sản xuất công nghiệp kháng sinh b lactam

Sản xuất penicillin thương mại Quá trình lên men của penicillin-G hoặc -V là một quá trình fedbatch thức ăn được thực hiện vô trùng trong các bể chứa bằng thép không rỉ lò phản ứng của 3

SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP KHÁNG SINH B-LACTAM

Các con đường sinh tổng hợp cho penicillin, cephalosporin và cephamycins được đặc trưng tốt cả về mặt di truyền và sinh học (Demain et al.1998) Một con đường tổng quát được thể hiện trong hình 1 Hầu hết các gen quan trọng đã được nhân bản, ngoại trừ gen epimerase N (Cef D) isopenicillin (Brakhage 1998) Sự gia tăng một số gen, đặc biệt là gen tổng hợp deacetoxycephalosporin C (cef E), đã làm tăng sản xuất cephalosporin C và làm giảm mức deacetoxycephalosporin C (DAOC) trong môi trường lên men sản xuất (Skatrud và cộng sự, 1998, Basch Và Chiang 1998) Việc chuyển giao và biểu hiện gen cef E từ Streptomyces clavuligerus trong Penicillium chrysogenum dẫn đến sự hình thành acid adipyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic (adipyl-7-ADCA) khi sự biến đổi chủng P chrysogenum đã được cho ăn acid adipic (Crawford et al 1995) Theo cách này, khả năng sinh tổng hợp lớn hơn của P chrysogenum có thể được sử dụng để sản xuất DAOCs, các phân tử - với các thị trường mở rộng - đắt hơn nhiều so với penicillin Công nghệ thú vị này đã không được mở rộng đến mức sản xuất tại thời điểm này

Sản xuất penicillin thương mại

Quá trình lên men của penicillin-G hoặc -V là một quá trình fedbatch thức ăn được thực hiện vô trùng trong các bể chứa bằng thép không rỉ lò phản ứng của 30.000-100.000 gallon năng lực Quá trình lên men thường kéo dài từ hai đến ba giai đoạn phát triển giống ban đầu, sau đó là giai đoạn sản xuất lên men có chu kỳ thời gian dao động từ 120 đến 200 giờ Mức oxy hoà tan cao là rất quan trọng, đặc biệt là trong giai đoạn tăng trưởng đỉnh cao thường xảy ra ở khoảng thời gian 40-50 giờ của chu kỳ Chế độ lên men là fedbatch, đường thô

và tiền chất được cho ăn suốt chu kỳ Quá trình lên men penicillin hiện nay được máy tính hóa và tự động hoá Nhiệt độ, độ pH, oxy hòa tan, carbon dioxide, đường, tiền chất, amoni được theo dõi và kiểm soát chặt chẽ để sản xuất kháng sinh tối ưu

Các nguồn carbon khác nhau đã được chấp nhận cho quá trình lên men bao gồm glucose, sucrose và các loại đường thô khác Khoảng 65% carbon được chuyển hóa để duy trì tế bào, tăng trưởng 20-25% và sản xuất penicillin 10-12% (Van Nistelrooij và cộng sự, 1998) Đường và tiền chất được cho ăn liên tục và đường cũng được sử dụng để giúp điều chỉnh độ pH của quá trình lên men giữa 6,4-6,8 trong giai đoạn sản xuất penicillin hoạt động

Rượu ngô và bột đậu nành, amoniac và amoni sulfat là nguồn nitơ chủ yếu Các chất tiền chất cần thiết là axit phenylacetic (đối với penicillin G) hoặc acid phenoxyacetic (đối với penicillin V) được cho ăn hoặc theo mẻ

Các giao thức thu hoạch mini thường được sử dụng trong quá trình lên men penicillin Hệ thống "điền và rút" này bao gồm việc loại bỏ 20-40% lượng chất lên men bằng việc thay thế bằng môi trường vô trùng tươi Thủ tục này có thể được lặp đi lặp lại nhiều lần trong quá trình lên men mà không giảm năng suất, và trên thực tế có thể tăng tổng sản lượng penicillin lên mỗi fermentor Các penicillin G mỡ khoảng 100.000 U / ml đã được báo cáo bởi các nhà nghiên cứu tại Panlabs

