Phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trưởng một số dòng tế bào ung thư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƯỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

Bùi Thị Thùy Dung

PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƯỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

Bùi Thị Thùy Dung

PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƯỞNG

MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS Phạm Thị Lương Hằng

PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội – Năm 2016

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

i

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Phạm Thị Lương Hằng và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, người đã trực tiếp hướng dẫn , tạo mo ̣i

điều kiê ̣n thuâ ̣n lợi , giúp đỡ tôi trong suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn Các cô không chỉ là những người truyền đạt cho tôi những kiến thức mà còn

hỗ trợ tôi rất nhiều về vật chất Tôi thấy mình thật may mắn khi được là học trò của các cô

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới ThS Bùi Thị Vân Khánh, ThS Nguyễn Đắc Tú , những người chi ̣, người anh tâ ̣n tình hướng dẫn tôi những kĩ

thuâ ̣t đầu tiên khi bước chân vào phòng thí nghiê ̣m Anh, chị không chỉ truyền đạt cho tôi những kinh nghiê ̣m trong công viê ̣c mà cả những kinh nghiê ̣m quý báu trong cuô ̣c sống, đó sẽ là những hành trang mà tôi sẽ luôn mang theo sau này

Xin gửi lời cảm ơn đến CN Nguyễn Thị Thu Hà, CN Hà Hữu Cường,

CN Nguyễn Thị Loan, CN Vũ Anh Công đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá

trình làm thí nghiệm

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô và cán bô ̣ trong Khoa Sinh

học, đă ̣c biê ̣t là các thầy cô trong Bô ̣ môn Sinh ho ̣c tế bào và Bộ môn Sinh lí Thực vật và Hóa sinh đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành lu ận

văn này

Và, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chi ̣ , các bạn và các em trong Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Tế bào người và động vật cũng như Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Mô thực vật và Vi tảo đã luôn đồng hành , quan tâm và giúp đỡ tôi

trong thời gian tham gia nghiên cứu ta ̣i đây Sự quan tâm , chia sẻ của các bạn và các em là động lực lớn lao với tôi trong những lúc mệt mỏi và khó khăn nhất Tôi sẽ không bao giờ quên thời gian làm việc đầ y ắp tiếng cười cùng các ba ̣n trong hai gia đình lớn ở trường Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Bùi Thị Thuỳ Dung

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

iii

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ED50 Median effective dose Liều có hiệu quả ở 50% số

động vật thí nghiệm EtOAc Ethyl acetate Dung môi ethyl acetate HCT116 Human colon carcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ đại

trực tràng HepG2 Hepatocellular carcinoma G2 Dòng tế bào ung thƣ gan

IC50

Half maximal inhibitory concetration

Nồng độ ức chế 50% số tế bào

LC/MS Liquid chromatography–mass

spectrometry Sắc kí lỏng - khối phổ

LD50 Median lethal dose 50% Liều gây chết trung bình MCF7 Breast adenocarcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ vú

MIC

Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

TLC Thin-layer chromatography Sắc kí bản mỏng

MỤC LỤC

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

iv

MỞ ĐẦU 1

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Vi khuẩn lam 2

1.1.1.Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam 2

1.1.2.Phân loại vi khuẩn lam 3

1.2 Tiềm năng phát triển dược phẩm điều trị ung thư từ vi khuẩn lam 4

1.3 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam 9

1.4 Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam 13

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Các chủng vi khuẩn lam 15

2.1.2 Dòng tế bào 16

2.2 Các nội dung chính trong nghiên cứu 17

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Đánh giá khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào 17

2.3.2 Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 19

2.3.3 Phương pháp sắc kí cột silica gel 20

2.3.5 Phương pháp LC/MS 21

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư 22

3.1.1.Kết quả hoạt hóa tế bào 22

3.1.2.Xác định chỉ số IC50 của các dịch chiết từ vi khuẩn lam 22

3.2 Phân lập các chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 29

3.2.1.Sự phân tách bằng cột sắc ký silica gel 29

3.2.2 Sự phân tách bằng cột sắc kí sillica gel lần 2 32

3.2.3 Sự phân tách bằng cột sắc kí silica gel lần 3 35

3.3 Xác định khối lượng phân tử của hoạt chất bằng phương pháp LC/MS 37

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

v

KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36] 5

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

vi

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Borophycin [17] 7

Hình 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng trong nghiên cứu 16

Hình 3.1 Các dòng tế bào ung thư dùng trong phép thử hoạt tính 22

Hình 3.2 Tế bào MCF7 ở mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm 23

