mô hình ảnh hưởng của asparaginase trong việc giảm sự hình thành acrylamide trong bánh quy

Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, acrylamide có trong thực phẩm giàu carbohydrate được chế biến ở nhiệt độ cao sẽ hình thành acrylamide..  Công thức phân tử là C3H5NO  Acrylamide cũng c

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

BÀI TIỂU LUẬN NHÓM 3

Môn: CÔNG NGHỆ ENZYME

MỤC LỤC

Mở đầu 1

I Giới thiệu về enzyme asparaginase và chất acrylamide: 1

1 Sơ lược về chất acrylamide: 1

2 Enzyme asparaginase: 2

II Vật liệu phương pháp: 4

1 Chuẩn bị vật liệu: 4

2 Phân tích acrylamide: 5

3 Phân tích màu sắc: 6

4 Xác định hàm lượng chất rắn: 7

5 Phương trình đa thức và phân tích thống kê: 7

III Kết quả và thảo luận: 8

IV Kết luận: 16

V Một số enzyme dùng trong sản xuất bánh kẹo: 17

Tài liệu tham khảo 18

Mở đầu

Bánh quy là một trong những loại bánh nướng phổ biến và được sử dụng rất nhiều ở Việt Nam cũng như trên thế giới Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, acrylamide có trong thực phẩm giàu carbohydrate được chế biến ở nhiệt độ cao sẽ hình thành acrylamide Nguyên nhân hình thành acrylamide trong thực phẩm là do phản ứng của asparagin và đường khử như glucose và fructose xảy ra ở nhiệt độ cao( nướng hay chiên ở nhiệt độ lớn hơn

1200C) và độ ẩm thấp Bánh quy cũng được nướng ở nhiệt độ cao nên cũng có khả năng tạo acrylamide Trong bài tiểu luận này nhóm sẽ trình bày ảnh hưởng của asparaginase trong việc giảm sự hình thành acrylamide trong bánh quy

1 Sơ lƣợc về chất acrylamide:

 Acrylamide là một chất hóa học được sử dụng chủ yếu trong một số ngành công nghiệp như làm giấy, thuốc nhuộm, nhựa và trong xử lý nước uống, nước thải Hợp chất này được tìm thấy trong một số sản phẩm tiêu dùng, như bao bì thực phẩm, một số chất kết dính và trong khói thuốc lá

 Công thức phân tử là C3H5NO

 Acrylamide cũng có thể hình thành trong một số loại thực phẩm giàu tinh bột như chiên, nướng ở nhiệt độ trên 1200C Cơ quan Nghiên cứu Quốc tế về Ung thư (IARC) - một phần của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã phân loại acrylamide và coi đó như một "chất gây ung thư có thể xảy ra" ơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (EPA) duy trì các hệ thống tích hợp rủi ro thông tin (IRIS), một cơ sở dữ liệu điện tử có chứa thông tin về ảnh hưởng sức khỏe con người khi tiếp xúc với các chất khác nhau trong môi trường cũng phân loại acrylamide là "có thể là một chất gây ung thư cho con người" dựa trên các nghiên cứu ở động vật

 Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu để giảm lương acrylamide trong thực phẩm Trong đó việc sử dụng enzyme asparaginase tiền xử lý với khoai tây, bột đã được tuyên bố để giảm hiệu quả nồng độ acrylamide mà không làm thay đổi diện mạo và vị của sản phẩm cuối cùng Hiệu quả của asparaginase trong việc giảm

acrylamide được chứng minh bằng một số đơn xin cấp bằng sáng chế liên quan đến các loại thực phẩm chế biến khác nhau, như thức

ăn nhanh, khoai tây chiên, các loại thực phẩm dạng bột, vv Vì nó được biết đến, asparaginase xúc tác quá trình thủy phân asparagine thành axit aspartic và amoniac, do đó loại bỏ được một tiền thân then

chốt cho sự hình thành acrylamide

2 Enzyme asparaginase:

 Asparaginase (L- asparaginase amidohydrolase) là enzyme thủy phân Lasparagine thành aspartic và amoniac Asparaginase có mặt ở thực vật, động vật, vi sinh vật ở thực vật, phần lớn nghiên cứu enzyme này từ cây đậu Ở động vật, enzyme này được tìm thấy trong gan gà Ở vi sinh vật thì enzyme này có ở một số chuẩn: Escherichia coli, serretia marcescens, Pseudomonas, aeruginosa, aerobacter aerogens Một số nấm mốc, nấm men cũng có thể sản sinh ra asparaginase

