Arabidopsis có một số yếu tố điều hòa phiên mã CO Một số yếu tố điều hòa phiêm mã CO GIGANTI GI FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX 1 FKF1 RED RED FAR-INSENSITIVE 2 RFI2 LONG V
Trang 1Sự kiểm soát biểu hiện của nhân tố kích hoạt phiên mã Flowering BHLH (basic helix– loop–helix) của gen CONSTANS (CO) điều
hòa quang kỳ ra hoa ở Arabidopsis
Trang 2I Tổng quan
SỰ HÌNH THÀNH HOA
1 Định nghĩa: Sự hình thành hoa là dấu hiệu của sự chuyển tiếp từ giai đoạn sinh dưỡng sang giai đoạn sinh sản
2 Các giai đoạn hình thành hoa
Sự chuyển tiếp ra hoa
Sự tượng hoa
Sự tăng trưởng và nở hoa
3 Các yếu tố ảnh hưởng
Các yếu tố chính tác động đến giai đoạn cảm ứng hình thành hoa bao gồm: nhiệt độ và quang kỳ
Trang 3Đặt vấn đề:
Ở Arabidopsis: sự dịch mã mRNA của gen CO dẫn đến hoạt hóa một số gen khởi phát sự ra hoa như FT khởi phát sự tượng hoa
Điều hòa phiên mã của gen CONSTANS (CO) và điều hòa dịch mã của protein CO là những cơ chế rất quan trọng để đo đúng độ dài ngày trong quang kỳ ra hoa.
Arabidopsis có một số yếu tố điều hòa phiên mã CO
Một số yếu tố điều hòa phiêm mã CO
GIGANTI (GI)
FLAVIN-BINDING
KELCH REPEAT
F-BOX 1 (FKF1)
RED RED FAR-INSENSITIVE 2 (RFI2)
LONG VEGETATIVE PHASE 1 (LOV1)
FIONA1 (FIO1)
LIGHT-REGULATED WD1 (LWD1)/2 và các proteins CYCLING DOF FACTOR (CDF)
FLOWERINGBHLH1 (FBH1), FBH2, FBH3 và FBH4
trong các yếu tố điều hòa phiên mã trên, ta tập trung và 4 nhân tố khởi đầu phiên mã gen
CO là FBH1, FBH2, FBH3, FBH4
FBH là 1 protein có cấu trúc xoắn vòng xoắn, nhân tố mà ưu tiên liên kết với yếu tố cis E-box ở promoter CO
E-box là vùng trình tự nằm ở vị trí ngay điểm khởi đầu phiên mã, khi protein FHB gắn vào thì khởi sự phiên mã CO
Trang 4II Đối tượng nghiên cứu
Giống hoang dại Arabidopsis thaliana.
Các giống đột biến: fbh
Trang 5III Mục đích thí nghiệm:
Khảo sát ảnh hưởng của BHLH điều hòa quang kỳ ra hoa ở Arabidopsis
Trang 6IV Kết quả thí nghiệm
1 Thí nghiệm 1: chứng minh FBH1 và FBH2 là 2 nhân tố gắn vào promoter cảu gen CO ở vị trí E-box
ở hình 1A, người ta tiến hành 3 nghiêm thức, lấy 3 đoạn trình tự ở vùng
promoter của gen CO với độ dài lần lượt là:
- Từ -509 đến -1 ( có chứa 3 vùng E-box và 1 G-box)
- Từ -288 đến -1 ( có chứa 1 vùng E-box và 1 G-box)
- Từ -196 đến -1 ( có chứa 1 vùng G-box)
Sau đó tiến hành đo sự biểu hiện của 2 nhân tố FBH1 và FBH2
Kết quả cho thấy sự biểu hiện của FBH1 và FBH2 cao nhất ở đoạn tirn2h tự có
3 vùng E-box, kế đến là đoạn trình tự có 1 vùng E-box thì sự biểu hiện ít hơn,
và vùng trình tự chỉ có 1 vùng Gbox thì gần như không có sự biểu hiện của 2 nhận tố FBH1 và FBH2
Ta có thể kết luận rằng: FBH1 và FBH2 là 2 nhân tố liên kết với promoter của gen CO tại vị trí E-box
Để cũng có thêm kết quả này người ta tiến hành thêm 1 thí nghiệm như hình 1B Người ta cũng làm tương tự như ở hình A nhưng chỉ với 2 nghiêm thức
- 1 đoạn trình tự có 4 vùng E-box
- 1 đoạn trình tự bị đột biến mất 4 vùng E-box này
Kết quả cho thấy ở trình tự có 4 vùng E-box thì có sự biểu hiện mạnh của FBH1 và FBH2 và ở trình tự bị đột biến mất 4 vùng E-box thì gần như không
có sự biểu hiện của 2 nhân tố này
Dẫn đến 1 kết luận sau cùng cho thí nghiêm 1 này: FBH1 và FBH2 liên kết với promoter của gen CO tại vị trí E-box
Trang 72 FBH1 và FBH2 là nhân tố kích hoạt sự ra hoa thông qua
CO / FT.
