn Chúng cũng có khả năng phân hủy các chất phế thải
hữu cơ, tích lũy trong nền đáy ao nuôi, làm sạch nước B licheniformis có tác dụng
làm giảm COD, H2S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi
Ngoài ra, B licheniformis góp phần ổn định hệ vi khuẩn có ích cho đường ruột,
có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc ưu tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm lẫn gram
dương, nấm gây bệnh Do đó, B licheniformis có khả năng cạnh tranh tốt với các vi
khuẩn gây hại khác Nó còn giúp cải thiện trọng lượng, chuyển hóa thức ăn và giảm bệnh tiêu chảy, tỉ lệ chết non ở vật nuôi
1.2 Ezyme protease kiềm
Proteases là những enzyme phá vỡ liên kết peptit giữa các axit amin của protein
Chúng còn được gọi là enzyme proteolytic Điều rất quan trọng trong việc tiêu hóa là các enzyme phân hủy các protein phức tạp thành các axit amin đơn giản hơn
Protein kiềm được sản xuất bởi một loạt các vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men, actinomycetes vv Proteases có 6 nhóm, protease serine, protease threonine, Protease cysteine, protease aspartate, và các kỹ thuật tổng hợp kim Trong
vi khuẩn, enzym protease được sản xuất chủ yếu là Bacillus licheniformis,
B.horikoshii, B.sphaericus, B furmis, B alcalophilus, B Subtilis.
Protease kiềm của Bacillus licheniformis có đẳng điện bằng 11, khối lượng phân
tử 20.000 – 30.000 dalton Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng
pH rộng 7-12
Protease được sử dụng nhiều nhất trong các lĩnh vực như :
Ngành công nghiệp thực phẩm: Protease enzyme được sử dụng rộng rãi trong làm mềm thịt, tăng hương vị cho thịt, sản xuất nước tương, phomat,
Y học: chế phẩm có chứa protease có thể dùng để chữa bệnh tắc nghẽn động mạch biên, chữa bệnh khó tiêu hóa, chữa bệnh ngoài da,…
Trang 4 Ngành công nghiệp dệt may: protease được dùng để làm sạch tơ tằm , tẩy
tơ nhân tạo để được đánh bóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thủy phân lớp serisin làm bết dính các các sợi tơ tự nhiên làm bong và tách rời các sợi tơ tằm,
do đó làm giảm hóa chất để tẩy trắng
Ngành công nghiệp da: chất quan trọng nhất của da là collagen, dưới tác dụng của protease, các chất nhờn được tách ra , một số liên kết sợi collagen bị phá hủy Kết quả là da thu được có độ mềm nhất định Enzyme se tách cá chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn, loại
bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định Chất tẩy rửa: protease có tác dụng tẩy rửa các vết bẩn như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu,… và chỉ có hoạt tính trong dung dịch lọc Enzyme có tác dụng như sau khi ở trong chất tẩy rửa:
Trang 5 Giúp tăng hiệu quả của việc giặt tẩy
Giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh
Giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt rửa cao
Giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzyme là chất có thể phân hủy sinh học
2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Môi trường nuôi cấy
Nồng độ các thành phần của môi trường thực sự quan trọng vì chúng là công cụ cho thiết kế môi trường sinh học Môi trường nuôi cấy vi sinh vật với tất cả các yếu tố thiết yếu cho sự phát triển của vi sinh vật Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp tất
cả các thành phần tế bào của chúng từ các nguồn carbon và nitơ Tuy nhiên, hầu hết các vi sinh vật đều cần một số lượng vi chất dinh dưỡng (như axit amin, các nguyên tố
vi lượng, vitamin, vv) Các điều kiện nuôi cấy để thúc đẩy sản xuất enzyme như proteases khác biệt đáng kể so với điều kiện nuôi cấy tăng sinh tế bào Do đó tối ưu hóa thành phần môi trường là cần thiết để tế bào tăng trưởng tối ưu và hình thành sản phẩm
