Các hợp chất thơm từ vi sinh vật tổng hợp de novo

Hầu hết các quy trình cổ điển được đánh giá cao sự tự điều chỉnh và kết quả trong cấu trúc liên tục của các chất bay hơi, những quy trình khác phụ thuộc vào các mặt hạn chế của các thuộc

MỤC LỤC

5.1.Tóm tắt lịch sử của Bioflavors ( chất thơm sinh học) 2

5.2 Oligo – Isoprenoids (terpen) 4

5.2.1 Sinh tổng hợp terpenoid ở prokaryote 9

5.2.2 Sinh tổng hợp terpenoid tự nhiên từ nấm 13

5.3 Hợp chất béo 16

5.3.1 Acid carboxylic 16

5.3.2 Sản phẩm Lipoxygenase 18

5.3.3 Carbonyls 21

5.3.4 Alkanols 27

5.3.5 Este 30

5.4 Chất thơm (Aromatic) 33

5.4.1 Vanillin 35

5.4.2 Cinnamate 38

5.4.3 Heterocycle 40

5.5 Sự giảm thiểu mùi lạ 46

Tài liệu tham khảo 48

Chương 5: Các hợp chất thơm từ vi sinh vật Tổng hợp De Novo

De novo tổng hợp có nghĩa là sự tổng hợp mới các phân tử phức tạp từ những phân

tử phân tử đơn giản như là phân tử đường hay acid amin

Các hợp chất thơm truyền thống được lên men từ thực phẩm, ít nhất là trong giai

đoạn đầu tiên, từ một hệ vi sinh phức tạp mà tác động lên một chỉ một phần đã hiểu con

đường của các tiền chất hóa học của một cấu trúc thực phẩm phức tạp (cf chương 2) Hầu

hết các quy trình cổ điển được đánh giá cao sự tự điều chỉnh và kết quả trong cấu trúc liên

tục của các chất bay hơi, những quy trình khác phụ thuộc vào các mặt hạn chế của các

thuộc tính của chất xúc tác sinh học và các biến sản xuất với nguy cơ sắp xảy ra của sự

hình thành chất phi hương vị Sự phối hợp công nghệ sinh học trong hương liệu đòi hỏi

một vi sinh vật học xác định và môi trường dinh dưỡng không phải thực phẩm Chương

sau đây sẽ chủ yếu thảo luận về công tác tuyển chọn thực hiện với biến đổi, nhưng thường

không được tối ưu hóa môi trường để làm rõ phạm vi và chiều sâu của hướng nghiên cứu

hiện nay Từ một điểm áp dụng xem một phần nhỏ của chủ đề theo cấu trúc hóa học xác

định được cho là thích hợp hơn

5.1.Tóm tắt lịch sử của Bioflavors ( chất thơm sinh học)

Omelianski đã báo cáo mùi của vi sinh vật tự nhiên được giải phóng gắn liền với sự

tích tụ của sự ôi sản phẩm trao đổi chất như axit hữu cơ và rượu trong môi trường của

Mycobacterium tuberculosis và Pseudomonas aeruginosa

Môi trường nuôi cấy của vi khuẩn thường sản xuất các mùi cụ thể nhiều mức độ

khác nhau của cường độ và do đó cho phép chúng tôi nhận ra dễ dàng một số loài Thông

thường, các mùi khó chịu đáng chú ý ở những nơi mà môi trường đại chúng của vi khuẩn

được lưu giữ Mùi được sản xuất bởi các môi trường nuôi cấy có thể là một đặc tính

chung nhóm hay một đặc điểm cụ thể cá nhân Các vi khuẩn gây thối rữa điển hình có thể

là ví dụ, được công nhận bởi mùi riêng của chúng, trong khi môi trường của nấm men,

nấm mốc và xạ khuẩn được dễ nhận ra bởi hương thơm đặc biệt của chúng Môi trường

cổ của Erythrob, prodigiosus tạo ra một mùi đặc trưng của trimethylamine, B fitzianus,

mùi của mồ hôi (axit caproic ester), B odorificus, mùi phân thối, vv Điều này cũng đúng

đối với vi khuẩn gây bệnh: môi trường cũ của Mycob, bệnh lao phổi phát ra một mùi đặc

biệt, Ps pyocyanea, một mùi hơi ngọt, giống như của những bông hoa vôi cây, M

tetragenes và M pyogenes-mùi một phần giống như của keo, vv

đặt tên là đúng "vi sinh vật hương thơm sản xuất", bao gồm những loài trong đó sản xuất

trong môi trường nuôi cấy một mùi hương thanh tao mạnh mẽ của cường độ khác nhau,

làm gợi lại một trong những mùi trái cây: dâu tây, dứa, táo, lê, dưa thơm, vv Đây cũng

thuộc về những vi sinh vật, trong đó cung cấp cho các "mùi đặc trưng" cho các sản phẩm

khác nhau được sử dụng cho thực phẩm và đồ uống như sữa, pho mát, bơ, rượu, vv Tên

của các loài thuộc nhóm này được hình thành tương ứng bằng cách thêm tính ngữ: cus

aromati-, aromafaciens, odorus, odoratus, esterifaciens, fragi, fragariae, nobilis, vv, và các

tác giả thường khác nhau mô tả các loài khác nhau dưới cùng tên Có trong ba tài liệu

khác nhau: Bact aromaticum- those of Beijerinck, Pammel và van der Leck, và ba Bact

odoratum-of Henrici, Burri và Weiss

Bên cạnh tiêu chí hóa học và hình thái, chất mùi được bắt nguồn bởi các vi sinh vật

được nuôi cấy đã phục vụ để phân loại các loài trong thế kỷ XIX Một nghiên cứu tổng

thể đầu tiên trong việc tạo ra hương thơm của vi sinh vật xuất hiện sớm nhất là vào năm

1923 (Omelianski) Các mô hình thường được trích dẫn của Pseudomonas aeruginosa,

một bệnh nhân có mùi hơi ngọt gây ra bởi 2-amino acetophenone, chứng tỏ giá trị chẩn

