qtsx enzyme protease và ứng dụng trong cntp (nước mắm ngắn ngày)

LỜI MỞ ĐẦUNgày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chếphẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnhvực như: chế biến thực p

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

TP.HCM, tháng 3 – 2015

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chếphẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnhvực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…

Hằng năm, lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau.Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất

tự nhiên

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số nghành sảnxuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa fomat, làm mềm thịt, bổ sung để là tăngchất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xứ lý phế phụ phẩm trong chế biến thựcphẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc gia, y tế, nông nghiệp, đặc biệt nó được sử dụngtrong sản xuất nước mắn ngắn ngày, nó có vai trò quan trọng rất lớn tới quá trình thủyphân hình thành nên nước mắm Sau đây nhóm sẽ trình bày quy trình sản xuất enzymeprotease cũng như làm rõ ứng dụng củ nó trong sản xuất nước mắm ngắn ngày

Lần đầu làm bài với nội dung này chắc chắn không tránh khỏi nhiều sai sót Rấtmong được cô góp ý kiến để những bài sau được hoàn thiện hơn nữa

Xin chân thành cảm ơn!

Nhóm thực hiện

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

I Tổng quan về enzyme Protease 4

1.1 Giới thiệu chung 4

1.2 Phân loại Protease 4

1.3 Nguồn thu nhận Protease 6

II Phương pháp sản xuất enzyme 10

2.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 10

2.1.1 Định nghĩa cấy bề mặt 10

2.1.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt 11

2.2 Phương pháp nuôi cấy bề sâu 11

2.2.1 Định nghĩa nuôi cấy bề sâu 11

2.2.2 Ưu điểm và nhược điểm 12

2.3 Các loại môi trường dùng trong sản xuất Enzyme 12

2.3.1 Môi trường lỏng 12

2.3.2 Môi bán rắn 12

III Quy trình sản xuất enzyme protease theo hai phương pháp 13

3.1 Bản chất quá trình 13

3.2 Nguyên liệu dùng trong sản xuất 14

3.2.1 Nguyên liệu dùng làm môi trường sản xuất 14

3.2.2 Nguyên liệu giống Vi Sinh Vật 14

3.2.3 Phân lập giống VSV 14

3.3 Kỹ thuật sản xuất chế phẩm Protease 18

3.3.1 Theo phương pháp nuôi cấy bề măt 18

3.3.2 Theo phương pháp nuôi cấy bề sâu 23

IV Ứng dụng của enzyme Potease 26

4.1 Ứng dụng chung 26

4.1.1 Trong công nghiệp thực phẩm 26

4.1.2 Trong công nghiệp da 28

4.1.3 Trong công nghiệp dệt 28

4.1.4 Trong chế biến thủy sản 28

4.1.4 Một số ứng dụng khác 28

4.2 Ứng dụng của enzyme ptotease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày 29

4.2.1 Cơ sở khoa học của phương pháp 29

4.2.2 Quy trình 30

4.2.3 Giải thích quy trình 30

4.2.4 Cách tăng hương vị cho nước mắm ngắn ngày 42

4.2.5 Tiêu chuẩn của nước mắm thành phẩm 42

4.2.6 Một số loại nước mắm trên thị trường 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

I Tổng quan về enzyme Protease

 Nhóm enzyme protease (peptit – hidrolase 3,4) xúc tác quá trình thuỷ phân liênkết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩmcuối cùng là các axit amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phânliên kết este và vận chuyển axit amin

 Phản ứng thủy phân liên kết peptide

 Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tếbào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ visinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan,

dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật cónhững đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rấtphức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hìnhdạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

 Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vậtthường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

Hình 1.2 Cấu trúc không gian enzyme Protease.

1.2. Phân loại Protease

 Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4)

 Protease được phân thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase

 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân

chia thành hai loại:

- Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu Nitơ tự do củachuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặcmột tripeptide

- Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu Cacbon củachuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốnnhóm:

Protease(E.C.3

Exopeptidase(E.C.3.4.11-17)

Endopeptidase (E.C.3.4.21-99)

Carboxypeptidase

Serin proteinaseAminopeptidase

Sơ đồ phân loại enzyme protease

Metallo proteinaseCysteine proteinase

Aspartic proteinase

- Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serinetrong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạtđộng xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ:chymotrypsin và subtilisin

 Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin,trypsin, elastase

 Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn nhưsubtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạtđộng mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đốirộng

 Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạtđộng.Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,bromelin, một vài protein động vật có protein ký sinh trùng Các cysteinproteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có đặc hiệu cơ chất rộng

 Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin Nhómpepsin bao gồm các enzym tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin, renin.Các Aspartic proteinase có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động vàthường hoạt động mạnh ở pH trung tính

 Metallo proteinase: Matallo proteinase thuộc nhóm Proteaza được tìm thấy ở

vi khuẩn, nấm mốc và các vi sinh vật bậc cao hơn Các Metallo proteinasethường hoạt động ở vùng pH trung tính, và hoạt động giảm đi dưới tác dụngcủa EDTA

 Ngoài ra ta có thể phân enzyme protease thành 3 nhóm theo cùng pH:

- Protease acid: pH 2÷4

- Protease trung tính: pH 7÷8

- Protease kiềm tính: pH 9÷11

Tuy nhiên sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng không thực sự chính xác vì

pH hoạt động tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất và nhiềuyếu tố khác nữa

Enzyme Proteasa phân bố ở động vật, thực vật và vi sinh vật

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin.

- Bromalain có ở chồi quả dứa, vỏ dứa (Pineapple pant)

- Papain có ở nhựa củ lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya)

 Các enzyme này được sử dụng để hạn chế tủa trắng ở bia khi làm lạnh dokết tủa protein

- Ficin thu ở nhựa cây cọ (Ficin carica) được sử dụng thủy phân protein tựnhiên

 Nguồn vi sinh vật:

- So với protease động vật và thực vật, protease sinh vật có những đặc điểmkhác biệt Trước hết protease sinh vật là một hệ thống rất phức tạp baogồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạngphân tử nén rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Đu đủ nguồn thu nhậnenzyme Papain

Dứa nguồn thuenzyme Bromalain

- Cũng do là hệ nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật có tínhđặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng.

- Nguồn thu nhận protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạkhuẩn

 Vi khuẩn:

 Trong số các vi khuẩn các chủng có khả năng tổng hợp mạnh

protease là Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus

thermoproteoliticus và một số thuộc giống Clostridium Các vi

khuẩn thường tổng hợp protease hoạt động thích hợp ở vùng pHtrung tính và kiềm yếu

 Các Protease được sản xuất từ vi khuẩn được biết nhiều hởn cả là:Subtilizin A, Subtilizin B và Subtilizin C

 Nấm mốc:

 Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng

dụng trong công nghệ thực phẩm là các chủng: Asp.oryzae, Asp.terricola,

Asp.fumigatus, Asp.saitoi, Penicillium chrysogenum… Các loại nấm mốc có

khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính

 Tỷ lệ cấu tử enzyme có thể thay đổi tùy theo thành phần môi trường nuôi (ví

dụ: Asp.oryzae nuôi trong điều kiện bình thường sinh tổng hợp chủ yếu

protease tính kiềm, còn trong môi trường giảm gluxit thì chủ yếu tạoprotease tính acid) Các nấm mốc đen có khả năng tổng hợp chủ yếu cácprotease tính acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5÷3

Clostridium Bacillus subtilis

 Một số nấm mốc khác như Asp.candidatus, Penicillium cameberti, Penicillium roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp các protease có khả

năng đông tụ sữa được sử dụn trong sản xuất pho mát

 Xạ khuẩn:

 Xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên người ta

đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như:

Streptomyces griceus, Streptomyces fradiae, Streptomyces rimosus…

 Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là protease (Nhật) đượctách từ Streptomyces griseus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năngthủy phân 90% lien kết peptit của nhiều protein với acid amin Ở Liên Xô,người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ Streptomyces griseus có tên làprotelin

 Từ Streptomyces fradiae cũng tách được Keratinaza, thủy phân Keratin Ở Mỹchế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ

Streptomyces fradiae cũng có hoạt tính elastaza cao do đó được dùng trong

- Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu đượckhối lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thuđược lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao.

