Đánh giá đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên tại vùng biển đà nẵng việt nam thông qua nghiên cứu metagennomics bằng kỹ thuật 16s rRNA miseq sequencing

Bảng 1: Phần mềm, các công cụ dựa trên Web và các cơ sở dữ liệu sử dụng để phân tích metagenome Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA metagenome Bảng 3.2: Kết quả

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN MẠNH HÙNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG SINH HỌC VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI HẢI MIÊN TẠI VÙNG BIỂN ĐÀ NẴNG VIỆT NAM THÔNG QUA NGHIÊN CỨU METAGENOMICS

BẰNG KỸ THUẬT 16S rRNA MISEQ SEQUENCING

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan kết quả thể hiện trong bản luận văn này là công trình nghiên cứu thực

tế Toàn bộ số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan, chƣa đƣợc công bố công khai bởi một ai khác

Tôi cũng xin được tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các cán bộ thuộc phòng Công nghệ sinh học, viện Hoá sinh biển; Viện nghiên cứu khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã có những hỗ trợ, đóng góp, tư vấn rất nhiệt tình giúp tôi hoàn thiện đề tài

Tôi thật sự rất biết ơn người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã giành tình cảm, đặt niềm tin, hỗ trợ, động viên; đồng thời cũng là nguồn động lực to lớn góp phần giúp tôi hoàn thiện đề tài này Với sự hỗ trợ về kiến thức; các nguồn dữ liệu bổ sung; các công trình nghiên cứu khoa học có liên quan ở trong nước và trên thế giới-Tập thể các Thầy cô thuộc khoa sinh học; Bộ môn Vi sinh vật học và đặc biệt TS Phạm Đức Ngọc đã giúp tôi làm nên sự thành công của đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 27 tháng 12 năm 2016

Nguyễn Mạnh Hùng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Sơ lược về hải miên 2

1.2 Vai trò và tầm quan trọng của vi sinh vật liên kết với hải miên 5

1.3 Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên 11

1.4 Sơ lược về gen 16S rRNA 16

1.5 Sơ lược về MiSeq Sequencing 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 VẬT LIỆU 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Tách DNA 21

2.2.2 Thiết kế thư viện 16S rRNA cho MiSeq 21

2.2.3 Phân tích thư viện 16S rRNA 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 KẾT QUẢ 23

3.1.1 Tách DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên 23

3.1.2 Khuếch đại vùng siêu biến V4 của gen 16S rRNA và gắn barcodes 24

3.1.3 Đa dạng các cộng đồng vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng 26

3.2 THẢO LUẬN 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

Hình 1.1: Hình thái Porifera, (Ruppert et al., 2004)

Hình 1.2: Cấu trúc cơ thể hải miên và các tế bào chức năng

Hình 1.3: Sinh sản hữu tính ở hải miên

Hình 1.4 Đa dạng vi khuẩn liên kết với hải miên (Tabares 2011)

Hình 1.5: Mô mesohyl của (A) Ancorina alata, hải miên có vi khuẩn liên kết phong

phú

Hình 1.6: Gene 16S rRNA có 9 vùng biến đổi nằm xen giữa các vùng bảo thủ

Hình 3.1: Điện di đồ DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng trên agarose gel 0,8% Lane 1: DN 9 ; lane 2: DN10; lane

Hình 3.2: Ảnh điện di PCR khuếch đại vùng V4 gen 16S rRNA của vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng M: Marker DNA 1 kb (GeneRuler™); 1, 2, 3: Sản phẩm PCR vùng V4 của mẫu DN9, DN10 và DN12, tương ứng

Hình 3.3: Sản phẩm PCR sau khi gắn barcodes M: Marker DNA 1 kb (GeneRuler™);

1, 2, 3: Mẫu DN9, DN10 và DN12, tương ứng

Hình 3.4: Đồ thị biểu hiện tỉ lệ vi khuẩn và cổ khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên Hình: 3.5: Đồ thị biểu hiện thành phần các ngành vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Hình: 3.6: Đồ thị biểu hiện thành phần các lớp vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Hình: 3.7: Đồ thị biểu hiện thành phần các bộ vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Hình: 3.8: Đồ thị biểu hiện thành phần các họ vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Hình: 3.9: Đồ thị biểu hiện thành phần các chi vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Bảng 1: Phần mềm, các công cụ dựa trên Web và các cơ sở dữ liệu sử dụng để phân tích metagenome

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA metagenome

Bảng 3.2: Kết quả nhận dạng các mẫu hải miên

Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả phân loại vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.4: Kết quả phân loại vi sinh vật liên kết với hải miên ở mức giới

Bảng 3.5: Kết quả phân loại các ngành vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.6 Kết quả phân loại các lớp vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.7 Kết quả phân loại các bộ vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.8 Kết quả phân loại các bộ vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.9: Kết quả phân loại các chi vi sinh vật liên kết với hải miên

1

MỞ ĐẦU

Hải miên là vật chủ của nhiều vi sinh vật và vai trò của những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh với hải miên Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương pháp như điện di gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis_DGGE), giải trình tự gen 16S rRNA và lai huỳnh quang in-situ (Fluorescense In Situ Hybridization_FISH), người ta nhận thấy ngoài các thành viên của Archaea còn có tới hơn 25 ngành vi khuẩn liên kết với hải miên Trong số đó

có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia Chưa rõ

về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết với hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 40% - 50% thể tích hải miên và cộng đồng này đặc trưng cho từng hải miên [40] Mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên gần đây đang được quan tâm nghiên cứu do: (i) phát hiện nhiều hải miên có liên kết với cộng đồng vi khuẩn dày đặc và đa dạng, (ii) chúng là một nguồn giàu các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học có ý nghĩa trong lĩnh vực dược phẩm và công nghệ sinh học [50]

Việc phân lập, nuôi cấy vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện đặc biệt thường khó khăn, đặc biệt vi sinh vật liên kết với các dạng sống khác như hải miên bởi mối tương tác giữa chúng khá phức tạp Cũng không thể khai thác hải miên để tách chiết các hoạt chất vì nguồn nguyên liệu này có hạn, khó phục hồi và gây hủy hoại môi trường

Đề tài này được thực hiện với mục đích nghiên cứu sự đa dạng của vi sinh vật liên kết với hải miên biển trên cơ sở phân tích dữ liệu metagenome của vi sinh vật Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp nguồn cơ sở dữ liệu có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo về mối liên hệ giữa vi sinh vật-hải miên biển

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược về hải miên

Hải miên (bọt biển) là động vật ăn lọc, đa bào, cổ xưa thuộc ngành động vật thân lỗ

