Sự tái sinh trong in vitro của hypericum preforatum l sử dụng thidiazunron và phân tích ổn định gene tái sinh

Đánh giá ổn định gen của cây tái sinh đang phát triển có sự hiện diện TDZ sử dụng RAPD và PCR-PFLP.2.. Trong tái sinh cây con.Vùng hạ diệp của cây con nuôi cấy trên môi trường MS với 3

SỰ TÁI SINH TRONG IN VITRO CỦA HYPERICUM PREFORATUM L SỬ

DỤNG THIDIAZUNRON VÀ PHÂN TÍCH ỔN ĐỊNH GENE TÁI SINH.

Arpita Banerjee, Subhendu Bandyopadhyay and Sarmistha Sen Raychaudhuri.

Plant Tissue Culture and Molecular Biology Laboratory Department of Biophysics, Molecular Biology and Bioinformatics

University of Calcutta, Kolkata 700 009, India

Received 7 August 2010; revised 21 December 2010; accepted 12 February 2011

• Hypericum preforatum L có khả năng chống vi rút, chống bị

nhiễm, chống ung thư, và chống suy nhược

• Sống ở vùng có độ cao 1000 – 2500m.

1 Hypericum preforatum L

Đánh giá ổn định gen của cây tái sinh đang phát triển có sự hiện diện TDZ sử dụng RAPD và PCR-PFLP.

2 Mục tiêu.

 Khảo sát tác dụng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong quá trình tái sinh H preforatum

Trong tái sinh cây con.

Vùng hạ diệp của cây con nuôi cấy trên môi

trường MS với 3% sucrose từ hạt giống.

Mô lá được cô lập từ một phần ngẫu nhiên của cây mẹ và 10 cây tái sinh trong môi trường MS bổ sung 1 mg/l TDZ

Trong phân tích ổn định gen.

2 Phương pháp và vật liệu.

 vật liệu:

Tạo

mô sẹo:

Với 5 lần lặp lại và toàn bộ thí nghiệm làm 2 lần Sau 4 lần cấy chuyền, mô sẹo được chuyển sang môi trường tạo chồi

 Trong phân tích ổn định gen:

Phân tích đa hình bằng kỹ thuật PCR-RAPD:

25µl {1x PCR dung dịch đệm, 2 mM MgCl2, 0,2 mM hỗn hợp dNTP, 0,2 mM RADP primer và 0,5 U Taq DNA polymerase

và 25 ng mẫu H preforatum }

94oC trong 5 phút 94oC trong 1 phút 36oC trong 1 phút 72oC trong 2 phút 72oC trong 5 phút

45 chu kỳ

Điện di trên agar 1.5 % trong 1 x TAE đệm Và ethidium bromide làm thuốc nhộm phát huỳnh quang

Phân tích ITS:

Khuếch đại bằng PCR

98oC trong 2 phút94oC trong 1 phút58oC trong 30 giây72oC trong 1 phút72oC trong 5 phút

35 chu kỳ

25 µl {dung dịch hỗn hợp đệm gồm 1x PCR phản ứng đệm, 2 mM MgCl2, 0,1 mM hỗn hợp dNTP, 5 mM primer và 1.0 U

Taq DNA polymerase và 25 ng mẫu DNA }

Tinh chế PCR-Clean up kit

Cắt bởi enzyme (REs): EcoRV, ClaI và HpaII

Phân loại sản phẩm bằng điện di trên gel Agar 2% với dòng điện 65V, phẩm màu ethidium bromide và chụp ảnh lại.

h từ cảm ứng với 1 mg/L TDZ

đã được nhân lên g

ắn vào

vector pTZ57R / T bằ

ng cách

sử dụ

ng I

ns T/AcloneTMPC

R Cloni

ng K

it biến nạp v

ào E.co

li XL1-

Blue

•

Chọ

n dòng nhân lên v

à ti

ến hành tách chiết DN

A plasmid

•

Xác định trình

tự bằng các

h sử dụ

ng m

áy phân tích trìn

h tự tự độ

ng ABI3130 và m

ồi M13

Nhân dòng và trình tự của vùng ITS:

Tạo mô sẹo Tạo chồi

4 Kết quả:

 Cây tái sinh trong in Vitro.