- Một đặc điểm riêng của vi sinh vật là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành,kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều

- Vi sinh vật là giới thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp:Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp enzymecủa vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài.Trongkhi đó, sản xuất enzyme từ động vật và thực vậtkhông thể đưa vào quy môcông nghiệp được

- Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽtiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà có ý nghĩa về mặtmôi trường sống, vi sinh vật không đồi hỏi quá khắc khe những yếu tốdinh dưỡng của môi trường, nhất là nhũng vi sinh vật tổng hợp enzyme.Chính vì thế,enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẽ tiền hơnenzyme từ các nguồn khác

- Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau

2.1.1 Định nghĩa cấy bề mặt

 Đối tượng áp dụng: Có thể dùng vi sinh vật hiếu khí hoặc bán hiếu khí hay kỵ khí

 Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo điều kiện cho VSV phát triểntrên bề mặt môi trường

- Nuôi cấy bề mặt trên bề mặt dịch thể: (dùng cho nhóm vi sinh vật hiếu khí)

tùy từng loại vi sinh vật khác nhau mà chọn môi trường thích hợp khác nhau.Môi trừơng pha loãng với nồng độ thích hợp, sau đó bổ sung nguồn nitrogen(N), nguồn khoáng… khi môi trường cho vào thiết bị lên men phải có bề mặtthoáng, rộng Nuôi cấy theo phương pháp này đơn giản nhưng đòi hỏi diệntích sử dụng lớn, khó tự động hóa sản xuất hiện nay phương pháp này ítđược sử dụng

- Nuôi cấy sử dụng bể mặt môi trường bán rắn: Có thể dùng vi sinh vật hiếu

khí hoặc bán hiếu khí, kỵ khí ở phương pháp lên men này nguyên liệuthường được dùng là:

 Các loại hạt: thóc, ngô, nếp, đậu tương…

 Các loại mảnh: mảnh sắn, mảnh bắp…

 Các loại phế liệu hữu cơ: bã mía, trấu, cọng rơm rạ, rác thải sinh hoạt…

2.1.2 Ưu và nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt

- Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện Quy trình công nghệ thường không phức

tạp

- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất

nhiều so với nuôi cấy bề sâu

- Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối VSV,

enzyme và nước) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc

vận hành công nghệ cũng như việc đầu tư vừa đơn giản vừa không tốnkém

- Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý Môi trường

đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm tachỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy

- Phương pháp nuôi cấy bề mặt cũng có những nhược điểm cần quan tâm

để khắc phục và hoàn thiện dần phương pháp này Nhược điểm lớn nhất

và dễ nhận thấy nhất đó là: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích chonuôi cấy Trong phương pháp này VSV phát triển trên bề mặt môi trường(môi trường lỏng hoặc môi trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích,khó tự động hóa sản xuất

2.2.1 Định nghĩa nuôi cấy bề sâu

 Đối tượng áp dụng: tất cả các vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí

 Môi trường nuôi cấy: Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơchất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột Chỉ có một số ít giống visinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucoza, saccharoza.

2.2.2 Ưu điểm và nhược điểm

vô trùng.Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nênkhi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao

- Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở cáckhâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôicấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy

- Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễmhàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn

2.3.1 Môi trường lỏng

 Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thànhkhuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí) Ở đây,VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí,tiến hành quá trình tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từsinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào sẽ nằmtrong sinh khối VSV

2.3.2 Môi bán rắn

 Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme,người ta thường sử dụng môi trường đặc Để tăng khả năng xâm nhập củakhông khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạtngũ cốc để làm môi trường

 Trong trường hợp này, VSV phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chấtdinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoạibào Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còncác enzyme nội bào nằm trong sinh khối VSV.

 VSV không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn(môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt của cáchạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường Môi trường nuôi cấy vừa có

độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bếtmôi trường lại ,không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường,nếu có độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển Thông thườngngười ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý

 Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme,người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiệnthuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường Phương pháp nuôicấy bề mặt bán rắn (môi trường đặc) này rất thích hợp cho lên men ở nấm

đó có nghĩa là khoảng hoạt động của nó có độ pH rất rộng

 Protease kiềm thường ở nấm men

 Protease trung tính có ở rất nhiều loài nấm mốc khác nhau, chủ yếu là các

loài nấm mốc có màu vàng hoa cau (Asp Oryzae, Asp Flavus, Asp.

Fumigatus…) Ngoài ra còn thấy ở vi khuẩn Bac Mensentericus.

 Protease acid thường được thu ở các loài nấm mốc màu đen như Asp niger,

Asp awamori… Tuy nhiên tùy theo điều kiện môi trường và thành phần cơ

chất trong môi trường dinh dưỡng mà protease hình thành là acid, kiềm,trung tính

3.2 Nguyên liệu dùng trong sản xuất

3.2.1 Nguyên liệu dùng làm môi trường sản xuất

- Đối với nuôi cấy bề mặt thì môi trường sản xuất chính là: cám gạo, bột mì,bột bắp, đậu tương nghiền, rang…

- Đối với nuôi cấy bề sâu thì môi trường sản xuất chính là: Chủ yếu là mật

rỉ đường có bổ xung thêm dinh dưỡng

3.2.2 Nguyên liệu giống Vi Sinh Vật

- Từ nấm mốc gồm có: Aspergillus oryzae, Asp.niger, Asp.flavus,

Asp.awamori, Asp.fumigatus, Asp.soizae, A terricola, A saitoi, Penicillium chysogenum …là thông dụng nhất

- Từ vi khuẩn có Bacillus subtilis, Bac.mensentericus, Bac.thermophlus,B.