Penicillin được bài tiết ra môi trường và được phục hồi vào cuối quá trình lên men Việc tách chiết toàn bộ canh trường thường được thực hiện ở pH có tính axit của hầu hết các nhà sản xuất và đã làm tăng hiệu suất khai thác tổng thể lên 2-5% bằng cách loại bỏ bước lọc chân không quay Dung môi chiết xuất canh trường acid lạnh được thực hiện với amyl, butyl hoặc isobutyl acetate Nhiều quá trình tách chiết trở lại thành đệm và dung môi ở pH khác nhau bằng cách sử dụng tiếp xúc ngược đã dẫn đến nồng độ penicillin đáng kể trong giai đoạn thu hồi sớm của quá trình tinh chế Các sắc tố và tạp chất tạp chất khác được loại bỏ bằng cách sử dụng than hoạt tính Penicillin được kết tinh khi bổ sung kali axetat và được cô lập như một muối kali tinh thể Các phương pháp xử

lý cacbon và rửa dung môi bổ sung dẫn đến sản phẩm cuối cùng tinh khiết cao Thông thường, sản phẩm chuyển đổi dùng cho axit 6-aminopenicillanic (6-APA) có độ tinh khiết thấp hơn và chi phí sản phẩm cuối cùng thấp hơn Bảng 2 cho thấy một số thay đổi sản xuất chính đã xảy ra trong cả quá trình chế biến đầu vào và đầu ra trong năm thập kỷ qua

Năm 1949, Hoa Kỳ là nước sản xuất chính, với sản xuất penicillin lên đến

83 tấn natri penicillin G Năm 1982, sản xuất penicillin đã được thực hiện trên khắp thế giới, với tổng sản lượng là 12.000 tấn và Châu Âu là nước chính (Van der Beck và Roels 1984) Năm 1995, tổng sản lượng thế giới đã được báo cáo là

~ 33.000 tấn, tăng gấp năm lần kể từ cuối những năm 1960

Sự tăng lên đáng kể năng suất lên men penicillin (Elander và Chiang 1991) và năng suất phục hồi cao (> 90%) tương ứng đã dẫn đến giảm chi phí đáng kể mặc dù chi phí lao động, năng lượng và nguyên vật liệu tăng lên Năm

1953, chi phí cho penicillin G là $ 300 / kg (Sylvester và Coghill 1954) Vào năm 1980, giá bán penicillin chủ yếu là $ 35 / kg Vào cuối những năm 1990,

chi phí penicillin hàng loạt dao động từ 10 đến 20 đô la / kg và chi phí tiếp thị hàng loạt cho 6-APA ước tính khoảng từ 35 đến 40 đô la Mỹ / kg Bảng 3 liệt kê các nhà sản xuất penicillin chính và các chất trung gian b-lactam có khối lượng lớn

Chất bán tổng hợp b-lactam

Khoảng 75% tổng lượng penicillin được sản xuất vào năm 1995 ~ 33.000 tấn được sử dụng để sản xuất penicillin bán tổng hợp và cephalosporin (Barber 1996) Một số kháng sinh quan trọng được liệt kê trong Bảng 1 Hạt nhân penicillin (6-APA) đã cho phép các nhà nghiên cứu phát triển nhiều penicillin bán tổng hợp tuyệt vời 6-APA cũng có thể được hóa học hóa thành vòng 7-ADCA để tạo ra một số lượng cephalosporin hoạt tính quan trọng (cephalexin, cephradine, cefadroxyl, vv) 6-APA hiện đã trở thành sản phẩm bán thành phẩm b-lactam lớn nhất thế giới

6-APA được phát hiện vào cuối những năm 1950 và mặc dù enzyme vi khuẩn được phát hiện ra sớm rằng penicillin bị thủy phân đến 6-APA, việc sử dụng chúng trong quá trình sản xuất đã bị bỏ rơi vào cuối những năm 1960 Công nghệ phân tách hóa học hiệu quả đã được Weissenburger và van der Hoeven (Hà Lan) phát triển ở Hà Lan (1970) và sớm được nhiều nhà sản xuất chấp nhận Các vấn đề môi trường và chi phí về dung môi và năng lượng cao khiến các nhà nghiên cứu điều tra lại các tuyến đường enzyme cho 6-APA Khi sản phẩm phản ứng hòa tan trong nước, tái sử dụng men là rất khó vì enzym bị mất hoặc bị phân hủy trong quá trình cách ly 6-APA Vấn đề này phần lớn bị bỏ qua trong công nghệ tách hóa học Sử dụng lại Enzyme và các vấn đề mất mát liên quan của nó đã sớm được loại bỏ bằng cách phát triển phương pháp luận lý học cố định enzym được cải tiến cho phép tái sử dụng enzym lâu dài Các enzym cố định bây giờ có thể được sử dụng trong cải tiến modul thức ăn hóa lỏng (Matsumoto 1993) Các chủng Escherichia coli tái tổ hợp được sử dụng như các nhà sản xuất penicillin G acylase (Savidge 1984) cực kỳ hiệu quả và các chủng tái tổ hợp của Fusarium oxysporum có thể được sử dụng như các nhà sản xuất penicillin V acylase hiệu quả cao

