Nó được chọn lọc dựa trên sự ổn định của enzyme phân giải protein trong các dung môi hữu cơ khác nhau.. Giới thiệu.Trong những năm gần đây, những nỗ lực lớn đã được thực hiện để phát hiệ
Trang 1Tóm tắt.
Một nhà sản suất protease về tế bào kháng DMHC đã thành công trong việc phân lập từ 11 mẫu phân lập vi khuẩn chống chịu benzen-etoluene-xylene-ethylbenzene (BTEX) VSV được tìm thấy có khả năng kháng DMHC là một vòng đa chức thơm hydrocarbons (PAHs) phân giải và được xác định là Pseudomonas aeruginosa ( trực khuẩn mủ xanh) chủng K Nó được chọn lọc dựa trên sự ổn định của enzyme phân giải protein trong các dung môi hữu cơ khác nhau Protease trực khuẩn mủ xanh chống chịu lên đến ít nhất 50% (v/v) của benzen, n-hexane, 1-decanol, isooctan và n-hexadecan và
độ ổn định khi có 25% (v/v) n-decane và n-dodecane Enzyme của chủng K này được hoạt hóa 2.5, 1.5 và 1.2 lần khi có 75% (v/v) 1-decanol, isooctanvà n-Dodecan, tương ứng Độ ổn định protease trong DMHC có thể được sd làm chất xúc tác sinh học cho sự tổng hợp enzyme hữucơ khi có mặt DMHC
Trang 21. Giới thiệu.
Trong những năm gần đây, những nỗ lực lớn đã được thực hiện để phát hiện ra tầm quan trọng của phản ứng enzyme protease sử dụng trong sự hiện diện của các dung môi hữu cơ cho Pseudomonas Protease của vi sinh vật có thể hoạt động như 1 chất xúc tác trong các dung môi không chứa nước cung cấp những khả năng mới như chuyển dịch cân bằng nhiệt động lực học có lợi cho quá trình tổng hợp, tăng độ tan của các chất kỵ nước, đặc biêt kiểm soát cụ thể bằng dung môi và cải thiện sự ổn định nhiệt của enzyme G.Bell và Klibanov đã báo cáo rằng các dung môi hữu cơ được sử dụng như là môi trường cho các phản ứng enzyme cung cấp lợi thế quan trọng trong việc áp dụng công nghiệp của chất xúc tác sinh học Ngoài ra, các vi sinh vật chịu dung môi cũng hữu ích trong biến đổi sinh học với toàn bộ các tế bào trong hệ thống dung môi nước ở 2 giai đoạn Đối với những lý do này, nó đã trở thành một lĩnh vực mới trong enzymology để tìm kiếm các protease, đó là ổn định tự nhiên trong sự hiện diện của DMHC được sử dụng trong các phản ứng tổng hợp
Protease thường được sử dụng trong môi trường không chứa nước vì môi trường
có thể làm tăng độ tan của các chất hoặc các sản phẩm và tạo thuận lợi cho việc thu hồi sản phẩm và thuận lợi cho phản ứng như tổng hợp peptide, nhiệt động lực học không thuận lợi trong nước Như vậy, sự ổn định của protease trong sự hiện diện của các dung môi hữu cơ có thể hữu ích để tổng hợp trong môi trường như vậy Chú ý bổ sung bắt nguồn từ thực tế là nhiều loại dung môi kỵ nước được phân loại là chất gây ô nhiễm môi trường và sự suy thoái của các vi sinh vật là trọng tâm của ngành công nghiệp xử lý sinh học mới nổi
Trong bài báo này, chúng tôi báo cáo sự cô lập và mô tả đặc tính của vi sinh vật được lựa chọn này dựa trên những đặc tính hình thái và sinh hóa và độ ổn định các dung môi hữu cơ của các enzyme
Trang 32. vật liệu và phương pháp
2.1 Chủng VK
