môi trường nuôi cấy trong lên men công nghiệp

Toàn bộ các chủng vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng, phát triển vàtạo sản phẩm trao đổi chất đều cần nước, nguồn năng lượng, nguồn carbon, nguồnnitrogen, nguồn khoáng vi lượng, vit

I GIỚI THIỆU

Môi trường nuôi cấy được thiết kế tùy theo yêu cầu của chủng vi sinh vật, phươngpháp lên men và sản phẩm mục tiêu Trước khi thiết kế môi trường lên men cần khảo sátchi tiết về nhu cầu dinh dưỡng của chủng, nguồn cơ chất trực tiếp tạo ra sản phẩm và hệthống thiết bị công nghệ lên men Tuy nhiên các môi trường lên men đều có chung một sốyêu cầu căn bản Toàn bộ các chủng vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng, phát triển vàtạo sản phẩm trao đổi chất đều cần nước, nguồn năng lượng, nguồn carbon, nguồnnitrogen, nguồn khoáng vi lượng, vitamin và oxygen (đối với trường hợp hiếu khí) Đốivới qui mô phòng thí nghiệm thì việc chuẩn bị môi trường tương đối đơn giản vì thườngdùng các hợp chất tinh khiết Tuy nhiên với qui mô sản xuất công nghiệp thì công đoạnnày khá phức tạp

Trong công nghiệp người ta dùng các nguồn dinh dưỡng khác nhau để chuẩn bị môitrường với yêu cầu là thỏa mãn các điều kiện sau đây càng tốt:

• Tăng cường tối đa hiệu suất tạo sinh khối và sản phẩm

• Tăng cường tối đa nồng độ sinh khối hoặc sản phẩm

• Cho phép tạo được tốc độ sản xuất tối đa

• Hạn chế đến mức tối thiểu hiệu suất tổng hợp các sản phẩm không mong muốn

• Ổn định chất lượng và sẵn sàng cho sử dụng quanh năm

• Hạn chế đến mức tối thiểu các vấn đề nảy sinh, gây trở ngại cho việc khuấy trộn, chiết,tinh sạch và xử lí chất thải

Cần lưu ý là việc chọn môi trường có liên quan mật thiết đến thiết kế nồi lên men,ảnh hưởng đến quá trình thu hồi sản phẩm và quá trình xử lí chất thải sau lên men

II PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG LÊN MEN

Hiện nay, có rất nhiều loại môi trường được sử dụng trong công nghiệp lên men, tùyvào điều kiện hiện tại và mục đích lên men mà người ta sẽ thiết kế và lựa chọn những loạimôi trường phù hợp

- Dựa vào đặc tính vật lý của môi trường mà người ta phân loại thành:

+ Môi trường lỏng: môi trường này chủ yếu phục vụ cho quá trình lên men chìm.

+ Môi trường rắn: môi trường này chủ yếu phục vụ cho quá trình lên men bề mặt.

+ Môi trường bán rắn (hoặc xốp): phục vụ cho lên men bề mặt

- Dựa vào thành phần môi trường người ta phân thành:

+ Môi trường tự nhiên: nguyên liệu tự nhiên có nguồn gốc động, thực vật Thành phần

hoá học chính xác của các nguyên liệu trong môi trường này đến nay chưa biết rõ hoặcxác định rất khó khăn

+ Môi trường tổng hợp: môi trường có thành phần xác định thường dùng trong lên men

quy mô phòng thí nghiệm

+ Môi trường bán tổng hợp: bên cạnh những thành phần tự nhiên còn bổ sung 1 lượng

chính xác các chất dinh dưỡng, chất kích thích tăng trưởng hay các nguyên tố vi lượng

- Dựa vào mục đích sử dụng của môi trường người ta phân thành:

+ Môi trường hoạt hóa chủng: các dạng môi trường thạch trong đĩa petri hay môi trường

thạch nghiêng trong ống nghiệm giúp phục hồi các đặc tính vốn có của chủng vi sinh vật.+ Môi trường nhân giống: thường là môi trường lỏng với quy mô từ 100-500 ml, môi

trường này sẽ giúp tạo một lượng sinh khối đủ lớn để đưa vào qui trình sản xuất

+ Môi trường lên men sản xuất: sử dụng trong các nồi lên men sản xuất để thu sinh khối

tế bào, sản phẩm biến dưỡng,

III CÁC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN

1 Nước

1.1 Yêu cầu nước cho lên men

 Nước dùng cho các xí nghiệp lên men phải đáp ứng được những yêu cầu về nước uống,không có mùi vị, không màu, trong suốt

Các yêu cầu về nước uống như sau:

