Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn geobacillus stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa

Hiện nay, các phương pháp phân tích bằng vi sinh vật được sử dụng phổ biến để xác định dư lượng kháng sinh vì tính đơn giản, tiện lợi của nó.. Các phương pháp phát hiện dư lượng kháng si

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VƯƠNG THANH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƯ LƯỢNG

KHÁNG SINH TRONG SỮA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VƯƠNG THANH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus

stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƯ LƯỢNG

KHÁNG SINH TRONG SỮA

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS MAI THỊ ĐÀM LINH

Hà Nội - Năm 2017

Luận văn thạc sỹ

MỞ ĐẦU

Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928 bởi Alexander Flemming, chất kháng sinh được coi là công cụ hữu hiệu trong việc điều trị bệnh cho người và động vật Chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như chăn nuôi, trồng trọt, nuôi truồng thủy hải sản, … có tác dụng rất lớn là giúp cho vật nuôi trồng chống lại bệnh tật Việc sử dụng chất kháng sinh trong chăn nuôi đã được chứng minh là làm tăng khả năng hấp thu dinh dưỡng, khả năng thu nhận thức ăn của vật nuôi đề kháng lại các bệnh tật Do hiệu quả nhanh và mạnh, chất kháng sinh hiện nay được sử dụng tràn lan và phổ biến trong chăn nuôi mà không được kiểm soát Điều này dẫn đến một thực trạng là hiện tượng tồn dư chất kháng sinh trong vật nuôi gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm Tại Việt Nam, trong chăn nuôi gia súc, gia cầm hiện nay người dân sử dụng rất tùy tiện các loại thức ăn có chứa chất tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh cho vật nuôi và giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn Hậu quả là dư lượng chất kích thích và thuốc kháng sinh trong thực phẩm từ vật nuôi này vượt ngưỡng cho phép gấp nhiều lần

Trong ngành sản xuất sữa hiện nay, việc sử dụng thuốc kháng sinh để phòng

và chữa bệnh cho bò (phổ biến là bệnh viêm vú bò) là nguyên nhân gây ra sự tồn dư thuốc kháng sinh trong mô và trong sữa của bò Kháng sinh tồn dư trong sữa bò, dê, cừu gây ức chế vi khuẩn được dùng trong quá trình chế biến sữa, đặc biệt là quá trình chế biến phomat, sữa chua khi phải dùng vi khuẩn để lên men Đồng thời sự tồn dư lượng kháng sinh trong sữa gây nguy hiểm cho trẻ em và người già, là những đối tượng dùng sữa nhiều

Các nước Châu Âu đã ngừng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi từ năm

2006 Mỹ và Thái Lan sẽ ngừng sử dụng trong năm 2017 Quốc tế đã có rào cản của riêng mình để nói không với thực phẩm chứa kháng sinh Ở Việt Nam, vấn đề kiểm tra và kiểm soát dư lượng kháng sinh trong sữa đang được quan tâm Trước đòi hỏi ngày càng cao về chất lượng và độ an toàn của các sản phẩm có nguồn gốc từ đồng

Hiện nay, các phương pháp phân tích bằng vi sinh vật được sử dụng phổ biến

để xác định dư lượng kháng sinh vì tính đơn giản, tiện lợi của nó Có nhiều test vi sinh vật đã được nghiên cứu và ứng dụng để xác định kháng sinh trong nhiều loại

sản phẩm Geobacillus stearothermophilus là chủng vi sinh vật ưa nhiệt, rất nhạy

cảm với kháng sinh, được sử dụng phổ biến trong các test của nước ngoài Tuy nhiên các test này có giá thành rất cao, thủ tục nhập khẩu đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi ở Việt Nam Để chủ động trong nghiên cứu cũng như

đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sử

dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa”

Mục tiêu của đề tài

Xây dựng được quy trình chế tạo test thử từ bào tử vi khuẩn Geobacillus

stearothermophilus để phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa tươi nguyên liệu

Luận văn thạc sỹ

Chương 1 - TỔNG QUAN

1.1 Tình hình sản xuất sữa tươi ở Việt Nam:

Là quốc gia đông dân với mức tăng trưởng dân số cao, khoảng 1,2%/năm, Việt Nam được đánh giá là thị trường tiềm năng cho các hãng sản xuất sữa Với tỷ

lệ tăng trưởng GDP 6-8%/năm, thu nhập bình quân đầu người tăng 14,2%/năm cùng với xu hướng cải thiện sức khỏe và tầm vóc của người Việt khiến nhu cầu sử dụng các loại sữa và các sản phẩm từ sữa luôn ở mức cao Theo dự báo của Hiệp hội Sữa Việt Nam (VDA), lượng sữa tiêu thụ bình quân đầu người tại Việt Nam vào năm

2010 đạt 15 lít/năm và sẽ tăng gần gấp đôi, lên mức 28 lít/năm vào năm 2020 [15] Tăng trưởng doanh thu ngành sữa chủ yếu là sữa bột và sữa nước, chiếm 74% tổng giá trị thị trường Tuy nhiên, năng lực sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa trong nước được dự báo sẽ không theo kịp nhu cầu tiêu thụ, đặc biệt là trong lĩnh vực sản xuất sữa tươi Lượng sữa tươi nguyên liệu trong nước chỉ đáp ứng được 30% nhu cầu sử dụng [15] Trong khi đó, chất lượng sữa thấp, không ổn định do nguồn cung cấp chủ yếu từ các hộ chăn nuôi nhỏ, năng suất thấp

Nắm bắt được tiềm năng tăng trưởng của thị trường, ngày càng có nhiều doanh nghiệp tham gia vao ngành chế biến sữa Việt Nam Đặc biệt, đa phần các doanh nghiệp hiện đang tập trung đầu tư phát triển vùng nguyên liệu của riêng mình dưới nhiều hình thức nhằm giải quyết được nhược điểm lớn nhất của ngành sữa Việt Nam là thiếu hụt nguyên liệu Một trong những doanh nghiệp sữa thành công nhất với việc tạo lập vùng nguyên liệu để phát triển sản phẩm là Công ty Cổ phần sữa

TH (nhãn hiệu sữa TH true milk) Các doanh nghiệp khác cũng không đứng ngoài cuộc đua phát triển vùng nguyên liệu như Công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk, Công ty cổ phần Thực phẩm dinh dưỡng NutiFood Việt Nam, … Sức hấp dẫn của thị trường sữa Việt Nam không chỉ kích thích các doanh nghiệp nội địa mở rộng sản xuất mà còn thu hút nhiều nhà đầu tư nước ngoài bỏ vốn vào ngành Ví dụ, doanh nghiệp sữa Friesland Campina Việt Nam (nhãn hiệu sữa Cô gái Hà Lan) đang xúc tiến đẩy mạnh phát triển vùng nguyên liệu tại tỉnh Hà Nam theo hình thức hợp tác

Luận văn thạc sỹ

với các hộ nông dân, hình thành các trang trại chăn nuôi bò sữa quy mô gia đình (50

- 80 bò sữa/trại) khác với mô hình trại lớn 500 - 1000 bò sữa/trại của các doanh nghiệp khác [15]