Hình 3.3 Tế bào MCF7 dưới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc 24

Hình 3.4 Tế bào HCT116 dưới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc 24

Hình 3.5 Tế bào HepG2 dưới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc 24

Hình 3.6 Đường cong đáp ứng liều của các dịch chiết có hoạt tính trên hai dòng tế bào MCF7 và HCT116 27

Hình 3.7 Đường cong đáp ứng liều của dòng tế bào MCF7 đối với Taxol 28

Hình 3.8 Các phân đoạn rửa giải từ dịch chiết APD4-Met 30

Hình 3.9 Hình dạng tế bào MCF7 khi được ủ với phân đoạn DE5 32

Hình 3.10 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn có hoạt tính (DM-E) 33

Hình 3.11 Tế bào MCF7 khi ủ với phân đoạn DP1 và DP5 ở nồng độ 50µg/ml 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC của phân đoạn DP1 và DP5 35

Hình 3.13 Tế bào MCF7 dưới tác dụng của phân đoạn DF4 36

Hình 3.14 Sắc kí đồ của phân đoạn DF2 ở bước sóng 256nm 37

Hình 3.15 Sắc kí đồ của phân đoạn DF4 ở bước sóng 256nm 38

Hình 3.16 Phổ khối lượng của hợp chất P3 xuất hiện ở phút 23,6 39

Hình 3.17 Kết quả tra cứu hợp chất có trọng lượng phân tử từ 795-796 dalton tháng 10/2016 40

Hình 3.18 Công thức cấu tạo của Apratoxin E [26] 41

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chất có khả năng kháng ung thư được phân lập từ vi khuẩn lam [39] 8

Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính 15

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

vii

Bảng 3.1 Giá trị tăng sinh A% của các dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh

tế bào dòng MCF7 25 Bảng 3.2 Giá trị tăng sinh A% của các dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh

tế bào dòng HCT116 26 Bảng 3.3 Giá trị IC50 của một số dịch chiết có hoạt tính 27 Bảng 3.4 Giá trị IC50 của Taxol trên ba dòng tế bào MCF7, HCT116 và HepG2 28 Bảng 3.5 Khối lượng các phân đoạn từ dịch chiết của chủng APD4 31 Bảng 3 6 Khối lượng khô của các phân đoạn thu được từ cột silica gel lần 2 34 Bảng 3.7 Khối lượng các phân đoạn thu được từ cột sắc ký silica gel lần 3 36 Bảng 3.8 Tỷ lệ tương đối về hàm lượng của các chất trong phân đoạn DF4 38

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

1

MỞ ĐẦU

Sự xuất hiện của bệnh ung thư đã và đang là mối đe dọa tính mạng con người hàng đầu trên thế giới với tỷ lệ mắc phải ngày càng tăng Theo số liê ̣u báo cáo của Viện nghiên cứu quốc tế về ung thư , trong năm 2012, trên toàn thế giới có hơn 8,2 triệu người chết vì các loại bệnh ung thư khác nhau Các chuyên gia cảnh báo nếu con người không sớm tìm được biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn tốc độ phát triển như hiện nay của căn bệnh này thì tới năm 2035, ung thư sẽ cướp đi sự sống của ít nh ất 24 triệu người [14] Hóa trị và xạ trị từ lâu là phương pháp được sử dụng phổ biến trong điều trị ung thư, tuy nhiên hai phương pháp này có nhiều tác dụng phụ, ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người bệnh, hoặc người bệnh có thể tử vong trước khi tiêu diệt được tận gốc các tế bào ung thư Bởi vâ ̣y, viê ̣c tìm ra mô ̣t loa ̣i thuốc đă ̣c hiê ̣u điều tri ̣ ung thư và an toàn v ới người bệnh là

mô ̣t vấn đề r ất cấp bách hiê ̣n nay Trong công cuộc tìm kiếm đó, các hợp chất từ thiên nhiên được quan tâm nhiều hơn cả bởi chúng đã có mặt trong các bài thuốc dân gian từ lâu và có độ an toàn cao