đoán liên quan đến hiển thị mùi (Mann, 1966) Các bác sĩ có kinh nghiệm chú ý đến mùi

của hơi thở, nước tiểu hoặc các cơ quan bị nhiễm bệnh Loài có sự nổi bật đặc tính mùi đã

được gán cho với các epithetons như aroma - ticus, esterifaciens, odorus, odoratus, jragi,

hoặc nobilis Omelianski được xem là hương thơm tạo nên như là một ‘đặc tính dễ thay

đổi’mà hương nhiều hơn hoặc ít hơn nhanh chóng mất đi trong quá trình 'nuôi cấy nhân

tạo' Họ đã đề nghị các hợp chất tự nhiên, ví dụ lá dâu tây để lấy lại dâu tây Trong khi

những ý kiến có lẽ đã được đề cập trước, sự quan sát chăm chú của tiền chất hương thực

vật glycosidic, họ cũng đã chuẩn bị nền tảng để tiếp tục sử dụng các thành phần môi

trường dinh dưỡng phức tạp với các hệ quả sinh hóa không lường của họ Omelianski

được nhận thấy một cách chính xác rằng những thay đổi của mùi của một môi trường vi

sinh vật có thể phát sinh từ các hiển thị phụ thuộc vào sự tập trung được truyền bởi một sự

bay hơi đơn lẻ, hoặc từ một sự thay đổi động lực của toàn bộ hồ sơ của các chất bay hơi

trong quá trình canh tác hàng loạt Sự cô lập của một loại nấm men giống như năm 1889

được mô tả Mùi Sachsia suaveoleus này có thể được gây ra bởi methylbutanols và một số

este của chúng Ban đầu được gọi là 'Weinbouquet Schimmelpilz', dòng này có thể là

giống hệt với một dòng Oidium suaveoleus hoặc Oospora suaveoleus , gần một thế kỷ sau

đó, báo cáo như là một mùi có nguồn gốc của trái cây (Hattori et al., 1974) Omelianskii

cũng được báo cáo là một trực khuẩn monotri chous được phân lập từ sữa và sản xuất một

mùi dâu tây Các este hoá học của vi khuẩn Pseudomonas frafi này đã được đánh giá đầy

đủ chỉ gần đây (Cormier et al., 1991; Raymond et al., 1991; cf Sect 5.3.5) Tiềm năng

vượt trội của nấm bậc cao đã được công nhận sớm (Badcock, 1939) Trong những năm

1940 dưới sự chỉ đạo của Birkinshaw khởi xướng một loạt các nghiên cứu về các chất

chuyển hóa dễ bay hơi của nấm bậc cao (Birkinshaw and Findlay, 1940; Birkinshaw and

Morgan, 1950) Nếu không có sự trợ giúp của phương pháp sắc ký khí, chất bay hơi của

Lentinus lepideus và Trametes suaveolens đã được xác định như là anisaldehyde và

methyl este của axit p-methoxy cinnamic, axit anisic, và acid cinnamic Các loài trong

Ceratocystis (Endoconidiophora tại thời điểm đó) đã hình thành methylpropyl acetate và

cấu trúc methylheptene Chất dễ bay hơi, terpenes được xác định đầu tiên trong loài

Ceratocystis vào khoảng trước năm 1960, về sau trong một số loài khác (Sprecher et al.,

1975; Drawert and Barton, 1978) Phổ duy nhất của các chất bay hơi của nhiều loài

Ceratocystis đã mê hoặc nhiều nhà nghiên cứu trên khắp thế giới (Collins and Morgan,

1962; Collins, 1976; Lanza et al., 1976) Các chất dễ bay hơi do vi khuẩn ít nhận được

quan tâm, trừ các trường hợp, nơi mà có vấn đề mùi lạ, ví dụ gây ra bởi geosmin trong

nguồn nước uống, đã cần được giải quyết (Gerber, 1968; Collins et al., 1971) Thực phẩm

liên quan các loài, chẳng hạn như Penicillium roqueforti (Gehrig and Knight, 1958) hoặc

loài Cadida (Okui et al., 1963) được nuôi cấy trên môi trường tối thiểu để nghiên cứu sự

hình thành acid béo dễ bay hơi phân hủy Các phần vi sinh của hương pho mát và hương

vị của nấm ăn đã được làm sáng tỏ trong các nghiên cứu kỹ (for example, Dwivedi and

Kinsella, 1974; Pyysalo, 1976)

Với sự ra đời của cặp phương pháp sắc kí khí và khối phổ thì số lượng công bố và

bằng sáng chế tăng lên đáng kể Tổng kết các kỹ thuật của các ý kiến năm 1980, Kempler

kết luận rằng "nhu cầu công nghiệp cho các hợp chất hương liệu cùng với việc

làmsáng tỏ con đường sinh tổng hợp có liên quan phức tạp chắc chắn sẽ dẫn đến các

ứng dụng của quá trình sinh học vi sinh ngày càng tăng để sản xuất hương trong những

năm tới (Kempler, 1983)

5.2 Oligo – Isoprenoids (terpen)

Cấu trúc của terpene bao gồm các monomer được gọi là isoprene Isoprenoid là tên

gọi khác của terpen

Chuỗi hở và vòng mono-và sesquiterpene (3 vòng isoprene) với mức độ khác nhau

của quá trình oxy hóa là những nguyên tắc hóa học và cảm quan của các loại dầu thiết yếu

nhất Mục đích thương mại monoterpene rất quan trọng, chẳng hạn như D-limonene

(giống cam quýt), citral (chanh), tinh dầu bạc hà (làm mát), carvone (cây phòng phong/

bạc hà) và -tecpineol (tử đinh hương) có nhiều trong các loại tinh dầu có sẵn và thường

terpenoid bay hơi được giới hạn geosmin, một số các dẫn xuất borane, và

cadin-4-ene-l-ol (Gerber 1968; Ccadin-4-ene-l-ollins et al., 1971; Ger- ber, 1971) Nấm men như là một nguồn của

tecpen dễ bay hơi đã được đề cập trong phần 2.3.1 Chủng Kloeckera và Torulopsis là khả

năng hình thành một lượng thấp của limonene, linalool, -tecpineol, và -myrcene Free

farnesol như một trung tâm terpenoid trung gian cao hơn, đã xuất hiện thoát ra từ các tế

bào trong S.fermentati, S rosei, và cả S.cerevisiae, nếu điều kiện nuôi cấy không ủng hộ

tăng trưởng đều đặn Citronellol sinh tổng hợp bởi Kluyveromyces lactis không phụ thuộc

vào tiền chất đặc biệt, nhưng đã bị kích thích bởi việc bổ sung L-asparagin (Drawert và