Có rất nhiều doanh nghiệp tham gia vào ngành chế biến sữa do họ nắm bắt được tiềm năng tăng trưởng của thị trường Điều này dẫn đến sự cạnh tranh gay gắt của các hãng sữa trong việc đưa ra sự lựa chọn sản phẩm sữa tốt nhất cho người tiêu dùng Vấn đề chất lượng và an toàn vệ sinh thực phẩm của các sản phẩm này được đặt lên hàng đầu Một vấn đề đang được quan tâm hiện nay là xuất hiện sự tồn dư của chất kháng sinh trong các sản phẩm sữa Nguyên nhân là do người dân sử dụng kháng sinh bừa bãi trong chăn nuôi, quy trình sử dụng không được kiểm soát Do đó việc kiểm soát chất lượng sữa, đặc biệt là dư lượng kháng sinh trong sữa ngay tại nguồn là vấn đề đang được quan tâm và đẩy mạnh

Hình 1.1 Quy trình kiểm soát chất lượng sữa đầu vào trước khi xử lý

Mỹ là nước đầu tiên phát hiện ra hiệu quả sử dụng kháng sinh làm chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi Ở Mỹ hàng năm có khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong chăn nuôi Theo thống kê, xấp xỉ 80% số gia cầm, 70% lợn, 70% bò sữa và 60% bò thịt được nuôi dưỡng bằng thức

ăn có bổ sung kháng sinh Ước tính cứ mỗi USD chi phí cho kháng sinh dùng trong thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2-4 USD [33] Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm (FDA) Mỹ đã ban hành các quy định về việc cho phép sử dụng kháng sinh để kích thích tăng trọng từ năm 1951 Theo Hội đồng nghiên cứu Quốc Gia Hoa Kỳ (NRC), 1998, Mỹ và Canada đã cho phép sử dụng 17 loại kháng sinh vào thức ăn cho lợn, trong đó có 8 loại phải ngừng sử dụng trước khi giết mổ từ 5-

70 ngày Liều lượng bổ sung thường rất thấp tùy theo loại kháng sinh, nhưng nếu sử dụng Chlotetracycline hay Zinbacitracilin thì hàm lượng đó là 30 đến 40 ppm [33]

Ở Anh và Pháp, trung bình một năm có khoảng 75% số động vật được dùng kháng sinh để điều trị và gần 60% động vật được dùng kháng sinh để phòng bệnh

Ở Anh, Tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng nhiều nhất để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, chiếm hơn 50% tổng số kháng sinh [52] Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (quy theo mức 100% tinh khiết của các thành

Việc bổ sung kháng sinh với liều lượng thấp được xác nhận là cải thiện về trọng lượng vật nuôi, giảm lượng thức ăn cho vật nuôi, giúp vật nuôi chống lại bệnh tật Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc thuốc thú y nói chung và kháng sinh nói riêng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đã gây hiện tượng kháng thuốc hoặc tồn dư thuốc trong sản phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng, môi trường cũng như hiệu quả điều trị bệnh [20,23] Chính vì vậy, để tăng cường kiểm soát dư lượng thuốc, các nước phát triển đã có những qui định rất chặt chẽ và kiểm soát nghiêm ngặt Ngày 22/12/2009 EU đã ban hành quyết định số 37/2010 thay cho quyết định số 2377/90 EC quy định giới hạn tồn dư thuốc thú y cho phép trong sản phẩm động vật [34] Hoa Kỳ và Liên minh Châu Âu cho phép dư lượng tối đa của kháng sinh trong thịt và phủ tạng động vật là

100 µg/kg, trong khi đó, Nhật Bản chỉ cho phép 20 µg/kg và Hàn Quốc là 10 µg/kg [17,22,28] Do phát hiện ra những độc tính của Chloramphenicol (CAP) lên cơ quan tạo máu (có thể gây thiếu máu không tái tạo, không phục hồi do suy tủy, gây tử vong) nên từ năm 1990 Ủy ban Châu Âu đã cấm sử dụng CAP trong thú y [3]

1.2.2 Tại Việt Nam:

Ở Việt Nam kháng sinh được sử dụng tràn lan để phòng bệnh và trị bệnh nên tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt và sữa là rất phổ biến Có tới 60-70% tổng các thuốc đang dùng để phòng trị bệnh cho vật nuôi là thuốc hóa học trị liệu trong

đó chủ yếu là thuốc kháng sinh [16] Theo Lã Văn Kính và cộng sự (2007), tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở nước ta là rất cao: 100% các cơ sở chăn nuôi có

sử dụng Oxytetracycline, 67% các cơ sở chăn nuôi có sử dụng Chloramphenicol

cơ sở sử dụng kháng sinh không hợp lý chiếm 17,22%, chủ yếu là sai về liều lượng (12,57%) và liệu trình điều trị (3,09%) đồng thời số cơ sở không tuân thủ các quy định về thời gian ngưng thuốc trước khi giết mổ chiếm tới 40,13% [14,18]

Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các hộ chăn nuôi trên địa bàn Hà Nội, kết quả nghiên cứu của Lê Thị Ngọc Diệp cho thấy kháng sinh thuộc hai nhóm Quinolones và Macrolides được sử dụng nhiều nhất với tỷ lệ tương ứng là 78,14% và 86,89% Các nhóm kháng sinh khác là Polipeptides (54,92%), Aminoglycosides (50,96%), β-lactams (4,58%) và Tetracycline (46,58%) [5] Từ năm 2003 - 2006, kết quả phân tích lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong 150 mẫu thịt và gan của gia cầm, gia súc thu thập tại Hà Nội của Khoa Thực phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện dinh dưỡng Quốc gia cho thấy:

đã phát hiện tồn dư thuốc kháng sinh nhóm Tetracycline trong 18 mẫu, chiếm tỷ

lệ 12% Có 5,5% số mẫu trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường Hà Nội có tồn dư kháng sinh Tetracycline Tại các khu vực chăn nuôi ở miền nam cũng nhận thấy

có 4 cơ sở chiếm 22,2% các mẫu thịt gà có tồn dư các loại kháng sinh Tetracycline, Amoxyline, Erofloxacine với hàm lượng cao gấp từ 1,4 – 30,9 lần

so với ngưỡng cho phép [14]

Luận văn thạc sỹ

Các bệnh của bò thường được điều trị bằng kháng sinh như bệnh nhiễm khuẩn nặng, viêm vú, viêm tử cung, viêm phổi, viêm móng, khớp, tiêu chảy,… Kết quả nghiên cứu của Sa Đình Chiến và Cộng sự [4] cho thấy bệnh viêm vú đang gây thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi Tỷ lệ viêm vú lâm sàng của bò sữa mới nhập vào địa bàn Mai Sơn, Sơn La là 27,46 %, viêm vú phi lâm sàng là 48,16 % Có nhiều nguyên nhân dẫn đến phát sinh phát triển bệnh viêm vú Kháng sinh được sử dụng để điều trị bệnh viêm vú bò sữa là: Amoxilin, Lincomycin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Cefazolin, Neomycin, Tetracyclin, Gentamycin

Hình 1.2 Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi trên địa bàn tỉnh

Bình Dương [18]

1.3 Tồn dƣ chất kháng sinh trong thực phẩm:

Theo tiêu chuẩn Việt Nam số 7405:2004 [1] về sữa tươi nguyên liệu - yêu

cầu kỹ thuật cho phép giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y như sau:

Luận văn thạc sỹ

Bảng 1.1 Giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh cho phép trong sữa

những nguyên nhân của tình trạng mất an toàn vệ sinh thực phẩm

Kháng sinh đã và đang đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi, không chỉ để