Vi khuẩn lam là nguồn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm năng dược phẩm có ý nghĩa quan trọng Chúng cho thấy khả năng chống lại các khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm Một số hợp chất được phân lập và tinh sạch từ vi khuẩn lam đã cho kết quả bước đầu thành công trong các thử nghiệm điều trị ung thư lâm sàng Các hợp chất này được xem là hợp chất tiên phong cho sự phát triển, tổng hợp các hợp chất dẫn với hoạt tính sinh học tốt hơn

Từ các kiến thức như trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trưởng một số dòng tế bào ung thư” với mục đích:

1 Đánh giá được khả năng ức chế tăng trưởng của dịch chiết từ 9 chủng vi khuẩn lam lên 3 dòng tế bào ung thư phổ biến ở Việt Nam

2 Tìm ra được hợp chất có khả năng kháng ung thư từ dịch chiết vi khuẩn lam

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

2

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lam

1.1.1 Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam là vi khuẩn quang hợp cổ xưa, xuất hiện trên trái đất từ 3,5 tỉ năm về trước Bằng việc tạo ra khí oxy như một sản phẩm phụ của quá trình quang hợp, vi khuẩn lam được cho là đã chuyển đổi khí quyển ở thời kì sơ khai từ tính khử sang tính ô-xi hóa, từ đó làm thay đổi thành phần sự sống trên Trái Đất Chính vì vậy, chúng được xem là nhóm sinh vật tiên phong trong quá trình sản xuất ra khí oxy giúp hình thành sự sống trên Trái Đất ngày nay

Vi khuẩn lam trước đây còn được biết đến với tên gọi là tảo lam bởi chúng có cơ chế quang hợp giống tảo (nhóm sinh vật nhân chuẩn) với sắc tố quang hợp nằm trên màng thylakoid Tuy nhiên, cấu tạo tế bào của chúng giống với sinh vật nhân sơ (Prokaryote) hơn là sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote) vì chúng không có màng nhân, vật liệu di truyền không liên kết với protein histone, thiếu màng bao quanh các bào quan như bộ máy Golgi, lục lạp, ty thể, lưới nội chất Vi khuẩn lam có ribosome 70S và có cấu trúc thành tế bào gồm các lớp peptidoglycan Màu xanh của vi khuẩn lam là do sự kết hợp của chlorophyll a (xanh lục) và các sắc tố phụ phycocyanin (xanh lam), allophycocyanin (xanh lam), phycoerythin (màu đỏ) Các sắc tố này kết hợp với nhau theo tỷ lệ và thành phần nhất định để thích ứng với môi trường sống [9]

Vi khuẩn lam có hai hệ thống quang hệ I và II nằm trên màng thylakoid (trừ

chi Gleobacter) Trong quang hệ II có phycobiliprotein có chức năng giống các

sắc tố “ăng-ten” bắt giữ năng lượng sáng cho chlorophyll a Năng lượng ánh sáng sau đó sẽ được chuyển từ quang hệ II sang quang hệ I - nơi chúng được chuyển thành năng lượng hóa học trong đó có phân tử cao năng lượng như ATP và NADPH+H Phân tử cao năng này sẽ được sử dụng để cố định CO2 thành carbohydrate thông qua chu trình Calvin Vi khuẩn lam thực hiện quang hợp trong điều kiện hiếu khí với H2O là chất cho điện tử và O2 là sản phẩm phụ được tạo ra

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

Vi khuẩn lam đã và đang được nghiên cứu trong một số lĩnh vực, đem lại giá trị kinh tế vô cùng to lớn như:

 Làm phân bón sinh học cho lúa và các cây trồng khác bởi nhiều chủng vi khuẩn lam có các tế bào dị hình, có khả năng cố định nitơ khí quyển giúp tăng năng suất cây trồng

 Vi khuẩn lam là một nguồn protein đơn bào có ý nghĩa quan trọng

Các chủng không độc như Spirulina sp đã được nuôi trên quy mô lớn để làm thực

phẩm bổ sung cho người và làm thức ăn giàu protein cho gia súc

 Các chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn lam là nguồn dược liệu quan trọng cho việc phát triển thuốc và điều trị bệnh