- Quá trình lên men trong điều kiện tự nhiên là một quy luật sống còn củaVSV Tự tham gia tổng hợp nên chất sống từ vật liệu lên men có trong tựnhiên Các VSV và vật chất sử dụng trong quá trình lên men tự nhiên rấtphức tạp, không đồng đều về chủng loại và về số lượng Mặt khác, quátrình lên men này không được kiểm soát, bao gồm nhiều pha và khôngđịnh hướng Sản phẩm lên men là đa dạng, không ổn định; do đó chấtlượng sản phẩm kém không đồng nhất

- Quá trình lên men trong sản xuất công nghiệp, tất cả các khâu về phân lậpgiống VSV, cơ chất, nhiệt độ, pH, độ ẩm… các quá trình phản ứng sinhhọc, quá trình thu nhận, tinh sạch sản phẩm đều được kiểm soát hoàn toàn(Sản phẩm tạo ra mang tính định hướng rõ ràng ngay từ lúc đầu ở khâuchọn giống VSV cho đến cuối quá trình thu nhận sản phẩm) Do đó chấtlượng sản phẩm được cải thiện

a Vai trò của giống trong công nghệ enzyme.

Trong công nghệ enzyme từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:

- Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy

- Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tínhenzyme)

- Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất

- Và cuối cùng là giống VSV quyết định đến giá thành sản phẩm

Như vậy, giống VSV có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ VSV

b Yêu cầu giống VSV trong công nghiệp enzyme.

Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và đượcsản xuất theo quy mô công nghiệp Do đó, giống VSV ứng dụng trong công nghệenzyme cần phải có những yêu cầu và những chuẩn mực nhất định Đó là:

- Giống VSV phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn Sản phẩm này phải có

số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác Vì trong quá trìnhtrao đổi chất, để chuyển hóa một khối lượng sinh chất khổng lồ lớn gấp hàngnghìn lần cơ thể mình trong một khoảng thời gian cực kỳ ngắn thì cơ thể VSVcần tổng hợp nhiều chất Do đó, sản phẩm tạo ra sẽ chứa nhiều loại khác.Chính vì thế, giống VSV dùng trong sản xuất một sản phẩm nào đó, thì sảnphẩm này phải trội hơn các sản phẩm khác cả về số lượng và chất lượng

- Giống phải cho năng suất sinh học cao

- Giống VSV phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điềukiện sản xuất công nghiệp

- Giống VSV phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tạiđịa phương nơi nhà máy đang hoạt động

- Giống sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những VSV thuầnkhiết, có tốc độ sinh sản nhanh

- Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh sản phẩm mong muốn; dễ dàng táchsản phẩm ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối VSV giống

- Giống phải ổn định trong bảo quản và dể dàng bảo quản

 Để tạo thuận lợi nhất về chủng giống VSV cung cấp cho quá trình lên mencông nghiệp, ta cần tiến hành phân lập giống VSV thuần khiết

c Quá trình phân lập giống VSV

- VSV phân bố rất rộng trong tự nhiên từ nơi có địa hình bình thường đếnnơi có địa thế phức tạp, đâu đâu cũng có mặt VSV Ở những nơi giàu chấthữu cơ, những nơi nghèo chất hữu cơ, trong không khí, trên bề mặt cácvật, trong cơ thế người, động vật, nơi có nhiệt độ rất thấp và hiện diện cả ởnơi có nhiệt độ cao

- VSV có khả năng thích nghi trong mọi hoàn cảnh môi trường Chính nhờkhả năng tuyệt vời này mà VSV có khả năng tồn tại ngay cả trong hoàncảnh khắc nghiệt nhất

- Thông thường để phân lập một giống chủng VSV để thu nhận enzyme thì

có 3 cách phân lập:

 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

 Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng

Tùy thuộc vào khả năng và những điều kiện thực tế mà ta chọn cách phân lập chophù hợp nhất Mỗi cách phân lập trên đều cho thấy những ưu điểm riêng biệt Sau đây

là 1 số ưu điểm:

Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên.