Mối quan hệ hóa học của penicillin (thiazolidine) và khung cephalosporin (dihydrothiazine) được hình thành vào đầu những năm 1960, khi chứng minh rằng penicillin sulfotlenides có thể được sắp xếp lại để tạo thành một loạt các chất dẫn xuất cephalosporin quan trọng Khi este penicillin sulfotlenic được nung nóng trong điều kiện axit, một sự giãn nở vòng hóa học xúc tác axit xảy ra (Morin et al 1963) Cuối cùng, một quá trình hiệu quả hơn đã được phát triển bằng cách sử dụng silyl bảo vệ trong quá trình sắp xếp lại mở rộng vòng hóa học Silyl bảo vệ đã dẫn đến sản xuất hóa chất hiệu quả của 7-ADCA và đã dẫn đến việc sản xuất hiệu quả cao của cephalosporins uống, cephalexin và cephradine Cephadroxyl được tổng hợp sau khi silic của axit

7-aminocephalosporanic (7-ACA) và acyl hóa với một hỗn hợp anhydrit được điều chế từ muối r-hydroxyphenylglycine và ethylchloroformate Amoxicillin được tổng hợp bằng một quy trình tương tự

Một sản phẩm quan trọng của Lilly, cefaclor, liên quan đến việc mở rộng vòng của một este penicillin V đến một oxit cephalosporin-S mở rộng với một liên kết đôi ngoại lai Sản phẩm này là một chất trung gian hữu ích vì nó có thể chuyển đổi thành thế vị trí 3 cephalosporin và cefaclor, cephalosporin uống với clo ở vị trí C-3

Cephalosporin C và các cephalosporin bán tổng hợp quan trọng

Cephalosporin C lên men

Các dòng năng suất cao của A chrysogenum được sử dụng rỗng rãi trong các quá trình lên men fed-batch Các nhà sản xuất lên men chính cephalosporin C thu được các mẻ thu hoạch trong khoảng 20-25 g / l Quá trình lên men quy mô sản xuất được cho ăn bằng fed-batch với carbon cung cấp như là thức ăn đơn giản hoặc phức hợp carbohydrate trong giai đoạn tăng trưởng của quá trình lên men Khi quá trình lên men, thức ăn đường bị giảm đi và thường được thay bằng các loại dầu năng lượng cao hơn như dầu đậu nành hoặc dầu đậu phộng Bảo toàn năng lượng từ dầu như một chất nền ít hiệu quả hơn và dẫn đến sự tăng trưởng chậm hơn, với các sợi nấm thực vật trở thành chuyển đổi phần lớn thành bào tử chia đôi đa bào Giai đoạn bào tử chia đôi dẫn đến sự sẵn có của oxy lớn hơn trong cơ thể và kết quả là sản xuất cephalosporin nhanh

Bổ sung dl-Methionine, cũng gây ra sự hình thành arthrospore, thường được thêm vào môi trường trong giai đoạn tăng trưởng sớm của quá trình lên men Sự hình thành arthrospores cũng tương quan với nồng độ oxy hoà tan được cải thiện trong môi trường canh tác và rất quan trọng cho sự biểu hiện tối đa của cyclase sinh tổng hợp quan trọng và enzyme giãn nở

Nitơ hữu cơ thường được cung cấp như là một sự kết hợp của đậu nành

và các bữa ăn hạt bông bổ sung với sulfat amoni và amoniac cũng được sử dụng

để giúp kiểm soát độ pH trong suốt quá trình lên men Rượu ngô cũng được cung cấp như một nguồn nitơ rẻ tiền và giàu axit amin, vitamin, axit hữu cơ và các nguyên tố vi lượng Độ pH của quá trình lên men được duy trì từ 6.2 đến 7.0

và phạm vi nhiệt độ được kiểm soát trong khoảng từ 24 đến 28 ° C

Một vấn đề chính liên quan đến quá trình lên men cephalosporin C là sự mất ổn định hóa học vốn có của phân tử cephalosporin C Đây có lẽ là một

trong những lý do chính khiến quá trình lên men cephalosporin C chu kỳ kéo dài thường dẫn đến việc giảm sản xuất cephalosporin so với quá trình lên men penicillin chu kỳ dài