• Độ cứng chung, mg đương lượng không quá 7

• Hàm lượng các chất, mg/l không quá

• Tổng số lượng vi sinh vật trong 1ml không quá 100 (CFU/ml)

• Số lượng trực khuẩn đường ruột trong 1l nước:

Chuẩn coli, ml, không nhỏ hơn 300

Chỉ số coli, không lớn hơn 3

 Đối với nguồn nước giếng hoặc thủy vực cho phép chuẩn coli không nhỏ hơn 100 (chỉ số coli là 10) Nói chung về nước uống không cho phép có mặt ammoniac và các muối của

acid nitrit, về các muối của kim loại nặng (thủy ngân, bari…) Độ oxi hóa của nướckhông vượt quá 3,0mg O2/l Trong một số trường hợp riêng biệt, được sự đồng ý của các

cơ quan giám sát vệ sinh cho phép độ cứng chung cũng không quá 14 mg đương lượng

 Nước dùng cho sản xuất bia, ngoài yêu cầu chung về chất lượng nước còn có những yêucầu cụ thể sau:

Carbon với giới hạn nồng độ, mg/l 50

Độ cứng tạm thời đối với bia sáng màu vào khoảng 0,71 mg đương lượng và độ cứngvĩnh cửu là 0,36- 0,72 mg đương lượng, đối với bia sẫm màu, độ cứng tạm thời là 2,85 –4,8 mg đương lượng và độ cứng vĩnh cửu không xác định.

 Nước dùng pha nước ngọt và rượu có độ cứng chung không quá 1,6 mg đương lượng và

độ cứng tạm thời 0.36 mg đương lượng Nếu nước có chứa các chất rắn lơ lửng, hoặc độcứng vượt quá tiêu chuẩn thì cần phải được xử lí trước khi sử dụng

b) Đông tụ hay keo tụ

Khi trong nước có thể keo thì rất khó cho việc lọc bình thường Trong trường hợpnày, cần bổ sung chất keo tụ làm cho các thể keo kết lại với kích thước lớn hơn và sau đó

để lắng cặn Quá trình này được họi là đông tụ Những chất làm đông tụ là sunfat nhôm,sunfat sắt Sunfat nhôm còn được gọi là phèn Có hai dạng phèn đơn và phèn kép Ngàynay người ta còn tạo ra các dạng polymer của các dạng phèn này có khả năng đông tụcao Sunfat nhôm được cho vào nước phản ứng với các bicarbonat canxi và magie:

Al2(SO4)3 + 3Ca(HCO3)2 = 2Al(HCO3)3 + 3CaSO4

Al(HCO3)3 không bền và phân hủy thành nhôm và carbonic

Al(HCO3)3 = Al(OH)3 + CO2

Hydroxit nhôm tạo thành các dạng dịch keo, các dịch thể trong keo mang điệndương, xảy ra sự keo tụ các thể keo của nước và hydroxit nhôm, tạo thành cặn lắngxuống đáy Cặn lắng này kéo theo các vật thể rắn nhỏ ở dạng huyền phù, để lắng và lọc

c) Làm mềm nước

Làm mềm nước được tiến hành bằng các phương pháp với vôi, xút vôi và trao đổiion Phương pháp dùng vôi làm mềm nước thường dùng với nước có độ cứng tạm thờicao và độ cứng vĩnh cửu thấp Phản ứng xảy ra như sau:

Ca(HCO3)2 + Ca(OH)2 = 2CaCO3 + 2H2OMg(HCO3)2 + Ca(OH)2 = CaCO3 + MgCO3 + 2H2O MgCO3 hòa tan khá tốt trong nước và lại phản ứng với hydroxyt canxi thànhMg(OH)2 không tan

MgCO3 + Ca(OH)2 = Mg(OH)2 + CaCO3

Sau đó đem lọc

Để làm giảm độ cứng tạm thời và độ cứng vĩnh cửu của nước, người ta sử dụngphương pháp xút vôi (hydroxyt canxi và natri carbonat): hydroxyt canxi làm kết lắng cácmuối trong độ cứng tạm thời, còn natri carbonat – các muối của độ cứng vĩnh cửu

CaSO4 + Na2CO3 = CaCO3 + Na2SO4

MgSO4 + Na2CO3 = MgCO3 + Na2SO4

MgCO3 + Ca(OH)2 = Mg(OH)2 + CaCO3

Các cặn lắng được lọc bỏ

d) Phương pháp trao đổi ion

Trao đổi ion là sự trao đổi ion của nước với nhựa ionit Nhựa ionit là các vật liệu rắnkhông tan trong nước, có khả năng trao đổi ion Nếu nhựa có khả năng trao đổi với cáccation thì được gọi là catinoit, ngược lại là anionit