Barton, 1978) Điều này có vai trò được ưu tiên trong L-asparagin , trong khi đó, được

khẳng định đối với nhiều vi sinh vật khác Giống Ambrosiozyma, một sinh vật nấm men

giống với quy tắc phân loại, là ngoại lệ duy nhất cho quy tắc và sản xuất monoterpene phổ

biến, chẳng hạn như geraniol hoặc citronellol, trong mg L-1 mở rộng (Klingenberg and

Sprecher, 1985)

'Nấm luôn nhận được điểm nhấn không tốt’ (Wainwright, 1992), nhưng chúng hẳn

nhiên đến nay là các nhà sản xuất linh hoạt nhất trong terpenoid dễ bay hơi Điều này bao

gồm các dòng chính chuyển hóa các hợp chất geraniol, nerol và linalool và các chất tương

tự sesquiterpene họ farnesol và nerolidol (Hanssen và Abraham, 1987; Abraham và

Berger, 1994), cũng như các cấu trúc hiếm chưa được xác định trong bất kỳ nguồn thực

vật nào (Abraham và Arfmann, 1988; Hình 5.1) Nuôi cấy nấm cần phải thông khí Tùy

thuộc vào thời gian nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy chung, linalool đã nhanh chóng chuyển

thành ete vòng, đó cũng đã được tìm thấy trong nhiều loại tinh dầu (Abraham và Berger,

1994; Hình 5.2.) Linalool thể hiện một ngưỡng phát hiện mùi rất thấp, và các oxit cyclic

được nghĩa vụ phải đóng góp cho mùi của tinh dầu do các sự dư thừa thường lớn của

chúng Tuy nhiên nghiên cứu tốt nhất và vượt trội trong sự đa dạng và số lượng

monoterpene sản xuất là các loài Ceratocystis (Sprecher et al, 1975; Collins, 1976; Lanza

et al, 1976) Các terpenoid phổ biến nhất được liệt kê trong Hình 5.3 Trong số các

tecpineol, -isomer và có ưu thế hơn acetate của nó Mặc dù tỷ lệ hấp thu của 2- 14

C-mevalonate là thấp, nó đã được kết luận rằng sự sinh tổng hợp theo con đường như sự

hình thành trong các thưc vật bậc cao (Lanza và Palmer, 1977) Năng suất thường thấp đã

được tăng lên thành công hơn bằng cách áp dụng một vật liệu hấp phụ polyme hơn bằng

cách thay đổi của môi trường lên men (Schindler, 1982) Các chất hấp phụ, XAD-2, được

chứa trong một bình bên ngoài, và canh trường bioreactor được luân chuyển qua lòng cố

định để tích lũy các chất bay hơi liên tục (cf chương 10 , 11) Khoảng 1.9 g L-1

trong chất chuyển hóa có mùi cuối cùng đã hồi phục được gần đến khối lượng khô có liên quan

đến số tinh dầu thực vật cần thiết Các kết quả trên có thể được tóm tắt như sau:

- Ascomycetes (Ceratocystis) và một loạt các basidiomycetes sản xuất mono-và

sesquiterpene cả về chất lượng và số lượng gần với các nguồn thực vật

Hình 5.1 6- ((Z2) -butenyl) -3-methyl- -pyrone, một mỗi monoterpene liên hợp

tạo ra bởi nấm Fusarium solani (Abraham và Arfmann, 1988)

Fig 5.2 Oxidation of genuine (microbial) linalool results in chemically formed

linalool Oxide

- Hình thành các tecpen dễ bay hơi chặt chẽ phụ thuộc vào các chủng (hay đột biến)

được sử dụng, và một chủng sản xuất phải được lựa chọn như bình thường trong

công nghệ sinh học

- Tối ưu hóa các môi trường dinh dưỡng (ví dụ L-asparagin vs nitrat) ảnh hưởng đến

chất lượng và số lượng sản phẩm nhiều hơn nuôi dưỡng mevalonate

- In situ loại bỏ các tecpen sẽ không tránh khỏi tiếp nhận bất cứ thứ gì giống như lợi

suất hấp dẫn về mặt kinh tế

Những trở ngại lớn đối với năng suất cao hơn và các ứng dụng công nghiệp được thể

hiện rõ: Hiện vẫn còn thiếu đáng kể kiến thức về quy chế sinh tổng hợp terpene trong

các vi sinh vật, nghiên cứu hopanoid đã tiết lộ rằng ngay cả những bước đầu tiên tổng

hợp isoprene trong vi khuẩn có thể không tiến hành theo lộ trình sách giáo khoa nói

chung Các aldehyde monoterpene mạnh hơn và xeton hiếm khi được tìm thấy Một số

khó khăn để tổng hợp các cấu trúc sesquiterpene, chẳng hạn như - copaene

(Abraham và Berger, 1994), -bisabolol (Gross et ai., 1989), eleganthol (Arnone et

al., 1993), hoặc những bộ xương drimene đã được xác định (Hanssen và Abraham,

1987; Abraham và Berger, 1994), nhưng các hợp chất hương vị và mùi thơm có cấu

trúc liên quan không được hình thành (Hình 5.4) Các hydrocacbon sesquiterpene 

-gurjunene, (E) -caryophyllene, và một cadinene được phân lập từ các môi trường đất

ngập nước có chủng Aspergillus flavus (Zeringue et al., 1993) Bốn trong số tám

chủng tích lũy và phân hủy sesquiterpene và aflatoxin, trong khi các chủng

nonaflatoxigenic không sản xuất tecpen dễ bay hơi Mối tương quan này rõ ràng là

không thể được giải thích bởi một nguồn gốc sinh học di truyền phổ biến Tương tự

như vậy, nhiều vi sinh vật được đánh giá cao về phổ giàu của các chất chuyển hóa thứ

cấp tạo ra geosmin norterpenoid (Hình 5.5) Rượu bậc ba này là một mùi trần tục tiềm

năng sản xuất bởi một loạt các Streptomycetes (Rezanka et al., 1994), Penicillia,