Hình 1: cấu trúc 3D của enzyme asparaginase

 Asparaginase có thể được tổng hợp nội bào hoặc ngoại bào, hầu hết các chủng sản sinh asparaginase ngoại bào thuộc nấm sợi asparaginase sinh ra từ các sinh vật khác nhau thì có khối lượng phân tử khác nhau: từ 40-200 kDa Tính chiệu nhiệt của asparaginas khác nhau thường khác nhau Asparaginase của một số vi khuẩn như

là P.earuginosa hoạt động tối ưu ở 370C, trong khi asparaginase của Chrombacteriaceae có nhiệt độ tối ưu chỉ là 200C,…

 Cơ chế xúc tác của asparaginase: Asparaginase giảm lượng acrylamide tạo thành trong sản xuất bánh quy là do sự thủy phân axit

amin asparagine Enzyme asparaginase sẽ xúc tác thủy phân axit amin asparagine thành axit aspartic và amoni, do đó không cho asparagine tham gia vào phản ứng Mailard để hình thành acrylamide Việc này bổ sung chế phẩm sinh học mà không làm ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của bánh quy vì vẫn còn những acid amin khác tham gia phản ứng Mailard để tạo màu cho bánh quy mà không sinh ra các hợp chất gây ung thư như acrylamide

 Enzym thương mại dựa trên việc nhân bản Aspergillus oryzae đã nhận được công nhận là 'trạng thái an toàn' bởi Hoa Kỳ và đã được đánh giá bởi Ủy ban chung của FAO / WHO về phụ gia Thực phẩm (JEFCA, 2007) Nó được cho phép sử dụng ở Hoa Kỳ, Úc, New Zealand, và Đan mạch Ở Canada, nơi mà các enzyme được sử dụng trong các ứng dụng thực phẩm có thể được coi là các chất phụ gia thực phẩm, nên các Quy định cho phép sử dụng asparaginase như một chất phụ gia thực phẩm (Health Canada, 2009) Trong năm

2008, Ủy ban Thường vụ về Chuỗi Thực phẩm và Thú y đã cho phép

sử dụng asparaginase cho sản xuất các sản phẩm bánh ở hai quốc gia thành viên của EU, vì các nhà sản xuất đã tuyên bố rằng enzym này

bị bất hoạt trong quá trình chế biến nhiệt như nướng

 Các nghiên cứu cho thấy hoạt tính asparaginase bị ảnh hưởng bởi liều enzyme, thời gian phản ứng, nhiệt độ và pH mà tại đó phản ứng xảy ra ) Đặc biệt, asparaginase A oryzae được cho thấy hoạt động mạnh nhất trong khoảng pH trung tính và ở nhiệt độ lên tới 60oC Hơn nữa, hoạt tính của enzim chịu ảnh hưởng bởi sự tiếp xúc với chất nền Trong thực tế, sự di chuyển hạn chế của chất nền và enzyme sẽ thủy phân Asparagine không hoàn toàn và chỉ một phần giảm hình thành acrylamide Về mặt này việc phân hủy thực phẩm, cũng như hàm lượng nước trong môi trường phản ứng, có thể ảnh hưởng lớn đến hiệu quả asparaginase trong việc giảm sự hình thành acrylamide Trên thực tế, việc giảm hàm lượng acrylamide rất lớn có thể đạt được bằng cách sử dụng nồng độ asparaginase tương đối thấp trong thức ăn có công thức (lên đến 1000 U / kg), chẳng hạn như các sản phẩm bánh và đồ ăn nhẹ dựa vào khoai tây vì có thể đạt được sự phân bố enzym tốt trong hệ thống Ngược lại, cần phải có nồng độ asparaginase rất cao (> 10,000 U / l dung dịch chiên sơ chiên) để giảm acrylamide trong khoai tây chiên (Pedreschi, Kaack, & Granby, 2008) Tuy nhiên, trong trường hợp này, bất kỳ hoạt động

công nghệ nào có thể làm tăng sự khuếch tán chất nền và tiếp xúc với enzym có thể làm giảm mức độ acrylamide Ngược lại, cần phải

có nồng độ asparaginase rất cao (> 10,000 U / l dung dịch chiên sơ chiên) để giảm acrylamide trong khoai tây chiên (Pedreschi, Kaack,