Ionit có thể là chất hữu cơ hay vô cơ, có trong tự nhiên hoặc nhân tạo Các cationit cónguồn gốc vô cơ tự nhiên là nhóm các silicat alumin (nhôm silicat), như xeolit, đất sét,glaucolit (kali sắt alumino silicat),… Những ionit tổng hợp nhân tạo là permunit(aluminat silicat acid yếu) Ionit hữu cơ trong tự nhiên là acid humic có trong đất, có tácdụng điều chỉnh dinh dưỡng thực vật và acid humic của than đá, than nâu

Trong xí nghiệp lên men hay dùng than lưu huỳnh để làm mềm nước Khi lọc nướcqua than lưu huỳnh (Na – cation) sẽ xảy ra các phản ứng sau:

Na2R + CaSO4 = CaR + CaSO4

Na2R + CaCl2 = CaR + 2NaCl

cả các ion Na+ sẽ trao đổi với ion Ca2+ và Mg2+ Khả năng trao đổi ion của nhựa sẽ giảmdần theo thời gian Để phục hồi khả năng này ta cho chảy vào cột dung dịch NaCl:

CaR + 2NaCl = Na2R + CaCl2

Dùng Na- cation làm cho nước giảm độ cứng đáng kể, nhưng phương pháp nàykhông làm giảm độ kiềm của nước Nếu yêu cầu làm giảm độ kiềm, có thể acid hóa nước

đã mềm bằng acid sunfuric hoặc acid clohydric

Phản ứng trung hòa xảy ra như sau:

2NaHCO3 + H2SO4 = Na2SO4 + 2H2O + 2CO2

Có thể làm mềm nước bằng cách kết hợp hai phương pháp với vôi và Na – cationit.Vôi sẽ khử độ cứng tạm thời, còn Na – cationit loại các muối vĩnh cửu Cũng có thể dùngH- cationit làm mềm nước Ion H+ được trao đổi với ion Ca2+ và Mg2+ Nước chảy quaphin lọc chứa nhựa H – cationit và các phản ứng xảy ra như sau:

H2R + Ca(HCO3)2 = CaR + 2H2O + 2CO2

H2SO4 + Ca(HCO3)2 = CaSO4 + 2H2O + 2CO2

2HCl + Ca(HCO3)2 = CaCl2 + 2H2O + 2CO2

Để khử muối cho nước, người ta cho nước chảy liên tiếp vào lọc H – cationit và lọcanionit Trong phin lọc thứ nhất có các ion trong nước như Ca2+, Mg2+, Na+ và những ionkhác sẽ trao đổi với ion H+ của cationit, CO2 sẽ thoát ra Để khử các anion trong nước,người ta cho nước qua lọc chứa các anion ở dạng OH- và phản ứng xảy ra như sau:

2ROH + H2SO4 = R2SO4 + 2H2O

ROH + HCl = RCl + H2O

Vì vậy, nếu cho nước chảy qua cả 2 phin lọc thì có thể loại bỏ được tất cả các cationcũng như anion trong nước Tái sinh phin lọc H – cationit bằng cách cho dung dịch

H2SO4 hoặc HCl chảy qua, còn tái sinh lọc anionit dạng OH- bằng dung dịch xút

1.3 Khử khuẩn cho nước

Nước cung cấp cho lên men nếu nhiễm khuẩn vượt quá mức cho phép cần phải tiếnhành diệt khuẩn Diệt khuẩn có thể bằng phương pháp hóa học hoặc phương pháp vật lí,cũng có thể kết hợp 2 phương pháp:

Nước Javel ở dạng lỏng là chất oxy hóa rất mạnh, có tính sát khuẩn cao Clorua vôi ởdạng bột: hòa tan thành dịch 3 – 5% rồi cho vào nước Hiện nay diệt khuẩn người ta haydùng hợp chất của clo là các viên cloramin B (CH3C6H4SO2NaNCl) Dung dịch cloramin

B 0,02% có thể ức chế được tụ cầu vàng và diệt khuẩn đường ruột Các viên này thường

có 20 – 40% lượng clo hoạt động.Thời gian khử khuẩn khoảng 20 – 40 phút

Dùng clo diệt khuẩn cho nước thường còn dư một chút hóa chất này trong nước vàlàm cho nước có mùi clo Để khắc phục, người ta thường gia nhiệt hoặc thổi khí chonước Dùng clo còn có nhược điểm yếu nữa là nếu trong nước có mặt các hợp chất

phenol thì clo dễ kết hợp với phenol và tạo thành clophenol Hợp chất này với một nồng