Basidiomycetes, và vi khuẩn lam (Pollak, 1994) Nano đo được cho mỗi lít làm cho

nước không uống được; các hợp chất là tuy nhiên, được coi là có giá trị trong màu đỏ

củ cải và whisky hương và nước hoa Với điều này trong sự chú ý , nỗ lực đã được

thực hiện để làm sáng tỏ sự sinh tổng hợp các geosmin bởi hoặc ức chế hoặc kích

thích sự hình thành của nó, nhưng một bước đột phá vẫn chưa đạt được (Boland et AI,

1993; Mattheis và Roberts, 1992)

Hình 5.3 Terpenoids of Ceratocystis strains I=6-Methyl-5-hepten-2-o1 and

derivatives, R=OH/OAc/O, II=Geraniol/ Nero/ acetates, III=Citronello/ acetate,

N=E,E-famesol, V=E- Nerolidol, VI - IX=  - -Terpineol

Hình 5.4 Drim-8 (12) dẫn xuất -ene với long diên hương thuộc tính cấu trúc liên quan

đến sesquiterpene phân lập từ các môi trường basidiomycete

Hình 5.5 Geosmin, các thành phần ảnh hưởng của hương vị củ cải đỏ và

streptomycetes đất

5.2.1 Sinh tổng hợp terpenoid ở prokaryote

Ở prokaryote (vi khuẩn và vi khuẩn cổ) terpenoid là rất cần thiết và có vai trò quan

trọng trong việc tổng hợp vách và màng tế bào (bactoprenol, hopanoids), chuỗi chuyển

điện tử (ubiquinone, menaquinone) hoặc trong chuyển đổi năng lượng ánh sáng thành

năng lượng hóa học ( chlorophylls, bacteriochlorophylls, rhodopsins, carotenoids) và

trong nhiều quá trình khác Nhưng mặc dù cấu trúc và chức năng đáng chú ý của nó là

khác nhau nhưng chúng đều chuyển hóa từ một chất tiền thân giống nhau là isopentenyl

diphosphate (IPP) và dimethylallyl di phosphate (DMAPP), hai chất này là đồng phân của

nhau và có 2 con đường chính tạo ra 2 chất này trong tế bào là :1 Theo con đường

mevalonate (MVA), 2 Theo con đường 2-C- methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP)

a Con đường mevalonate (MVA)

Trong con đường này chỉ tạo ra một tiền chất ở tế bào động vật và nấm Trong tế

bào thực vật thì tạo ra IPP ở cytosolic, còn trong lục lạp thì tạo tiền chất của terpenoid

theo con đường MEP MVA trong sinh vật bậc cao là con đường chính Trong bước đầu

tiên của con đường này thì 3- hydroxyl- 3- methylglutaryl- CoA (HMG- CoA) được tạo ra

từ sự tụ lại liên tiếp của ba phân tử acetyi- CoA được xúc tác bởi enzyme acetoacetyl-

CoA thiolase (AACT) và HMG- CoA synthase (HMGS) Trong biến đổi đầu tiên, HMG-

CoA chuyển đổi thành MVA trong một phản ứng không thuận nghịch được xúc tác bởi

HMG- CoA reductase (HMGR) Sau đó, MVA được phospholate liên tiếp thành 5-

phosphomevalonate và 5- ddiphossphomevalonate và được decarboxylate tạo thành IPP

bởi enzyme mevalonate kinase (MVK), 5- phosphomevalonate kinase (PMVK) và 5-

điphóphomevalonate kinase decarboxylase (DPMD).Hoạt động của enzyme isomerase

IPP/DMAPP yêu cầu hình thành DMAPP từ IPP.( hình 1)

Hình 1 Con đường MVA tổng hợp tiền chất terpenoid

Trong tế bào prokaryote, con đường MVA được tìm thấy ở vi khuẩn cổ và một vài

chủng vi khuẩn bao gồm xoắn khuẩn Borrelia burgdorferi và khuẩn cầu gram dương

Staphylococus aureus và Streptococus pneumonia.Trong các vi khuẩn chứa con đường

MVA này thì một vài chủng Listeria monocytogenes và Streptomyces cũng chứa con

đường MEP

Mặc dù tất cả các chủng Streptomyces sử dụng con đường MEP cho tổng hợp tiền

chất terpenoid cần thiết , nhưng một vài loài có thể sử dụng MVA cho việc tạo ra các chất

chuyển hóa thứ cấp như kháng sinh

b Con đường 2-C- methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP)

Con đường MEP đã được mô tả kĩ ở Escherichia coli, một vi khuẩn điển hình, tương

tự hầu hết ở vi khuẩn, ngoại trừ những loài sử dụng con đường MVA Phản ứng đầu tiên

trong con đường MEP là sự hợp nhất của (hydroxyethyl)thiamine có nguồn gốc từ

pyruvate với nhóm aldehyde C1 của D- glyceraldehyde 3- phosphate để tạo ra 1- deoxy-

D- xylulose 5- phosphate (DXP) Phản ứng này được xúc tác bởi enzyme DXP synthase

(DXS) DXP có thể được sử dụng như là một tiền chất cho sự sản xuất của các cofactor

như pyridoxal phosphate (vitamin B6) và thiamine (vitamin B1) diphosphate Khi được

sử dụng trong việc sản xuất terpenoid một sự tái sắp xếp của nội phân tử và biến đổi DXP

thành MEP Trong bước đầu tiên của trao đổi trong con đường MEP thật ra là được xúc

tác bởi enzyme DXP reductoisomerase (DXR) Sau đó, enzyme MEP cytidily transferase