đề phòng và trị bệnh mà còn được dùng ở liều thấp như một chất kích thích sinh trưởng [6,30,52] Việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp hoặc sử dụng sai nguyên tắc

Luận văn thạc sỹ

các chất kháng sinh trong chăn nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc hoặc tồn dư thuốc trong sản phẩm thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng cũng như

hiệu quả điều trị bệnh [20,23]

Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh chính:

- Kháng sinh có thể nhiễm vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh

- Kháng sinh có thể tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi do sử dụng thường xuyên trong thức ăn chăn nuôi nhằm kích thích tăng trọng cho gia súc (liều thấp) hoặc cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh (liều trung bình)

- Kháng sinh có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật, để bảo quản thực phẩm

- Kháng sinh sử dụng để chữa bệnh cho gia súc (liều cao)

1.3.2 Tác hại:

1.3.2.1 Nguy cơ đối với sức khỏe cộng đồng:

- Gây dị ứng, phản ứng quá mẫn: Theo các báo cáo về y tế, Penicillin là kháng sinh thường gây dị ứng nhất Kết quả nghiên cứu của Jones đã chỉ ra rằng có khoảng 5-10% dân số mẫn cảm đối với Penicillin hoặc kháng sinh khác với biểu hiện dị ứng da, mệt mỏi, nôn, thậm trí sốc ngay ở nồng độ thấp (1ppb) [48] Đã có trường hợp người bị nổi mẫn da trầm trọng vì uống sữa có dư lượng Penicillin (<1 IU/ngày tương đượng 0,003 IU/ml) Một số trường hợp khác gây ngứa da tay, da mặt sau khi ăn thịt bò có tồn dư Penicillin hoặc thịt heo từ thú mới điều trị bằng Penicillin cách đó 3 ngày Gây sốc quá mẫn dẫn đến chết người ở người có cơ địa dị ứng với kháng sinh

- Gây ngộ độc: Cloramphenicol là loại kháng sinh cấm sử dụng trên thế giới

do gây thiếu máu suy tủy (phụ thuộc liều), đôi khi gây thiếu máu bất sản (không phụ thuộc liều) ở những cá thể đặc ứng do di truyền có thể dẫn đến tử vong Một số thuốc như Nitrofurans, Quinoxalinedinoxides và Nitroimidazoles cần có sự kiểm soát nghiêm ngặt vì sự tích lũy thuốc do dùng lâu ngày có thể gây suy gan, suy thận

- Tạo dòng vi khuẩn đề kháng kháng sinh: Đề kháng kháng sinh hiện nay đang

là vấn đề toàn cầu bởi trong vòng 15 - 20 năm trở lại đây chưa có một kháng sinh kiểu mới nào được phát hiện trong khi không có kháng sinh nào là không bị kháng

do sử dụng các sản phẩm động vật có tồn dư kháng sinh Theo kết quả nghiên cứu

của một số tác giả cho thấy ở bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ E.coli kháng kháng sinh

tăng từ 18% năm 2005 lên 42% năm 2008: cho thấy mức độ kháng kháng sinh Tetracycline là 88,6%, Ciprofloxacine là 82,3% [12]

1.3.2.2 Nguy cơ đối với môi trường:

Những chất kháng sinh không rõ nguồn gốc được tổng hợp bằng các loại phụ gia gây ô nhiễm môi trường nặng nề không kém rác thải công nghiệp Chất kháng sinh vào cơ thể vật nuôi thông qua thức ăn hoặc bằng các con đường khác đều được thải ra môi trường Ảnh hưởng của việc thải chất kháng sinh đến môi trường được thể hiện ở các khía cạnh sau:

+ Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất: chất kháng sinh dù bằng con đường nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bừng sinh thái hệ vi sinh vật và ảnh hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường

+ Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường: chất thải của vật nuôi khi điều trị hoặc nuôi dưỡng bằng các loại thức ăn có kháng sinh, không chỉ gồm các cặn bã của quá trình tiêu hóa hấp thu mà còn chứa rất nhiều loại vi sinh vật kháng thuốc, nhất là các chủng vi khuẩn đa kháng Chúng

là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường

1.3.2.3 Nguy cơ đối với công nghệ chế biến bảo quản thực phẩm:

Chất kháng sinh có thể gây trì hoãn sự khởi đầu tích cực của các vi sinh vật

có lợi trong sản xuất bơ, phomat, sữa chua chỉ với nồng độ 1ppb Kháng sinh còn

Luận văn thạc sỹ

làm giảm bớt mùi, vị và độ axit trong các sản phẩm, làm giảm quá trình đông tụ của sữa, đồng thời nó cũng là nguyên nhân không thể chấp nhận được với sự chín muồi của phomat [48] Sự có mặt của kháng sinh trong thịt gây nên những tác dụng ngoài mong muốn trong sản xuất xúc xích và các sản phẩm lên men thịt khác

Người tiêu dùng khó nhận biết được những sản phẩm có tồn dư kháng sinh nếu không có chuyên môn Vấn đề này cần phải được bắt đầu giải quyết từ quy trình nuôi gia súc, gia cầm Khi đó sẽ cải thiện được chất lượng của thực phẩm chế biến từ động vật cũng như tránh được tình trạng kháng kháng sinh cho người Do đó cần phải biết được phương pháp xác định dư lượng thuốc kháng sinh trong thực phẩm để hạn chế được những tác dụng nguy hại từ những thực phẩm chứa dư lượng thuốc kháng sinh quá tiêu chuẩn cho phép

1.4 Các phương pháp phát hiện dư lượng kháng sinh trong sữa:

Hiện nay, việc phân tích nhóm kháng sinh trong các nền mẫu sinh học (có nguồn gốc từ động vật) rất đa dạng, trong đó tập trung vào các phương pháp chính như: Xác định định tính nhờ vi sinh vật [6,24,58], xác định bán định lượng bằng phương pháp ELISA, định lượng kháng sinh bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử [25], phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [9,21,62],…

1.4.1 Phương pháp khẳng định (lý hoá)

Phương pháp này cho phép có thể nhận diện chất kháng sinh tồn dư, định lượng chính xác và đối chiếu MRL (dư lượng tối đa cho phép)

1.4.1.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC):

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (còn được gọi là Sắc ký lỏng áp suất cao) là một

kỹ thuật trong hóa phân tích dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp Hiện nay, HPLC đang ngày càng phát triển và được ứng dụng rất nhiều trong các ngành phân tích định tính và định lượng đặc biệt được ứng dụng trong phân tích dư lượng kháng sinh sữa, phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu , các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

Khả năng phát hiện dư lượng kháng sinh: HPLC có khả năng phát hiện tất cả các kháng sinh có mặt trong thực phẩm, các kháng sinh thuộc nhóm Betalactams,

Luận văn thạc sỹ

Tetracyclines, Sulphonamides, Macrolides, Chloramphenicol,… William và cộng

sự đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng kháng sinh tetracycline trong các mẫu thịt và sữa bò với ngưỡng phát hiện là 20-50 ppb trong mẫu thịt và 4-8 ppb trong các mẫu sữa [68], xác định được dư lượng kháng sinh Sulfamethazine ở 3 trong 4 mẫu sữa bò đã phân tích với hàm lượng 12,2 μg/kg cao hơn rất nhiều so với giới hạn cho phép [26] Sử dụng phương pháp HPLC để xác định các dư lượng kháng sinh Cefotaxime và Cephalexine trong sữa, với giới hạn xác định tương ứng

là 0,1 và 0,3 ng/ml [64] Tác giả W Hela và cộng sự [41] đã phát triển phương pháp HPLC với detector DAD để xác định 12 kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamid (SAs) trong thịt, gan, thận động vật (lợn, bò, gà)