1.1.2 Phân loại vi khuẩn lam

Phân loại sinh học là một phương pháp theo đó các nhà sinh học lập nhóm

và phân loại các loài sinh vật theo những nguyên tắc nhất định Mỗi nhóm sinh vật có tên gọi riêng và được phân định dựa trên những đặc điểm xác định về hình thái, trình tự DNA,…Căn cứ vào mối quan hệ giữa các nhóm, người ta sắp xếp chúng theo thứ tự bằng hoặc phân cấp cao hơn trên cây phân loại

Dựa trên hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey, vi khuẩn lam được chia thành 5 bộ [41]:

 Bộ Chroococcales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung lại thành đám Các tế bào phân chia theo 1; 2 hoặc 3 mặt phẳng đối xứng

hoặc nảy chồi Ví dụ các chi: Microcystis, Prochlorococcus, Prochloron,

Synechoccus

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

4

 Bộ Pleurocapsales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung

lại thành đám Ví dụ các chi: Chroococcidiopsos, Myxosarcina, Pleurocapsa

 Bộ Oscillatoriales: Dạng sợi đơn, không có tế bào dị hình Ví dụ các

chi: Oscillatoria, Spirulina, Lyngbya, Trichodesmium, Planktothrix

 Bộ Nostocales: Dạng sợi, không phân nhánh, có tế bào dị hình, có khả năng cố định nitơ Ví dụ các chi: Nostoc, Calothrix, Nodularia

 Bộ Stigonematales: Dạng sợi, phân nhánh, có tế bào dị hình để cố định nitơ Ví dụ các chi: Fischerella, Hapalosiphon, Westiellopsis

Sự phân loại vi khuẩn lam truyền thống thường dựa trên hình thái của chúng Tuy nhiên, chỉ dựa vào tiêu chí hình thái có thể không chính xác vì một số chủng vi khuẩn lam có sự thay đổi về hình thái khi đáp ứng với các điều kiện môi trường khác nhau Sử dụng các trình tự DNA 16S để làm thước đo phân loại đang

là hướng đi nhiều tiềm năng vì DNA không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường Sự kết hợp giữa phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại giúp quá trình phân loại vi khuẩn lam chuẩn xác hơn

1.2 Tiềm năng phát triển dược phẩm điều trị ung thư từ vi khuẩn lam

Trong số 974 hợp chất mới được giới thiệu làm thuốc trên thế giới những năm 1981-2006, 63% có nguồn gốc từ các sản phẩm thiên nhiên Trong đó, 6% là các sản phẩm thiên nhiên, 33% là các dẫn xuất tổng hợp dựa trên các kiến thức thu được từ các sản phẩm tự nhiên và 24% là sản phẩm bắt chước sản phẩm tự nhiên Bên cạnh đó, đối với các dược phẩm điều trị ung thư, 78% là sản phẩm tự nhiên hoặc có nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên [29] Đại đa số các sản phẩm tự nhiên bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn và thực vật Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu phát triển nguồn dược phẩm từ hợp chất thiên nhiên theo hai hướng, đó là: phân tích sâu hơn các hợp chất có mặt trong nguồn tài nguyên cũ đã được biết đến

và hướng tới nguồn tài nguyên mới dồi dào, phong phú hơn Trong đó, vi khuẩn lam đang là đối tượng tiềm năng được chú ý theo hướng nghiên cứu thứ hai

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

5

So sánh với các loại thuốc từ vi khuẩn nói chung, vi khuẩn lam nổi trội hơn hẳn nhờ có mặt những hợp chất tiềm năng kháng ung thư Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra 6% đến 10% dịch chiết từ vi khuẩn lam đang được nuôi cấy có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư ở người, 0,8% trong tổng số 2000 dịch chiết vi khuẩn lam có độc tính đối với các khối u rắn [27] Theo báo cáo của Patterson, ông và cộng

sự đã tiến hành sàng lọc trên quy mô lớn sử dụng 1000 chủng vi khuẩn lam từ các môi trường sống khác nhau Quá trình sàng lọc đã cho thấy khoảng 7% dịch chiết có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư KB [31]

Các nghiên cứu của Gerwick và cộng sự tập trung vào việc sàng lọc các hợp chất kháng ung thư của các chủng vi khuẩn lam sống trong môi trường nước biển Kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 40% các chất từ vi khuẩn lam thu được có hoạt khả năng chống lại ung thư, ngăn ngừa khối u Chúng cũng là nguồn giàu các hợp chất peptide và polyketide, các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh có thể là nguồn hợp chất tạo dược phẩm kháng ung thư mới [16]