(MCT) và 4- (cytidine 5’- diphospho) 2- C- methyl- D- erythritol kinase (CMK) và 2- C-

methyl –D- erythritol 2,4- cyclodiphosphate (MEcPP) synthase (MDS) chuyển MEP

thành MEcPP, một hợp chất gần đây tìm thấy để tác động như một tín hiệu đi ngược trong

tế bào thực vật Một biến đổi mở của vòng MEcPP xúc tác bởi enzyme 4- hydroxyl-

3-methylbut -2- enyl diphosphate (HMBPP) synthase (HDS) hình thành con đường trung

gian tiếp theo, HMBPP Nó đã được chứng minh rằng trong sự thêm vào 1 chất trung gian

trong con đường MEP HMBPP là một phosphoantigen có tác động lớn, thuộc nhóm chất

hoạt động đặc trưng của tế bào T ở người Trong bước cuối cũng của con đường này,

enzyme HMBPP reductase (HDR) xúc tác đồng thời quá trình tạo thành IPP và DMAPP

theo tỷ lệ sấp xỉ 5:1 (hình 2)

Hình 2 Con đường MEP tổng hợp tiền chất của terpenoid ở vi sinh vật

Con đường MEP không hiện diện trong vi khuẩn cổ, nấm và tế bào động vật (ngoại

lệ ở động vật nguyên sinh), nhưng nó được tìm thấy ở hầu hết vi khuẩn và trong lục lạp

Kết quả gần đây đã thiết lập sự tồn tại song song của một sự chuyển hóa thứ cấp

khác trong một số vi khuẩn quang tự dưỡng Rhodospirillum rubrum Trong trường hợp

này, DXP được tìm thấy đã tạo ra từ 5- methylthio- D- ribulose-1- phosphate (MTRP),

một chất trung gian của con đường thu hồi methionine Trong con đường chuyển hóa

song song này để sản xuất ra DXP, một RubisCO không điển hình giống protein (RLP)

isomerizes MTRP thành 1- methylthio- D- xylulose 5- phosphate (MTXP) và sau đó

enzyme MTXP methylsulfurylase (MMS) chuyển đổi MTXP thành DXP Bởi vì gen mã

hóa cho RLP và MMS (cũng như các enzyme khác yêu cầu tạo ra MTRP) được tìm thấy

trong vài nhóm của vi khuẩn

Terpenoid hiện diện trong sinh vật nhân sơ và chức năng của nó (hình 3)

Hình 3 Con đường chuyển hóa terpenoid được tìm thấy ở sinh vật nhân sơ

5.2.2 Sinh tổng hợp terpenoid tự nhiên từ nấm

Các terpenoid đa số được phân lập từ nguồn thực vật và vi sinh vật Ở nấm bậc cao

(Ascomycota và Basidiomycota) được biết đến để sản xuất các hợp chất terpenoid chuỗi

trong tự nhên là rất tốt, bao gồm mycotoxin, antibiotic, antitumor, phytohormone Một vài

nghiên cứu ngoại lệ trong con đường sinh tổng hợp ở nấm đa số các gen và con đường

sinh tổng hợp có nhiệm vụ trong việc sinh tổng hợp một số lượng nhỏ các chất chuyển

hóa thứ cấp này chỉ được khám phá trong 5- 10 năm gần đây Ascomycota và

Basidiomycota sẽ là hai nhóm minh họa trong việc sản xuất terpenoid tự nhiên

Ngành Ascomycota (nấm túi) thống kê khoảng 60% các loài nấm đã được mô tả

Loài nấm này gồm nhiều loài nguy hiểm cho người, động vật, và mầm bệnh cho cây như

các loài Aspergillus, Fusarium, Trichoderma với phổ rộng và được biết đến lâu đời trong

công nghệ sinh học công nghiệp, một vài chủng đã được khám phá trong các chuyển hóa

thứ cấp của chúng

Ngành Basidiomycota - nấm đảm (bao gồm các loài nấm mốc hình thành quả thể)

chiếm khoảng 30% các loài nấm đã biết, một số loài trong ngành này đã được mô tả có

vai trò quan trọng trong sự phân hủy các nguồn nguyên liệu thực vật ( gỗ: nấm làm mục

hoặc nấm hoại sinh) hoặc các loài nấm cộng sinh với thực vật (mycorrhizal fungi) Các

loài trong basidiomyceteous rất lớn và đa dạng , một vài trong số đố đã được mô tả và

sinh tổng hơp các hợp chất tự nhiên đã được nghiên cứu kĩ

Nghiên cứu để giải mã con đường chuyển hóa thứ cấp ở mức độ phân tử và sinh

hóa đã được chú trọng kỹ trên Ascomycota (Aspergillus, Fusarium, Penicillum), chúng có

thể được nuôi cấy dễ dành với kỹ thuật trong phòng thí nghiệm Lượng lớn các loài nấm

còn lại chưa được khám phá ra Các chất tự nhiên mới mà trong con đường sinh tổng hợp

của nó tạo ra bao gồm isoprenoid có nguồn gốc từ chuyển hóa thứ cấp Đó là có sự tham

gia của Bacidiomycota, những loài nấm này thuộc loài khó tăng trưởng và không thể nuôi

cấy dưới điều kiện phòng thí nghiệm, ngoại trừ một số loài chịu trách nhiệm trong thao

tác di truyền Thật vậy, nấm lớn đã được sử dụng hàng thiên niên kỉ trong y học truyền

thống và được biết có chứa một loạt các chất có hoạt tính sinh học bao gồm các chất

kháng sinh, chất độc, kháng ung thư…

Tất cả các terpenoid được sản xuất từ nấm được chuyển hóa từ hợp chất 5C

isoprenyl diphosphate IPP và dimethylallyl diphosphate (DMAPP), nó được tổng hợp từ