Tỷ lệ cytokinin/auxin cao ảnh hưởng đến tăng trưởng mô sẹo

TẠO RỄ

Mô sẹo tăng trưởng cao nhất đã được quan sát trong môi trường có chứa 0,5 mg/ L 2,4-D và 1 mg/L Kn

1 mg/l TDZ được chứng minh là PGR tốt nhất trong số các nồng độ để tạo chồi

Tạo rể 2 mg/l IAA là nồng độ hiệu quả nhất, theo sau 4 mg/l IAA

 Nghiên cứu tính ổn định di truyền.

RAPD ( random aplified polymorphic DNA): kĩ thuật khuếch đại ngẫu nhiên đa hình DNA

RFLP ( restriction fragment length polymorphism): kĩ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài đọan DNA dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn

Enzyme cắt giới hạn (REs) EcoRV, ClaI và HpaII.

Vùng nrITS ( nuclear ribosomal internal transcribed spacer) ( bao gồm vùng ITS1, 5.8S và ITS2) là vùng gen dùng cho sự phân loại các cấp loài thậm chi trong loài bởi cấp độ cao của biến dị

Mồi dùng cho RAPD : mồi xuôi 17SE (5’ ACG AAT TCA TGG TCC GGT GAA GTG TTC G 3’) và mồi ngược 26SE (5’ TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C 3’)

*Phản ứng khuếch đại RAPD

15 đoạn mồi RAPD sử dụng khuếch đại DNA cây

mẹ và các cây tái sinh từ môi trường bổ sung 1 mg/l TDZ được chọn ngẫu nhiên

* Phân tích ITS

Toàn bộ vùng nrITS,bao gồm ITS1, 5.8S và ITS2, đã được khuếch đại bằng cách sử dụng mồi 17SE và 26SE, mỗi đoạn có kích thước khoảng 930 bp Chiều dài vùng nrITS của cây mẹ và cây tái sinh được so sánh không khác nhau(Hình b)

Sử dụng PCR-RFLP để phân tích vùng nrITS.

Sử dụng các enzyme cắt giới hạn:

• EcoRV

• HpaII

• ClaI

BLAST cho thấy sự tương đồng giữa hai

trình tự là 99%

Nucleotides từ cả hai mẫu cũng cho thấy tương đồng gần như hoàn hảo vùng ITS1 và ITS2 trong quá trình phân tích trình tự bằng CLUSTAL W (Hình a & b)

Vùng nrITS ( bao gồm vùng ITS1, 5.8S và ITS2) là vùng gen dùng cho sự phân loại các cấp loài thậm chí trong loài bởi cấp độ cao của biến dị nên được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu biến dị thậm chí trong các loài gần nhau.

Trong nghiên cứu hiện nay, sự khuếch đại và PCR-RFLP vùng nrITS của cây mẹ và cây tái sinh với 3 enzyme cắt giới hạn

EcoRV, ClaI và HpaII, tạo ra 1 chuỗi mẫu.

Phân tích chuỗi đa hình bằng CLUSTAL W của cây mẹ và cây tái sinh cũng cho thấy tính tương đồng trong vùng ITS1 và ITS2

Sử dụng các kĩ thuật RAPD và RFLP đối với vùng nrITS cho thấy không có sự khác nhau trong gen của cây mẹ và cây tái sinh.

Phân tích chuỗi đa hình bằng CLUSTAL W cho thấy sự tương đông trong vùng ITS1 và ITS2 của cây mẹ và cây tái sinh

→ Chứng minh sự bền của DNA trong cây con tái sinh

Kết luận

Click icon to add picture

Tài liệu tham khảo:

Arpita B, Subhendu B & Sarmistha S R, 2011 In vitro regeneration of Hypericum perforatum L using thidiazuron and

analysis of genetic stability of regenerants

Cám ơn thầy và các bạn đã theo dõi.

The end