độ vô cùng nhỏ cũng làm cho nước có mùi khó chịu

Một điều cần lưu ý: dùng clo diệt khuẩn cho nước chỉ với điều kiện nước chứa íthoặc không có chất hữu cơ Nếu nồng độ các chất hữu cơ cao dễ tạo thành phức chứa clo

ở dạng AOX Dạng này gây độc và có thể là tác nhân gây ung thư

Phương pháp này tiện lợi, nhưng cần phải trang bị thiết bị sinh ozon với tần số khácao

Ngoài hai phương pháp trên, người ta còn sử dụng ion bạc sát khuẩn nước Dịch chứaion này với nồng độ cực kì thấp cũng đã có khả năng sát khuẩn

c) Khử khuẩn bằng tia cực tím (UV)

Trong ánh nắng mặt trời có tia cực tím Đèn thủy ngân – thạch anh áp lực cao và đènthủy ngân – argon áp lực thấp sẽ sinh ra tia cực tím Tia cực tím được phát ra từ các đènđược chiếu qua nước Yêu cầu nước phải trong và ít, hoặc không có chất hữu cơ Nhượcđiểm của tia cực tím là không xuyên qua được vật rắn

Với nước, diệt khuẩn bằng ozon và clo có chi phí cao, phần nhiều chi phí là do thiếtbị

2 Nguồn năng lượng

Năng lượng cho sự tăng trưởng của vi sinh vật bắt nguồn hoặc là từ sự oxy hóa cácthành phần dinh dưỡng trong môi trường hoặc là từ ánh sáng Hầu hết trong công nghiệp

vi sinh, các chủng thường dùng là hóa dưỡng Do vậy, nguồn năng lượng thông dụng nhấtđược dùng là từ nguồn carbon như các carbohydrate, lipid và protein Một vài chủng còn

dùng được cả hydrocarbon hay methanol làm nguồn C và năng lượng cho quá trình tăngtrưởng và trao đổi chất Chu trình TCA vừa cung cấp các acid hữu cơ làm khung C đểhình thành các chất quan trọng khác cung cấp cho tế bào mặt khác còn cung cấp các chấtmang năng lượng lớn như NADH, FADH, các chất này sau đó di vào chuỗi chuyển điện

tử để tổng hợp ATP cung cấp nguồn năng lượng lớn cho hoạt động của tế bào

Các carbohydrate thường được sử dụng: glucose, lactose, succrose, xylose

Các protein: lysine, tryptophan, glycine

 Đường phân (Embden, Meyerhof và Parnas [EMP] Pathway)

Đây là con đường phổ biến nhất trong các vi khuẩn dị hóa đường (nó cũng được tìmthấy trong hầu hết các tế bào động thực vật) Một loạt các quá trình chuyển đổi đườngthành pyruvate, tạo ra ATP (adenosine triphosphate) và NADH (nicotinamide adeninedinucleotide) Năng lượng hóa học cần thiết cho các mục đích sinh tổng hợp được lưu trữtrong các hợp chất mới được thành lập (ATP và NADH)

* đề cập đến số lượng nguyên tử carbon trong phân tử

Có những lựa chọn thay thế cho con đường này cho việc chuyển hóa đường để sảnxuất năng lượng được lưu trữ trong ATP Chúng bao gồm các con đường pentosephosphate được tìm thấy trong hầu hết các tế bào động thực vật NADPH được tạo rabằng con đường này Một con đường khác, con đường Entner-Doudoroff thường chỉ đượctìm thấy trong các tế bào vi khuẩn nhất định

 Hô hấp kỵ khí

Hô hấp kỵ khí bao gồm đường phân và lên men Trong giai đoạn sau của quá trìnhnày NADH (tạo ra trong quá trình đường phân) được chuyển đổi trở lại NAD do mất một

nguyên tử hydro Hydro được thêm vào pyruvate và tùy thuộc vào loài vi khuẩn, một loạtcác trao đổi chất sản phẩm cuối cùng được sản xuất.

 Hô hấp hiếu khí

Hô hấp hiếu khí liên quan đến đường phân và chu trình acid tricarboxylic(Krebs) Pyruvate hoàn toàn bị phá vỡ thành carbon dioxide (C1) và trong quá trình này,NAD được chuyển thành NADH Vì vậy, trong quá trình lên men hiếu khí, NADH đượctạo ra từ hai nguồn (đường phân và chu trình Krebs) Phosphoryl hóa oxy hóa chuyển đổiNADH dư thừa trở lại NAD và trong quá trình sản xuất hơn ATP (lưu trữ nănglượng) Ubiquinone và cytochrome là những thành phần của chuỗi vận chuyển điện tửtham gia vào quá trình sau này Chuyển đổi oxy cho nước là bước cuối cùng trong tiếntrình

Chu trình Krebs (hợp chất C4-C6 trung gian)