acetyl- CoA thông qua con đường MVA như đã đề cập ở trên Con đường chuyển hóa

được minh họa ở hình 4

Hình 4 Con đường Isoprenoid được sinh tổng hợp trong nấm

Các kí hiệu: ACAT: acetoacetyl – CoA thiolase, HMGS: 3- hydroxyl 3-

methylglutaryl CoA synthase, HMGR, 3- hydroxyl 3- methylglutaryl CoA reductase,

MK: mevalonate kinase, PMK: phosphomevalonate kinase, MDD: mevalonate

diphosphate decarboxylase, IDI: isopentenyl diphosphate isomerase, GPS, FPS,

GGPS: geranyl-, farnesyl, geranyl geranyl diphosphate synthase, PT: prenyl

transferase, TPS: terpene synthase, TPC: terpene cyclase, OSC: oxidosqualene

synthase

5.3 Hợp chất béo

5.3.1 Acid carboxylic

Acid cacboncylic là một chuỗi trung bình, mùi bơ thay đổi khi tăng chiều dài

chuỗi, methyl hóa nhánh đặc trưng như axit 3-methylbutanoic có ngưỡng mùi thấp hơn và

có nguồn gốc từ các tiền chất axit amin Độ bão hòa tùy thuộc vào cấu hình chuỗi liên kết

đôi, thay đổi thuộc tính mùi hăng, cay, và tăng chiều dài chuỗi để tạo độ béo và mỡ Axit

béo tự do không chỉ đem lại các mùi thơm của lipit thực phẩm như pho mát, mà còn làm

nổi bật hương vị thức uống trái cây và lên men

Sản xuất axit axetic loãng, sự khởi đầu của công nghệ sinh học rắn hiện đại phụ thuộc

vào sự cố định tế bào của Acetobacter aceti Tế bào cố định là tế bào có sự chuyển động

trong không gian tế bào bị giới hạn, sự giới hạn tế bòa có được bằng đưa nó vào 1 phase

cách ly với phase dung dịch tự do Phase chứa tế bào thường không tan trong nước, là

polymer cao phân tử nước

Vi khuẩn lên men giấm (vi khuẩn acid acetic) là giống Acetobacter với đặc tính chuyển

đổi rượu ethylic (C2H5OH) thành acid acetic (CH3CO2H) bởi quá trình oxy hóa Thực

chất quá trình lên men Acid Acetic là quá trình oxy hóa không hoàn toàn Ethanol thành

Acid Acetic dưới tác dụng của vi khuẩn Quá trình lên men giấm cơ bản là quá trình hai

giai đoạn với giai đoạn đầu tiên là chuyển đổi kỵ khí các loại đường lên men thành

ethanol bằng nấm men, sử dụng loài Saccharomyces, và thứ hai là quá trình oxy hóa hiếu

khí ethanol do vi khuẩn, thường loài Acetobacter (Horiuchi et al., 2000) Vi khuẩn giấm,

còn gọi là vi khuẩn acid acetic, là thành viên của chi Acetobacter với đặc điểm chuyển đổi

ethyl alcohol, C2H5OH thành acid acetic , nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử

dụng để chuyển đổi glucose thành rượu ethylic Lên men acetic là bước tiếp theo của quá

trình lên men, trong đó các phân tử rượu được oxy hóa thành acid acetic do tác động của

vi khuẩn Acetobacter aceti tạo hương vị dấm đặc trưng Vi khuẩn sử dụng chất nền

ethanol để chuyển hóa thành sản phẩm trung gian acetaldehyde và cuối cùng thành acid

acetic

Phương trình tổng quát:

Cố định (bằng cách ngậm) của Propionibacterium cho sản xuất axit Propanoic đã

được đề cập trong chương 2 Nhóm vi khuẩn propionic (giống Propionibacterium) được

sử dụng trong giai đoạn ủ chín một số loại phomat như Gruỳere, Jarlsberg, Grevé,

Emmenthal, Maasdam… Chúng lên men lactose hoặc chuyển hóa acid lactic thành acid

propionic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác Mục đích sử dụng i h ẩn propionic là

tạo nên những lỗ hổng trong cấu trúc một số phomat cứng và góp phần hình thành nên

hương vị đặc trưng cho sản phẩm Phương trình lên men tổng quát như sau:

5.3.2 Sản phẩm Lipoxygenase

Lipoxygenase một enzyme xúc tác các quá trình oxy hóa của axit béo không no

để tạo thành một peroxide của các axit Chúng xuất hiện rộng rãi trong thực vật, nấm, một

số sinh vật nhân sơ (vi khuẩn lam và proteobacteria) và động vật, nhưng không có trong

côn trùng và vi khuẩn cổ

Lipoxygenases (EC 1.13.11.12) ở nấm xúc tác cho sự peroxy của axit linoleic và

linolenic thành 10-monohydroperoxides

(R)-1-octen-3-ol là kết quả hình thành từ enzyme phân chia linolinic, thường tồn

tại trong quả thể của nấm bậc cao Hai enzyme lipoxygenases (EC 1.13.11.12) và

hydroperoxydase lyase liên quan đến sự hình thành (R)-1-octen-3-ol và

10-oxo-8(E)-decenoic

Hợp chất bay hơi trong hương thơm nấm được sinh ra bởi hoạt động của

hydroperoxide lase và các bước tiếp tiếp theo enzym trong tế bào nấm bị hư hỏng Một

vài đề nghị đã được làm về cơ chế phản ứng phân mảnh, nhưng hơn nữa thực hiện toàn bộ

chuỗi Biến động hương thơm nấm được tạo ra bởi các hoạt động của một lyase

hydroperoxide và các phản ứng tiếp theo

Các phản ứng tạo ra mùi hương trong nấm

Một số gợi ý đã được thực hiện liên quan đến các cơ chế của phản ứng phân mảnh,

nhưng công việc tiếp theo là cần thiết hoàn thành đầy đủ toàn bộ chuỗi phản ứng Những

tấn công vật lý hay sinh học làm tổn hại đến sự toàn vẹn của các tế bào nấm bắt đầu phản