FBH1 và FBH2 có vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa phiên mã CO, biểu hiện quá mức của FBHs có thể thay đổi lượng CO biểu hiện, từ đó sẽ làm thay đổi thời gian ra hoa Vì vậy, người ta đã phân tích hiện tượng ra hoa của FBH1 và FBH2 biểu hiện
quá mức (35S:FBH1 và 35S:FBH2) dưới điều kiện ngày dài và ngày ngắn Hình 2A cho
thấy tổng số lá của các cây chứa FBH1 và FBH2 biểu hiện quá mức thấp hơn nhiều so với cây hoang dại Sự thay đổi về kiểu hình lá là một trong những dấu hiệu quan trọng cho thấy hiện tượng ra hoa sớm ở các cây chứa FBH1 và FBH2 biểu hiện quá mức dưới điều kiện ngày dài và ngày ngắn (Hình 2A-C) Trong điều kiện ngày dài, cây chuyền gen
35S:FBH1 và 35S:FBH2 ra hoa ở 18 ngày tuổi trong khi cây hoang dại 27 ngày tuổi vẫn
chưa ra hoa Tương tự, trong điều kiện ngày ngắn, cây chuyền gen 35S:FBH1 và
35S:FBH2 ra hoa ở 28 ngày tuổi trong khi cây hoang dại 70 ngày tuổi vẫn chưa ra hoa Kết
quả này cho thấy rằng FBHs biểu hiện quá mức có thể làm tăng lượng CO Như dự đoán, lượng CO biểu hiện ở các cây chứa FBH1 và FBH2 biểu hiện quá mức cao hơn nhiều so với cây hoang dại dưới điều kiện ngày dài và ngày ngắn (Hình 2D và E) Điều đó cho thấy
cả FBH1 và FBH2 cảm ứng phiên mã CO Thật thú vị, mặc dù lượng CO biểu hiện ở 35S:
FBHs cao hơn 20 lần so với cây hoang dại nhưng mô hình biểu hiện CO ở 35S: FBHs rất
giống với cây hoang dại dưới điều kiện ngày dài và ngày ngắn Kết quả cho thấy FBHs biểu hiện quá mức làm tăng lượng CO phiên mã
Để làm sáng tỏ nguyên nhân ra hoa sớm ở cây chứa FBH1 và FBH2 biểu hiện quá mức, người ta đã nghiên cứu mức độ biểu hiện của FT điều chỉnh thời gian ra hoa FT mRNA cũng tăng cao trong cây chứa FBHs biểu hiện quá mức dưới điều kiện ngày dài và ngày ngắn (Hình 2F và G) Những kết quả này cho thấy rằng lượng FT cao có thể giúp ra
hoa sớm ở 35S: FBHs Để đánh giá khả năng này, người ta tiến hành đột biến ft ở 35S:
FBH1 Kết quả cho thấy hiện tượng ra hoa muộn dưới điều kiện ngày dài và ngày ngắn.