(Porifera) Ngành Porifera là một nhóm đa ngành bao gồm ba lớp chính, được đặc

trưng bởi cơ cấu gai của chúng: (1) Hexactinellida (glass sponges -bọt biển thủy tinh) chứa gai silic trong cấu trúc hexactine; (2) Calcarea (calcareous sponges -bọt biển vôi) chứa gai vôi (calcareous spicules); (3) Demospongiae (demosponges) có khoảng 85% các loài được công nhận hiện nay, thường có một bộ khung khoáng chất bao gồm gai silic (siliceous spicules) Tuy nhiên, một số loài trong Demospongiae không chứa bộ khung [21] Hải miên có cấu trúc cơ thể đơn giản nhất trong tất cả các loài động vật đa bào: thiếu cơ quan và mô thực; không có cơ, hệ thần kinh, hệ tiêu hóa, hệ tuần hoàn, cơ quan bên trong, và khả năng vận động Các tế bào của hải miên sắp xếp có thứ tự gồm nhiều lớp tế bào chuyên biệt (Hình 1.2) phù hợp với lối sống ăn lọc Hầu hết hải miên

có bộ khung cứng được hình thành từ canxi cacbonat và các gai silic dioxide Các sợi Collagen và spongin có tác dụng hỗ trợ thêm sự cứng chắc và đàn hồi cho bộ khung [21] Ngoài các loại tế bào xốp khác nhau, mật độ cao của các vi sinh vật cũng được tìm thấy trong các mesohyl của một số loài hải miên Độ sâu phổ biến tìm thấy hải miên từ 5-10m

Động vật thân lỗ, trong đó có hải miên thường ăn bằng cách hút nước qua các lỗ chân lông Một dòng chảy được duy trì liên tục qua cơ thể để lấy thức ăn, ôxy cũng như loại

bỏ chất thải Khi nước đã được lọc qua các khoang choanocyte, nó bị thải ra khỏi cơ thể qua các osculum, về cơ bản là vô trùng [43, 44] Hầu hết hải miên có thể bơm một lượng nước tương đương với khối lượng cơ thể của nó mỗi 5 giây [47], điều này có thể bằng vài ngàn lít mỗi ngày [55] Mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên gần đây đang được quan tâm nghiên cứu do: (i) phát hiện nhiều hải miên có liên kết với cộng đồng vi

3

khuẩn dày đặc và đa dạng, (ii) chúng là một nguồn giàu các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học có ý nghĩa trong lĩnh vực dược phẩm và công nghệ sinh học [50]

*) Cấu trúc chung của một cơ thể hải miên:

Porifera có 3 dạng hình thái cơ thể từ đơn giản (asconoid và syconoid) đến phức tạp (leuconoid) được hình thành bằng cách thay đổi mức độ gấp của màng cơ thể bên trong và sự thay đổi phức tạp của hệ thống kênh [9]

Pinacoderm: Bề mặt bên ngoài, được hình thành bởi các tế bào biểu mô được gọi là

pinacocytes Ở lớp ngoài này nước sẽ được rút ra qua các lỗ (Ostia)

Mesohyl:Một matrix ngoại

bào giữa pinacoderm và

choanoderm có vai trò như

một hệ khung dàn, chiếm

phần lớn cơ thể hải miên

Các hạt thức ăn được

chuyển từ choanocytes tới

archaeocytes di động (hoặc amoebocytes) để thực bào Amoebocyte là nhóm các tế bào toàn năng (totipotent), thực hiện việc phân phối dinh dưỡng từ Choanocytes tới các tế bào khác; giúp các tế bào trứng (Oocyte) phát triển, chuyển tinh trùng từ choanocytes tới các tế bào trứng; có khả năng biệt hóa thành các loại tế bào có chức năng khác nhau Ví dụ như collencytes, sản xuất ra các sợi collagen, sclerocytes hình thành spicule và spongocytes sản xuất spongin

Hình 1.2: Cấu trúc cơ thể hải miên và các tế bào chức năng

Hình 1.1: Hình thái Porifera, (Ruppert et al., 2004)

4

Choanoderm: Một lớp tế bào bên trong hình thành bởi các tế bào hình roi

(choanocytes) cho phép nước đi qua hệ thống aquiferous Hệ thống này được hình thành bởi một loạt các kênh, dẫn đến một kênh chính (atrium) Nước ra khỏi cơ thể hải miên thông qua một lỗ thoát cuối cùng (osculum) Vi sinh vật và thức ăn được lọc

ra khỏi nước tuần hoàn (circulating water) bởi choanocytes

Với tổ chức đơn giản nhưng hải miên là động vật đa bào thực Ngoài cấu trúc cố định của cơ thể, hải miên còn thể hiện khả năng biến đổi hình thái tuyệt vời Cơ thể chúng xuất hiện nhiều màu sắc do sự hiện diện của các tế bào sắc tố xốp và/hoặc từ vi khuẩn lam cộng sinh và vi tảo Hải miên đa dạng về hình thái, từ dạng các lớp đóng cặn chỉ

vài mm chiều cao tới các dạng khổng lồ, ví dụ: Xestospongia muta có đường kính và

chiều cao hơn một mét [35]

*) Sinh sản ở hải miên

Hải miên có 2 hình thức sinh sản bao gồm vô tính và hữu tính

Sinh sản vô tính: Xuất hiện các chồi mọc ra từ cơ thể trưởng thành Các chồi trải qua quá trình phát triển, tăng lên về kích thước cuối cùng tách khỏi cơ thể ban đầu và phát triển thành cơ thể mới Ở hình thức sinh sản hữu tính, hải miên không có sự chia tách

cụ thể về giới tính Cả hai loại tế bào trứng và tinh trùng đều có nguồn gốc từ một cơ thể hải miên Các tế bào tinh trùng được phóng thích vào môi trường nước, sau đó sẽ thụ tinh với tế bào trứng ở cơ thể hải miên

khác Ấu trùng hình thành sẽ phát triển và

tách khỏi cơ thể mẹ nhờ sự tác động của

nước Đây là giai đoạn duy nhất cho sự vận

động của hải miên Ấu trùng sau đó sẽ bám

vào bề mặt cứng và phát triển thành cơ thể

trưởng thành Trong suốt giai đoạn đó hải

miên không có sự di chuyển Hình 1.3: Sinh sản hữu tính ở hải miên

5

1.2 Vai trò và tầm quan trọng của vi sinh vật liên kết với hải miên

Môi trường biển được chứng minh là nguồn đa dạng sinh học và hóa học giàu có Được biết có tới 109 taxa vi khuẩn trên trái đất, trong đó 106 taxa là từ đại dương Sự phân bố của vi sinh vật biển là 105 tế bào/ml và dự báo các đại dương chứa 3.6x1029 tế bào vi sinh vật, với phần lớn sinh khối là từ vi khuẩn, archaea, protist và nấm đơn bào Trong

nước biển vi khuẩn chiếm ưu thế thuộc về một số loài: Pseudomonas sp., Vibrio sp., Achromobacter sp., Flavobacterium sp., và Micrococcus sp