ứng bởi màng lipoxygenase và bề mặt của nó Một nghiên cứu toàn diện gần đây đã xác

nhận vai trò tác động trong tám carbonyls (Buchbauer et al., 1993) Lấy mẫu trong môi

trường, chưng cất hơi nước, và chiết dung môi được so sánh để cô lập các hợp chất hương

thơm từ Agaricus campestris, A bisporus, Lepiota procera, Armillaria mellea, Boletus

edulis, và cibarius Cantharellus Các lipoxygenase bắt nguồn carbonyls không chỉ được

xác định trong 'mô' nhỏ, mà còn trong trong khoảng trống ở trên quả thể còn nguyên vẹn

cơ quan Các sản phẩm thứ hai của hydroperoxide lyase, 1o-oxo- (E8) axit -decenoic

(Hình 5.6), kích thích tăng trưởng và kéo dài thân nấm trong A bisporus (Mau et al.,

1992) Điều này đồng ý với sự tham gia dự kiến của sản phẩm lipoxygenase trong việc

bảo vệ hệ thống hóa học (phần 1.5) Các acid tương tự cũng đã được đề nghị ở quả thể

Axit béo 2-hydroxy khác thường đã được tích lũy trong nấm men (Kaneshiro et,

1993), và các acid béo hydroxy và methyl thay thế khác nhau trong Basidiomycetes

(Dembitsky et al., 1993) Trong khi các axit hydroxy không mùi như vậy có thể bị phân

hủy bởi các hoạt động của vi sinh vật lạ, sản phẩm tách bởi sự dễ bay hơi Axit jasmonic

và các dẫn xuất ở vi sinh vật có thể bắt nguồn từ thực vật, ví dụ như từ các axit béo tiền

thân mười tám carbon qua (Z9, Ell, ZI5) -13- axit hydroperoxyoctadecatrienoic (Vick và

Zimmermann, 1984) Một hydroperoxycyclase cung cấp trong một prostaglandin tổng

hợp một axit cacboxylic cyclopentanoyl , sau khi 3 lần oxy hóa, sản lượng các axit tiền

thân của mùi methyl epijasmonate (Hình 5.7) Một số hợp chất jasmonoid điều tiết cây

tăng trưởng và già yếu Theo sự tìm thấy của tiền chất phổ biến không mới lạ jasmonate

đã được tìm thấy trong nhiều nguồn thực vật

Hình 5.7: methyl jasmonate Stereoisomer: IS, 2S, và, 2R không mùi; IR, 2R yếu; IR, 2S

mạnh, ngưỡng 3 Ilg L-i

Sự hình thành các hợp chất của Jasmonic

Hai chất (+)-7-iso-jasminic acid và (-)-jasmonic acid là thành phần quan trọng của

jasmonic Chúng được tìm thấy trong thực vật bật thấp Các methyl este của axit

epijasmonic góp phần vào hương vị quý giá của dầu jasmin,dầu vỏ chanh và hương trà

đen Các dẫn xuất và hợp chất của axit jasmonic được phân lập từ dịch lọc nuôi cấy của

một chủng đột biến Gibberella fujikuroi và từ một chủng Botryodiplodia (syn

Lasiodiplodia) theobromae (Miersch et ai., 1993) Các chức năng sinh thái học của axit

jasmonic ở môi trường nuôi cấy của vi sinh vật vẫn chưa được biết (cf chương 1, Bảng

1.2)

5.3.3 Carbonyls

Carbonyl là các hợp chất hữu cơ trong phân tử có chứa nhóm carbonyl C=O Nhóm này

gọi là nhóm oxo, do đó hợp chất carbonyl còn gọi là hợp chất oxo

Trong số các keton (là một hợp chất hữu cơ, trong đó nhóm cacbonyl C=O liên kết trực

tiếp với 2 gốc hydrocarbon Công thức tổng quát R-CO-R'), 2-alkanones có số cacbon lẻ

(từ 5C-11C) , cùng với các axit béo tự do và 2-alkanols, xác định mùi thơm phô mai chín

của Penicillium và đã nhận được nhiều sự chú ý

Con đường hình thành hợp chất mùi hương từ chất béo trong phomai

- Chất béo trong phomai là thành phần quan trọng để tạo mùi hương Trong các con

đường kể trên, phân giải lipit và biến đổi các acid béo là con đường quan trọng tạo nên

mùi vị của phomai Phân giải lipit, sự thủy phân acid béo tự do từ triglyceride, xúc tác bởi

lipase tạo ra acid béo và glycerol Từ glycerol qua chu trình β-ketoacids để tạo methyl

ketones là một sản phẩm mùi hương trongphomai

Kết quả sinh học từ một chu trình oxydase, nơi ester 3-ketoacyl-CoA dư thừa được

tích lũy Một phần của khối này không được xử lý hơn nữa để acetyl-CoA và

acyl-CoA(Acyl-CoA là một nhóm các coenzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa của axit

béo) Các hợp chất trải qua quá trình oxy hóa beta , tạo thành một hoặc nhiều phân tử

acetyl-CoA Điều này, đến lượt nó, đi vào chu trình acid citric , cuối cùng hình thành một

số phân tử ATP Axit béo + CoA + ATP ⇌ acyl-CoA + AMP + PP i nhưng sự tự thủy

phân tiếp theo là phản ứng khử carboxyl Đối với sản xuất hương phomai xanh,

conidiospores hoặc nấm sợi Penicillium cố định và liên lạc với các nguồn chất thải từ sữa

có bổ sung dầu dừa hoặc chuỗi axit béo tự do trung bình Các loài nấm mốc thuộc giống

