TẠO DÒNG PHÂN tử và PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG của ENZYME BERGAPTOL o METHYLTRANSFERASE từ cây BẠCH CHỈ (ANGELICA DAHURICA) và ỨNG DỤNG TRONG sản XUẤT một CÁCH HIỆU QUẢ CHẤT BERGAPTEN TRONG e COLI (shu chin LO, pei en chung và co sh

TẠO DÒNG PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG CỦA ENZYME BERGAPTOL-O-METHYLTRANSFERASE TỪ CÂY BẠCH CHỈ ANGELICA DAHURICA VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT MỘT CÁCH HIỆU QUẢ CHẤT BERGAPTEN TRONG E.COL

TẠO DÒNG PHÂN TỬ VÀ PHÂN TÍCH CHỨC NĂNG CỦA ENZYME BERGAPTOL-O-METHYLTRANSFERASE TỪ CÂY BẠCH CHỈ (ANGELICA DAHURICA) VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT MỘT CÁCH HIỆU QUẢ CHẤT BERGAPTEN TRONG E.COLI (Shu-chin LO, pei-en Chung và Co-shine Wang)

Shu-Chin LO 1,2 ,Pei-En CHUNG 2 , vàCo-Shine WANG 1,*

1 Học việnCông nghệ sinh học, Đạihọcquốc gia ChungHsing, Taichung40.227, Đài Loan

2 SởPhòngHóa họcNông nghiệp, Việnnghiên cứu nông nghiệpĐàiLoan, Taichung41.362, Đài Loan

TÓM TẮT.Bạch chỉ từ lâu đã được sử dụng làm kem dưỡng trắng da, do có chứa hợp

chất 8-hydroxybergapten, là sản phẩm hydroxylate từ chất bergapten nhờ enzyme 5-o-methyltransferase (BMT) phân cắt chất bergaptol trong cây bạch chỉ DNA bổ sung mã hoá BMT được dòng hoá từ rễ cây bằng cặp mồi thoái biến ở vùng chứa mã bảo tồn cao của O-methyltransferase từ những cây khác phân tích RT-PCR đã chỉ ra mảnh đơn DNA phù hợp cho trình tự AdBMT thu được đoạn liên tục 5’ và 3’ nhanh chóng khuếch đại tạo cDNA thông qua phương pháp PCR sử dụng để thu đựơc đoạn cDNA đầy đủ cDNA của AdBMT chứa một ORF dài 1080bp mã hóa cho polypêptide của 359aa và khối lượng

là 39kDa, pI là 5.9 phương pháp sắp gióng trình tự đã tiết lộ sự tương đồng của AdBMT

so với OMTs của những loài khác Đoạn AdBMT chứa vùng bảo tồn I-V tương tự như OMTs của những loài khác Liên kết His-AdBMT được biểu hịên ở E.coli và được làm sạch bằng cách tủa trong ammonium sulfate Đoạn tái tổ hợp của AdBMT hầu hết hoạt động ở trong môi trường có chứa đệm kali phosphate ở pH 7.5 và iử 35độC enzyme không cần ion cofactor hoá trị 2 để hoạt động, mặt khác, nồng độ ion của Cu2+, Ni2+, Co2+ dù chỉ rất thấp (0.1mM) đủ gây ức chế hoàn toàn enzyme Cách sản xuất bergapten đơn giản và hiệu quả là biểu hiện vượt mức AdBMT trong nuôi cấy vi khuẩn E.coli lượng bergapten thu được cao gấp 13 lần lượng hợp chất thu từ sản phẩm làm sạch mảnh

vỡ trong ammoni sulfate Bằng cách bổ sung bergaptol trong môi trường nuôi cấy E.coli

đã hứa hẹn một phương pháp đầy tiềm năng trong việc sử dụng bioreactor để sản xiất bergapten (tìm hình cây bạch chỉ)

Từ khóa:Bạch chỉ; Bergapten; Bergaptol5-O-methyltransferase, nhân bản cDNA, hoạt

động củaenzyme

Viết tắt:BMT,bergaptol5-O-methyltransferase, cDNA, DNA bổ sung;

EDTA,axitethylenedi-aminetetraacetic; IPTG, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside; NTA, axitnitrilotriacetic; OMT,O-methyltransferases; PAGE,điện dipolyacrylamide; RT-PCR, phản ứng chuỗipolymerasesao chép ngược, RACE, khuếch đạinhanh chóngcủa điểm kết thúccDNA; SAM,S-adenosyl-L-methionine, SDS-PAGE, sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, UPLC, siêusắc ký lỏnghiệunăng.