Cộng đồng vi sinh vật biển vô cùng đa dạng, phong phú và phức tạp Vì biển là môi trường cực đoan, nơi có sự đa dạng về các điều kiện sinh thái dẫn đến có rất nhiều cộng đồng vi sinh vật đặc trưng cho từng điều kiện sống khác nhau, như vi sinh vật ưa nhiệt,

ưa acid, ưa kiềm, … Vi sinh vật biển là các nhà sản xuất sinh khối đầu tiên trong đại dương, thu nhận ánh sáng và cố định cacbon, và là những tác nhân chuyển hoá dinh dưỡng đầu tiên Vi sinh vật biển cũng được biết tham gia vào chu trình toàn cầu của các nguyên tố sinh học như nitơ, cacbon, oxy, photpho, sắt, lưu huỳnh và các yếu tố vi lượng Do tính linh hoạt của các khả năng sinh hóa và sinh khối to lớn của chúng trong

hệ sinh thái biển, chúng được tin rằng là các thành phần chính chịu trách nhiệm cho việc duy trì các chu trình này, giúp ổn định các hệ sinh thái

Hải miên là động vật có đời sống ở biển, là vật chủ của nhiều vi sinh vật khác nhau Vì vậy cộng đồng vi sinh vật có liên kết với hải miên cũng như cộng đồng vi sinh vật tồn tại ở những vật chủ khác đều là những thành phần tạo nên sự đa dạng, phong phú, phức tạp về hệ sinh thái vi sinh vật biển nói chung Đến nay, nhiều công trình khoa học trong nước và trên thế giới đã có những công bố về số lượng thành phần các vi sinh vật liên kết với hải miên lên tới hơn 25 ngành vi khuẩn khác nhau

Người ta cũng phát hiện ra nhiều điều thú vị khi nghiên cứu về mối quan hệ giữa vi khuẩn với hải miên Nhiều dẫn chứng đã được đưa ra đều khẳng định vai trò to lớn và

vô cùng quan trọng mà những dạng sống có kích thước vô cùng nhỏ bé này mang lại

6

nhiều lợi ích cho chính vật chủ của nó cũng như cho con người Qua đó giúp chúng ta hiểu rõ hơn về quá trình tiến hoá, quá trình trao đổi chất, các chu trình chuyển hoá vật chất, đa dạng sinh học và cân bằng sinh thái[4]; [16]; [38] Ở từng đối tượng cụ thể, hệ

vi sinh vật có những vị trí và vai trò khác nhau

1.2.1 Đối với hải miên:

Chức năng cộng sinh của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý chất thải trao đổi chất, sản sinh các chất trao đổi thứ cấp, quang hợp, oxy hoá metan, nitorat hoá, cố định nitơ, khử sulphat và khử halogen (dehalogenation)

Một số nghiên cứu đã tìm thấy sự xuất hiện của chu trình lưu huỳnh ở hai loài hải miên

nước lạnh Geodia barrette và Aplysina aerophoba Chu trình này được thực hiện trong

điều kiện vắng mặt oxy, lúc quá trình bơm đẩy không hoạt động ở hải miên Ở hải

miên Geodia barrette, người ta ước tính được tỉ lệ khử sulphur là rất cao lên tới

1200nmol/cm3 hải miên/ngày [22] Các gen mã hoá cho enzyme APS (aprA)-một enzyme quan trọng trong việc khử sulphate và oxy hoá sulphur được tìm thấy ở hải

miên nước sâu Polymastia corticata thuộc biển Caribe [36] Cả hai loại vi khuẩn oxy

hoá sulphur và khử sulphate đều được phát hiện ở nhiều loài hải miên [50] Vi khuẩn

khử sulphate thuộc các chi Desulfoarculus, Desulfomonile Chi Syntrophus được tìm thấy ở hải miên nước lạnh Geodia barretti [22]

Quá trình oxy hoá metan cũng được tìm thấy ở nhiều loài hải miên được khảo sát

Chẳng hạn, loài hải miên ăn thịt sống ở vùng nước sâu Cladorhiza methanophila được

phát hiện có liên quan đến hai nhóm vi khuẩn, trong số đó có ít nhất một loại là vi khuẩn methane (methanotrophic) [52, 53] Dehalogenation (khử halogen) cũng được chứng minh có xuất hiện ở hải miên có cộng sinh với vi sinh vật Một số hải miên được biết là nguồn tự nhiên cung cấp các hợp chất brome như bromophenols và

7

bromoindoles Ở hải miên Aplysina aerophoba khử halogen có thể được thực hiện qua

trung gian là vi khuẩn [2]

Với lối sống dị dưỡng, quá trình chuyển hoá cacbon ở hải miên có thể diễn ra bằng cách tiêu thụ trực tiếp vi khuẩn từ nước biển hoặc sử dụng nguồn cacbon hữu cơ được hấp thu từ vi khuẩn cộng sinh với hải miên [62] Trong môi trường nghèo dinh dưỡng, hải miên vẫn có thể phát triển do cộng sinh với vi khuẩn quang hợp, đặc biệt là vi

khuẩn lam Synechococcus spongiarum [14] Ở khu vực có sự xuất hiện của những rạn

san hô, nơi mà dinh dưỡng hoà tan và các vật chất hữu cơ khan hiếm, hải miên sẽ phải đối mặt với môi trường sống thiếu nitơ Trong trường hợp này, nhóm vi khuẩn tự dưỡng (cyanobacteria) và dị dưỡng cộng sinh với hải miên [60] sẽ là nguồn bổ sung nitơ cho hải miên thông qua quá trình cố định nitơ từ khí quyển [37] Bằng chứng đầu tiên để kiểm định điều này là việc phát hiện ra hoạt tính của enzyme nitrogenase có trong hải miên được khảo sát ở Biển đỏ [60] Bằng chứng tiếp theo được phát hiện trong những năm gần đây thông qua việc sử dụng kỹ thuật đo tỉ lệ đồng vị nitơ [59] và việc giải trình tự gen mã hoá cho enzyme nitrogenase ở vi khuẩn [37] đã cho thấy có sự xuất hiện quá trình nitrat hoá ở hải miên Người ta cũng tìm thấy chi vi khuẩn

Nitrosospira và Nitrosococcus oxy hoá ammonia thành nitrite ở hải miên [38] Cổ khuẩn oxy hoá ammonia lần đầu tiên được phát hiện ở hải miên Axinella mexicana thuộc vùng biển California Vi khuẩn oxy hoá nitrite thành nitrate là Nitrospina và Nitrospira cũng được tìm thấy trong nhiều loài hải miên

Vi sinh vật liên kết với hải miên biển có vai trò chủ yếu trong việc bảo vệ vật chủ chống lại các loài ăn thịt do chúng sản sinh ra các chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn quang hợp cố định cacbon cung cấp đến gần 50% nhu cầu cacbon cho hải miên Ngoài ra, có quan hệ cộng sinh với vi khuẩn quang hợp giúp hải miên nhận được một số sản phẩm từ quá trình quang hợp như glycerol Ngược lại, vi khuẩn sẽ được cung cấp giá thể và cơ chất từ hải miên mà nó có quan hệ