Các vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này đã được phân lập từ đất bị ô nhiễm của một nhà máy gỗ ở Selangor, Malaysia 11 mẫu phân lập đều là vi khuẩn chịu benzen-toluen-xylene-ethylbenzene (BTEX) và đã được chứng minh là có đa vòng thơm-hydrocarbons (PAHs) được phân giải Pseudomonas aeruginosa chủng K bị cô lập trong nghiên cứu này đã được đặc trưng bởi các xét nghiệm về hình thái và sinh hóa và tiếp tục khẳng định bằng cách sử dụng hệ thống xác định vi khuẩn MicroLog
2.2 Phân lập và sàng lọc DMHC của VSV phân giải protein
11 vi khuẩn kháng BTEX được sàng lọc với chất lượng cho việc sản xuất protease của chúng trên thạch (SMA) chứa (g /l): sữa tách chất béo( sữa gầy), 12.0 và thạch dinh dưỡng, 13.8 Các tấm được ủ ở 37◦C trong 24-48h Vi sinh vật sản xuất enzyme phân giải protein hình thành khu làm sạch xung quanh khuẩn lạc trên đĩa SMA.Việc phân lập cho thấy kết quả tích cực trên SMA sau đó được thử nghiệm để sản xuất enzyme của chúng trong môi trường lỏng
2.3 Chọn lọc của VSV kháng DMHC
Sản xuất protease được xác định hiếu khí ở 37 độ C trong 100ml dung dịch trung tính Môi trường phát triển trung tính bao gồm: (g/l): peptone (Type IV), 10,0; (NH4) 2SO4, 1.0; KH2PO4, 0.5; MgSO47H2O, 0.3; CaCl2.2H2O, 1.0; NaCl, 1.0; glycerol 10,0
ml 4ml chất cấy vi khuẩn 24h được cấy vào trong 100ml môi trường tăng trưởng trung tính và ủ dưới 150rpm ở 37 độC Mẻ cấy được lấy ra bằng phương pháp ly tâm 12,000× g
ở 4◦C cho 10 phút Dịch nổi sau đó được lọc bởi màng lọc cellulose acetate (kích thước
lỗ 0.22 µm) và 1.0ml DMHC được thêm vào 3.0ml dung dịch nổi không có tế bào trong một chai thông dụng và ủ ở 37 độ C trong 30 phút với độ rung 150rpm Hoạt hóa protease được thí nghiệm bởi sự thay đổi một ít phương pháp của Keay và Wildi
2.4 Khảo sát hoạt hóa protein
Hoạt tính Caseinolytic được đo dựa trên sự biến tính nhỏ của phương pháp Keay
và Wildi Hỗn hợp phản ứng gồm 1,0 ml pha loãng dung dịch enzyme (enzyme:nước,1: 3) ủ trước ở 37◦C trong 5 phút Các phản ứng bắt đầu bằng việc bổ sung 1,0 ml casein 2,0%(w/v) pH 7,0.Hỗn hợp phản ứng sau đó được ủ trong nồi hấp ở 37◦C trong 10 phút
và kết thúc bằng việc bổ sung 2,0 ml 0,4 M trichloroacetic acid (TCA)
Một máy trộn xoáy được sử dụng để đảm bảo trộn hoàn chỉnh ở các giai đoạn khác nhau của các quá trình xét nghiệm.Hỗn hợp này được tiếp tục ủ ở 37◦C trong 20 phút, sau
đó ly tâm ở 13.000 xg trong 10 phút.( Các dịch nổi đã được thu hoạch) Để 1.0 ml dịch nổi , 5.0 ml 0.4 M Na2CO3 và 1.0 ml thuốc thử Folin ciocalteau : nước (1:3 v/v) được thêm vào hh tạo ra màu xanh.Hỗn hợp màu được ủ trong nồi hấp ở 37◦C trong 20 phút
Trang 4trước khi hấp thụ được ở 660 nm Một "khoảng trống" đã được chuẩn bị bởi các quá trình tương tự, các TCA được thêm vào ngay sau đó và casein sau 10 phút ủ Một đơn vị (U) của protease tương đương với 0,5g tyrosine giải phóng 1,0 ml dung dịch enzyme trong điều kiện khảo sát Số lượng tyrosine đã được xác định từ đường cong chuẩn tyrosine
2.5 Sản xuất enzyme
Vi sinh vật được phát triển và nuôi cấy như sau:4 ml chất cấy vi khuẩn 24h (OD 540 nm = 0.5) được bơm vào 100 ml môi trường tăng trưởng và giao động ở tốc độ
150 rpm trong 24 và 48 giờ ở 37◦C Các tế bào chưa phát triển dd enzyme được chuẩn bị loại bỏ các tế bào bằng cách ly tâm12.000 × g và 4◦C trong 10 phút Dịch nổi được thu hoạch đã được kiểm định về hoạt động phân giải protein Mỗi thí nghiệm được thực hiện