Penicill m như P camemberti, P roq eforti…được sử dụng trong giai đoạn ủ chín một

số loại phomat bán mềm Nhóm vi sinh vật này có khả năng sinh tổng hợp enzyme

protease và lipase ngoại bào, xúc tác chuyển hóa protein và lipid trong khối đông tạo nên

mùi vị đặc trưng cho sản phẩm Bào tử nấm sợi sẽ phát triển thành những khuẩn ty mọc

theo chều dọc các mao quản hình thành do quá trình xăm khối đông Sự sinh trưởng của

hệ sợi nấm k m theo sự thoát hơi nước ra môi trường có ảnh hưởng đôi chút tới cấu trúc

và hình dạng phomat thành phẩm Các enzyme lipase do sợi nấm tổng hợp xúc tác thủy

phân triacylglycerid thành glycerol và các acid béo Tiếp theo một số acid béo có thể bị

phân giải (quá trình β-oxy hóa) và tạo ra methylketon và các sản phẩm phụ như ester và

rượu Trong số những methylketon được tìm thấy trong phomat vân xanh, chiếm hàm

lượng cao nhất là heptanone, ngoài ra còn có nonanone, pentanone và

2-undecanone Quá trình thủy phân lipid và protein trong giai đoạn ủ chín luôn được theo

dõi và điều khiển để đạt mức độ phân giải nhất định Nếu không, chúng sẽ làm thay đổi

cấu trúc, mùi vị, làm giảm giá trị dinh dưỡng và mức độ an toàn của phomat thành phẩm

Hệ thống liên tục và fed-batch với các sản phẩm tích hợp phục hồi phản ánh tình

trạng tiên tiến nghiên cứu trong lĩnh vực này (van der Schaft et ai., 1992a) Vi khuẩn,

chẳng hạn như Aureobasidium (Fukui và Yagi, 1991), nấm men, và các loại nấm bậc cao

sản xuất 2-alkanones, nhưng chỉ Penicillium được sử dụng trong công nghiệp Một nghiên

cứu so sánh trong mười chủng P camemberti trong môi trường liên quan đến phômai,

phát phổ tương tự như các chất bay hơi, nhưng sự khác biệt về số lượng đáng kể (Jollivet

et ai., 1993) Chủng này tốt nhất sản xuất hơn 50 mg 2-alkanonesxL-1 sau 4 ngày ủ Hơn

60% chuyển đổi các thêm tiền thân axit béo được báo cáo Sau 14 ngày ủ hàm lượng các

2 alkanones và tổng số chất dễ bay hơi đã giảm Chuyển đổi 2-alkanols và tiếp tục ketone

hydroxy không bay hơi và diol có thể là lý do Cách khác tạo 2-alkanones, chẳng hạn như

quá trình oxy hóa ankan hoặc chuyển đổi CoA-độc lập của béo axit đang được thảo luận

và làm cho toàn quá trình trao đổi chất nhiều khó khăn hơn

Chỉ hợp chất hương vị quan trọng diketone là carbohydrate 2,3-butandione Có sẵn như

là một sản phẩm phụ của quá trình nuôi cấy sản xuất, các quy trình sinh học phối hợp hơn

nữa đã được trình bày (phần 2.5) Yếu tố rất quan trọng là cung cấp citrate, hoạt độ của

nước, và cố định enzyme Cải thiện chủng bởi đột biến hoặc kỹ thuật di truyền được đề

cập trong chương 8

Alkanals ( hay gọi là andehit) béo thường là các các hợp chất có giá trị mùi trái

cây, chua cay và có đặc trưng chất béo Thông qua sản phẩm trung gian của quá trình oxy

hóa của nó, andehit tuân theo các con đường khác nhau: quá trình oxy hóa của rượu ban

đầu , sự khử axit béo tương ứng, phản ứng aldolase, hoặc bởi một Strecker

decarboxylation tương tự của 2-keto axit Aldehyde trong phomai được tạo ra từ các acid

amin bằng con đường chuyển hóa acid amin, sau đó hình thành các hợp chất trung gian

bằng cách decarbonxylat Các andehyde mạch nhánh 2-methylpropanal, 2-methybutanal

và 3-methylbutanal tạo ra muid mạch nha cho các sản phẩm, nếu ở nồng độ thấp có thể

chuyển sang mùi trái cây.Acetaldehyde, trong pha loãng trong chanh và hương vị sữa

chua, là một ví dụ tốt cho cấu trúc phân tử đơn giản, tính quan trọng trong thương mại đã

trở thành một hợp chất mục tiêu công nghệ sinh học Nhu cầu thị trường đã kích thích

nghiên cứu của một nhóm người Canada để chuyển đổi (sinh học) ethanol với chủng

Candida utilis thích nghi hoặc tế bào Pichia pastoris cố định bằng alginate (Armstrong et

al., 1993)( tìm về quy trình này) Đột biến cao khi sục khí của Zymomonas mobilis có

thể sản xuất acetaldehyde từ glucose Một chuỗi dài aldehyde hình thành hoạt tính của

enzyme đã được ghi nhận ở các loại tảo xanh Ulva Pertusa (Kajiwara et al., 1993) Các

sản phẩm có hương vị rong biển là (ZS, ZII, ZI4) –heptadecatrienal và những loại khác

Nguồn gốc từ các axit béo không bão hòa là một lần nữa rõ ràng Không có như vậy hoạt

động này vẫn chưa được phát hiện trong các tế bào vi sinh vật

Aldehyt chuỗi nhánh, như butanal 3-methyl, 2-metyl butanal và propanal 2-methyl,

là những hợp chất hương vị mạnh Trong nhiều sản phẩm thực phẩm, andehit, như vậy là

hợp chất quan trọng, hương vị Một quá trình quan trọng dẫn đến sự hình thành của các

hợp chất như 3-metyl butanal là phi enzym, nhiệt gây ra, Strecker suy thoái của các nhóm

amin với việc giảm các gốc thuốc đường (Strecker 1862 ) Kể từ khi thực phẩm trong quá

trình sản xuất của họ trong nhiều trường hợp phải chịu một số loại xử lý nhiệt và protein

và carbohydrate thường hiện nay, các điều kiện cho sự hình thành của các aldehyd chuỗi

nhánh được ưa chuộng Ngoài hình hóa, andehit chuỗi nhánh được hình thành trong quá

trình lên men của nhiều loại thực phẩm Mặc dù 3-metyl butanal và các chuỗi ngắn khác,

nhánh aldehyde là các hợp chất hương vị quan trọng trong nhiều loại thực phẩm, các

tuyến đường chuyển đổi sinh hóa đã được nghiên cứu chủ yếu trong các sản phẩm sữa lên

men và chuyển đổi hóa học chủ yếu là liên quan đến phản ứng Strecker (Maillard)