Một số lượng lớn các hợp chất được phân lập từ vi khuẩn lam có hoạt tính

ức chế sự trùng hợp tubulin đang là đối tượng được nghiên cứu để phát triển thuốc kháng ung thư

Được phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc sp ATCC 53789, Cryptophycin là

một trong những ứng cử viên được phát hiện sớm và có tiềm năng cao cho loại dược phẩm mới chống ung thư Ở nhóm Cryptophycin có hơn 25 thành viên có hoạt động mạnh gây bất ổn tubulin, trong đó Crytophycin 1 có hoạt tính mạnh nhất [36]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36]

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

6

Curacin A được phân lập từ chủng vi khuẩn lam Lyngbya majuscule có khả

năng ức chế sự tăng sinh tế bào và có độc tính mạnh với các tế bào ung thư đại tràng, thận và vú Chúng hoạt động bằng cách liên kết với vị trí bám trên tubulin ngăn cản sự tổng hợp vi ống, từ đó ức chế sự phân chia và tăng sinh tế bào Tuy

nhiên Curacin A ít tan trong nước vì vậy khi tiến hành thử nghiệm trên mô hình in

vivo đã gặp nhiều khó khăn Để khắc phục hiện tượng trên, các nhà khoa học đã

tìm cách tổng hợp hợp chất có đặc tính sinh học tượng tự Curacin A với tính tan tốt hơn [15, 40]

Dolastatin 10 được phân lập lần đầu tiên vào năm 1987 bởi Pettit từ loại

sinh vật biển Dolabella auricularia và được Luesch phân lập từ vi khuẩn lam

Symploca sp năm 2001 Dolastatin 10 ức chế ức tăng sinh tế bào trong các thử

nghiệm in vivo ở các bệnh bạch cầu, u lympho [35]

Một thành viên khác trong nhóm Dolastatin là Dolastatin 15 còn được dùng

trong thử nghiệm trên mô hình in vitro với hoạt tính sinh học tương tự là ức chế

tăng sinh tế bào và ức chế sự gia tăng kích thước khối u động vật Tuy nhiên, hợp chất này có hiệu suất tổng hợp rất thấp và khả năng tan trong nước hạn chế Chính điều này đã thôi thúc các nhà khoa học tổng hợp thành công các chất có hoạt tính sinh học tương tự Dolastatin 15 với hiệu suất tổng hợp cao, tính tan ổn định, đó là: ILX-651 và LU3793 Các chất này đã được thử nghiệm lâm sàng tại pha II Nhìn chung, các hợp chất Dolastatin có cơ chế hoạt động ức chế quá trình lắp ráp vi ống khi bám vào tubulin Ngoài ra, chúng còn tham gia vào quá trình apoptosis thông qua sự can thiệp vào protein Bcl-2 [35]

Hai chất có khả năng gây độc đến tế bào được nhiều nghiên cứu đề cập đến đó là: Borophycin và Apratoxin A Borophycin là phức hợp của boron và

polyketide được phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc linckia và Nostoc

spongiaeforme Borophycin có khả năng kháng ung thư ở dòng tế bào ung thư biểu

bì và ung thư đại trực tràng ở người [17]

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

7

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Borophycin [17]

Apratoxin A là chất chuyển hóa thứ cấp được phân lập lần đầu tiên từ vi

khuẩn lam Lyngbya majuscule Apratoxin A có cấu trúc hỗn hợp

peptide-polyketide dạng vòng, gồm một vòng thiazoline Đây là chất có khả năng gây độc mạnh đối với tế bào ung thư bởi khả năng kích thích tế bào phân chia bị bắt giữ ở pha G1, gây ra quá trình apoptosis (chết theo chương trình) Mặc dù chất này có khả năng gây độc ở 60 dòng tế bào khối u nhưng các nhà nghiên cứu vẫn chưa tìm

ra cơ chế hoạt động của chúng [4]