Cephalosporin C có thể dễ dàng bị phân hủy thành axit X (2- (d-4-amino-4-carboxybutyl) -thiazolo-4-carboxylic), có thể chiếm tới khoảng 40% tổn thất của cephalosporin C sản xuất (Usher Et al 1988) Các phân tử tiền thân sinh tổng hợp của cephalosporin C, deacetylcephalosporin C và DAOC có tính ổn định hóa học nhiều hơn Các chủng của nấm men, Rhodosporidium toruloides

có một acetyl esterase mạnh, và khi sinh vật được bổ sung vào quá trình lên men cephalosporin C, sẽ làm tăng mức độ deacetylcephalosporin C với sự gia tăng nồng độ cephalosporin tổng thể khoảng 40%

Trong thập kỷ qua, nhân bản của nhiều gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp cephalosporin đã dẫn đến các dòng có năng suất cao hơn Các nhà nghiên cứu tại Lilly đã chứng minh rằng giãn nở / hoạt tính hydroxylase có thể

là hạn chế tỷ lệ trong các dòng sản xuất nhất định (Skatrud và cộng sự, 1989) Các biến thể có thêm một bản sao gen cef EF có gấp đôi giãn nở / hoạt tính hydroxylase của dòng không biến đổi, giảm nồng độ penicillin N và tăng mức

độ cephalosporin C Sự gia tăng tỉ lệ cephalosporin C dao động từ 47% trong quá trình lên men quy mô phòng thí nghiệm lên 15% trong máy lên men thí điểm (Skatrud và cộng sự, 1989) Không có báo cáo nào khác từ Lilly về năng suất của các dòng thiết kế trong các máy lên men lớn

Basch và Chiang (1998) đã báo cáo về việc sử dụng các chiến lược kỹ thuật di truyền để giảm bớt các sản phẩm phụ không mong muốn trong quá trình lên men cephalosporin C tại Bristol-Myers Squibb Họ đã chỉ ra rằng sử dụng một chủng tái tổ hợp của A chrysogenum với số lượng sao chép tăng lên của gen mở rộng / hydroxylase bẩm sinh (cef EF) đã làm giảm mức DAOC trong các máy lên men lớn Việc thu hồi và làm sạch các loại nước dùng này và việc chuyển đổi hóa học sang ACA đã làm giảm đáng kể chất gây ô nhiễm 7-ADCA

Cephalosporin C thu hồi và thanh lọc

Việc tinh chế và thu hồi nước canh cephalosporin C bắt đầu với việc làm lạnh nhanh của nước dùng có hoạt tính đến 3-5 o C sau đó là loại bỏ các chất rắn có thành phẩm bằng cách lọc hoặc bằng ly tâm Nước cất hoạt tính chứa không chỉ thành phần cephalosporin C mà còn là một số lượng nhỏ các tiền chất sinh tổng hợp, penicillin N, DAOC, deacetylcephalosporin C và sản phẩm cephalosporin C đã bị phân hủy, hợp chất X

Có thể sử dụng hai chiến lược chính để thu hồi và thanh lọc cephalosporin C Một chiến lược liên quan đến việc sử dụng than hoạt tính hoặc

sử dụng nhựa không ion Do tính chọn lọc cao của nhựa, nên cephalosporin C hấp thụ trên penicillin N hoặc Gây ô nhiễm các phân tử tiền thân sinh tổng hợp Hầu hết penicillin N được loại bỏ trong bước axit hóa pH 2.0 Một bước trao đổi anion và cation bổ sung thường dẫn đến chất cephalosporin chất lượng cao Một phần lớn cephalosporin C được chuyển thành 7-ACA và dẫn xuất thành cephalosporin bán tổng hợp

Chiến lược thanh lọc lần thứ hai liên quan đến việc thay thế phần tử amin trên chuỗi bên a-aminoadipyl ở C-7 Hai dẫn xuất được thế, N-2,4-dichlorobenzoyl cephalosporin C và tetrabromococboxylbenzoyl cephalosporin

C, có thể được kết tinh từ dung dịch nước có tính axit Ngoài ra, muối có thể được hình thành giữa các dẫn xuất N-thế và một bazơ hữu cơ như dicyclohexylamine hoặc dimethylbenzylamine dẫn đến các muối cephalosporin

có khả năng chiết xuất dung môi BristolMyers Squibb sử dụng quy trình thu được dung môi dẫn đến este isochlorobutylformate (ICBF) của cephalosporin C, gọi là cephalosporin D Một số bước khai thác thường cần thiết để đạt được độ tinh khiết cuối cùng mong muốn Các muối cephalosporin C được thay thế N có chứa một lượng nhỏ chất gây ô nhiễm có thể được chuyển đổi thành 7-ACA