- Trong điều kiện tự nhiên, VSV để có thể tồn tại và thích nghi nhanhđược thì cần phải có khả năng sinh tổng hợp thật nhiều loại enzyme đểchuyển hóa nhanh cơ chất có trong môi trường thành vật chất cung cấpcho tế bào Điều này thì không thích hợp cho việc sinh tổng hợp enzyme(ở quy mô sản xuất công nghiệp) với một loại enzyme thật sự mạnh

- Do phát triển trong điều kiện tự nhiên, VSV phải cùng lúc đối phó vớihàng loạt các yếu tố ngoại cảnh và phải phân giải rất nhiều loại cơ chấtkhác nên VSV bắt buộc phải tổng hợp nhiều loại enzyme với một nỗ lựcrất lớn

- Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sựkhác biệt đáng kể các giống VSV có khả năng sinh tổng hợp enzymetrong điều kiện tự nhiên, được gọi chung là các chủng VSV hoang dại.Chúng đã quá quen thuộc với sự thay đổi thất thường của điều kiện tựnhiên Khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với

nhiều điều kiện môi trường cố định, đòi hỏi các loài VSV giống phải cómột thời gian thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp Huấn luyệnchúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều rất cần thiết.

- Các loài VSV có khả năng sinh tổng hợp một loại enzyme nào đó thườngtập trung ở vùng môi trường chứa nhiều cơ chất tương ứng Dựa và đặcđiểm này để chúng ta có thể dễ dàng xác định vị trí cần phân lập loạiVSV sinh tổng hợp enzyme mà ta cần

Ví dụ: Nếu ta muốn phân lập VSV có khả năng sinh tổng hợp amylase

cao, ta phải tìm nơi có chứa nhiều tinh bột trong tự nhiên, còn nếu muốn phânlập VSV có khả năng sinh tổng hợp protease ta cần phải tìm nơi có chứ nhiềuprotein trong tự nhiên

- Trong quá trình sinh sản và phát triển, cạnh tranh giữa các loài VSV, VSVtrong điều kiện tự nhiên luôn xảy ra những thường biến và đột biến.Những đột biến thường cho ra hai hiệu ứng: Thứ nhất gây cho cá thể chết;thứ hai là nhiều đột biến tạo ra loài mới có khả năng sinh tổng hợp enzymerất cao Việc tìm ra những đột biến kiểu này thì hết sức có ý nghĩa và rấtcần tiến hành Và một lợi điểm nữa là, những đột biến có lợi kiểu nàythường rất bền vững Rất thích hợp để đưa vào sản xuất ở qui mô côngnghiệp

Phân lập giống trong điều kiện sản xuất.

- Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghivới điều kiện sản xuất Nhờ đó, sau khi phân lập, các giống này không cầnqua giai đoạn sản xuất thử, thí nghiệm

- Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường là những giống

đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặcđiểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại

- Mật độ tế bào vi sinh vật trong điều kiện sản xuất (trong dịch lên men,dịch nước thải, chất thải của quá trình lên men) thường rất cao Do đó, khảnăng thu nhận được những chủng có bản năng sinh tổng hợp cao thườngrất cao

Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng.

- Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản Do bị nhiễm, có thể

rất nhiều tế bào VSV giống bị thoái hoá, nhưng cũng còn nhiều tế bàokhông bị thoái hoá Việc phân lập lại từ nguồn giống này nhiều khi lại đạtđược những kết quả tốt

3.3 Kỹ thuật sản xuất chế phẩm Protease

3.3.1 Theo phương pháp nuôi cấy bề măt

3.3.1.1 Sinh trưởng và sinh tổng hợp protease từ nấm.

- Khi nuôi VSV tạo protease có 2 quá trình liên quan mật thiết với nhau.Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tếbào hoặc ngoài môi trường

- Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp protease tiến hành song song vớiquá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào

sự tăng khối Trong trường hợp này, sinh tổng hợp enzyme protease kếtthúc ở pha logarit cùng đồng thời với sự ngưng sinh trưởng và sự bắt đầupha phát triển ổn định tiếp theo sau

- Tuy nhiên theo ý kiến của nhiều tác giả, sự tạo thành protease cực đạithường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng Trongtrường hợp này, sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy

enzyme protease trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng

mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn

3.3.1.2 Sơ đồ qui trình công nghệ

Nguyên liệu Hấp thanh trùng Làm nguội đến 300C

Đổ lên khay Nuôi cấy ở t0 phòng

Asp oryzae

0,5-2%

Thu nhận sinh

khối (enzyme thô)