8

cộng sinh [6] Một số vi sinh vật được cho là sinh các chất trao đổi thứ cấp có khả năng bảo vệ vật chủ Các chức năng khác như loại bỏ các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất có hại Đổi lại hải miên làm cho vi sinh vật có thể nhận được ánh sáng mặt trời, chỗ ẩn náu khỏi các loài săn mồi, cơ chất để bám và cung cấp dinh dưỡng [58]

1.2.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật liên kết hải miên

Vi sinh vật liên kết với hải miên và một số vật chủ biển khác có cả nội bào và ngoại bào Hiện nay, cộng đồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chưa được hiểu

rõ Người ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên kết

với nó sinh ra Ví dụ diketopiperazines của Tedania ignis được qui cho là sản phẩm trao đổi chất của Micrococcus sp liên kết với hải miên Kháng sinh polybrominated biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea herbacea (Demospongiae) thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra Vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P clavata được nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin

Người ta đã chứng minh được rằng vi sinh vật liên kết với hải miên sản sinh các chất

có hoạt tính sinh học thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, ức chế miễn dịch…và cũng có hoạt tính chữa bệnh tim, hô hấp và tiêu hóa (Grasa et al., 2013)

- Các chất có hoạt tính kháng khuẩn

Polyketide synthases (PKS) và Non ribosomal peptide synthases (NRPS) tham gia sản xuất rất nhiều các sản phẩm tự nhiên NRPS liên quan đến tạo ra một số thuốc chống khối u, ức chế miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, và hàng trăm các sản phẩm tự nhiên, gồm các hợp chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS (Brakhage, 2013) Yung và cs (2010) đã sử dụng Metagenomics chức năng để sàng lọc các protein

kháng khuẩn mới từ vi sinh vật liên kết với hải miên Cymbastela concentrica và đã chọn được 2 dòng là CcAb1 và CcAb2 có hoạt tính kháng Staphyloccus aureus và Alteromonas sp., cả hai dòng đều thuộc lớp Gammaprotebacteria Các tác giả cũng

9

nhận diện được các enzyme thủy phân mới từ cộng đồng vi sinh vật liên kết với hải

miên và phần lớn chúng thuộc lớp Alphaproteobacteria và Gammaproteobacteria

Phần lớn các chất kháng khuẩn được nhận dạng bởi chọn lọc metagenomic là những phân tử nhỏ, chẳng hạn như palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A và B, indirubin và indigo Những nghiên cứu trước đây cũng tìm thấy các enzyme lipolytic

mới bằng sàng lọc thư viện gen metagenomic của vi sinh vật liên kết hải miên Aplysina aerophoba và Hyrtios erecta (Karpushova et al., 2005; Okamura at al 2010) Lipases

tác động lên lipids giải phóng acid béo có độ dài khác nhau, chúng được biết có phổ đối kháng vi sinh vật rộng Phương thức hoạt động của chúng được cho là liên quan đến các đặc tính tẩy (detergent) của các acid này, cho phép chúng tạo các lỗ nhỏ hoặc ở nồng độ cao làm cho tế bào bị tiêu bởi màng tế bào bị phân hủy (Desbois et al 2010)

Sử dụng phương pháp chọn lọc chức năng từ thư viện metagenomic hải miên biển Nhật

Bản Discodermia calyx đã phân lập được cyclodipeptides có hoạt tính kháng khuẩn

cathepsins B và L được phân lập từ hải miên biển Theonella mirabilis Các chất ức chế

enzyme được chú ý như một công cụ hữu hiệu, không những để nghiên cứu cấu trúc enzyme và cơ chế tác động mà còn có tiềm năng sử dụng trong dược học và nông nghiệp Các chất ức chế protease là công cụ mạnh để bất hoạt các proteases đích trong quá trình gây các bệnh ở người như khí thũng (emphysema), viêm khớp (arthritis), nghẽn mạch (throbosis), huyết áp cao, loạn dưỡng cơ, ung thư và AIDS (Wahyudi et al., 2010) Abdelmohsen và cs (2012) đã tách được Diazepinomicin từ chủng

Micromonospora sp RV115 liên kết với hải miên Aplysina aerophoba (Croatia) có

10

hoạt tính không những kháng khối u phổ rộng, mà còn có khả năng chống ôxy hóa và

ức chế protease Ba chủng vi khuẩn SAB S-2; SAB 17; SAB S-21 được phân lập từ hải

miên Jaspis sp có hoạt tính ức chế serine protease (subtilisin), metalloprotease (thermolysin) và dịch chiết thô của vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn) và Pseudomonas aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh) Chủng SAB S-2 tương đồng với Providencia dựa trên trình tự gen 16S rRNA; chủng SAB 17 – Pracoccus và SAB S-21- Bacillus sp Một sản phẩm tự nhiên khác có hoạt tính ức chế protease là các dẫn xuất của tetromycins 1-4 được tách từ xạ khuẩn Streptomyces axinellae Po1001T liên kết với hải miên Axinella polypoides ở biển Mediterranean Các sản phẩm tự nhiên

này có hoạt tính ức chế một vài cystein proteases [36]

- Các chất có hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư

Dịch chiết ethyl acetate của nấm Eurotium cristatum phân lập từ hải miên Mycale sp

đã được nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học Kết quả nhận được cho thấy dịch chiết thô có hoạt tính ức chế sinh trưởng của 3 dòng tế bào ung thư: ung thư vú, ung thư phổi và ung thư da-tế bào hắc tố (melanoma) (Almeida et al., 2010) Có thể tìm

thấy trong hải miên Discodermia dissoluta và Theonella swinhoei các hợp chất chống ung thư discodermolide, onnamide và theopederin Ngoài ra, vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên Pseudoceratina clavata được nhận dạng là nguồn kháng sinh

rifamycin, được sản xuất bởi hệ PKS Kháng sinh polybrominated biphenyl tách từ hải

miên Dysidea herbacea thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra Lên men chủng nấm lớp Hyphomycetes được phân lập từ hải miên Jaspis affjohnstoni thu được tricyclic sesquiterpenes coriolin B, dihydrocoriolin C cũng như

chloriolines A-C mới Coriolin B có hoạt tính ức chế ung thư vú mạnh và dòng tế bào CNS, với IC50 0.7 µg (vú) và 0.5 µg (neuroblastoma) (Thomas et al., 2010) Một taxa thú vị khác liên kết với hải miên có tầm quan trọng dược học là Cyanobacteria như:

11

Lyngbya, Oscillatoria, Symploca, Calothrix, Leptolyngbya, Dichothrix, Geitlerinema, Schizothrix, Aphanothece, Blennothrix, và Synechocystis (Tabares, 2011)