GIỚI THIỆU

Sự Methyl hoá các hợp chất tự nhiên bằng S-adenosyl-L-methionine (SAM) phụ thuộc O-methyltransferases (OMTs) là cách chuyển đổi phổ biến trong các phản ứng tổng hợp trong tự nhiên Trong thực vật, O-methyl hoá cần thiết cho sự tổng hợp furanocoumarin mạch thẳng furanocoumarin được tổng hợp từ con đường phenylpropanoid được xem như một phytoalexin hoặc là sự phòng thủ chống lại vi sinh vật tấn công ((Tietjen et al, 1983;Kueteet al, 2007; Alexandervà cộng sự, 2008) các hợp chất mạch thẳng phong phú của furanocoumarin có thể kể đến là psolaren, bergapten, xanthotoxin và isopimpinellin, tất cả các chất trên đều là các chất có hoạt tính sinh học con đường tổng hợp của các hợp chất furanocoumarin được phát hoạ bởi… mặc dù những nghiên cứu về trình tự mã hoá cho quá trình hydroxyl hoá và O-methyl hoá psoralen để tạo thành chất isopimpinellin vẫn chưa được phát hiện bergaptol được BMT chuyển thành bergapten, tương tự với sự biến đổi OMTs bằng cách xử lý với elicitor của tế bào Ammi majus, và gần đây là với tb nuôi cấy của Glehnia littoralis Vì BMT được biểu hiện chủ yếu trong tế bào nuôi cấy của G.littoralis, người ta cho rằng tế bào nuôi cấy có thể sử dụng như một bioreactor đầy tiềm năng để sản xuất bergapten bằng cách cung cấp psolaren Bergapten hơn nữa đựơc chuyển thành 8-hydroxybergapten có thể ức chế tyrosinase của nấm, sự sức chế đó mạnh hơn cả kojic acid và arbutin – hai chất ức chế tyrosinase được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm trắng da (Piao etal, 2004)

OMT của cây được phân loại thành 2 nhóm lớn (…)

- Nhóm I: gồm các loại OMT có trọng lượng phân tử thấp (13-27kDa), hoạt động phụ thuộc Mg2+

- Nhóm II: gồm các loại OMT có trọng lượng cao (38-43 kDa) và họat động không

cần Mg2+

Hầu hết các OMT đều thuộc nhóm 2 bao gồm acid caffeic, flavonoid, coumarin và alkaloid OMT (Kutchan, 1999; Donget al,

2003), trong đó enzyme BMT thuộc về OMT nhóm II Một số

gene OMT thực vật mã hoá cho toàn thể cấu trúc của OMT chứa

5 vùng bảo tồn, 2 vùng trong đó (I và IV) được cho rằng có liên quan đến sự liên kết với ion kim loại và SAM tương ứng (tìm hình

- Rễ khô của Angelica dahurica (Umbeliferae) tên là bạch chỉ

là một vị thúôc quan trọng trong trung y, nhiều coumarin

được chiết từ rễ bạch chỉ thể hiện tính kháng vi sinh vật (Kwon etal, 1997) Chất 8-hydroxybergapten có bản chất là furanocoumarin có tiềm năng ức chế tyrosinase

từ nấm (Piao etal, 2004) do đó rễ của nó được dử dụng để chữa các chứng bệnh về rối loạn sắc tố trên cơ thể và đựơc ứng dụng nhiều vào ngành công nghiệp mỹ phẩm vì chất 8-hydroxybergapten có tác dụng làm trắng da nên các nghiên cứu hiện nay tập trung định dạng enz BMT từ bạch chỉ để sản suất chất tiền phản ứng bergapten để tạo chất 8hdxbgt làm trắng da Việc nghiên cứu E.coli làm bioreactor

để sản xuất bergapten là cách nuôi cấy tuyệt vời đang được nghiên cứu nhiều hơn cả