Chế phẩm

enzyme thô đem

tinh chế Nghiền mịn

Tinh chế

3.3.1.3 Thuyết minh qui trình

- Từ những nguyên liệu kể trên, trước hết chúng được làm ẩm tải mỏng ra

khay, nong hoặc nia, sau đó cấy giống nấm Aspergillus oryzae mốc vào;

trộn đều nguyên liệu với vi sinh vật và đậy vải màn lên nuôi truờng phòngsạch vô trùng, giữ ẩm 70 – 85% để ở nhiệt độ 300C sau khoảng 30-32 giờthì thấy các tế bào phát triển mạnh, mọc phủ kín bề mặt, loại bỏ những tếbào tạp, chỉ giữ những tế bào, khuẩn lạc thuần rồi trộn đều chế phẩm, sấykhô nhẹ ở nhiêt độ 45-500C, nghiền bóp, cho vào túi polyetylen bảo quảndùng dần Khi tế bào phát triển trên môi trường là lúc enzym proteazađược hình thành và phát triển theo Chế phẩm thu được là proteaza thô ởdạng rắn

- Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các

khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trênnhững giá đỡ Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí đượclưu thông thường xuyên Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt

độ và độ ẩm không khí Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là

28-320C Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấmsợi phát triển

- Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH Môitrường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ítkhi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường

- Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ Điều này

còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường

cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy

- Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằngphương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy.

Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

 Nhiệt độ tăng rất chậm

 Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

 Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

Khối môi trường còn rời rạc

 Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành.

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệtđối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫncảm với nhiệt độ

 Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ Trong giai đoạn này có những

thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắtđầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắptrong các hạt môi trường trong lòng môi trường

 Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màutrắng xám bằng mắt thường

 Môi trường được kết lại khá chặt

 Độ ẩm môi trường giảm dần

 Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-450C

 Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh củanấm sợi

 Enzym protease được tổng hợp mạnh.

 Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giaiđoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trìtrong khoảng 29-300C là tốt nhất

 Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ Ở giai đoạn này có một số thay

đổi cơ bản như sau:

 Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng

sẽ chậm lại

 Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khímôi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/1giờ Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C, trong giai đoạn này, bào tử được

hình thành nhiều do đó lượng Enzym protease tạo ra sẽ giảm xuống.

Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rấtcần thiết

3.3.1.4 Thu nhận sản phẩm

- Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme

protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần

enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối VSV, thành phần môi trường và nướctrong môi trường)

- Để đảm bảo cho chế phẩm enzyme protease không bị mất hoạt tính

nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp (thiết bịsấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không) Độ ẩm cần đạt được sau khiquá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn10% độ ẩm Để đảm bảo hoạt tính enzymekhông thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38 - 400C Enzym protease ở nấm mốc Asp.oryzae sẽ bị bất hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60 - 700C

- Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô này ngay khôngcần phải quá trình tinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phảitiến hành làm sạch enzyme Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phải tiếnhành như sau:

 Toàn bộ khối lượng enzym thô protease được đem đi nghiền nhỏ Mụcđích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ cácthành phần của chế phẩm thô Khi thành tế bào được phá vỡ, cácenzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào

Phần lớn enzym protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế

bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường Khi ta nghiền nhỏ,enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn

 Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trongtrường hợp này được dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh Các chấtnày là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăngmức độ ma sát Trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phảiđược rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước vàtiêu diệt VSV

a Trích ly

- Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease.

Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thườngdùng nước như một dung môi hòa tan Cứ một phần chế phẩm enzym thô,

người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thuriêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủytinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn).

- Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứanước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Việc tiếp theo là làmsao tách enzyme ra khỏi vật chất này

b Quá trình kết tủa enzyme protease:

- Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhângây tủa Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn vàsunfat amon Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tácnhân gây tủa khác

- Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzymethô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme Khi đổchất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránhhiện tượng biến tính

- Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liềulượng như sau: Cứ một phần dung dịch enzym thô người ta cho 2 đến 2,5 lầncồn hoặc sulfat amon

- Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzyme thô, người ta tiến hành khuấynhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-70C) theo thờigian, các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn

và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W)

- Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảoquản người ta sấy kết tủa enzyme protease ở 400C cho đến khi độ ẩm cuối cùngđạt 5-8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương)

- Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫnhoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa 1 số enzyme ngoàienzyme ta quan tâm

3.3.2 Theo phương pháp nuôi cấy bề sâu