& Granby, 2008) Tuy nhiên, trong trường hợp này, bất kỳ hoạt động công nghệ nào ủng hộ sự khuếch tán chất nền và tiếp xúc với enzym

có thể làm giảm mức độ acrylamide Đây là trường hợp miếng khoai tây sau khi được xử lý với asparaginase hoàn toàn

 Không có mô hình cơ bản về ảnh hưởng của asparaginase đối với động học của sự hình thành acrylamide Do sự phức tạp của mối quan hệ giữa các biến môi trường liên quan đến quá trình enzyme và

sự hình thành acrylamide, hoạt tính enzyme hiệu quả và nồng độ acrylamide cuối cùng đạt được, một nghiên cứu về các mối quan hệ này là cần thiết để tìm ra những điều kiện tốt nhất để giảm thiểu sự hình thành acrylamide Sự biến thiên tự nhiên trong các quá trình nướng là một yếu tố ảnh hưởng và hình thành acrylamide đã được thay đổi đáng kể giữa các mặt hàng với các thành phần tương tự và các quy trình nấu ăn (Levine & Smith, 2005) Hơn nữa, Bråthen và Knutsen (2005) cho thấy độ biến thiên đóng một vai trò quan trọng trong các hệ thống tinh bột ảnh hưởng đến giá trị cuối cùng của acrylamide sau quá trình nướng bánh Nếu quá trình này được mở rộng, sự khác biệt này cần phải được đánh giá, để đúng sai có thể được thiết lập trong phạm vi biến thiên bình thường của một quá trình công nghiệp (Aguirre, Frías, Barry-Ryan,Grogan, 2008) Mục đích của nghiên cứu này là để điều tra ảnh hưởng của asparaginase trong việc giảm sự hình thành acrylamide trong bánh quy bột ngắn Ảnh hưởng của bổ sung asparaginase lên sự phát triển nâu cũng được nghiên cứu Đặc biệt, nồng độ asparaginase, thời gian ủ và nhiệt độ được điều chế theo ba biến thể, thiết kế trung tâm ba cấp

1 Chuẩn bị vật liệu:

Công thức bao gồm bột, bơ thực vật (Unigrà, Ý), sucrose (Carlo Erba, Milano Italy), nước, glucose (Carlo Erba, Milano, Ý), muối (Carlo Erba, Milano Italy), asparagine (Sigma-Aldrich, Italy) và bột nướng (natri hydro cacbonat, disodium diphosphate, tinh bột sấy khô) (Cameo, Ý) Các thành phần không phải bột được thêm vào công thức với tỷ lệ tương ứng là 40%, 35%, 20%, 5%, 0.7%, 0.1% và 0.5% bột Các loại asparaginase khác nhau (Novozymes A / S, Đan Mạch, 3500 U

/ g), trong khoảng từ 100 U / kg bột đến 900 U / kg bột, được thêm vào công thức này theo một công thức ba thành phần, (CCD) (Bảng 1) Để đảm bảo sự phân bố đồng nhất trong bột, asparaginase đã được phân tán trong pha nước trước khi nó được bổ sung vào các thành phần khô Nó đã được bổ sung vào các thành phần khô Sau khi trộn và thời gian nghỉ 30 phút ở 4 0 C, bột được làm thành 0,3 cm, cắt thành đường kính 7 cm và để lại trong một thiết bị nhiệt ở nhiệt độ và thời gian ủ khác nhau theo CCD (Bảng 1) Đặc biệt, nhiệt độ ủ dao động từ 20 đến 54

C và thời gian ủ từ 10 đến 30 phút Theo số liệu nghiên cứu, enzim hoạt động trong phạm vi biến đổi này (Hendriksen và cộng sự, 2009) Ngoài ra, nhiệt độ và thời gian phản ứng được chọn có thể tương ứng với nhiệt độ nghỉ ngơi Và thời gian thường được áp dụng cho bột ở cấp độ công nghiệp Các mẫu được nướng trong lò không khí tuần hoàn (Salvis Thermocenter, Oakton, Vernon Hills, IL, USA) ở 2000 C đến độ ẩm cuối cùng là 2% Bánh quy pha chế mà không bổ sung asparaginase được lấy làm kiểm chứng Để đánh giá sự biến đổi của quá trình này,

mô phỏng tình hình công nghiệp, quá trình này đã được lặp lại với sáu mẻ bánh quy bột khác nhau