1.3 Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên

Bằng công nghệ sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy, kính hiển vi và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật, người ta đã phát hiện có sự liên kết của các loài thuộc ba giới là Bacteria, Archaea và Eukarya với hải miên (Taylor et al., 2007) Các quần thể vi sinh vật khác sống trong hải miên còn có vi nấm và vi tảo Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa Vi sinh vật liên kết với hải miên có cả nội bào và ngoại bào [7] [8] Cộng đồng vi sinh vật này đặc hiệu cho hải miên

Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương pháp như điện di gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis_DGGE), giải trình tự

gen 16S rRNA và lai huỳnh quang in-situ (Fluorescense In Situ Hybridization_FISH), người ta nhận thấy ngoài các thành viên của Archaea còn có tới hơn 25 ngành vi khuẩn liên kết với hải miên Trong số đó có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia Chưa rõ về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola

Ở Việt Nam, chỉ có một số nghiên cứu về thành phần hải miên ở vịnh Hạ Long, Nha Trang cho thấy thành phần loài của chúng rất đa dạng [1], [2]

Có hai con đường để hải miên tạo nên vi khuẩn liên kết, một là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn thông qua giao tử (gametes) của hải miên bằng cách đưa cả vi

khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et al.,

2007)

12

Hình 1.4: Đa dạng vi khuẩn liên kết với hải miên (Tabares 2011)

Sự phân bố tổng thể của vi khuẩn ở hải miên dường như đi theo một mẫu chung Ở các lớp bên ngoài tiếp xúc với ánh sáng thường được liên kết với các sinh vật quang hợp,

vi khuẩn lam và tảo nhân chuẩn (Wilkinson, 1992) Các mesohyl chứa phần lớn các vi sinh vật, cả dị dưỡng và tự dưỡng, thường liên kết ở ngoại bào (Hentschel et al., 2006) Trong một số trường hợp xuất hiện các vi sinh vật có ở trong tế bào thậm chí ngay trong nhân tế bào của một số hải miên (Vacelet và Gallissian, 1978; Friedrich et al., 1999)

Một số hải miên, đặc biệt là demosponges được liên kết dày đặc bởi nhiều tế bào vi

khuẩn (từ 108 – 1010 tế bào vi khuẩn trên 1g trọng lượng hải miên tươi) được gọi là hải miên có đa dạng vi khuẩn cao („high-microbial-abundance‟ (HMA) sponges) (Hình 1.5a) (Hentschel et al., 2006) Ngược lại các loài hải miên liên kết với vi sinh vật ở mật

độ thấp hơn (105 – 106 tế bào vi khuẩn trên 1g trọng lượng hải miên tươi) (Hentschel et al., 2006) được gọi là hải miên có đa dạng vi khuẩn thấp („low-microbial abundance (LMA) sponges‟) (Hình 1.5b) HMA và LMA có thể cùng tồn tại trong môi trường

Tài nguyên biển vô cùng đa dạng và ẩn chứa nhiều tiềm năng có ích cho đời sống con người Vì vậy việc nghiên cứu về mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên đã và đang tiếp tục được thực hiện bởi các nhà khoa học cả ở trong nước và trên thế giới

*) Trên thế giới

Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy, rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh vật cộng sinh với hải miên ở các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giả thấy rằng vi khuẩn liên kết với hải miên bền vững theo không gian và thời gian Nhưng kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác lại không

thống nhất với giả thuyết này Chẳng hạn, Cymbastela concentric có cộng đồng vi sinh

vật ít thay đổi giữa các khoảng cách địa lý nhỏ, cộng đồng vi sinh vật ở vùng ôn đới

khác với cộng đồng vi sinh vật trong Cymbastela concentric thuộc vùng nhiệt đới của

Australia (Hill et al., 2006; Ouyang et al., 2009)

Những nghiên cứu phát sinh loài đã nhận diện được 26 ngành vi khuẩn khác nhau liên kết hải miên biển, trong đó ngành Poribacteria hầu như chỉ tìm thấy trong hải miên [15], điều này cho thấy thành phần vi sinh vật liên kết hải miên biển rất phức tạp Theo

14

Schmitt et al (2012) [15], các loài hải miên khác nhau chứa quần thể vi khuẩn gồm các loài khác nhau (quần thể đặc trưng loài) và có quần thể nòng cốt Nhưng các loài vi khuẩn trong các loài hải miên khác nhau vẫn có mối quan hệ gần hơn so với các loài vi khuẩn ở môi trường nước xung quanh Li et al (2006) [8] đã sử dụng phương pháp đánh dấu diện di gel gradien biến tính gen 16S rDNA (16S rDNA-DGGE fingerprinting) không qua nuôi cấy, phân tích phát sinh loài và sự đa dạng của cộng

đồng vi sinh vật liên kết với 4 loài hải miên Stelletta tenui, Halichrondria, Dysidea avara và Craniella australiensis ở biển nam Trung Quốc Kết quả cho thấy,

Proteobacteria (α, β và γ) là những vi khuẩn chiếm ưu thế và có lẽ có quan hệ cộng

sinh mật thiết với hải miên Hải miên Craniella australiensis có sự đa dạng vi sinh vật

lớn nhất, với 4 ngành vi khuẩn là Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes và

Actinobacteria; tiếp đến là Dysidea avara với 2 ngành Proteobacteria và Bacteroidetes; và hải miên Stelletta tenui, Halichrondria với ngành Proteobacteria

Lee et al (2009) [7] đã sử dụng phương pháp nuôi cấy và không nuôi cấy để đánh giá liệu hải miên cùng loài hoặc cùng chi quanh đảo San Juan (Washington) có các quần thể vi sinh vật đặc hiệu hay không Kết quả cho thấy, quần thể vi sinh vật liên kết

Myxilla incrustans và Haliclona rufescens rất giống nhau, trong khi với loài Halichondria panacea lại rất khác [7]

Thú vị là thành viên của Poribacteria - ứng viên đặc hiệu ở hải miên có rất ít trong nước biển dẫn đến giả định Poribacteria là thành viên hiếm hoi trong sinh quyển biển

có thể là những mầm giống cho vi khuẩn liên kết hải miên biển Những ngành (phyla)

vi khuẩn liên kết hải miên hay gặp là Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Nitrospira và Proteobacteria

Nghiên cứu trình tự khu hệ vi sinh vật liên kết hải miên được công bố vào năm 2011 [Lee et al, 2011] Phân tích 3 hải miên từ Red sea, nghiên cứu đã tăng các ngành vi khuẩn phát hiện trong hải miên biển lên 30 Nhưng thú vị hơn là cặp mồi sử dụng nhắm

*) Một số nghiên cứu trong nước

Những năm gần đây, Việt Nam đã xúc tiến một số chương trình nghiên cứu và giám sát