Kết quả này góp phần giải thích hiện tượng ra hoa sớm của 35S:FBH1 chủ yếu là do sự gia
tăng lượng FT và do lượng CO cao
Người ta đã chứng minh rằng tăng nồng độ FBH1 và FBH2 dẫn đến tăng biểu hiện của CO Để phân tích biểu hiện của CO phụ thuộc vào lượng FBHs, người ta tiến hành
Trang 8cảm ứng FBHs nhờ β-Estradiol β-Estradiol được bổ sung vào môi trường nuôi của cây
chuyển gen (pER8-FBH1, pER8-FBH2) và cây hoang dại vào cuối ngày thứ 9 và sự biểu
hiện của FBH1, FBH2 cũng như sự biểu hiện của CO được phân tích trong 2 ngày sau đó (Hình 2H) Sự biểu hiện CO chỉ tăng ở cây chuyển gen mà biểu hiện của FBH1 hay FBH2 được cảm ứng (Hình 2 I-L) Kết quả này tiếp tục chỉ ra rằng lượng FBH1 và FBH2 điều chỉnh biên độ dao động CO hàng ngày
Bởi vì CO được biểu hiện chủ yếu trong các mô mạch (Hình 2M) nên người ta đã phân tích sự biểu hiện của CO bằng nhuộm GUS ở toàn bộ cây con, một lá mầm và lá mầm đầu tiên của cây chứa FBH1 và FBH2 biểu hiện quá mức cũng như cây hoang dại mười hai
ngày tuổi Kết quả cho thấy CO: GUS hoạt động ở 35S: FBHs cao hơn so với cây hoang
dại và CO biểu hiện cao nhất ở lá mầm đầu tiên (Hình 2M-O) Tương tự, người ta cũng
phân tích sự biểu hiện của FT Kết quả FT: GUS hoạt động ở 35S: FBHs cao hơn so với
cây hoang dại và FT biểu hiện cao nhất ở lá trưởng thành Như vậy, cây chứa FBH1 và FBH2 biểu hiện quá mức ra hoa sớm là do lượng FBH1 và FBH2 cao làm tăng lượng CO biểu hiện từ đó kích hoạt FT giúp ra hoa sớm không phụ thuộc vào quang kỳ
Trang 93 FBH1 liên kết gần vị trí khởi đầu phiên mã của promoter CO.
Để hiểu được cơ chế điều hòa CO phụ thuộc FBH, chúng tôi kiểm tra các vùng biểu hiện của FBH1 bằng cách phân tích các vùng biểu hiện promoter FBH1_ GUS (FBH1: GUS) Chúng tôi giả định rằng nếu FBH1 là một nhân tố điều hòa CO, vùng biểu hiện nó
sẽ trùng lặp với các vùng CO FBH1: GUS hoạt động, chủ yếu được phát hiện trong các
mô mạch (Hình 3 A, B, C), đúng dự đoán
Tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu xem FBH1 liên kết trực tiếp với promoter CO trong cơ thể bằng cách sử dụng một phương pháp miễn dịch nhiễm sắc (ChIP) Đối với phương pháp ChIP, chúng tôi đã sử dụng cây chuyển gen biểu hiện một FLAG-gắn FBH1 điều hòa bởi promoter FBH1 (FBH1: FLAG-FBH1) và cây 35S: FLAG -FBH1
Để nghiên cứu FBH1 liên kết với promoter CO, chúng tôi thu hoạch những cây phát triển LD tại (ZT4) khi sự biểu hiện CO ở mức độ thấp và tại ZT 13 khi sự biểu hiện