Vật liệu và phương pháp

Nguyên liệu thực vật

Vật liệu: cây bạch chỉ Angelica dahurica (Fish.) BENTH Et HOOK đuợc trồng trên

ruộng rễ được thu và đựơc bảo quản lạnh ngay trong nitơ lỏng và tất cả phần vật liệu được sử dụng phải cất trữ ở -80oC

Hình 1 Con đường sinh tổng hợpcủabergaptenvà8-hydroxybergapten

Nhân bản cDNA

Tổng số RNA được phân lập từrễ 3tháng tuổicủaA.Dahurica Những đoạncDNAđược tạo

ra bởiphản ứngphiên mã ngược chuỗipolymerase (RT-PCR) khuếch đạibằngcáchsửdụngmột cặpmồithoái hóađược thiết kế từhai trình tựbảo tồn caocủaOMTsthực vật Mồi5'-(5'-gtg/tgatgttggc/tggtggg/a/cactgga/t-3') nằm trongvùng được bảo vệtrongkhimồi3' – primer (5'-ggg/atgcatcg/t/cc/tca/gac/tg/a/cacgtga/ggg-3') trongvùng được bảo vệIInhư được chỉ ratrong hình 2.Những đoạncDNAtạo rađượcnhân bản vô tínhởpGEM-T Easyvector (Promega, Madison, WI, Mỹ) vàđược sắp xếp theo trình tựđể xác nhậndanh tính của chúng Sự khuếch đại nhanh chóng 2 mạch song

song5'-và 3'- của điểm kết thúc trên cDNA

(RACE) thôngquaphản ứng chuỗi polymerase(PCR)đã được thực hiệntheohướng dẫn sử dụngbộkhuếch đạiRACESMARTTMcDNA(các phòng thí nghiệmCLONTECH,Inc, Mountain View,CA, USA) Trình tự DNAhoàn chỉnh đã đượcxác định từcả hai sợichènnhânbảnvớimộtmáy phân tíchABI3730XLDNA(FosterCity, CA, USA)bởi Sứ mệnhCông ty TNHHMission Biotech(Đài Bắc, Đài Loan) Sự liên kếtchuỗiđượcđạt được bằng cách sử dụngVectorNTISuite 8chương trình (InforMax, Inc, Bethesda, MD, USA) vàtìm kiếmtương đồngđã được thực hiệnvới chương trìnhBLAST(Altschul etal, 1997) Biểu hiện vượt mức AdBMT và động năng chuyển hoá từ bergaptol thành bergapten trong E.coli

Đoạn cDNAAdBMTmã hóakích thước đầy đủbao gồm một mẫuvàmột cặpmồi đặc hiệu

chogenAdBMT-over-f (5 GTCGACCATATGGCAGAAATGAAAACTAG-3)có

chứamộtvị tríSalI, vàAdBMT-over-r (5-G CGGCC GCCTTCGAAAATTCCATAATC-3’)

cóchứamột vị tríNotIđãđượcsử dụng đểkhuyếch đạiPCR MảnhAdBMT1,077bpdo đóđã đượctạo dòngbằng trình tự cắt giới hạnSalI/NotIvào vectorbiểu hiệnpET32a(Novagen, Madison, WI, USA) Saukhixử lývớiNdeI, mảnh6,5kb được tinh lọcvàtự nối lạiđể tạo

plasmid biểu hiện pET32a-AdBMT chứa gene AdBMTvới His-tag tạiđầu C-terminus

PET32a-AdBMTa đã được chuyểnvàoE coliBL21 Saukhibiến nạp,các tế

bàovikhuẩnđược nuôi cấytrong môi trườngLB(1% Bactotryptone, 0,5%chiết xuất từnấm menBacto, và 170mMNaCl, pH 7.0) có chứaampicillin (50 µg/ml)ở 37°Ccho đến khiOD600đạt từ0,6-0,8.Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) sau đó đã đượcthêm vào để chonồng độ cuối cùng1mMvà các tế bàosau đó đượcủ ởđiều kiện nhiệt độkhácnhaucho thêm trong 16 h.các tế bàothu đượcbằng cách ly tâmvà được dùng để tách chiết proteinvà tinh chếenzymehoặchuyền phù trong25mlmôi trườngLBcó chứaampicillin(50mg/ml) và100µMbergaptolvàủthêm24 giờở 25°C.Sau khily tâm, phần nổiđượcsửdụngđể trích xuấtbergaptencho đo bằngphương pháp sắc kýlỏngsiêuhiệu suất (UPLC).Bergaptenthu được đượcchuẩn hóatrên cơ sởcủacácphần bằng nhaucủa các tế

bàovi khuẩn E coli(trọng lượng ướt) Chỉ cóE colimang gene biểu hiện vựơt mức

AdBMT phát triểnở nhiệt độcảm ứngtối ưuđã được thực hiệnđể phân tíchđộng học Thời gianủbệnhkéodàitừ24đến48h (tìm hình vector ET32a,)