đa dạng sinh học biển, đặc biệt là sự hợp tác lâu năm với Viện hàn lâm Khoa học Nga

và các chuyến đi biển dài ngày của tàu Oparin nhằm thu thập mẫu vật tại các vùng biển của Việt Nam Các nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ động vật biển như hải miên, san hô mềm… cũng được tiến hành tại một số cơ sở nghiên cứu Từ

hải miên Spongia sp của Việt Nam đã tách chiết được sesquiterpene quinines với hoạt tính chống oxy hoá (Utkina & Deniseko 2011), C29-Sterols từ hải miên Ianthella sp

có đặc tính chống ung thư (Nguyen Huu Tung et al 2009) Từ hải miên biển Việt Nam

Xestospongia testudinaria đã phân lập được 3 C29 sterol mới, xác định cấu trúc và khả

năng ức chế sự bám dính của Pseudoalteromonas spp và Polaribacter sp (Xuan

Cuong Nguyen et al., 2013) Viện Hoá sinh biển có hợp tác với KORDI Hàn Quốc:

“Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ các đối tượng san hô mềm và hải miên thu thập tại Hạ Long, Quảng Ninh” Nghiên cứu thành phần hoá học

16

một số loài hải miên và vi sinh vật cộng sinh thuộc biển Việt Nam với đối tác Pháp và Bảo tàng lịch sử thiên nhiên quốc gia Pháp

Các nghiên cứu về hải miên tại Việt Nam còn hạn chế và chưa có nghiên cứu nào về hệ

vi sinh vật liên đới với hải miên cũng như phát hiện các chất có hoạt tính sinh học từ hệ

vi sinh vật này, đặc biệt là việc sử dụng kỹ thuật metagenomics để phát hiện và sàng lọc các gen có hoạt tính sinh học từ nguồn môi trường tiềm năng này

1.4 Sơ lược về gen 16S rRNA

Là đoạn trình tự tương đối ngắn, bảo thủ và đặc trưng cho mỗi loài Những khảo sát về gen trên rRNA được thực hiện trực tiếp từ DNA môi trường đã cho thấy, số lượng loài

vi khuẩn và vi khuẩn cổ đã tìm thấy trước đây bằng phương pháp giải trình tự truyền thống chỉ tương đương khoảng 1% số lượng thực của chúng trong môi trường Gen 16S rRNA là thành phần của bộ máy tổng hợp protein có từ lâu đời Hơn nữa, các rRNA là những phân tử có chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải cho phép phản ánh sự liên quan tiến hoá giữa các loài sinh vật

Zuckerkand và Pauling (1967) cho rằng 16S rRNA có các đặc điểm phù hợp làm thước

đo tiến hoá vì: (i) phân tử có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát; (ii) phân tử không truyền qua lại giữa các loài; (iii) trình tự của phân tử có độ bảo tồn và biến động thích hợp trong khoảng cách tiến hoá khảo sát; (iv) phân tử có kích thước đủ lớn để chứa nhiều thông tin Mặc dù các tRNA có mặt ở hầu hết các vi sinh vật nhưng chúng không được chọn làm thước đo tiến hoá do kích thước quá nhỏ (75 ribonucleotides)

Ba loại rRNA là thành phần của ribosome đều có một số tính chất để có thể được chọn làm thước đo tiến hoá Tuy nhiên chỉ có 16S rRNA là sự lựa chọn phù hợp cho các nghiên cứu hiện nay do có kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotides) Còn lại 5S có kích thước quá nhỏ (khoảng 120 ribonucleotides), mang ít thông tin của quá trình tiến hoá nên ít được chọn 23S rRNA là phân tử có kích thước lớn (khoảng 2900

17

ribonucleotides), nên hiện không mấy thuận lợi cho việc nghiên cứu Phân tử 16S rRNA được coi như “tiêu chuẩn vàng” cho phân loại học Tuy nhiên, do RNA dễ bị phân huỷ nên cần phải rất cẩn trọng trong thao tác, vì vậy khuynh hướng hiện nay là sử dụng gene 16S rDNA mã hoá cho RNA trong các nghiên cứu Gene 16S rRNA của các

vi khuẩn thuộc nhóm Eubacteria có một đặc điểm rất đặc biệt là có những vùng bảo tồn cao ở cấp độ của nhóm xen kẽ những vùng biến động khác nhau giữa các loài trong cùng nhóm này Tuy là những vùng biến động, nhưng những vùng này lại là những vùng bảo tồn ở cấp độ loài Sự bảo tồn và biến động ở các cấp độ khác nhau đã giúp cho gen 16S rRNA luôn là sự lựa chọn đầu tiên của các nhà nghiên cứu khi tiến hành định danh vi khuẩn hay xác định mối quan hệ họ hàng giữa hai hay nhiều loài vi khuẩn

Ở prokaryote, gene 16S RNA ribosome (rRNA 16S) dài khoảng 1.500 bp và chứa chín vùng biến đổi rải rác giữa các vùng bảo thủ Vùng biến đổi 16S rRNA thường được sử dụng trong phân loại phát sinh loài như chi hoặc loài trong đa dạng quần thể vi sinh vật

Hình 1.6: Gene 16S rRNA có 9 vùng biến đổi nằm xen giữa các vùng bảo thủ

1.5 Sơ lược về MiSeq Sequencing

Platforms Illumina là họ sản phẩm được sử dụng rộng rãi nhất Kỹ thuật được đưa ra vào năm 2006 và nhanh chóng được các nhà khoa học sử dụng bởi có thể tạo ra lượng lớn số liệu với chi phí hiệu quả hơn Theo thời gian, chiều dài read được tăng lên và những người thường sử dụng 454 đã chuyển sang Illumina platform do hiệu quả kinh

tế của kỹ thuật này Mặc dù phương pháp giải trình tự bằng tổng hợp như của 454, nhưng phương pháp Illumina có 2 điểm nổi bật khác với 454: (1) sử dụng flow cell với

18

vùng đính oligo, thay cho chip chứa các vi giếng (microwell) riêng lẻ có hạt và (2) nó không liên quan đến pyrosequencing, mà kết thúc bằng thuốc nhuộm thuận nghịch Phương pháp kết thúc bằng thuốc nhuộm giống như giải trình tự Sanger, nhưng khác là chúng thuận nghịch vì vậy chúng được gỡ bỏ sau mỗi chu kỳ để tiếp tục kết thúc cho nucleotide tiếp theo