Theo nghiên cứu của Martins và cộng sự khi cho tế bào HL-60 tiếp xúc với

dịch chiết của các chủng vi khuẩn lam Synechocytis sp và Synechococcus sp đã

có hiện tượng apoptosis xuất hiện ở tế bào thử nghiệm Cụ thể, có sự biến đổi ở phần màng tế bào, tế bào bị co rút và bắt đầu xuất hiện hiện tượng phân mảnh

nhân Bên cạnh đó, một glycoside được phân lập từ Lyngbya sp hay Anabaena sp

cũng tham gia vào quá trình thúc đẩy tế bào ung thư tham gia vào chu trình apoptosis với dấu hiệu ban đầu là ngưng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân Các sản phẩm từ dịch chiết vi khuẩn lam (Bảng 1.1) còn gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các dòng tế bào ung thư, đưa chúng vào chu trình chết tế bào thông qua các hoạt động như: bắt giữ tế bào trong chu kì tế bào, làm rối loạn chức năng ty thể, lạp thể, gây ra các hoạt động oxi hóa, thay đổi caspase để ngăn chặn không cho chúng tham gia vào các quá trình cắt nối hay thay đổi họ protein Bcl-2 và thay đổi hoạt động của các kênh vận chuyển trên màng ty thể, đây đều là những con đường trực tiếp dẫn tới apoptosis [7]

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

8

Bảng 1.1 Một số chất có khả năng kháng ung thư được phân lập từ

vi khuẩn lam [37]

STT Tên chất Từ vi khuẩn lam Dòng tế bào tác động

1 Ankaraholide A Geitlerinema sp Các dòng tế bào ung

thư: phổi H460, vú MDA-MB 435, đại trưc tràng LoVo, vòm họng KB

2 Apratoxin A-G Lyngbya majuscule

Lyngbya sp

Lyngbya sordida Lyngbya bouilloni

Ung thư máu U2OS,

cổ tử cung HeLa, phổi H460, đại trực tràng HCT116

3 Belamide A Symploca sp Ung thư đại trực tràng

7 Cryptophycin 1 Nostoc sp Ung thư vú ở người

MDA-MB-435, ung thư phổi A549

8 Curacin A Lyngbya majuscula Ung thư phổi A549

9 Symplostatin 1 Symploca hydnoides Ung thư vú ở người

MDA-MB-435

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

9

10 Malevamide D Symploca hydnoides Ung thư phổi A549,

HT29, ung thư da SKMEL-28

1.3 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam

Hợp chất tự nhiên (hay hợp chất thiên nhiên) là các chất hóa học có nguồn

từ tự nhiên hoặc được con người tách ra từ các loài động vật, thực vật có trong tự nhiên có thể có hoạt tính sinh học hoặc tác dụng dược học dùng để làm thuốc [5] Chúng là nguồn cung cấp các cấu trúc dẫn đường để tổng hợp các chất tương tự nhưng đạt hiệu quả dược lí và an toàn cao hơn, được xem là mốc khởi đầu trong quá trình tổng hợp và sản xuất thuốc

Vào năm 1891, Albrecht Kossel đề xuất chia các hợp chất tự nhiên thành hai nhóm chính, đó là: các hợp chất sơ cấp và các hợp chất thứ cấp [22] Trong đó, các hợp chất thứ cấp không thực sự cần thiết cho sự sống của bản thân sinh vật nhưng chúng gây tác động đến các sinh vật khác, làm tăng khả năng cạnh tranh của các sinh vật trong môi trường sống Do có khả năng điều chỉnh con đường truyền và sinh hóa tín hiệu, một vài chất chuyển hóa thứ cấp có tính chất dược liệu hữu ích

Các hợp chất sinh học của vi khuẩn lam cung cấp một nguồn dược liệu mới, nhiều tiềm năng Sự đa dạng và mới lạ của các chất tìm thấy trong vi khuẩn lam được so sánh với xạ khuẩn- nhóm vi khuẩn cung cấp nhiều dược phẩm quan trọng [3, 34] Các chất được tìm thấy trong vi khuẩn lam gồm nhiều nhóm chất khác nhau bao gồm: alkaloid, terpenoid, polyketide và peptide không phụ thuộc ribosome Phần lớn các sản phẩm này được sản xuất thông qua con đường sinh tổng hợp polyketide (PKS) và peptide không phụ thuộc vào ribosome (NRPS) hoặc phối hợp cả hai [24] Các nhóm chất từ vi khuẩn lam thể hiện nhiều hoạt tính sinh học khác nhau: kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virus, ức chế miễn dịch,