Hình 2.Nucleotide và chuỗi amino acid dự

đoáncủacDNA AdBMT xác định từ A.dahurica.(A)Số

lượng của chuỗinucleotidevàchuỗi axit aminđượcchỉ

trongchuỗinucleotidechothấycác codonmở đầu và kết thúc Haimồithoái hóađược chỉ địnhbằng các mũi tên Các tín hiệupolyadenylationđượcgiả địnhbởi gạch chân đôi.Điểm kết thúcdịchmã được đánh dấu bằngdấu hoa thị(B)RT-PCRđược thực hiện trêntổng

số RNAđượcphânlậptừrễA.dahurica. Trình

tựcủaAdBMTđượckhuếch đạibằng cách sử dụng

mộtcặpmồi thoái hóa được chỉ định

sắc ký lỏngsiêu giới hạn (tìm hình về hệ thống này)

Sau khi ly tâm, 5 mldịch nổi được thu nhậnvàtrộnlẫnvới etyl axetat(1 ml)vàly tâm ở16.000vòng trong 2 phút Sau khidư lượngđượchòa tan trongmethanol(0,3 ml), đem

dịch bay hơi trong chân không và thu lấy chất rắn Bergaptolvàbergaptensau đó đượcđotrongcáckhoảng thời gianchỉ địnhbởiUPLC

thốngWatersACQUITYTMUPLC(WatersCrop,Milford,MA,USA)chứa mộtcực góp tự độnglàm mát, một cột chứa thiết bị làm nóngchophépkiểm soát nhiệt độcủa cộtphântíchvàmột đầu dò mẫuphotodiode Mỗi lần tiêm5μlsản phẩmđược hoà tan tronglsản phẩmđược hoà tan trong methanol nạpvàomột cộtBEH(2,1mm ×18 cm, 1,7 μlsản phẩmđược hoà tan trongm)C18vàgiải hấp vớimột hỗn hợpnước/axetonitril(70/30) bằng máy bơmUPLCở tốc độ dòng chảylà 0,25ml/ phút.Cộtđược duy trì trongmột cái lò ở40ºC.Phát hiệnởbước sóng 254 nm Sản phẩm phản ứngđược xác địnhvàđếm số lượngthành 2 bản Bergaptoltinh khiết (Xác thực) (ChromaDex, Inc, Irvine, CA,USA)vàbergapten(Sigma-Aldrich Chemical Co, St Louis,MO,USA)đãđượcsử dụng như lànhững hóa chất tiêu chuẩn Dữ liệu đượcthuthậpvà

xử lý bởiphần mềmsắc kýMassLynx(Waters cây trồng, Milford,MA,USA)

SDS-PAGE và phương pháp miễn dịchthấm

Đối vớiphân đoạnprotein, các tếbàođượcthuthậptừ16°C đượccố địnhtrong200mMđệmkali photphat(pH7,5)cóchứa10mMaxitethylenediaminetetraacetic(EDTA), phá màng bằng sóng âmvàly tâm16.000vòng trong 5phút ở4ºC.Tổngproteintrongnổiđã được trộn lẫnvới