2.1.1 Nguồn Carbon
Glucose thường được sử dụng trong các quá trình sinh học để sản xuất protease Nâng cao sản lượng của alkaline proteases với sự có mặt của nhiều loại đường như lactose, maltose, sucrose và fructose Tuy nhiên, khi các thành phần này ở nồng độ cao gây ra một sự ức chế trong tổng hợp protease Trong thực tiễn thương mại, nồng độ carbohydrate cao đã làm giảm hoạt động sản xuất enzyme Do đó, carbohydrate được thêm vào hoặc liên tục trong quá trình lên men để bổ sung khi thành phần cạn kiệt và giữ cho khối lượng ở mức ổn định Whey, một phụ phẩm thải của ngành công nghiệp
sữa có chứa lactose và muối chính là cơ chất tiềm năng cho việc sản xuất alkaline
proteases Tương tự, sự tiết ra alkaline proteases cực đại đã được quan sát thấy với sự
có mặt của cellulose tinh khiết như nguồn carbon chính Các axit hữu cơ khác như acid acetic, axetyl axetat và citric acid hoặc natri citrate đã chứng minh làm tăng sản xuất protease ở pH kiềm
2.1.2 Nguồn nitrogen
Hầu hết các vi sinh vật có thể sử dụng cả dạng vô cơ và hữu cơ của nitơ cần thiết
để sản xuất axit amin, axit nucleic, protein và các thành phần tế bào khác của thành tế bào Akaline protease có chứa 15,6% nitơ và sản phẩm của nó phụ thuộc vào sự sẵn có của cả nguồn carbon và nitơ trong môi trường Các nguồn nitơ phức tạp thường được
Trang 6Thiết kế bể phản ứng
sử dụng để sản xuất alkaline protease Yêu cầu bổ sung nitơ xác định khác với cơ thể sinh vật Sự tổng hợp enzyme được tìm thấy là bị ức chế bởi các nguồn nitơ chuyển hóa nhanh như axit amin hoặc nồng độ ion amoni trong môi trường Tuy nhiên, không
có sự ức chế trong hoạt động protease được tìm thấy trong sự hiện diện của muối amoni
Sự gia tăng sản xuất protease cũng được quan sát thấy khi có sunfat amoni và kali nitrat Tương tự, natri nitrat (0.25%) được cho là kích thích cho sản xuất alkaline protease Sự thay thế natri nitrat trong môi trường cơ bản với ammonium nitrate làm tăng sản xuất enzyme Ngược lại, một số báo cáo đã chứng minh việc sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ d n tới sản xuất enzym cao hơn các nguồn nitơ vô cơ Bột đậu nành cũng được báo cáo là nguồn nitơ thích hợp để sản xuất protease Thêm vào đó, bằng cách sử dụng hydrolyzate axit của đậu tương thay cho đậu nành thông thường, tăng 3 lần hoạt tính của enzyme Cao chiết bắp (CSL) được tìm thấy là một nguồn nitơ rẻ và thích hợp bởi một số công nhân Ngoài việc phục vụ như một nguồn nitơ, cao chiết bắp cũng cung cấp một số vi chất dinh dưỡng, vitamin và các yếu tố thúc đẩy tăng trưởng Tryptone và casein cũng là nguồn cung cấp nitơ tuyệt vời để sản xuất protease Một số hợp chất amin đã được chứng minh có hiệu quả trong việc sản xuất các enzyme ngoại
bào bởi Bacillus sp Tuy nhiên, glycine dường như có tác động ức chế lên sự sản sinh
protease Axit Casamino cũng được tìm thấy để ức chế sản xuất protease
2.1.3 Ion kim loại và muối
Các ion kim loại hóa trị hai như canxi, coban, đồng, bo, sắt, magiê, mangan, và molybden được yêu cầu trong môi trường lên men để sản xuất tối ưu các alkaline protease Tuy nhiên, yêu cầu đối với các ion kim loại cụ thể phụ thuộc vào nguồn của enzyme Kali phosphate đã được sử dụng làm nguồn phosphate trong hầu hết các nghiên cứu Điều này đã cho thấy là có sự tác động của đệm trong môi trường Phosphate ở nồng độ 2 g/l được tìm thấy là tối ưu cho việc sản xuất protease Tuy nhiên, lượng vượt quá nồng độ này cho thấy sự ức chế sự phát triển của tế bào và sự ức chế trong quá trình sản xuất protease Hơn nữa, việc bổ sung muối, natri clorua và ion phosphate đã được sử dụng như là chất gây cảm ứng cho sự bài tiết protease Do hoạt động đệm, các ion phosphat có thể làm ổn định pH của môi trường lên men (pH homeostasis) mà gián tiếp sẽ kích thích việc tổng hợp protease Trước đó đã được xác lập rằng vi khuẩn sử dụng các hệ thống vận chuyển dung môi có natri để sống sót và thích ứng với môi trường pH cao Cũng có báo cáo rằng sự phát triển của Bacillus sp được điều chỉnh bằng gradient natri Do đó ion natri là cần thiết cho quá trình sinh lý