CO vào ban ngày là ở đỉnh của nó Chúng tôi đã phân tích làm giàu FLAG-FBH1 cụ thể của các mảnh ADN trên các điểm CO khác nhau (amplicon 1-9 bằng cách sử dụng PCR định lượng (qPCR) (Hình 3D) Trong cây FBH1: FLAG -FBH1, FBH1 cụ thể đã được phát hiện từ tất cả các mẫu nhiễm sắc thu hoạch tại ZT 4 và ZT 13 (Hình 3 E và F) với mức cao nhất trong amplicon 5, 6, 7, tiếp giáp với các vị trí bắt đầu phiên mã CO Amplicon 5 (vị trí: -430 Đến -273) và amplicon 6 (vị trí: -301 đến -89), cả hai đều chứa một E-box Amplicon 7 (-89 đến 66) cũng có chứa một E-box -5'-UTR của CO So sánh các kết quả thu được từ cả hai thời điểm cho thấy một lượng cao hơn trong các mẫu thu hoạch tại ZT
13 (Hình 3 E và F), trùng với vùng thượng nguồn phiên mã của CO () Xu hướng tương tự cũng được quan sát thấy khi chúng tôi sử dụng cây chuyển gen 35S: FLAGFBH1 (Hình 3
G và H)
Trang 104 Các đồng đẳng FBH1 có chức năng hoạt hóa CO
Để bổ sung cho phân tích biểu hiện quá mức của chúng tôi, chúng tôi đã phân tích các kiểu hình đột biến Vì vậy, chúng tôi mở rộng tìm kiếm đồng đẳng của FBH1 (hoặc FBH2) Trên cơ sở phân tích phát sinh loài trước đó, có hơn bốn gen bHLH trong nhánh giống như FBH1 và FBH2 (tên là FBH3 và FBH4) cũng gây ra một kiểu hình hoa sớm Điều này có thể do biểu hiện FT cao gây ra bởi biểu hiện gia tăng CO trong LD và SD (Hình 4 A, D) Tương tự như kiểu hình biểu hiện quá mức FBH1 và FBH2 , các vùng biểu hiện của CO phần lớn được phục hồi trong dòng 35S: FBH3 và 35S: FBH4 (Hình 4 A.)
Bởi vì kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng bốn protein FBH này có thể có chức năng không cần thiết, phân tích biểu hiện CO cho thấy giảm lớn hơn 50% biểu hiện CO trong 6 giờ đầu tiên trong những thời kỳ tối trong LD và SD (Hình 4 E và F), cho thấy rằng các protein FBH kích hoạt chủ yếu của CO đặc biệt trong sự khởi đầu của đêm Trong LD, có giảm nhẹ trong biểu hiện CO buổi chiều (Hình 4E) Điều này có thể gây ra biểu hiện thấp của FT và sau đó nở hoa của các đột biến tăng gấp bốn lần trong LD () Những kết quả này ngụ ý rằng bốn protein FBH hoạt hóa phiên mã CO trong Arabidopsis
Trang 11V Kết luận
FBH1 và FBH2 liên kết với promoter CO ở vị trí E-box điều hòa sự biểu hiện gen CO dẫn đến điều hòa quang kỳ ra hoa ở Arabidopsis
Protein FBH tích cực điều hòa phiên mã CO cho quang kỳ ra hoa
và cơ chế này có thể được bảo tồn trong các loài thực vật đa dạng
Protein FT được tổng hợp trong các mạch ở lá di chuyển đến mô phân sinh ngọn chồi (SAM) được cho là tín hiệu cảm ứng thay đổi hoa
1 sự khẳng định mới của các nhà khoa học là: protein FT được tổng hợp ở lá và sau đó được vẫn chuyển lên vùng SAM chứ không phải mRNA của protein FT được vận chuyển lên vùng SAM rồi mới tổng hợp protein
Trang 12Tài liệu tham khảo:
Shogo Ito, Young Hun Song, Anna R Josephson-Day, Ryan J Miller, Ghislain Breton, Richard G Olmstead and Takato Imaizumi (2012) FLOWERING BHLH transcriptional activators control expression of the photoperiodicflowering regulator
CONSTANS in Arabidopsis PNAS 109: 3582–3587
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1118876109