bộ đệmmẫu2x[2% (w/v)sodiumdodecylsulfate (PAGE) và 4% (v/v) 2mercaptoethanol] vàphân đoạn[12%(w/v)SDS-polyacrylamide gel(PAGE) Sau khi điện di, gel đượcnhuộm màu với0,25%xanh CoomassieR-250, 10%acetic acid, và5%ethanoltrong 4 giờ, và khử màuvới axit axetic10% và20%ethanolhoặcelectroblottedlênnitrocellulose(0,45 μlsản phẩmđược hoà tan trongm,SartoriusStedim, Biotech, Goettingen, Germany) Màng tế bàobị chặnở 37°Ctrong 1 giờtrongmột dung dịch chứa10 mMTris-HCl, pH7,5, 0,05%Tween-20, 150 mM NaClvà5%sữa bộtkhông có chất béo.Màng đượcủ vớikháng thể khángHis-tag với pha loãng1:1,000trong 2 hở 4°Csau đómàngđượcrửa sạch, ủ với kháng thểthứ cấpphosphataseliên hợpkiềmtrong1 h ở4°C.Các điểm củaphức hợpkháng nguyên-kháng thể hiện màu lên bởi sự phân tách bởialkaline phosphatasevới cơ chấtphosphate5-bromo-4-chloro-3 indolylvà nitrobluetetrazoliumtrong một bộ đệmcarbonate(100mMNaHCO3, 1 mMMgCl 2, pH9,8) Nồng độ proteinđượcxácđịnhtheoBradford(1976)vớitiêu chuẩn của albuminhuyết thanh bò (chả biết làm chi??)

Tinh chế enzyme vàthử hoạt tính

Để tinh sạch enzyme, các tế bào thu thập từ 16°C được cố định trong 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) có chứa 10 mM axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA), phá màng bằng sóng âm và ly tâm 16.000 vòng trong5 phút ở 4°C vì cột Ni-nitrilotriacetic

acid (NTA) không thích hợp cho tinh chế BMT (Hehmann et al, 2004) nên tổng số protein trong dịch nổi được phân đoạn bằng sự tủa ammonium sulfate mà từ đó phầnprotein được thu thập ở độ bão hòa 40-50% Protein trong phân đoạn này được hòa tan trong 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) và khử muối qua cột PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) Protein phân đoạn ammonium sulfate được tiếp tục cô đặc bởi centricon-30 (Millipore, Billerica, MA, USA) và nồng độ của nó đã được xác định Mỗi phần nhỏ phải chịu sự thử nghiệm tính của enzyme

Khảo nghiệm hoạt tính củaBMT (EC 2.1.1.69) như 1 báo cáo trước đó (Hehmann et al, 2004) với một số sửa đổi Một cách ngắn gọn, hoạt tính củaBMT trong ống nghiệm được

đo thường xuyên ở 35oC trong một thể tích 200 μlsản phẩmđược hoà tan trongl đệm có chứa mM 200 phosphate kali,

pH 7,5, 1,25 mM bergaptol như một chất nền (Indofine Chemical Co, Somerville, NJ, USA), và 9,6 μlsản phẩmđược hoà tan trongg protein tinh khiết tương ứng với hoạt động của 2,0 nkat BMT (hoạt động

cụ thể 0,21 kat/kg) Phản ứng được bắt đầu với việc bổ sung của SAM (5 mM) và chấm dứt sau 90 phút ủ bằng cách thêm 30 μlsản phẩmđược hoà tan trongl HCl 1N Hỗn hợp phản ứng được chiết xuất với etyl axetat (0,5 ml) và ly tâm 16.000 vòng trong 2 phút Lớp hữu cơ được thu thập và bốc hơi trong chân không sau đó, dư lượng đã được hòa tan trong methanol (0,3 ml) Sản phẩm phản ứng (bergapten) sau đó đã được xác định và đếm số lượng sử dụng UPLC ở

cả 2 bản Các chiết xuất của các tế bào với vector trống đã được sử dụng như một điều khiển thụ động

pH và nhiệt độ tối ưu và yêu cầu kim loại của AdBMT

Độ pH tối ưu cho hoạt động của enzyme được xác định bằng ủ ở 35°C trong 90 phút trong các hệ đệm khác nhau (200 mM), giữa 4,0 và 10,0 (acetate, pH 4,0-5,5; phosphate,

pH 5,5-9,0; Tris-HCl, pH 7,0 -8,5; cacbonat, pH 8,5-10,0) Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme được xác định từ 16°C và 42°Ctrong 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) trong 90 phút Ảnh hưởng của các ion kim loại khác nhau ở nồng độ 0,1 và 1,5 mMlên hoạt động của enzyme được xác định ở 200 mM đệm phosphate kali (pH 7,5) ở 35°C trong 90 phút Việc bổ sung 5.4 mM EDTA trong bộ đệm đã được sử dụng như một điều khiển Ba thí nghiệm độc lập trong bản sao đã được thực hiện để phân tích mỗi trường hợp