Tại Việt Nam, TCVN 8345- 2010 [2] qui định phương pháp xác định 10 SAs trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Phương pháp này cũng được áp dụng để xác định dư lượng các thuốc thú y có chứa Cephalexine Phương pháp HPLC có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký khác như sắc ký khí, khối phổ cho phép xác định chính xác các dư lượng kháng sinh trong các mẫu phân tích HPLC đã và đang được sử dụng cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu, pháp lý và y dược [40]

Hình 1.3 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Luận văn thạc sỹ

1.4.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS):

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography - HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry - MS) Phương pháp này đã được nghiên cứu để phát hiện đồng thời tồn dư nhóm Phenicol gồm Chloramphenicol (CAP), Thiamphenicol (TAP) và Florfenicol (FF) trong một số sản phẩm có nguồn gốc động vật

Trên thế giới, nhiều tác giả đã nghiên cứu thành công phương pháp xác định

dư lượng CAP (Chloramphenicol) trong sữa bằng kỹ thuật sắc ký khác nhau Gần đây với sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật sắc ký, áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phân tích CAP có nhiều ưu điểm nổi trội Nhóm tác giả Yanbin Lu, Quing Shen [69] đã xác định được 13 SAs chỉ trong 7 phút với độ nhạy cao, LOQ

từ 2-10 ppb bằng sự tương tác trực tiếp chiết pha rắn phân tán cột C18-Silica với sắc ký lỏng khối phổ chế độ bẫy tứ cực Tác giả George Stubbings và cộng sự [39]

đã ứng dụng kỹ thuật QuEChERS và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phát triển và thẩm định phương pháp phân tích dư lượng 30 thuốc thú y trong thịt gia súc, gia cầm

Ở trong nước, việc áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ để phát hiện dư lượng kháng sinh trong thực phẩm đã được triển khai Kết quả nghiên cứu của Vũ Thị Trang [19] về việc xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm Sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) đã chỉ ra rằng phương pháp phân tích LC-MS/MS có độ nhạy cao, phân tích nhanh và chính xác, có thể áp dụng phân tích dư lượng 10 SAs với độ tin cậy cao

Các mẫu được áp dụng chủ yếu là dược phẩm và một số loại thực phẩm như sữa, mật ong, thịt, cá, … Phương pháp này chủ yếu cho phép định tính sự hiện diện của các kháng sinh trong mẫu phân tích nhưng đôi khi cũng có thể xác định được lượng kháng sinh trong khoảng 0,4-0,6 μg/kg đối với Streptomycin, Kanamycin, Gentamycin [53], khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp, ví dụ Acetone-Methanol-Ammonia, 5:4,5:0,5 trong phân tích Streptomycin, Chloroform-Methanol-Ammonia, 1:1:1 trong phân tích Tetracycline

Luận văn thạc sỹ

Ưu điểm của phương pháp khẳng định lý hóa:

Nhận diện rõ ràng, khả năng định lượng tốt, có độ nhạy cao, thích hợp cho việc khẳng định các chất cấm, các chất có dư lượng tối đa cho phép

Nhược điểm của phương pháp khẳng định lý hóa:

Qui trình rất phức tạp (chuẩn bị, tách chiết, làm sạch), đòi hỏi thiết bị đắt tiền, cần kỹ thuật viên chuyên nghiệp cao, một số kháng sinh không có qui trình phân tích bằng phương pháp này Do vậy phương pháp này không phù hợp cho các phòng kiểm nghiệm quy mô nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương

1.4.2 Phương pháp sử dụng kỹ thuật nano

Công nghệ nano đã tạo ra các loại vật liệu thế hệ mới có nhiều đặc tính siêu việt Ưu điểm nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc nano trong tạo các cảm biến sinh học cho độ đặc hiệu và độ nhạy cao Hiện nay, việc ứng dụng các aptamer (là các oligonucleotide ssDNA, RNA hoặc các peptid có khả năng liên kết đặc hiệu với các phân tử đích) trong tạo cảm biến sinh học đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Lã Thị Huyền và cộng sự [11] đã công bố các kết quả cho thấy có thể

sử dụng kỹ thuật nano để xác định sự có mặt của chất kháng sinh trong các mẫu nghiên cứu, cụ thể như:

- Tạo được thư viện các aptamer (có bản chất ADN) có độ đa dạng cao để làm nguồn sàng lọc, thu nhận aptamer có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với từng kháng sinh trong số 4 kháng sinh thường sử dụng trong chăn nuôi: Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline

- Thu nhận và gắn kết aptamer với các hạt nano (hạt nano vàng hoặc sillica phát quang) để tạo phức hệ DNA-Au/DNA-sillica có khả năng gắn kết đặc hiệu với từng kháng sinh: Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline

- Sử dụng phức hệ DNA-Au/DNA-sillica để tạo được KIT xác định nhanh, chính xác dư lượng kháng sinh Penicillin, Streptomycin, Neomycin và Tetracycline trong sữa với thời gian 1,5-2 giờ và độ nhạy > 99%, độ đặc hiệu > 98%

Ưu điểm: xác định chính xác dư lượng kháng sinh trong sữa với thời gian

ngắn, độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Luận văn thạc sỹ

Nhược điểm: Cần có trang thiết bị đắt tiền và đội ngũ cán bộ thực hiện được

đào tạo chuyên sâu

1.4.3 Phương pháp sàng lọc (screening method)

Đây là phương pháp được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của một hoặc một nhóm chất ở một nồng độ quan tâm hay để phân biệt giữa các mẫu đạt và mẫu không đạt yêu cầu vệ sinh Phương pháp này thường được thiết kế để tránh tối đa kết quả âm tính giả Trong chiến lược phân tích tồn dư, phương pháp sàng lọc thường được tiến hành trước khi định danh và định lượng chính xác

1.4.3.1 Phương pháp sắc ký miễn dịch

Hiện nay các test nhanh trên cơ sở sắc ký miễn dịch được sử dụng để phát hiện nhanh và tương đối chính xác các loại kháng sinh trong sữa ngay tại địa điểm thu mua, cho kết quả trong thời gian ngắn (khoảng 1-2 phút) Test thường ở dạng que thử, được sử dụng phổ biến, rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Que thử dạng sắc kí miễn dịch dựa trên cơ sở phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại test thử nhanh dạng sắc ký miễn dịch như:

- Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc nhóm -lactam của hãng Ar Brown - Nhật Bản cho kết quả sau 5 phút với độ nhạy từ 3-20 ppb tùy từng loại kháng sinh như với Penicillin 3 ppb, Ceftiofur 5ppb, Cloxacillin 4ppb,

- Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa thuộc các nhóm lactam, Tetracycline, Streptomycin, Chloramphenicol của hãng Ballya - Trung Quốc cho kết quả chỉ sau 3-5 phút với độ nhạy từ 0,3-100 ppb tùy từng loại kháng sinh như Penicillin G 1,5-2ppb, Tetracycline 10 ppb, Streptomycin 100 ppb, Chloramphenicol 03 ppb,…