Phosphoryl hóa oxy hóa

Chu trình Krebs có 4 và 6 carbon trung gian Pyruvate (C3) có thể được đưa vào chutrình Krebs trong một cách mà các số C4/C6 trung gian vẫn giữ nguyên hoặc tăng

a) Sự mất CO2 (C1) từ pyruvate thành acetyl CoA, tiếp theo là thêm vào một thànhphần cho C4 của chu kỳ (oxaloacetate) sản xuất một thành phần C6 (acid citric) Do đó số

lượng của các phân tử của C6 sản xuất tương đương với số lượng của các phân tử của C4đầu xuất hiện.

b) Nhờ vào sự thêm CO2 thành pyruvate, một hợp chất C4 được sản xuất Trongtrường hợp này, các phân tử bổ sung của C4 (một thành phần chu kỳ) được hình thành

Vì vậy, nếu một số thành phần chu kỳ được loại bỏ để sử dụng trong con đường sinh tổnghợp khác, chúng có thể được bổ sung thông qua phản ứng này

Chuyển hoá các axit béo

Các acid béo được cắt thành các nhóm acetyl (C2) và tham gia chu trình TCA nhờviệc kết hợp với một chất trung gian C4 để tạo thành C6 Trong suốt chu trình, C2 đượcgiải phóng dưới dạng CO2 còn C4 được tái tạo Về toàn thể phản ứng, không xảy ra sựtăng lên về số lượng phân tử các sản phẩm trung gian Vì thế nếu các acid béo là nguồn

C, không có chất trung gian chu trình TCA nào có thể bị loại bỏ mà không làm dừng chutrình

Thay vào đó, vi khuẩn sử dụng chu trình glyoxylate, trong đó nhờ các bước xúctác enzyme sẽ phóng thích 2 phân tử CO2 từ chất trung gian C6 Chất trung gian C6 nàysau đó được chuyển thành hai hợp chất C4 Vì vậy đối với nhóm acetyl từ các acid béo,chất trung gian thêm vào chu trình có thể được tạo thành Con đường glyoxalte thườnghiếm khi tìm thấy ở tế bào động vật do việc sử dụng các tiền acid béo – chủ yếu từ thức

ăn

3 Nguồn carbon

a) Vai trò: carbon là nguồn dinh dưỡng quan trọng

− Thành phần cấu trúc tế bào (50% vật chất khô)

− Cung cấp năng lượng

− Nguồn carbon được sử dụng thường có ảnh hưởng đến sự tổng hợp sinh khối haycác sản phẩm trao đổi sơ cấp và thứ cấp

b) Nguồn cung cấp

Các nguồn C thường dùng là carbohydate: bột ngô, bột ngũ cốc, khoai tây, bột mì.Các loại trên được dùng nhiều trong sản xuất bột ngọt, rượu…

 Từ các nguyên liệu đường:

Mật rỉ: là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô vàkết tinh Chứa các loại đường như sucrose, glucose, fructose Thường dùng để sản suấtrượu rum

• Mật rỉ mía: còn có chứa các hợp chất nitrogen, các vitamin và các hợp chất vô cơ.Ngoài ra trong rỉ đường còn chứa một số chất keo, vi sinh vật tạp nhiễm bất lợicho quá trình lên men sau này, vì vậy tùy theo mục đích sử dụng khác nhau màngười ta cần xử lý rỉ đường trước khi đưa vào sử dụng làm môi trường nuôi cấy visinh vật trong công nghiệp lên men

• Mật rỉ củ cải đường: là nước cốt sinh ra trong quá trình sản xuất đường từ củ cảiđường Dịch này được cô đặc có thể dùng lâu dài

 Nguồn carbon từ tinh bột và cellulose:

• Tinh bột được sử dụng dưới dạng hạt hoặc bột của khoai, sắn, lúa, đại mạch Dạng nguyên liệu này trước khi sử dụng làm môi trường lên men vi sinh vật phảiqua khâu xử lý và đường hóa Đối với các chủng vi sinh vật có hệ enzyme amylasephát triển có thể sử dụng trực tiếp tinh bột không thông qua khâu đường hóa

• Cellulose được sử dụng là rơm rạ, giấy, mùn cưa Tùy từng loại vi sinh vật khácnhau mà có biện pháp xử lý nguyên liệu khác nhau sao cho phù hợp

 Nguồn carbon từ dầu mỡ:

• Dầu olive, dầu bắp, dầu cotton, dầu đậu phộng … mỡ (các acid béo, oleic, linoleic,linolenic,…), có thể cung cấp năng lượng cao hơn nhiều so với từ glucose.