và trao đổi chất của vi khuẩn như độ pH homeostasis và tổng hợp ATP
Trang 72.2 Thiết bị lên men
Hình 1: Bể phản ứng lên men
Phần chính của thiết bị là một thùng lên men được làm bằng thép không gỉ để tránh sự ăn mòn mạnh của muối và acid có trong môi trường Bề mặt có độ bóng cao,
để vi sinh vật không có điều kiện thuận tiện để bám lên bề mặt Chiều cao các nhấp nhô phải bé hơn 0,6 μm Thùng kín và thường hoạt động ở áp suất lớn hơn áp suất khím Thùng kín và thường hoạt động ở áp suất lớn hơn áp suất khí quyển để ngăn không cho không khí xâm nhập, tránh bị lây nhiễm Bên ngoài thùng có một lớp áo nước để gia nhiệt, làm nguội và điều hòa nhiệt độ cho thùng Để đảm bảo cho các thành phần trong thùng đồng đều, bố trí động cơ kéo cánh khuấy bên trong thùng Trên trục cánh khuấy thường có bộ phận phá bọt Phía dưới thùng có cơ cấu sục khí với nhiều lỗ nhỏ
Ở trường hợp hệ lên men hiếu khí (aerobic fermenter), thì một bộ phun lỗ đơn (single orifice sparger) hoặc một bộ phun vòng được sử dụng để sục khí cho hệ lên men Bộ phận phun được đặt ở vị trí giữa cánh khuấy cuối cùng và đáy của vessel
Độ pH trong hệ lên men có thể được duy trì bằng cách dùng dung dịch đệm hoặc
bộ điều chỉnh pH (pH controller) Nhiệt độ được điều chỉnh bằng hệ thống gia nhiệt và làm lạnh tự động
Trang 8Thiết kế bể phản ứng
2.2.1 Các dòng vật chất:
Hình 2: Mô hình bể phản ứng
Thùng lên men có lắp một số đường d n để đưa vật chất vào thùng hay ra khỏi thùng Ta có thể kể các dòng chính sau (các số hiệu tương ứng với số trên hình 2) 1: Đưa canh trường vào thùng
2: Đưa dưỡng chất & cơ chất vào thùng
3: Đưa dịch lên men ra khỏi thùng
4: Đưa khí vào thùng
5: Đưa khí ra khỏi thùng
6: Đưa dung dịch axit hay kiềm vào thùng để điều chỉnh pH cho môi trường lên men
7: Đưa nước hay hơi nước vào và ra thùng để gia nhiệt, làm lạnh hay điều hòa nhiệt độ cho môi trường lên men
8: Đưa hơi nước vào thùng để thanh trùng hay tiệt trùng rồi sau đó d n nước ngưng ra khỏi thùng Thông thường các đường ống này được nối với hệ thống CIP (Clean In Place) hay SIP (Sterilization In Place)
9: Dùng để lấy m u để theo dõi hay kiểm tra M u này có thể được đưa trở lại thùng lên men hay không
Trang 92.2.2 Đo lường trong thiết bị lên men
Để cho quá trình lên men luôn hoạt động ở điều kiện tốt nhất, việc đo lường và điều khiển các thông số giữ một vai trò rất quan trọng Hình 1 trình bày một số cảm biến và dụng cụ đo Chức năng của chúng được tóm tắt như sau :
KT: Xác định thành phần khí thoát khỏi thùng,
N: Đo vận tốc quay của cánh khuấy,
V: Đo mức của dịch lên men, qua đó ta có thể xác định được thể tích của dịch lên men,
X: Đo hàm lượng sinh khối khô,
T: Đo nhiệt độ môi trường lên men,
pH: Đo pH của dịch lên men,
Oxy: Đo hàm lượng oxy hòa tan trong dịch lên men,
LL: Đo lưu lượng dòng khí vào thùng
Thông thường các cảm biến hay dụng cụ này sẽ, một mặt nối với cơ cấu hiển thị, nhưng mặt khác lại nối với các cơ cấu điều khiển tương ứng để giữ cho thông số có liên quan ở giá trị tốt nhất
Trang 103 TÍNH TOÁN VÀ KẾT QUẢ
3.1 Công thức
Từ những thông số tối ưu trên ta sẽ tính toán, thiết kế bể phản ứng sản xuất protease