 Test kiểm tra nhanh dư lượng kháng sinh thuộc nhóm Sulfonamides trong sữa của hãng Nankai Biotech - Trung Quốc cho kết quả sau 10 phút với độ nhạy từ

3-30 ppb tùy từng loại kháng sinh, nhóm Beta-lactams từ 2-4 ppb trong 5 phút, …

Luận văn thạc sỹ

Ưu điểm:

Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao; phát hiện được nhiều nhóm kháng sinh trong sữa, cho kết quả nhanh, có thể sử dụng các mẫu khác nhau, bán định lượng; thích hợp dùng để kiểm soát nguyên liệu đầu vào

Nhược điểm:

Giá thành nguyên liệu cao, có thể phản ứng chéo

Hình 1.5 Một số loại que thử sắc ký miễn dịch

Phương pháp ELISA có khả năng phát hiện hầu hết những chất kháng sinh thường có mặt trong thực phẩm như nhóm Beta-lactams, nhóm Chloramphenicol, nhóm Macrolides, nhóm Tetracyclines, nhóm Aminoglycosides, nhóm Sulphonamides

Luận văn thạc sỹ

Liên minh châu Âu (Chỉ thị 657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng các hóa chất kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo và các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm Abhishek Gaurav và cộng sự [38] đã nghiên cứu trên 133 mẫu sữa thu thập được từ nhà sản xuất sữa thuộc 5 huyện của Punjab, Ấn Độ vào tháng 5/2013 và đã thử nghiệm, phân tích tình trạng tồn dư kháng sinh Tetracycline Kết quả cho thấy có 18 mẫu sữa có tồn dư Tetracycline

Tỷ lệ Tetracycline được phát hiện trong các mẫu sữa thuộc 5 huyện trong phạm vi

từ 0-46 là 15% Nồng độ các mẫu sữa có chứa dư lượng kháng sinh Tetracycline trong phạm vi từ 16-134 là 5ppm

Với mục đích đưa việc xác vào xét nghiệm cận lâm sàng, nghiên cứu của Hua-Jin Zeng và cộng sự năm 2011 đã sử dụng kháng thể thu được từ việc tạo miễn dịch với Sparfloxacin trên thỏ kết hợp với huyết tương bò Sau khi tối ưu hóa, phương pháp ELISA đã xác định hàm lượng Sparfloxacin từ 5ng/mL đến 2mg/mL với độ thu hồi từ 87,7 đến 106,2% [42] Năm 2012, cũng với kỹ thuật ELISA gián tiếp, tác giả Jiang Jinqing đã xác định được hàm lượng Sparfloxacin trong mẫu sữa

bò với khoảng xác định từ 0,036 đến 92,5 ng/mL với giới hạn phát hiện là 0,019 ng/mL, hệ số tương quan đạt 0,9844 [46]

Ở Việt Nam, từ năm 2002 đến nay phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích sàng lọc tại phòng kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng với các chỉ tiêu CAP (Chloramphenicol), AOZ (3-amino-2-oxazolidone để kiểm tra Furazolidone) và AMOZ (5-methylamorfolino-3-amino-2-oxazolidone để kiểm tra Furaltadone) Phạm Kim Đăng và cộng sự đã sử dụng kít ELISA do CER Vương Quốc Bỉ sản xuất để phân tích tồn dư chất kháng sinh Quinolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc Kết quả được khẳng định lại bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Kết quả cho thấy, bộ kít ổn định để phân tích các Quinolone được thử vào trong tôm với giới hạn nồng độ phát hiện là 0,07ppb Tác giả cũng cho rằng khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện

Nhược điểm:

Một số hóa chất trong bộ kit phải bảo quản lạnh và có hạn sử dụng nhất định;

độ chính xác không cao bằng các phương pháp hóa lý như phương pháp sắc ký do

đó phương pháp này chỉ thích hợp với các phân tính sàng lọc hơn là các phân tích định lượng

sử dụng mẫu đặt trực tiếp lên đĩa thạch hoặc dùng dung dịch chiết tách từ mẫu nhỏ vào khoanh giấy thấm rồi đặt lên đĩa thạch

Luận văn thạc sỹ

Test vi sinh vật được thiết kế theo các hướng:

1 Sử dụng một chủng vi sinh vật ở cùng một điều kiện môi trường: Test một

đĩa dùng chủng Bacillus subtilis (test thận Bỉ)

2 Sử dụng một chủng vi sinh vật nhưng điều kiện môi trường khác nhau (pH khác nhau) như New Two Plate Test [29]

3 Sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau ở cùng điều kiện môi trường

4 Sử dụng các chủng vi sinh vật khác nhau ở các điều kiện môi trường khác nhau (pH khác nhau) Điển hình là test 4 đĩa Châu Âu (FPT-Four Plate Test), test cải tiến test 4 đĩa CPMA (Combined Plate Microbial Assay) Các chủng vi sinh vật

thường sử dụng là B.subtilis pH 7.2, Kocuria varians pH 8, B.cereus pH 6, E.coli

pH 8, Geobacillus stearothermophilus pH 7

5 Đọc kết quả dựa vào phản ứng lên men, kết hợp với chỉ thị màu

Hình 1.7 Test thận Bỉ sử dụng chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

Vi sinh vật chính thức được dùng để thực hiện đầu tiên là Sarcina lutea trong

test thận của Van Schothorst và đã trở thành phương pháp chính thức được sử dụng

ở Hà Lan năm 1973 Vào khoảng thời gian đó, ở Đức đã nghiên cứu test BGA có sử

dụng vi khuẩn Bacillus subtilis và đã được một số nước dùng để thử nghiệm [60]

Vào năm 1980, EU sử dụng phương pháp test 4 tấm trong đó 3 tấm là môi trường

thạch agar có bổ sung bào tử vi khuẩn B subtilis BGA ở pH 6; 7,2 ; 8 và 1 tấm là vi khuẩn Micrococcus luteus ở pH 8 Môi trường có pH 7.2 được bổ sung với

trimethoprim (TMP) để tăng độ nhạy cho sulfonamides Trong một thời gian dài các

Luận văn thạc sỹ

kết quả của thử nghiệm này đã được sử dụng [51] Ferrini et al [35] đã nghiên cứu

phương pháp sáu tấm, bao gồm 4 tấm ở trên có bổ sung thêm tấm chứa vi khuẩn B

cereus và tấm có vi khuẩn E coli Nghiên cứu trên đã cho phép xác định được

nhóm kháng sinh trong sữa và sàng lọc ban đầu chỉ trong một bước

Khả năng phát hiện tốt nhất đối với các kháng sinh nhóm β-lactam là các

chủng Geobacillus stearothermophilus, Kocuria rhizophila, và Bacillus subtilis, trong khi đó đối với các kháng sinh macrolide là chủng K rhizophila Giới hạn phát hiện Tetracycline thấp khi sử dụng chủng Bacillus cereus, còn đối với Quinolone là

Escherichia coli và Yersinia ruckeri Sulfonamid được phát hiện khi sử dụng các

chủng G stearothermophilus và Bacillus pumilus Chủng B subtilis được sử dụng

để phát hiện sự hiện diện của các Aminoglycoside [31]

Ưu điểm:

Trang thiết bị đơn giản, cần ít mẫu; phổ phát hiện rộng, tương đối nhạy (tùy vào chủng vi sinh vật và môi trường), thời gian phát hiện tương đối nhanh, giá thành rẻ; có thể tự động hoá, rất tiện để sàng lọc; dễ thực hiện, không cần kỹ thuật

viên tay nghề cao

Nhược điểm:

Không định lượng được, độ nhạy phụ thuộc điều kiện của chủng vi sinh vật

sử dụng Một số chất kháng sinh như Chloramphenicol, Nitrofurane, Nitroimidasole không phát hiện được dù có nồng độ cao do các chủng vi sinh vật không mẫn cảm với những chất này

Có rất nhiều chủng vi sinh vật được sử dụng trong phương pháp này, chúng được sử dụng như là một chỉ thị sinh học cho việc xác định dư lượng kháng sinh Việc lựa chọn đúng loài vi sinh vật chỉ thị đóng vai trò qua trọng đối với kết quả của phương pháp Để lựa chọn đúng loại vi sinh vật ta dựa vào những đặc điểm của mẫu nguyên liệu, đặc điểm của loại kháng sinh cần xác định và nhiều yếu tố liên quan khác Đề tài lựa

chọn chủng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus vì đây là chủng rất nhạy cảm với

kháng sinh và là chủng vi sinh vật ưa nhiệt Chúng có thể tồn tại ở nhiệt độ cao mà ở nhiệt độ đó một số vi sinh vật khác không tồn tại được, giúp tránh lây nhiễm các chủng khác trong không khí gây khó khăn trong quá trình xây dựng test

Luận văn thạc sỹ

1.5 Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus và ứng dụng trong việc phát hiện

nhanh dƣ lƣợng kháng sinh trong sữa:

1.5.1 Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:

Đây là vi khuẩn được tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1920 [32] Năm 1986, vi

khuẩn này được đặt tên là Bacillus stearothermophilus [27,44] Năm 2001, nhóm các

nhà khoa học từ Moscow [70] đã bắt đầu phân tích các hệ sinh thái vi sinh vật của các

mỏ dầu ở nhiệt độ cao ở Kazakhstan Sau khi phun nước nóng từ biển Caspian để thay thế nước ban đầu, các nhà khoa học phát hiện ra rằng có sự gia tăng vi sinh vật và đa dạng sinh trưởng Nguồn nước nóng, mặn và nước oxy hóa đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của vi khuẩn ưa khí, ưa nhiệt và hình thành nội bào tử của thermophiles Sau khi phân tích các đặc điểm di truyền và sinh lý, các nhà khoa học xác

định chỉ một phần thuộc vi khuẩn Bacillus stearothermophilus Sau khi kiểm tra kỹ

lưỡng các loại vi khuẩn dựa trên đặc điểm về hình thái, sinh lý học, và phát sinh loài, họ

thấy nó thuộc một đơn vị phân loại riêng biệt là Geobacillus Vi khuẩn này đã chính thức đổi tên Geobacillus stearothermophilus vào năm 2004 [67]

G stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đã được phân

lập từ một số địa điểm quan trọng tại Hoa Kỳ như: trên gỗ mục nát ở Florida, đất đã được sử dụng kỹ thuật làm giàu và suối nước nóng ở công viên Quốc gia Yellowstone Những địa điểm này thể hiện đặc điểm của nó là một vi khuẩn khử nitơ, có khả năng sinh trưởng trong các môi trường nóng khác nhau và có tên là

Geobacillus mà chữ “Geo” có nghĩa là trái đất [70]

Luận văn thạc sỹ

Hình 1.8 Cây phát sinh dựa trên sự sắp xếp gen 16S rRNA [70]

1.5.1.2 Đặc điểm của Geobacillus stearothermophilus:

Vi khuẩn G stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong các môi trường

ấm như: đất, cát sa mạc, vùng biển và suối nước nóng G stearothermophilus là

trực khuẩn ưa nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ sinh học Về mặt lâm sàng, vi khuẩn này cũng có vai trò quan trọng trong việc chứng minh rằng quá trình khử trùng phòng thí nghiệm đang hoạt động đúng tiến trình [60] Cả hai

chỉ số sinh học và hóa học được sử dụng để xác định sự hiện diện của bào tử G

stearothermophilus trên bề mặt đã trải qua một quá trình khử trùng [59,70] Vi

khuẩn này cũng được sử dụng như là một chỉ số sinh học để chứng minh độ sạch của các sông suối, cũng như nguồn chính cung cấp các enzyme chịu nhiệt được sử

dụng trong các ứng dụng công nghiệp [70] G stearothermophilus còn có ý nghĩa

trong việc xác minh các thực phẩm bị hư hỏng, chủ yếu là sữa và sữa chua [36,43]

Luận văn thạc sỹ

 Đặc điểm hình thái

Geobacillus stearothermophilus là vi khuẩn Gram dương, hình que, có thể

sinh trưởng đơn lẻ hoặc chuỗi, có khả năng tạo thành bào tử, có thể tạo thành nội bào

tử khi môi trường dinh dưỡng bị suy giảm Thành tế bào của vi khuẩn có cấu trúc của

vi khuẩn Gram dương điển hình Chúng có cấu tạo gồm một lớp peptidoglycan dày xung quanh màng sinh chất [67] Lớp peptidoglycan này chứa DAP hoặc axit meso-diaminopimelic và có chứa lượng axit teichoic đáng kể với axit muramic giúp bảo vệ thành tế bào trong suốt quá trình phân chia [70]

Bề mặt của vi khuẩn này có chứa một lớp vỏ, lớp S-layer, các protein Các lớp này kết tinh trên bề mặt các protein giống như các lớp S-layer của các vi khuẩn khác, chúng có mối liên quan chặt chẽ với các tế bào của vi khuẩn [67]

 Đặc điểm sinh hóa

G stearothermophilus có phản ứng catalase và oxidase dương Vi khuẩn này

sử dụng hoàn toàn các hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, axit amin, axit hữu cơ

và oxy là chất nhận điện tử cuối cùng [67,70] G stearothermophilus cũng là vi

khuẩn khử nitơ Vi khuẩn được tìm thấy trong đất công nghiệp và phân compost và

nó tham gia vào quá trình khử nitơ trong phân bón từ NO3 xuống NO2 dễ bay hơi hoặc N2 [70]

 Đặc điểm nuôi cấy

- Điều kiện sinh trưởng: Vi khuẩn này có khả năng di động, hiếu khí G

pH từ 2-11 và nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ở 50-65°C Đặc biệt loài vi khuẩn này có thể sống sót ở nhiệt độ cao đến 130oC [59] Vi khuẩn dễ dàng sinh trưởng và phân

lập trong phòng thí nghiệm vi sinh [70] G stearothermophilus là chủng vi khuẩn

rất dễ bị ức chế bởi kháng sinh, đặc biệt là nhóm β-lactam [54,61,66,45]

- Đặc điểm nuôi cấy:

Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB):

Hình 1.9 Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus trên môi trường thạch [31]

1.5.1.3 Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:

Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus có dạng elip đến hình cầu,

có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với

các thành phần lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử G.stearothermophilus có chứa

một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic

Hình 1.10 Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus [63]

Luận văn thạc sỹ

 Cấu tạo bào tử Geobacillus stearothermophilus:

Bào tử G stearothermophilus là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các

thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về

tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới Bào tử được bọc trong một vỏ dày gồm nhiều lớp:

- Lớp màng ngoài: Màng ngoài nằm ở ngoài cùng, đó là các phần còn sót lại của tế bào mẹ, có khi có khi không, khi dày, khi xốp, chiếm 2 - 10% khối lượng khô của bào tử Màng ngoài gồm 2 lớp, lớp ngoài dày 6nm, lớp trong dày 19nm