 Nguồn carbon từ dịch kiềm sulfite:

• Là một loại phế phẩm của công nghiệp sản xuất cellulose Dịch kiềm sulfite có80% chất khô là đường hexose (glucose, mannose, galactose), ngoài ra trong dịchkiềm sulfite có chứa acid ligninsulfuric, acid này chưa được vi sinh vật sử dụng

• Một điều đáng lưu ý là dịch kiềm sulfite có đặc tính hấp phụ nhiều O2, cho nên khinuôi cấy vi sinh vật hiếu khí có thể giảm mức cung cấp O2 tới 60% so với mứcbình thường

 Từ Hydrocarbon

• Người ta đã biết có nhiều vi sinh vật có khả năng sống được ở mỏ dầu, mỏ khí đốt,

ở đáy bồn chứa dầu, mặt đường nhựa Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy paraffin là loại nguyên liệu tương đối vạn năng để nuôi cấy vi sinh vật Theo sốliệu của Fuch (1961) có 26 giống vi sinh vật, trong đó 75 loài có khả năng phânhủy hydrocarbon mạch thẳng

n-4 Nguồn Nitrogen

a) Vai trò và nguồn gốc

Hầu hết các chủng vi sinh vật sử dụng trong công nghiệp có thể dùng được cả hainguồn nitrogen là vô cơ (ammonia, nitrate, nitrite) và hữu cơ (amino acid, urea, cao nấmmen, dịch chiết thịt, dịch chiết cao bắp, dịch thủy phân đậu nành, peptone, dịch thủyphân cá–nước mắm,…) NH3 được dùng vừa để hiệu chỉnh pH vừa là nguồn cung cấp N

trong môi trường nuôi cấy S.cerivisiae để sản xuất công nghiệp dịch albumin người

(Collins, 1990) Các muối của ammonium như ammonium sulphate, thường gây nên tínhacid khi vi sinh vật sử dụng NH4+ và giải phóng gốc acid tự do Mặt khác, khi gốc nitrateđược sử dụng thì gây nên sự thay đổi dần sang điều kiện kiềm Ban đầu, ammoniumnitrate tạo nên pH acid khi NH4+ được sử dụng và sẽ gây ức chế quá trình đồng hóanitrate Sau đó khi nguồn NH4+ bị cạn kiệt, có sự chuyển dần sang điều kiện kiềm khinitrate được dùng làm nguồn N Tuy nhiên có một ngoại lệ cho kiểu trao đổi chất nguồn

N này là đối với chủng Gibberella fujikuroi (Borrow và cộng sự, 1961, 1964) Ở pH 2,8

-3,0, nitrate ức chế sự đồng hoá NH4+của vi sinh vật Khi pH tăng dần đến giá trị thíchhợp, sự đồng hoá nitrate của vi sinh vật chuyển dần qua NH4 Nguồn N hữu cơ được sửdụng có thể từ các nguồn amino acid, protein, urea Trong nhiều trường hợp, sự tăngtrưởng của chủng sẽ nhanh hơn nếu chúng ta cung cấp nguồn N là hữu cơ, và một sốchủng vi sinh vật đòi hỏi một số amino acid nhất định cho tăng trưởng Trong lên menamino acid công nghiệp, cần bổ sung một lượng nhất định amino acid đối với các chủngđột biến khuyết dưỡng các amino acid này Tuy nhiên, các amino acid dùng để bổ sungvào môi trường nuôi cấy là nguồn N hữu cơ phức tạp, thường không đồng nhất, rẻ tiền,

ổn định Trong công nghiệp lên men sản xuất lysine, người ta sử dụng methionine vàthreonine thu nhận từ dịch thủy phân đậu nành để bổ sung vào môi trường nuôi cấy thaythế cho loại tinh khiết, đắt tiền

Các hợp chất N dùng làm nguồn cung cấp amino acid là dịch chiết cao bắp, dịch đậunành, đậu xanh, từ hạt coton, cao nấm men Ngoài ra các dịch này còn bổ sung các yếu tốkhác như vitamin, khoáng Trong quá trình cất giữ các sản phẩm này, chất lượng củachúng có thể bị ảnh hưởng bởi tác động của yếu tố môi trường như độ ẩm, nhiệt độ vàthời gian lưu giữ

Trong sản xuất vaccines cho người, cần phải sử dụng nguồn amino acid tinh khiết đểchuẩn bị môi trường, không nên dùng amino acid từ protein Khi chọn lựa nguồn nitơ cầnquan tâm đến các yếu tố sau:

• Cơ chế kiểm soát việc sử dụng nguồn nitrogen tồn tại bởi enzyme khử nitrate, mộtenzyme liên quan đến việc chuyển hoá nitrate thành ion NH4 , bị ức chế khi có sựhiện diện của ammonia Nguyên nhân của quá trình này là do ammonia hoặc ion NH4

là nguồn N được sử dụng thích hợp hơn Người ta đã có các thí nghiệm khảo sát trênnấm cho thấy rằng NH4+ ức chế sự hấp thụ các amino acid nói chung và các amino

acid màng nói riêng Đối với Aspergillus nidulans, ammonia điều hoà sự sản xuất các

protease kiềm tính và trung tính Vì thế, trong một hỗn hợp nguồn N, từng thành phầncủa N có ảnh hưởng đến sự điều hòa trao đổi chất và do vậy có sự chọn lựa nguồn Nthích hợp để sử dụng trước cho đến khi nguồn này cạn kiệt

• Người ta đã chứng minh rằng việc sản xuất kháng sinh bởi nhiều chủng vi sinh vậtkhác nhau chịu ảnh hưởng bởi loại và nồng độ nitrogen trong môi trường nuôi cấy.Nguồn N dễ đồng hóa NH4 , NO3-, các amino acid có thể ức chế sự sinh tổng hợp cácchất kháng sinh Sự sản xuất kháng sinh chỉ bắt đầu tăng trong môi trường nuôi cấysau khi toàn bộ nguồn N đã được sử dụng hết.

Trong thí nghiệm nuôi cấy lắc trong bình tam giác, muối của các acid yếu(ammonium succinate) được bổ sung vào làm nguồn N và để hạn chế sự thay đổi pH, cóthể dùng muối ammonium của các acid mạnh như Cl- hoặc SO42- Theo cách này, người ta

có thể dùng muối phosphate có nồng độ thấp hơn trong môi trường để làm hệ đệm pH,nhưng nếu nồng độ muối phosphate cao có thể gây ức chế việc sản xuất nhiều chất traođổi thứ cấp

Trong lên men sản xuất gibberellin, nguồn N ảnh hưởng lên việc định hướng sản xuấtcác loại gibberellin và tỷ lệ tương quan giữa các loại này (Jefferys, 1970) Năm 1963,Rhodes đã chứng minh rằng nồng độ tối thích của nguồn N cho sản xuất griseofulvin có

sự biến thiên tùy thuộc vào kiểu cấy giống và loại nồi lên men đang sử dụng Như vậy,các yếu tố này cần phải được đề cập khi giải thích các kết quả các chương trình nghiêncứu phát triển các loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật Một số nguyên liệu có chứanguồn N phức tạp, vi sinh vật không thể sử dụng được và gây trở ngại với các qui trìnhthu hồi và qui trình xử lý chất thải

b) Con đường chuyển hóa

5 Các nguyên tố khoáng trung-vi lượng

a) Vai trò

− Các nguyên tố trung - vi lượng là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với sựsinh trưởng của vi sinh vật Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vàothành phần của các trung tâm hoạt tính ở các enzyme của vi sinh vật, duy trì tính ổnđịnh của kết cấu của đại phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩmthấu của tế bào, khống chế điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinhnăng lượng đối với một số loài vi sinh vật

− Hầu hết các chủng vi sinh vật đòi hỏi một số nguyên tố trung - vi lượng nhất định cho

sự tăng trưởng và trao đổi chất Trong nhiều môi trường nuôi cấy Mg, P, K, S, Ca,Chlorine là các thành tố rất cần thiết.Những nguyên tố này cũng có vai trò quan trọngmặc dầu chỉ cần với số lượng rất nhỏ, khoảng 10-8-10-6 mol/ L môi trường nuôi cấy

− Tùy từng loại môi trường mà nồng độ yêu cầu cũng khác nhau và do vậy chúngthường được bổ sung vào môi trường từ các thành phần riêng biệt.

− Các nguyên tố khác như Co, Cu, Mn, Mb và Zn cũng là những nguyên tố đóng vai tròquan trọng thường có sẵn trong các thành phần nguyên liệu nhưng chỉ với hàm lượngrất nhỏ nên cần phải phân tích môi trường nuôi cấy để nếu cần thiết thì phải bổ sungthêm nhằm đảm bảo rằng các nguyên tố vi lượng đạt hàm lượng theo nhu cầu của visinh vật trong môi trường nuôi cấy Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phầnenzyme và làm hoạt hoá enzyme

− Trong lên men người ta đặc biệt chú ý đến vai trò của phosphor, vì nó ảnh hưởng đếnchất lượng của quá trình lên men Nồng độ phosphate vô cơ trong môi trường cũngảnh hưởng đến sự sản xuất của bacitracins, citric acid (trong nuôi cấy bề mặt), ergot,monomycin, novobiocin, oxytetraclin, polyenes, ristomycin, rifamycin Y,streptomycin, vancomycin và viomycin