Các quá trình enzyme hiệu quả hiện nay được sử dụng cho việc chuyển đổi cephalosporin thành 7-ACA, làm giảm đáng kể chi phí cho sản phẩm trung gian quan trọng này Hai enzyme biến đổi gen quan trọng có liên quan Bước đầu tiên là phản ứng của nhóm a-aminoadipyl với oxy hóa d-amino axit để tạo glutaryl-7-ACA Phản ứng này tiến hành thông qua một chất trung gian keto-7-ACA trải qua quá trình oxy hoá decarboxylation với sự hiện diện của hydrogen peroxide Một acylase glutaryl được sử dụng để loại bỏ chuỗi bên glutaryl để tạo ra 7-ACA

Khoảng 1/3 số cephalosporin thương mại được lấy từ 7-ADCA Do chi phí thấp của penicillin, 7-ADCA thường được sản xuất từ penicillin G bằng cách mở rộng vòng của một este penicillin sulfoxide để tạo ra este cephalosporin Nhóm este được loại bỏ, tiếp theo là loại bỏ các chuỗi phenylacetyl bên để cung cấp cho 7-ADCA

Hai phần ba cephalosporin thương mại bắt nguồn từ 7-ACA được sản xuất từ cephalosporin C bằng deacyl hoá hóa học hoặc enzyme Trong quá trình hoá học, sau khi bảo vệ các nhóm amino và cacboxyl, phản ứng với kali pentachloride với sự hiện diện của bazơ tạo thành dẫn xuất iminochloride Iminoether được hình thành khi bổ sung rượu Chất iminoether được thủy phân tạo thành 7-ACA

Các quá trình enzyme hiện đang được các nhà sản xuất chính của 7-ACA

sử dụng Chi phí thị trường khối lượng gần đây cho 7-ACA dao động từ $ 115 đến $ 130 / kg Antibioticos SpA và Biochemie / Hoechst đã sản xuất gần 50% nhu cầu thị trường thế giới vào năm 1998 (Barber 2000) Các nhà sản xuất lớn khác của 7-ACA là Glaxo-Wellcome, Fujisawa và Bristol-Myers Squibb

Các cephamycins bắt nguồn từ cephalosporin bằng methoxylation Methyl hóa ở vị trí C-7 Một hệ thống enzym đã được xác định trong S clavuligerus đã chuyển cephalosporin C hoặc O-carbamoyl-DAOC sang các dẫn xuất a-methoxy Việc phát hiện ra cephamycin C ở Merck vào đầu những năm 1970 đã dẫn tới những nghiên cứu và phát triển đáng kể về các cephalosporin prokaryote, vì sự hiện diện của nhóm methoxy trên vòng b-lactam làm cho phân

tử hoạt động mạnh hơn đối với các mầm bệnh Gram âm và kị khí và kháng lại nhiều hơn Blumamase gram âm (Stapley et al 1979) Như vậy, lần đầu tiên, cephalosporin methoxylated đã có sẵn cho thấy độ ổn định cao đối với các enzyme b-lactamase Cephamycin C không bao giờ được sử dụng lâm sàng, nhưng đã được sử dụng để tổng hợp bán các hợp chất có ích y khoa

Các nghiên cứu lên men sớm của kháng sinh 7-methoxycephalosporin bởi Streptomyces lipmanii và S clavuligerus được báo cáo bởi Nagarajan (1972) và bởi Stapley et al (1972) Độ chuẩn cực thấp từ 130-170 mg / ml đã được báo cáo Môi trường cephamycin được thu hồi và tinh chế bằng cách khử hoạt tính penicillin N bằng cách điều chỉnh pH của canh trường để đạt 2,0-2,5 Các cephamycins được cô lập bởi sự kết hợp của hấp thụ cacbon hoạt tính theo sau

là hấp phụ trên một nhựa trao đổi anion Một lượng nhỏ DAOC có thể được loại

bỏ bằng cách đi qua các cột silica gel với 30% axetonitril trong nước làm dung môi rửa giải Cefoxitin là được bán cephamycin-type cephalosporin ra hiện nay được sản xuất bằng tổng hợp hóa học Các phân tử khác có trong thị trường trong nhóm này là cefmetazole, temocillin và cefotetan (Bảng 1)