- Lớp áo bào tử: Lớp áo bào tử là một lớp peptidoglycan dày trong đó gồm nhiều loại protein khác nhau Lớp áo bào tử thường chứa các protein lắp ráp và các yếu tố hình thái quan trọng Lớp áo này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của bào tử

- Lớp vỏ bào tử: Vỏ bào tử chiếm thể tích rất lớn (36 - 60%) Lớp này có vai trò như một lớp rào cản và là nguồn gốc kháng nguyên bề mặt của bào tử Lớp vỏ bào tử có phản ứng với lectin để tạo liên kết với các olysaccharide nằm trong các sợi trên lớp vỏ bào tử

- Lõi bào tử: còn gọi là thể chất nguyên sinh của bào tử Lõi gồm 4 phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân

Hình 1.11 Cấu tạo bào tử vi khuẩn [49]

Luận văn thạc sỹ

 Sự hình thành và nảy mầm của bào tử:

Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:

1 Hình thành những búi chất nhiễm sắc

2 Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử

3 Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ

4 Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy nhiều peptioglican và tổng hợp dipicolinat canxi, tính chiết quang tăng cao

5 Kết thúc việc hình thành áo bào tử

6 Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử Bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt

7 Nang bào vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài

Hình 1.12 Quá trình hình thành bào tử

Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc và

Protein có chứa nhiều systein trong áo bào tử hoá xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến sự hoạt động của enzyme proteinaza Khi đó lượng protein trong áo bào tử giảm xuống Các cation bên ngoài có thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ lên, sau đó làm tan ra và tiêu thoái đi Khi đó nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp lõi bào tử làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hoá lên, bắt đầu quá trình tổng hợp thành tế bào

Trong quá trình nảy mầm các đặc tính chịu nhiệt, chiết quang cao… bắt đầu giảm dần, lượng BPA - Ca, acid amin, polipeptit dần dần mất đi, bắt đầu xảy ra việc tổng hợp ADN, ARN và protein trong lõi bào tử Bào tử chuyển sang thành tế bào dinh dưỡng Khi nảy mầm, bào tử mầm có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang ra Lúc đó thành tế bào còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm ADN ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp Cuối cùng, bào

tử chứa một số enzyme sửa chữa ADN, ADN sẽ được sửa chữa trong quá trình nảy mầm và tăng trưởng sau khi lõi đã được hoạt hóa trở lại

 Sức đề kháng của bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:

Bào tử có sức đề kháng cao với các yếu tố vật lý và hóa học như nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và chất sát trùng Bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do:

- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ

- Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với nhiệt độ

Luận văn thạc sỹ

- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài

- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các tính chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử

1.5.2 Ứng dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus trong việc phát hiện nhanh dư lượng một số kháng sinh trong sữa:

Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus là chủng vi khuẩn được ứng dụng

rộng rãi nhất trong các test của Châu Âu như: Improved Agar Diffusion test, Delvotest SP-NT, Charm AIM – 96, Disk Assay Plate Method, Copan Milk test,… [47] Vi khuẩn thường được dùng ở dạng bào tử do khả năng chống chịu tốt với những điều kiện bất lợi, dễ thương mại hóa, điều kiện bảo quản và sử dụng dễ dàng

Hình 1.13 Test thử dư lượng kháng sinh trong sữa của hãng Delvotest

Năm 1962, Galesloot và cộng sự [37] đã sử dụng vi khuẩn Geobacillus

stearothermophilus hoặc G calidolactis để phát hiện dư lượng kháng sinh trong

sữa Phương pháp này được thực hiện bằng cách đặt miếng giấy có tẩm sữa lên môi

trường thạch dinh dưỡng có bổ sung vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus, sau

đó ủ ở 55oC trong 2,5 giờ Tiến hành quan sát sự ức chế của vi khuẩn lên khu vực

có chứa miếng giấy tẩm để biết được sự hiện diện của kháng sinh trong sữa Phương pháp này có độ nhạy đối với kháng sinh Penicillin khoảng 0.0025 IU/ml Tuy nhiên

trường agar có bổ sung bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus var

sinh Mặc dù phương pháp này được đánh giá tốt hơn phương pháp của Galesloot nhưng có một số nhược điểm như: rất khó nhận ra vùng ức chế, thể tích mẫu không

đủ để thực hiện nhắc lại

Năm 1990, Lameris và cộng sự [50] đã nghiên cứu phương pháp phát hiện

dư lượng kháng sinh trong sữa bằng cách bổ sung vào môi trường dinh dưỡng từ

105 đến 108 bào tử/ml vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus var calidolactis

vào trong ống hình trụ, ủ ở nhiệt độ thích hợp là khoảng 55°C đến 70°C, tốt nhất là 60°C đến 65°C và ủ trong khoảng thời gian tương đối ngắn khoảng 1,5 đến 4 giờ, tốt nhất là 2-3 giờ có thể quan sát được sự thay đổi màu sắc của môi trường

Các nghiên cứu đã chứng minh được vai trò quan trong của vi khuẩn

Geobacillus stearothermophilus trong việc sản xuất ra các test thử để phát hiện

nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa Tuy nhiên hiện nay ở Việt Nam chưa có

đơn vị nào sử dụng chủng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để sản xuất

test phát hiện nhanh dư lượng kháng sinh trong sữa dạng ống thạch mà chủ yếu nhập ngoại với giá thành rất cao Do vậy việc nghiên cứu chế tạo được các test thử từ vi khuẩn này ở điều kiện Việt Nam là rất có ý nghĩa, góp phần tạo ra sản phẩm có chất lượng tốt nhưng giá thành rẻ đồng thời nâng cao chất lượng sản phẩm

có nguồn gốc trong nước

Luận văn thạc sỹ

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu:

2.1.1 Chủng vi sinh vật:

Chủng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus NBRC 100862 đang được

lưu giữ tại phòng thí nghiệm an toàn Sinh học của Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học

và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục Hậu cần Kỹ thuật, Bộ Công an

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất:

- Dụng cụ: bộ micropipet (1000 l, 200 l, 100 l, 20 l, 10 l) (Gilson - Pháp), que cấy, que trang, đĩa petri, chai duran (Đức), ống falcon 15ml, 50ml, ống eppendrof, ống nhựa cryo tube 1,8 ml có nắp vặn, pipet paster, giá đựng ống test, ống đong, găng tay, phiến kính, lá kính

- Hóa chất: Meat extract (Merck-Đức), Yeast extract (Merck-Đức), Polypeptone (Sigma-Mỹ), Nutrient broth (Difco-Mỹ), Tryptone (Merck-Đức), Glucose (Merck-Đức), MnSO4.H2O (Merck-Đức), MgSO4.7H2O (Merck-Đức), MnCl2.4H20 (Merck-Đức), K2HPO4 (Merck-Đức), NaOH (Merck-Đức), Phytone peptone (BD-Mỹ), Peptone (Merck-Đức), NaCl (Merck-Đức), Agar (Merck-Đức), Chỉ thị pH (Bromocresol Purple) (Merck-Đức), thuốc nhuộm Gram: Malachite Green bão hòa (7,6%), Safranin (0,5%)

- Chất kháng sinh ở dạng thuốc pha tiêm: Penicillin G, Ampicillin, Amoxicillin, Tetracycline, Gentamycin

- Mẫu sữa nguyên liệu đã được kiểm tra không có chất kháng sinh

Luận văn thạc sỹ

2.1.4 Các môi trường nuôi cấy:

Bảng 2.1 Các loại môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi

Môi trường TSB (Tryptic

soy broth) (pha sẵn): 3%

- Peptone from casein 1,7%

- Peptone from soymeal 0,3%

pH 7.2

- Điều chỉnh pH môi trường bằng dung dịch NaOH 0,1N hoặc HCl 0,1N để đạt được pH môi trường mong muốn

- Các môi trường đều được khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút

2.1.5 Nơi thực hiện đề tài:

Phòng Kỹ thuật Sinh học nghiệp vụ, Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ (H57), Tổng cục IV, Bộ Công an

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm và đọc kết quả:

Luận văn thạc sỹ

bào tử, thí nghiệm được lặp lại 3 lần (lưu ý: bật tủ ấm trước 10 phút để nhiệt độ bên trong tủ ổn định trước khi tiến hành thử nghiệm.)