kiềm từ Bacillus licheniformis với công suất (nhà máy) 200 tấn/năm Áp dụng một số
công thức sau:
- Yp/x = Hoạt lực enzyme
=HLE
( )
Khối lượng sinh khối
- U là đơn vị hoạt lực: 1 U = 1 µg Tyrosine trong điều kiện phòng thí nghiệm
Thời gian làm việc trong năm
Thời gian 1 mẻ
- Thời gian 1 mẻ = Thời gian nuôi cấy + thời gian nghỉ giữa các mẻ
- Các thông số của bể như thể tích, đường kính, chiều cao bể và cánh khuấy được tính như sau:
Trang 11Hình 3: Sơ đồ thùng lên men và cơ cấu cánh khuấy
Thể tích bể: V= H x 4D2
Chiều cao bể: H = ( 2-3 ) x D
Đường kính cánh khuấy: d = ( 0,3 – 0,5) x D
Khoảng cách đáy và đầu cánh khuấy: h = (0,5- 1,5 ) d
Số cánh khuấy trên trục tùy thuộc vào chiều cao của bể, khoảng cách giữa các cánh khuấy xấp xỉ với đường kính cánh khuấy
Chiều rộng vách ngăn: b = 0,1 D
Số tấm chắn phụ thuộc vào đường kính của thùng
3.2 Các thông số tối ưu cho quá trình lên men
Nhiều nghiên cứu trước đây của các nhà khoa học, đã tìm được những điều kiện tối ưu nuôi cấy Bacillus licheniformis cho việc sản xuất protease kiềm tối đa Dựa vào các nghiên cứu đó nhóm đã chọn một số thông số cho việc thiết kế bể phản ứng như sau:
- Nhiệt độ trong bể luôn giữ ở 37oC
- pH là 7.7
- Kiểu nuôi cấy: lên men hiếu khí, nuôi cấy chìm có cánh khuấy
- Thời gian nuôi cấy cho 1 mẻ là 72h
- Tốc độ của cánh khuấy 200 vòng/phút
- Tốc độ sục khí là 3m/s
- Nồng độ cơ chất casein là 20 g/l
- Yp/x = 119 U/mg
- Nồng độ sinh khối sau lên men 25 g/l
Trang 12Thiết kế bể phản ứng
3.3 Tính toán
Với công suất 200 tấn/ năm với một sản phẩm được bán trên thị trường trên tập đoàn Alibaba có hoạt lực enzyme là 200.000 U/g, tức là với 1 g bột enzyme sẽ có 200.000 U
Có 200 x 106 x 200.000 = 4 x 1013 U HLE = 4 x 1013 U
Hình 4: Chế phẩm enzyme Alkaline protease thương mại
Giả sử:
Hiệu suất của toàn bộ quá trình từ khi nuôi cấy đến thu nhận enzyme là 90 %
Một năm làm việc 330 ngày
Thời gian nghỉ giữa các mẻ là 10h
Ta có:
- Số mẻ lên men trong một năm = 330 x 24 = 96,6 mẻ số mẻ cần thực hiện là 97 72+10
mẻ
- Lượng hoạt tính một mẻ = 4 x 1013 x 100 = 4,582 x 10 11 U
97 90
- Yp/x =
Khối lượng sinh khối = HLE = 4,582 × 10 11 = 3,85 x 109 mg
/ 119
= 3,85 x 106 g
Trang 13154 x 103 L = 154 m3
-Ta có: V = H x 4 D 2 = 154 m 3
Thể tích thực tế của bể gồm có cả phần thể tích của bọt và thể tích chết của bể
khoảng 30% thể tích theo lý thuyết bể V thực tế = 154 + 154 x 0,3 200 m 3 H = 3x D 3D x 4 D 2 = 200 D = 4,4 m H = 3 x 4,4 = 13,2 m
- Đường kính cánh khuấy: d = 0,4 D = 0,4 x 4,4 = 1,76 m
- Khoảng cách đáy và đầu cánh khuấy: h = d = 1,76 m
- Chiều dài của trục cánh khuấy: 13,2 – 1,76 = 11,44 m
- Số lượng cành khuấy trên trục là 3
- Chiều rộng tấm chắn: b = 0,1 D = 0,1 x 4,4 = 0,44 m
- Số tấm chắn là 4
Tính tốc độ truyền oxi
- Col* : nồng độ oxi bão hòa
- Cols : nồng độ oxi hòa tan tại 1 thời điểm
- KtA :khối lượng oxi lỏng chuyển hóa trong 1 giờ
- OTR (oxygen transfer rate) :tốc độ truyền oxi
- Ta có công thức:
- OTR = KtA ( Col* - Cols)
- Dựa vào tài liệui , giá trị Col* ở áp suất 1 bar là 0,27 mol m-3
- Lựa chọn Ps / Vt = 2000 W m-3 và vcgs = 0,03 m s-1, giá trị KtA có thể tính như sau:
- KtA = 2,6.10-2 (Ps/Vt)0,4 (vgsc )0.5 = 0,094 s-1
- Nồng độ oxi tại một thời điểm luôn nhỏ hơn nồng độ bão hòa oxi, nằm trong khoảng số mũ lũy thừa của 0.1 mol m-3 và 0.01 mol m-3 s-1, t chọn giá trị 0,1 mol m-3
- Vậy tốc độ truyền oxi :
- OTR = 0,094 (0,27-0,1) =0,01598 mol m-3 s-1
Tính tốc độ sử dụng oxi của tế bào Y x/o
- YX/O Average specific cell yeil on oxygen (g g-1)
- Từ tài liệu ii , ta chọn giá trị OTR max =0.2 mol m-3 s-1
- Ta có: OTR max = KtA C DO
CDO = 0,2/ 0,094 =2,128 mol m-3