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

10

ức chế hoạt động của proteinase, đây đều là những mục tiêu nghiên cứu quan trọng của sinh y học

1.3.1 Nhóm các chất alkaloid

Sự phân lập và định tính alkaloid được bắt đầu từ rất sớm, vào những năm

1960 Đây là nhóm các chất có độc tính cao, chỉ với liều vài milligram đã có thể gây tử vong cho người Các alkaloid có tác dụng sinh học rất đa dạng, chủ yếu làm dược phẩm như: các thuốc ức chế thần kinh trung ương (morphin, scopolamine, L-tetrahydropalmatin), các thuốc điều trị bệnh tim (ajmalin), các thuốc điều trị bệnh cao huyết áp (reserpine, ajmalixin),…Mỗi alkaloid khác nhau có hoạt tính sinh học khác nhau, trong đó, vài chục alkaloid được sử dụng rộng rãi trong y học và trong nông nghiệp [1]

Anatoxin-a là sản phẩm được phát hiện vào những năm đầu của thập niên

1960 và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1972 bởi J P Devlin từ chủng vi

khuẩn lam Anabeana flos aquae Chúng được biết đến với cái tên “Yếu tố gây chết

nhanh” (Very Fast Death Factor), bởi chúng có khả năng gây độc nhanh và mạnh lên hệ thần kinh làm co giật và tử vong do liệt hô hấp Bằng cách liên kết với thụ thể nicotinic acetylcholine (nAchR) trên màng tế bào thần kinh, Anatoxin-a thay đổi hoạt động của các kênh vận chuyển ion qua màng làm cho các cation không thể đi qua màng, cuối cùng dẫn đến tắc nghẽn sự truyền tín hiệu xung thần kinh [10]

Cylindrospermopsin là một alkaloid tự nhiên mang độc tính được phân lập

từ các loài vi khuẩn lam: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans,

Aphanizomenon ovalisporum, Anabaena bergii và Raphidiopsis curvata Cấu trúc

hóa học của chất này được phát hiện vào năm 1992, bao gồm một trycyclic guanidine liên kết với hydroxymethyluracil Dựa trên cấu trúc nucleotide và khả năng phản ứng của guanine và nhóm sulphate của Cyclindrospermopsin, các nhà nghiên cứu chỉ ra rằng, chất này có khả năng liên kết với DNA/RNA của đối tượng thí nghiệm Cụ thể, có sự liên kết giữa chúng với DNA ở gan chuột trong

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

11

mô hình nghiên cứu in vivo, Cyclindrospermopsin gây ra sự phá vỡ DNA ở gan

đồng thời làm tăng số lượng các nucleic nhỏ ở tế bào ung thư máu lympho dòng WIL2-NS [38]

1.3.2 Nhóm các chất terpenoid

Các terpenoid có vai trò và chức năng đa dạng trong các hoạt động sinh học Chúng có thể là các hormones (gibberellins, abscisic acid), các sắc tố quang hợp (phytol, carotenoids), các chất dẫn truyền điện tử (ubiquinone, plastoquinon) hay các chất tham gia cấu trúc màng tế bào (phytosterol) Ngoài các chức năng về sinh lí, trao đổi chất và xây dựng cấu trúc, một số hợp chất terpenoid đặc biệt, chủ yếu thuộc gia đình terpenoid có mạch cacbon C10, C15, C20 còn tham gia vào quá trình “giao tiếp” và “phòng vệ” như: chất hấp dẫn côn trùng thụ phấn, hỗ trợ quá trình phát tán hạt giống, kháng sinh, tạo chất độc đối với động vật ăn cỏ

Ở vi khuẩn lam, terpenoid được tổng hợp bằng con đường methylerythritol- phosphate (MEP) Nghiên cứu của Kaneko và cộng sự cho thấy, các gen mã hóa cho mỗi enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp MEP đã được tìm thấy

trong genome của Synechocystis sp cũng như trong genome của nhiều loài vi

khuẩn lam khác [30]

Được phân lập từ vi khuẩn lam Tolypothrix nodosa, Tolypodiol là một

diterpenoid đã được nhận diện bằng NMR và phân tích khối phổ Tolypodiol thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh ở tai chuột với ED50 bằng 30µg/tai [32]