2.2.1.2 Phương pháp đọc kết quả:

Đọc kết quả ở 2/3 thạch phía dưới, tra bảng màu để kết luận:

 Mẫu âm tính hay dương tính với kháng sinh:

- Mẫu âm tính là mẫu sữa phân tích không có kháng sinh hoặc nồng độ kháng sinh dưới ngưỡng phát hiện của test

- Mẫu dương tínhlà mẫu sữa phân tích có nồng độ kháng sinh đạt ngưỡng phát hiện của test

 Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong test thử nghiệm:

- Màu vàng: vi khuẩn có sinh trưởng

- Màu tím: vi khuẩn không sinh trưởng

1 2 3 4 5 6

Mẫu âm tính (-) Mẫu dương tính (+)

2.2.2 Lựa chọn môi trường thích hợp cho vi khuẩn sinh trưởng:

Lấy 01 ống lưu giữ chủng G stearothermophillus trong tủ -20oC, đặt lên khay đá để làm tan từ từ dung dịch tế bào bên trong ống

Sau khi dung dịch tế bào tan hết, dùng micropipet hút 100l dịch vi khuẩn sang môi trường hoạt hóa NBRC 802 (15ml) Tiến hành nuôi cấy lắc qua đêm (12-

16 giờ) ở 55oC, 200 vòng/phút Để lựa chọn được một môi trường thích hợp cho sự

Luận văn thạc sỹ

sinh trưởng của vi khuẩn G stearothermophillus, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn này

trên 3 môi trường dinh dưỡng khác nhau:

- Hút 100l dịch vi khuẩn đã hoạt hóa vào ống falcon chứa 15ml môi trường cần nuôi cấy, sau đó nuôi cấy lắc 200 vòng/phút trong 12 giờ ở 55oC

- Để quan sát sự sinh trưởng của vi khuẩn tại các môi trường này, sau mỗi 2 giờ nuôi cấy lấy 1ml dịch để tiến hành đo độ đục ở bước sóng 595 nm

2.2.3 Phương pháp nhuộm bào tử Geobacillus stearothermophilus:

Nguyên tắc nhuộm: Bào tử rất khó bắt màu bởi đa số các thuốc nhuộm do có lớp màng dày, chắc và chứa nhiều lipid Vì thế, cần phải có những phương pháp nhuộm đặc biệt đối với bào tử Thông thường, tế bào cần phải được nhuộm ở nhiệt

độ cao trong thời gian dài để bào tử có thể bắt màu

Tiến hành:

- Làm vết bôi và cố định tiêu bản: Nhỏ một giọt dịch huyền phù vi khuẩn đã nuôi qua đêm lên lam kính, hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để cố định vi khuẩn vào phiến kính

 Bước 3: Bóc tờ giấy thấm ra, để phiến kính nguội hoàn toàn Rửa phiến kính bằng nước cất trong 30 giây, hong khô

 Bước 4: Nhỏ 2-3 giọt dung dịch Safranin (0,5%) lên trên vết bôi, giữ trong 90 giây

 Bước 5: Rửa phiến kính bằng nước cất trong 30 giây rồi thấm khô vết bôi hoặc

để khô tự nhiên

 Bước 6: Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính dầu (x100)

Kết quả: Tiêu bản nhuộm đúng thì bào tử sẽ bắt màu xanh lục, tế bào sinh dưỡng

bắt màu đỏ hồng

Luận văn thạc sỹ

Hình 2.2 Quy trình nhuộm bào tử theo phương pháp Schaeffer-Fulton 2.2.4 Lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình hình thành bào tử ở vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:

- Sau khi mặt thạch đã khô hoàn toàn thì lật úp đĩa petri và tiếp tục nuôi ở

60oC đến khi tế bào sinh dưỡng chuyển hoàn toàn sang dạng bào tử

- Để lựa chọn môi trường thích hợp nhất cho quá trình hình thành bào tử, trong quá trình nuôi, cứ sau 12 giờ kiểm tra sự tạo thành bào tử bằng cách nhuộm bào tử

và quan sát dưới kính hiển vi 100X

Luận văn thạc sỹ

2.2.5 Phương pháp thu nhận bào tử Geobacillus stearothermophilus:

Bước 1: Gặt bào tử từ đĩa thạch:

Bổ sung 2ml nước cất 2 lần vô trùng vào đĩa chứa bào tử vi khuẩn, sử dụng que trang để hòa bào tử, sau đó dùng pipet để hút toàn bộ dung dịch bào tử vào ống falcol 10ml, lặp lại các bước trên 2 lần để thu được tối đa lượng bào tử

Bước 2: Rửa bào tử:

- Bào tử sau khi thu được phải được rửa 3 lần với nước cất vô trùng theo quy trình:

 Dung dịch bào tử sau khi thu được ly tâm lạnh ở 4oC, tốc độ 6000 vòng/phút, trong 10 phút, thu cặn tế bào

 Bổ sung tiếp 10ml nước cất vô trùng, vortex mạnh để trộn tế bào Sau đó tiếp tục ly tâm lạnh 6000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút, thu cặn tế bào Lặp lại một lần nữa để rửa sạch bào tử

- Để bảo quản bào tử, cặn tế bào sau khi rửa được bổ sung 10ml nước cất vô trùng, cho vào ống falcon 50ml và bảo quản ở 0 - 4oC

2.2.6 Phương pháp xác định mật độ bào tử:

Để xác định mật độ bào tử, sử dụng phương pháp đếm trực tiếp

Cách tiến hành:

Chuẩn bị:

- Dịch pha loãng mẫu: sử dụng ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng

- Đĩa petri chứa môi trường đếm bào tử (là môi trường tăng sinh đã lựa chọn ở trên có bổ sung 2% agar)

- Pha loãng mẫu: Lấy 1ml dung dịch chứa bào tử cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, trộn đều dung dịch bên trong ống Dung dịch đã được pha loãng ra 10 lần Lặp lại quá trình pha loãng đến nồng độ 10-4, 10-5, 10-6

- Lấy 50µl dịch đã pha loãng ở mỗi nồng độ trên cho vào đĩa petri chứa môi trường đã chuẩn bị sẵn, trải đều bằng que trang Ở mỗi nồng độ pha loãng cần lặp lại tối thiểu 02 đĩa để cho kết quả Ủ đĩa thạch ở 60oC trong 24 giờ