3 lần lặp lại
2.6 Tác động của DMHC tới độ ổn định protease
Protease có ở chủng K kháng được nhiều loại DMHC được thử nghiệm trong các môi trường cơ bản như (g/l) : sorbitol 10.0; axit casamino 10.0; natri nitrat 1.0; KH2PO4 0.50; CaCl2 2H2O 1.0; NaCl 1.0 và Mg2SO4.7H2O 0.30 VSV được nuôi cấy trong môi trường hiếu khí ở các nông độ DMHC và môi trường khác nhau và được ly tâm với tốc độ quay 10000×g ở 4°C trong 10 phút Dịch nổi sẽ được lọc ra ngoài nhờ màng lọc cenllulose acetate ( kích thước lỗ 0.2µm) 1ml DMHC + 3ml dịch nổi không có tế bào
và bảo quản ở 37°C, 150rpm trong 14 days
Khảo sát độ ổn định protease ở các nồng độ DMHC khác nhau ( 0, 25, 50, 75 v/v ) đã được kiểm tra Dịch nổi không có tế bào với tỷ lệ DMHC khác nhau được rung lắc với150rpm ở 37°C trong 30 phút và đựng trong chai thông dụng Đo sự phân giải các protein hoạt hóa còn lại DMHC được chọn để nói ở đây là : 1-pentanol, benzen, ethylbenzene, toluene, decanol, isooctan, p-xylene, hexadecan, decane và dodecane Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại Độ ổn định được thể hiện ở việc phân giải protein hoạt hóa còn lại liên quan đến việc kiểm soát môi trường không có chứa dung môi
Trang 53. Kết quả và thảo luận
3.1 Phân lập và sàng lọc DMHC của VSV phân giải protein
Dựa trên việc kiểm tra định tính về SMA, tất cả 11 loại vi khuẩn đều cho thấy kết quả tích cực bằng cách hình thành các khu vực ly giải xung quanh các khuẩn lạc trên SMA, được phân lập và tinh khiết Vì tất cả các chủng phân lập được báo cáo là chịu được BTEX , vi sinh vật có khả năng kháng DMHC được xác định và lựa chọn trong số các vi sinh vật, trong đó hoạt động sản xuất phân giải protein cao khi có mặt của 25% (v/v) benzen và toluen trong các môi trường lỏng Vì vậy, trên cơ sở của sự ổn định tương đối trong 25% (v/v) benzen và toluen, chủng K đã được chọn là nhà sản xuất mạnh nhất của enzyme phân giải protein kháng DMHC
Trang 63.2 Nhận dạng VK
Tính chất vi sinh vật của dòng K được xác định bằng các phương pháp mô tả trong hướng dẫn sử dụng của hệ thống Vi khuẩn học của Bergey Chủng K là một VK hiếu khí, gram âm, hình que và vi khuẩn di chuyển được Nó có thể tiết ra sắc tố màu vàng-xanh tan trong nước trên một tấm thạch dinh dưỡng Chủng K này có nhu cầu dinh dưỡng rất đơn giản, có thể phát triển ở pH trung tính và ở nhiệt độ trong khoảng trung tính Trên cơ sở các đặc điểm hình thái, sinh hóa và văn hóa đặc trưng của nó được liệt kê trong Bảng 1, phân lập chủng K xác định là P aeruginosa Kết quả này được tiếp tục xác định bằng cách sử dụng các phần mềm MicroLog, Biolog Automated System MicroStation
Trang 73.3 Ảnh hưởng của DMHC tới độ ổn định protease
Khả năng hoạt hóa của enzyme được q.sát thấy khi có mặt của DMHC đc nhiều sự chú ý trong 2 thập kỷ qua Tuy nhiên thì chỉ có một vài nghiên cứu thực hiện để quan sát
độ ổn định protease của P.earuginosa khi có mặt của nhiều loại DMHC Mt nước tạo thành từ các xt sinh học truyền thống Trong những năm gần đây, MT hữu cơ được xếp vào là 1 chất xt sinh học truyền thống Tuy nhiên, do tác động của độc tố trong DMHC nên việc lựa chọn DM để làm chất xúc tác còn hạn chế