Bảng 4.1 Vai trò các nguyên tố vi lượng

Coban (Co) Cần để tạo vitamin B12, transcarboxylase của vi khuẩn lên men

propionic

Molypden (Mo) Có trong cấu trúc của molybdoflayvoprotein tham gia khử nitrate

và trong nitrogenase khử N2.Đồng (Cu)

Có trong một số enzyme tham gia hô hấp như cytochrome C; có trong enzyme tham gia quang hợp như plastocyanin và một số superoxide dismutase

Mangan (Mn) Hoạt hóa nhiều enzyme, có trong một số superoxide dismutase, là

những enzyme rất quan trọng để khử độc dạng độc O2.Niken (Ni) Có trong các enzyme hydrogenase có chức năng nhận hoặc phóng

thích H2.Tungsten và Selen Có vai trò trong định dạng cấu trúc enzyme dehydrogenase

Sắt (Fe) Có trong nhiều enzyme trong tế bào đặc biệt là các enzyme hô hấpKẽm (Zn) Đóng vai trò trong cấu trúc nhiều enzyme: carbonic anhydrase,

alcol dehydrogenase, DNA polymerase, RNA polymerase

Thường đóng vai trò nối các tiểu đơn vị protein trong sự sắp xếp

cấu hình đặc biệt cho hoạt động của enzyme.

− Các nguyên tố như Mn, Mo, Co thường có mặt trong các nguyên liệu tự nhiên banđầu khi đưa vào môi trường lên men như dịch trái cây, nước chiết từ các loại hạt,…

CaCO3

FeSO4.4H2O ZnSO4.8H2O MnSO4.H2O CuSO4.5H2O NaMoO4.2H2O

1,0-4,00,25-3,00,5-12,05,0-17,00,01-0,10,1-1,00,01-0,10,003-0,010,01-0,1

− Vì nhiều nguyên tố khoáng là kim loại nặng cho nên nếu dư thừa sẽ gây hại cho visinh vật, làm giảm hiệu quả lên men, khi thiết kế nồi lên men, người ta chế tạo từ thépcarbon, bên trong nồi còn quét lớp kem bảo vệ Khi cần bổ sung thêm nguyên tôkhoáng vào môi trường cần lưu ý khống chế chính xác liều lượng

− Nếu thiếu chất khoáng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt tính sinh lý của vi sinh vật

bị giảm sút, thậm chí ngừng sinh trưởng Do nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật làkhông giống nhau cho nên khái niệm về nguyên tố vi lượng chi có ý nghĩa tương đối

Vi sinh vật thường tiếp nhận nguyên tố vi lượng từ các chất dinh dưỡng hữu cơ thiênnhiên, các hoá chất vô cơ, nước máy hay ngay từ trong các dụng cụ nuôi cấy bằngthuỷ tinh Chỉ trong những trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượngvào môi trường nuôi cấy vi sinh vật

6 Chelator (Chất kìm)

a) Vai trò

Đối với nhiều loại môi trường lên men thường có tình trạng là ngay sau khi pha chếhoặc sau khi thanh trùng có sự hình thành chất lắng cặn ở dạng phức hợp của phosphatekim loại không tan Gaunt và cộng sự (1984) đã chứng minh rằng khi thanh trùng môitrường Mandels và Weber, một chất lắng cặn màu trắng được hình thành có chứa toàn bộ

Fe và hầu hết các kim loại như Ca, Mn, Zn hiện diện trong môi trường Hiện tượng hìnhthành lắng cặn này vừa làm giảm nồng độ các chất cần thiết cho sự phát triển và biếndưỡng của vi sinh vật vừa gây cản trở cho quá trình thu hồi sản phẩm và vệ sinh thiết bị

Để giải quyết vấn đề về sự hình thành các phosphote kim loại không tan trong môitrường lên men, người ta bổ sung các chất chelator nồng độ thấp như ethylene diaminetetraacetic acid (EDTA), citric acid, polyphosphates,… vào môi trường nuôi cấy Người

ta thấy rằng khi thêm vào môi trường Mandels và Weber lượng EDTA có nồng độ 25mg/dm3 thì không tìm thấy có sự xuất hiện của chất lắng cặn sau thanh trùng Lưu ý việcchọn lựa các chelator để không gây ức chế các chủng vi sinh vật trước khi đưa vào sửdụng

b) Nguồn cung cấp

Đối với môi trường dùng ở quy mô công nghiệp, không cần bổ sung chelator, do cácthành phần phức như dịch chiết nấm men, pepton, sẽ tạo phức với kim loại và đảm bảorằng kim loại được giải phóng dần trong quá trình đẳng trương

7 Nhân tố tăng trưởng