Bảng 1: Kết hợp asparaginase, nhiệt độ ủ và thời gian chạy khác nhau của ba biến, ba cấp độ thiết kế tổng hợp trung ƣơng

2 Phân tích acrylamide:

Xác định Acrylamide được thực hiện theo phương pháp Anese et al (2009) Tóm lại, 1000 lít dung dịch nước dung dịch 2,3,3 [2H3] acrylamide (d3-acrylamide) (0,20 lg / ml) (Isotec, Sigma-Aldrich, Ý) theo tiêu chuẩn nội bộ và 15 ml nước Milli Q Millipore, Ý) được thêm vào 1 g bánh quy xay nhỏ xay thành một ống ly tâm 100 ml Sau khi tách ở 600C trong 30 phút khi khuấy từ, hỗn hợp được ly tâm

ở 12 000vòng/phút trong 15 phút ở 40C (Beckman, Avanti Centrifyge J-25, Palo Alto, CA, USA) Lượng 10 ml dung dịch nước tinh khiết được làm sạch bằng phương pháp SPE trên Isolute Env +, 1 g (Biotage, Thụy Điển) Thể tích của giải hấp phụ được giảm xuống dưới chân không, khoảng 1,5-2 ml bằng cách sử dụng thiết bị bay hơi quay ở nhiệt độ 800C và lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi phân tích HPLC-MS LC-ESI-MS-MS, trong chế độ ion dương, các phân tích được thực hiện bởi một máy đo quang phổ khối Finnigan LXQ (Thermo Electron Corporation, San Josè, CA, USA) kết hợp với một máy dò LC Finnigan Surveyor Plus được trang bị một máy tự động lấy mẫu nhiệt và một lò nung nhiệt Cột phân tích là Waters Spherisorb ODS2 (250 2.0 mm, 5 µm) Tiệt trùng được tiến hành ở tốc độ dòng chảy 0,1 ml / phút, trong điều kiện đẳng chế, ở 300C sử dụng như pha động, pha với 98,9% nước, 1% methanol và 0,1% axit formic (v / v / v) Toàn quét

MS / MS được thực hiện bằng cách chọn các ion ở m / z 72 và m / z 75 là các ion tiền thân của acrylamide và d3-acrylamide Diện tích các đỉnh sắc ký của ion chiết xuất tại m / z 55, do sự chuyển tiếp 72> 55, và tại m / z 58, do sự chuyển tiếp 75>

58, đã được sử dụng để phân tích định lượng Việc phân tích định lượng được tiến hành theo phương pháp của tiêu chuẩn nội bộ Hệ số đáp ứng tương đối của acrylamide đối với d3-acrylamide được tính hàng ngày bằng cách phân tích một dung dịch tiêu chuẩn Đối với mỗi lần chạy, các phân tích được thực hiện trong bản sao trên sáu thí nghiệm nhân rộng Nồng độ Acrylamide được biểu diễn bằng

*, sau đó được tính từ Eq (1) (Clydesdale, 1978):

Trong đó:

L *, a *, b * là giá trị màu thực tế

L*0, a*0 và b*0 là các giá trị màu cho một mẫu kiểm soát, tức là đạt được nếu không có asparaginase

Đối với mỗi lần chạy, các phân tích được thực hiện ít nhất là ba lần trên ba thí nghiệm nhân rộng

4 Xác định hàm lượng chất rắn:

Tổng hàm lượng chất rắn được xác định bằng phương pháp trọng lượng bằng cách làm khô các mẫu trong buồng chân không (1,32 kPa) ở 750C cho đến khi có trọng lượng không đổi

5 Phương trình đa thức và phân tích thống kê:

Mô hình hóa là nhằm mô tả sự thay đổi nồng độ acrylamide và dữ liệu màu sắc như một hàm của các biến của thiết kế tổng hợp trung ương

Trong trường hợp phân tích acrylamide, các biến mã hóa được sử dụng để mô hình hóa sự thay đổi này:

̅ Trong đó: x là biến giải thích bình thường

̅ là giá trị trung bình của biến và ∆x là khoảng giữa giá trị cực đại và cực tiểu của

x

Các thư viện lme và lme4 của gói phần mềm R (R Development Core Team, 2009) đã được sử dụng để phù hợp với một mô hình hiệu ứng hỗn hợp với các thành phần sau:

1 Một thành phần hiệu ứng cố định bao gồm một mô hình đa thức bậc hai với các biến phụ thuộc

2 Một thành phần hiệu ứng ngẫu nhiên có chứa các tác động của biến đổi về sự hình thành acrylamide

Kết quả được biểu diễn theo:

) )

Trong đó: B0 là hằng số và Bi, Bii, Bij là các hệ số hồi quy của mô hình và xi và xj

là các biến độc lập với các giá trị mã hoá Các vector b đại diện cho các hiệu ứng ngẫu nhiên, nghĩa là các biến thể do tính chất ngẫu nhiên gắn liền với ma trận mô hình Z với ma trận tương quan-hiệp phương sai E có chứa các dự đoán có thể ảnh hưởng đến sự thay đổi nồng độ acrylamide N biểu thị sự phân bố bình thường đa lượng

Để xây dựng một mô hình với số lượng tối thiểu của các thông số hiệu ứng cố định các thủ tục sau đây đã được thực hiện:

1 Một mô hình đa thức bậc hai với tất cả các hiệu ứng cố định đã được xây dựng và ý nghĩa của các tham số đa thức được khảo sát (mô hình "đầy đủ")

2 Giảm các mô hình mà có thể loại trừ các điều khoản không quan trọng từ đa thức đã được trang bị và khả năng của họ để dự đoán nồng độ acrylamide trong nghiên cứu so với

mô hình đầy đủ thông qua một thử nghiệm tỷ lệ log-likelihood (LRT)

3 Xóa các điều khoản khác trong mô hình tuyến tính đã được theo dõi cho đến khi đạt được mô hình với một tập các thông số cố định (p <0,05) tối thiểu và với sự khác biệt không đáng kể trong việc dự báo đối với mô hình đầy đủ (thông qua LRT)

Trong trường hợp phân tích màu, Statistica for Windows (Statsoft Inc., 1993) đã được sử dụng để phù hợp với các mô hình bậc hai với các biến phụ thuộc sử dụng phương trình sau:

Các tiêu chí để loại bỏ một biến từ phương trình hồi quy đầy đủ dựa trên R2, sai số chuẩn

để ước lượng (SE) và ý nghĩa F-test (và các giá trị p có nguồn gốc)

Bảng 2 cho thấy giá trị trung bình của acrylamide và độ lệch chuẩn tương ứng của bánh quy bột ngắn được thêm vào với asparaginase theo CCD Đối với mỗi lần chạy CCD, kết quả nồng độ acrylamide được dựa trên hai phân tích lặp lại trên sáu

mẻ bánh quy bột ngắn khác nhau, tức là sử dụng cùng công thức và quy trình Mặc

dù lặp lại trong mỗi lô là tốt, với độ lệch chuẩn dao động từ 0,1 đến 10, kết quả giữa các đợt của mỗi lần chạy khác nhau rất nhiều Ví dụ, nồng độ acrylamide trong mẫu điều trị bằng asparaginase được làm với 500 U / kg và thời gian ủ 20 phút ở 200C (chạy 12) dao động từ 49 đến 120 ng / gdm, trung bình 90 ng / gdm

và một coeffi - mức biến động của 25% Các biến thể thử nghiệm tương tự được tìm thấy bởi Hendriksen et al (2009) trong bánh bích quy ngọt vừa Các thành phần biến đổi phát sinh từ

việc phân tích acrylamide hoặc từ các bản sao của cùng điều kiện thí nghiệm với cùng một lô bánh quy không đủ lớn để đóng góp cho 25% biến thể này và do đó kết luận rằng nguồn gốc này phát sinh từ việc chuẩn bị và chế biến các lô bánh quy khác nhau Dưới ánh sáng của một biến thể có thể xảy ra giữa các lô bánh quy được chuẩn bị, dữ liệu được phân tích bằng cách sử dụng mô hình hiệu ứng hỗn