Mặc dù sự tương tác giữa DM và enzyme rất phức tạp nên có rất nhiều hiện tượng phổ biến được làm chất xt sinh học trong mt hữu cơ
• Xét ảnh hưởng của DMHC đối với độ ổn định protease
o Với giá trị log P0/w từ 1.3 đến 3.5 thì môi trường nuôi cấy đc thêm vào dịch nổi các chất như 1-pentanol, benzen, toluen, p-xylene và n-hexane thì enzyme phân giải protein của chủng K sẽ bị bất hoạt hơn 35% so với đối chứng
o Với giá trị log P0/w từ 1 đến 5 thì theo báo cáo là sẽ gây độc cao cho tế bào khi thêm toluen
o Với giá trị log P0/w từ 4 đến 8.8 khi thêm vào dịch nổi không có tế bào các chất 1-decanol, isooctan, decane, dodecane và hexadecan thì hoạt tính của enzyme với độ ổn định là 1.10, 1.59, 1.20, 1.49 và 1.52 lần tương ứng với các chất và thấy ổn định hơn so với đối chứng
Trang 8Cũng có thể thấy ở bảng 2 enzyme protease được sản xuất bởi P.earuginosa chủng
K otaj hóa tốt hơn khi có mặt của DMHC, đặc biệt là với log P0/w có giá trị bằng hoặc lớn hơn 4.0 cũng như theo báo cáo của H.Ogino độ ổn định protease của PST-01 khi có mặt của DMHC Tuy nhiên protease của PST-01đã bị bất hoạt không đáng kể bởi nhiều loại DMHC trong việc kiểm soát sau khi ủ 14 days
Đã có nhiều khó khăn trong việc tìm kiếm tham số tổng hợp DMHC để có thể tương tác tốt với các hoạt tính của ezyme C.Laane đã thảo luận các thông số khác nhau như tham số hòa tan Hilderbrand, hằng số điện môi và hệ số logaric phân vùng của DM giữa octanol và nước (logP0/w) Họ kết luận rằng tham số tốt nhất liên quan đến hoạt tính của enzyme với dung môi đối chứng là tham số LogP0/w và đây cũng là tham số đã được
sử dụng rộng rãi.Giá trị của LogP0/w là thước đo dung môi phân cực hoặc kị nước, LogP0/w xác định hệ số phân vùng của DM trong octanol-nước ở 2 pha của hệ thống Độc tính của DMHC tỷ lệ nghịch với tham số LogP0/w DM ( dm kị nước) có giá trị LogP0/w cao sẽ ít gây bất hoạt chất xt simh học hơn so với dm có giá trị LogP0/w thấp hơn
Theo phát hiện (ở bài báo này), DM phân cực là một trong những yếu tố quyết định độ ổn định của chất xt sinh học Tuy nhiên trong 1 số trường hợp, nó không tương tác tốt với giá trị LogP0/w A.S Ghatorae đã báo cáo liên quan đến việc gây bất hoạt ảnh hưởng của các DM khác nhau đến enzyme mà không theo bất cứ xu hướng nào
Đặc biệt, không có mối quan hệ đơn giản nào giữa DM phân cực( dù đo bằng logP0/w hay bằng các tham số khác) và tỷ lệ bất hoạt thông qua DM hòa tan hay các cơ chế giữa 2 bề mặt
Theo báo cáo của A.Laane bản ghi LogP0/w các hoạt động tương tác khi quan sát
sự biến đổi của VK là hiện tượng phổ biến được giải thích bởi sự khác biệt trong thành phần vốn có của DMHC để làm sai lệch các yếu tố cần thiết trong lớp nước xung quanh chất xt sinh học
Họ cũng tìm được sự tương tác tốt nhất giữa tỷ lệ của epoxidation và độ phân cực khi hệ số phân cực LogP0/w đã được thực hiện như 1 chỉ số phân cực về dung môi Có thể kết luận rằng hoạt tính của epoxidation:
o có LogP0/w < 2: thấp
o 2 < LogP0/w < 4 : biến đổi yên tĩnh
o LogP0/w >4 : cao
DMHC có giá trị LogP0/w như trong nghiên cứu ở bảng 2:
Trang 9Hình 2: cho thấy hoạt hóa protease còn lại tiếp xúc với DMHC tương đối so với không chứa dung môi đối chứng Ảnh hưởng của các tỷ lệ khác nhau của DMHC khác nhau cho chủng K đã đc nghiên cứu