Phản ứng được khảo nghiệm trong điều kiện trong đó sản phẩm hình thành tuyến tính cho

cả 2 thời gian (15-120 phút) và nồng độ của protein tinh khiết (1,8-16 μlsản phẩmđược hoà tan trongg) Rõ ràng giá trị

Km và Vmax được xác định bởi các lô Lineweaver-Burk bằng cách sử dụng khoảng 9,6 μlsản phẩmđược hoà tan trongg chiết xuất protein khử muối và sự điều chỉnh của một quá trình pha loãng nối tiếp của các chất nền cả bergaptol (0,625 ~ 7 mM) và SAM (1,25 mM ~ 7,5 mM) trong phản ứng enzyme như mô tả ở trên

Các kết quả

Tạo dòng và đặc tính củacDNABMTtừ Bạch chỉ

Để có được cDNABMTtừ Bạch chỉ, RNA tổng sốđượcphânlậptừrễđược sử dụnglàm khuôn Một cặpmồithoái hóaoligonucleotideđược thiết kếtừ các vùngbảo tồn caocủa chuỗiBMTthực vật khácnhư đãtrình bàytrongHình2A Sửdụngkhuyếch đại RT-PCR, một

dảiduy nhất củađoạn DNA107bptương ứng vớitrình tựAdBMTthu được(Hình2B) Bởi

vìkích thướccDNAchỉ làmột phần,phương pháp5’ - và3’-RACE PCRđược sử dụngđể có

đượctoàn bộ chiều dài1.259bpcDNAAdBMT(accession no JN585954) ngoại

trừđuôipoly(A)

cDNAAdBMTchứamộtkhung đọcmở 1080bpmã hóa mộtpolypeptide359axit

amin(Hình2A) vớimột khối lượng phân tử đượctính toánlà 39kDavàpIlà 5,9.Đánh giáhồ sơthủy liệu phápcủanó(Kyte vàDoolittle, 1982) chothấyrằngpolypeptideAdBMTkhông cómột vùngkỵ nướcmạnhmẽgầnđầu N-terminus, có thể chỉ rasự vắng mặt củamột tín hiệupeptide(dữ liệukhông hiển thị) Trongvùng 3’ không được dịch, mộtbiến thể AATAACvà2 môtiftương đồng giả địnhAATAAAcủapolyadenylationđược đặttại vùng thượng nguồn130, 113, và102bptừvị trí củapolyadenylation

Chuỗi axit amin được dự đoán củaAdBMTđãđượcsử dụng đểtìmkiếmcơ sở dữ liệuprotein.

Chuỗiliên kếttiếtlộrằngpolypeptideAdBMT,trong đó tất cảnăm vùngđược bảo tồnIV(Ibrahim etal, 1998) đã được tìm thấy, chiasẻ28%-91% sự tương đồngvớiOMTsthựcvật và xác địnhít nhất là đối vớiOMTcủa người(13%) (Hình 3) AdBMTthể hiệnsự tương đồng vềtrìnhtựcao vớiGlBMT(91%giống nhau)vàAmBMT(84%giống nhau) Vùng I vàIVđãđược chứng minhbởinhiễu xạ tia Xđểđược tham gia vàoSAMvàliên kết kim loạitương ứng (Vidgren etal, 1994) Ngoàiký tựphổbiếncủa các vùngbảo tồncao(vùng IV)đặctrưngchoSAM-phụthuộcvàoOMTs, các motifA và Bđược xem xét đểchi phối cácđặc trưngchất nền (Joshi vàChiangnăm 1998; Schröder etal, 2002)

Hình 3.Liênkết amino acid của chuỗiproteinAdBMTvớicácBMTskhácvà các proteinliên

quan đếnOMT Một dấu gạch ngangtrong chuỗichỉramột khoảng trốngđượcđưa rađể duy trìsự liên kếttốt Năm vùngbảo tồn cao(vùng I-V)được kí hiệu bằngmột khung Các motif

A và Bđược ký hiệu bằngmột gạch dưới Hai BMTslàGlBMT(AB363638), một bergaptolO-methyltransferase Glehnialittoralis, và AmBMT(AY443006), một bergaptolO-methyltransferase MajusAmmi.Các protein liên quan

đếnOMTbaogồmAtOMT(NM_124796), quercetin3-O-methyltransferase của Arabidopsis