Chuẩn bị giải trình tự được bắt đầu với các đoạn DNA có các bộ chuyển đổi (adapter) đặc hiệu ở một đầu, chúng đi qua qua flow cell có các oligonucleotides cụ thể và lai với đầu cuối của đoạn DNA Mỗi đoạn DNA sau đó tái tạo (replicate) để tạo thành cụm các đoạn giống nhau Các nucleotides mầu kết thúc thuận nghịch sau đó chảy qua flow cell

và gắn vào đó Nucleotides thừa bị rửa trôi, flow cell được tạo hình ảnh và các chất kết thúc thuận nghịch, vì vậy quá trình có thể nhắc lại và nucleotides có thể tiếp tục được thêm vào trong các chu kỳ tiếp theo Hiện nay, read dài nhất mà platform Illumina tạo

ra là trên MiSeq, các read có đuôi kết đôi (paired-end) là 300 bp

Hiểu biết của chúng ta về vi sinh vật trong các môi trường tự nhiên rất hạn chế và việc nghiên cứu đa dạng sinh học trong tự nhiên không phải nhiệm vụ dễ dàng Trong các

hệ sinh thái tự nhiên, vi sinh vật tồn tại với mật độ cao mặc dù rất nhiều loài hiện chưa được mô tả Vi sinh vật thích nghi với hầu hết các loại môi trường trên trái đất và có các hoạt tính sinh học đa dạng tùy thuộc vào môi trường sống Câu hỏi quan trọng khi nghiên cứu vi sinh vật trong môi trường tự nhiên của chúng là: các cộng đồng vi sinh vật hoạt động như thế nào và sự thay đổi về chất trong cộng đồng xảy ra do sự thay đổi môi trường như thế nào

Có rất nhiều phương pháp mô tả đa dạng vi sinh vật như phương pháp sinh hóa, nuôi cấy, phân tích acid béo phospholipid , các phương pháp sinh học phân tử như lai acid nucleic, đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP), đa hình chiều dài các đoạn giới hạn cuối (T-RFLP), DNA microarrays, điện di gradient biến tính (DGGE) hoặc điện di gradient nhiệt độ (TGGE), đa hình thể cấu tạo sợi đơn (SSCP)

Bảng 1.1: Phần mềm, các công cụ dựa trên Web và các cơ sở dữ liệu sử dụng để phân tích metagenome

JANE

http://jane.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de

Lập bản đồ ESTs và reads trình tự genome prokaryote chiều dài khác nhau trên các mẫu genomes họ hàng

Hyatt et al.,

2010

Aziz 2010

CAMERA

http://camera.calit2.net

Metagenomic database server chứa các trình tự từ các mẫu môi trường thu thập được trong quá trình lấy mẫu đại dương toàn cầu (GOS)

Grossettete et al., 2010

envDB

http://metagenomics.uv.es/envDB/

Cơ sở dữ liệu và tool server cho sự phân bố trong môi trường các taxa prokaryotes

Tamames et al., 2010

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Tách DNA

Các mẫu hải miên được rửa ba lần bằng nước biển nhân tạo vô trùng, sau đó mười gram hải miên được cắt thành từng mẩu nhỏ, đồng nhất tới dạng huyền phù trong đệm TE (10 mM Tris- HCl, 1 mM ethylene axit diaminetetraacetic ( EDTA), pH 8,0) Đầu tiên, dịch huyền phù được lọc qua hai lớp vải mỏng, sau đó ly tâm ở 250g trong 1 phút để loại bỏ các mảnh vụn của hải miên Dịch nổi được ly tâm ở 8000g trong 15 phút để tập trung vi khuẩn Vi khuẩn thu được rửa sạch bằng dung dịch TE50 (10 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0) DNA tổng số được tách bằng E.Z.N.A® soil DNA Kit (OMEGA Bio-Tek) theo hướng dẫn của nhà sản xuất

2.2.2 Thiết kế thư viện 16S rRNA cho MiSeq

Để đánh giá sự đa dạng của vi sinh vật liên kết hải miên, đã phân tích vùng siêu biến V4 của gen 16S rRNA

PCR lần 1: Vùng V4 của gen 16S rRNA được khuếch đại sử dụng cặp mồi 515F

(GTGYCAGCMGCCGCGGTAA) và 806R (GGACTACNVGGGTWTCTAAT) Phản ứng được tiến hành trong thể tích cuối cùng 25μl, chứa 5µl Green HF buffer 5x; 200µM một trong bốn loại dNTPs (ThermoFisher); 0.2µM mỗi loại primer; 0.25µl Phusion Hot start DNA polymerase 2U/µl (ThermoFisher) và 1 µl DNA template

22

Chương trình khuếch đại gồm: biến tính 5 phút ở 98o C; 25 chu kỳ gồm (45 giây ở 98o C; 30 giây ở 50o C; 30 giây ở 72o C); kéo dài 10 phút ở 72o C, giữ ở 4o C Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1.8%

PCR lần 2: thực hiện gắn barcodes vào sản phẩm PCR lần 1 Mỗi mẫu có barcode

riêng Mẫu DN9: CCAAGTCA (Barcode forward), CCAAGTCA (Barcode reverse); Mẫu DN10: TGGTTGAC (Barcode forward), GAGTTCATACT (Barcode reverse); Mẫu DN12: GGTCAGAT (Barcode forward); GAGTTCATTCA (Barcode reverse) Thể tích cuối cùng của phản ứng: 31 µl chứa 10µl of Green HF buffer 5x; 200µM một trong 4 loại dNTPs; 0.5 µM mỗi barcode và 0.5µl Phusion Hot start DNA polymerase 2U/µl (ThermoFisher); 2,5 µl sản phẩm PCR từ PCR lần 1 được sử dụng như template Chương trình khuếch đại gồm: biến tính 1 phút ở 98o C; 5 chu kỳ gồm (10 giây ở 98o C; 20 giây ở 52o C; 20 giây ở 72o C); kéo dài 10 phút ở 72o C, giữ ở 4o C Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel 1.8% agarose

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Kit HighPrep™ PCR Protocol – MagBio, sau đó được đo nồng độ bằng Qubit (Invitrogen) Thư viện DNA được chuẩn bị bằng cách trộn đều sản phẩm PCR đã được tinh sạch của mỗi mẫu với lượng bằng nhau (150 µg/mẫu) Thư viện DNA cũng được tinh sạch bằng Kit HighPrep™ PCR Protocol – MagBio và được giải trình tự bằng máy giải trình tự MiSeq (Thực hiện tại Hà Lan)

2.2.3 Phân tích thư viện 16S rRNA

Thư viện 16S MiSeq được xử lý bằng Qiime Virtual Box 1.9.0 với NG-Tax pipeline Đầu tiên các reads không được gắn barcode hoặc không bắt cặp với primer sẽ được loại

bỏ bằng đoạn mã Library_filtering Các read sau sẽ được tiếp tục giải mã kênh (demultiplexing), nhóm OTU, loại bỏ các read chimera và phân loại taxonomy với kịch bản OTU_picking_pair_end_read, trong đó các read có mức tương đồng 98.5% sẽ được nhóm vào một OTU, chiều dài read mỗi đầu là 100 nucleotide, các OTU được phân loại theo database của Project (RDP) Silva database v.1.1.1

23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Tách DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên

Bằng phương pháp nêu trên, DNA tổng số của vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng đã được tách chiết và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% Kết quả nhận được trên hình 3.1

DNA tổng số cũng được đo nồng độ bằng Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermo Scientific) Kết quả nhận được trên bảng 3.1

Kết quả kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA metagenomes ở A260, A280 cho thấy DNA tách chiết không bị nhiễm bởi protein hoặc phenol (tỉ lệ A260/A280 ~ 1,8) Hàm lượng DNA nhận được khá lớn, ít nhất là mẫu DN9 (190,7 ng/mL) và nhiều nhất là mẫu DN12 (286,6 ng/mL) (bảng 3.1)

Hình 3.1: Điện di đồ DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển

Đà Nẵng trên agarose gel 0,8% Lane 1: DN9; lane 2: DN10; lane 3: DN12

24

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra hàm lượng và độ tinh sạch của DNA metagenome

Rhabdastrella, DN10 thuộc chi Cinachyrella và DN12 thuộc chi Dactylospongia

Bảng 3.2: Kết quả nhận dạng các mẫu hải miên biển Đà Nẵng

1 DN9 Demospongiae Astrophorida Ancorinidae Rhabdastrella

2 DN10 Demospongiae Spirophorida Tetillidae Cinachyrella

3 DN12 Demospongiae Dictyoceratida Thorectidae Dactylospongia

3.1.2 Khuếch đại vùng siêu biến V4 của gen 16S rRNA và gắn barcodes

Vùng V4 của gen 16S rRNA đã được khuếch đại theo phương pháp mô tả Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1.8%, điện di 45 phút tại 100V, sản phẩm PCR là đoạn gen có kích thước khoảng 300bp (hình 3.2)

25

Hình 3.2: Ảnh điện di PCR khuếch đại vùng V4 gen 16S rRNA của vi sinh vật liên

phẩm PCR vùng V4 của mẫu DN9, DN10 và DN12, tương ứng

PCR lần 2 được tiến hành để gắn barcodes cho các sản phẩm PCR vùng V4 của gen

16s rRNA nhằm thiết kế thư viện gen 16S MiSeq Kết quả nhận được trên hình 3.3

26

3.1.3 Đa dạng các cộng đồng vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng

Các reads nhận được từ thư viện 16S MiSeq được đánh giá chất lượng, loại bỏ các read không vượt qua quá trình lọc chất lượng và chimera Kết quả nhận được cho thấy, 55,9% reads của mẫu DN9 (tương ứng 26455 reads); 55,48% reads của mẫu DN10 (tương ứng 11733 reads) và 44,80% (tương ứng 220629 reads) của mẫu DN12 đáp ứng yêu cầu Các reads có chất lượng tốt này sau đó được nhóm thành các OTU với mức tương đồng trình tự 98,5%, sau đó được so sánh với cơ sở dữ liệu Project (RDP) Silva database v.1.1.1 để phân loại các vi sinh vật theo các mức giới, ngành, lớp, bộ, họ và chi Bảng tóm tắt kết quả phân loại được trình bày ở bảng sau

Bảng 3.3: Tóm tắt kết quả phân loại vi sinh vật liên kết với hải miên

27

Bảng 3.3 cho thấy mẫu DN9, mẫu DN10 có số lượng read đạt chất lượng cao, hơn 55% tổng số reads, tương ứng 26455 reads và 11733 reads, trong khi đó, mẫu DN12 chỉ có hơn 44% số reads đạt chất lượng Các cấp phân loại từ giới đến lớp có sự tương đồng ở

cả ba mẫu hải miên DN9; DN10 và DN12 Có sự khác biệt rõ rệt về thành phần vi sinh vật liên kết với ba mẫu hải miên từ phân loại cấp bộ cho đến chi Mẫu DN12 với 36 bộ, nhiều hơn hẳn ở hai mẫu còn lại là DN9 (32 bộ) và DN10 (29 bộ) Ở hai mẫu DN9 và DN12 có số chi tương đương Tuy nhiên mẫu DN10 có số chi vượt trội với 17 chi Điều này cho thấy càng ở mức phân loại thấp hơn (dưới lớp) càng thể hiện sự khác biệt

rõ rệt về thành phần các vi sinh vật liên kết với các loài hải miên khác nhau

Kết quả phân loại chi tiết theo các mức phân loại được trình bày ở các bảng sau:

3.1.3.1 Kết quả phân loại theo giới

Bảng 3.4: Kết quả phân loại vi sinh vật liên kết với hải miên theo giới

Hình 3.4: Đồ thị biểu hiện tỉ lệ vi khuẩn và cổ khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên 3.1.3.2 Kết quả phân loại theo ngành

Bảng 3.5: Kết quả phân loại các ngành vi sinh vật liên kết với hải miên

Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy cộng đồng vi khuẩn liên kết với 3 mẫu hải miên được

khảo sát có độ đa dạng cao 10 ngành vi khuẩn phổ biến đều được tìm thấy ở cả ba mẫu hải miên DN9; DN10 và DN12 Tuy nhiên độ phong phú là khác nhau ở mỗi mẫu Proteobacteria là ngành chiếm ưu thế vượt trội và phân bố ở cả ba mẫu hải miên, đặc biệt ở hải miên DN10, ngành này chiếm tới hơn 56% tổng số reads Ở mỗi mẫu hải miên có những ngành chiếm ưu thế khác nhau Chẳng hạn, ở mẫu DN12, Actinobacteria chiếm ưu thế vượt trội so với hai mẫu còn lại là DN9 và DN10 với tỉ lệ phần trăm các reads tương ứng lần lượt là: 26.42%; 1.99% và 4.08% Ngành Cyanobacteria được tìm thấy ở hai mẫu DN9 và DN12, cho thấy có mối quan hệ giữa

vi khuẩn lam quang tự dưỡng vô cơ với hải miên Bảng 3.5 cũng chỉ ra rằng, có những ngành chỉ phân bố ở vật chủ này mà không có trong vật chủ khác Ví dụ: Firmicutes có

30

mặt ở trong hai mẫu DN10 và DN12 nhƣng không đƣợc phát hiện trong mẫu DN9; Ngành Spirochaetes tìm thấy trong DN9 và DN10 không có trong DN12 Planctomycetes đƣợc phát hiện duy nhất trong mẫu DN10, cũng nhƣ vậy hai ngành Verrucomicrobia và Deinococcus-Thermus chỉ đƣợc tìm thấy trong mẫu DN12 mà không phát hiện ở hai mẫu còn lại Với kết quả thể hiện ở bảng 3.5 dễ dàng nhận thấy rằng, mẫu hải miên DN9 có độ phong phú về vi sinh vật liên kết cao hơn hẳn hai mẫu DN10 và DN12 Qua đó có thể nhận xét rằng số lƣợng, thành phần vi sinh vật liên kết với hải miên là không giống nhau và đặc trƣng cho từng cá thể hải miên

Hình 3.5: Đồ thị biểu hiện thành phần các ngành vi sinh vật liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12