1.3.3 Nhóm các chất polyketide

Là nhóm các sản phẩm thứ cấp có sự đa dạng về cấu trúc và chức năng được phân lập từ nguồn sinh vật khác nhau: vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng Các sản phẩm phân lập có đặc tính dược lí quan trọng như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống kí sinh trùng, chống khối u với phổ hoạt động rộng, có tác dụng trên nhiều đối tượng

Ở vi khuẩn lam, polyketide được tổng hợp bởi chuỗi các phản ứng liên tục được xúc tác bởi các enzyme polyketide synthenase (PKS)- đây là nhóm lớn các

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

12

đa enzyme chứa nhóm phối hợp với vị trí hoạt động Các phản ứng diễn ra theo từng bước bằng cách hoạt hóa 2; 3; 4-cacbon khởi đầu như acetyl-CoA, propionyl, CoA, butyryl-CoA thành malonyl-, methylmalonyl- và ethylmalonyl- CoA Các gen PKS được phát hiện ở vi khuẩn lam nhờ nghiên cứu đột biến gen transposon ở

tế bào dị hình có khả năng cố định ni-tơ [11]

Coibacin A-D là một polyketide được phân lập từ một loài vi khuẩn lam

Oscillatoria sp ở biển Panama Nghiên cứu đã chứng minh, Coibacin A-D có khả

năng ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư H460 với giá trị IC50 từ 11,4-34,5µM Chúng cũng có khả năng kháng viêm dựa trên khảo nghiệm nitric oxide, trong đó, Coibacin B thể hiện khả năng kháng viêm mạnh nhất Ngoài ra, sự có mặt của Coibacin A còn làm giảm các cytokine như TNF-α và IL-6 ở tế bào chuột RAW264.7 đã được kích thích bằng lipopolysaccharide [2]

1.3.4 Nhóm các chất peptide không phụ thuộc ribosome

Là sản phẩm của hệ thống sinh tổng hợp của các enzyme nonribosomal peptides synthetase Các peptide không phụ thuộc ribosome bao gồm D- và L-amino acid, protein và axit amin, axit hydroxyl, ornithine, acid β-amin và các thành phần dị biệt khác Chúng có thể được sửa đổi bởi glycosyl hóa, N-methyl hóa, hoặc acyl hóa Ngoài sự đa dạng về cấu trúc, các peptide không phụ thuộc ribosome có phổ rộng các hoạt động sinh học, một trong số đó có nhiều hữu ích trong y học, nông nghiệp và nghiên cứu sinh học Các peptide không phụ thuộc ribosome bao gồm các kháng sinh nổi tiếng, chất ức chế miễn dịch, tác nhân kháng

u và các độc tố [25]

Microcystin là là chất chuyển hóa đầu tiên khẳng định có tồn tại con đường chuyển hóa không phụ thuộc ribosome Theo báo cáo của Chorus và Bartram,

Microcystin là sản phẩm của các vi khuẩn lam Microcytis aeruginosa, Anabaena

flos-aquae, Oscillatoria agardhii và một số loài thuộc chi Nostoc [19] Chúng đặc

biệt ức chế protein phosphatase loại 1 và 2A ở sinh vật nhân thực Eukaryote

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

13

Microcystis có thể gây tổn thương gan nghiêm trọng do sự vận chuyển tích cực của chúng vào tế bào gan và cũng là nguyên nhân gây ngộ độc cho con người [28]

1.4 Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam

Sự phát triển của kĩ thuật sắc kí đã giúp một bước tiến lớn cho quá trình phân tách các hợp chất thiên nhiên có trong vi khuẩn lam

Các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam được tồn tại trong một hỗn hợp phức tạp gồm nhiều chất với cấu tạo khác nhau Với các hợp chất quan tâm khác nhau, người ta sẽ sử dụng các phương pháp khác nhau để thu được hiệu quả tối ưu

nhất Ví dụ ở loài vi khuẩn lam Spirulina sp., các chất có khả năng chống ô-xi hóa

được phân tách bằng cách sử dụng sắc kí cột có điều chỉnh tốc độ chảy và áp suất dung môi trong khi phương pháp chưng cất được sử dụng để thu lấy các chất có khả năng kháng virus Sự phân tách các hợp chất này phụ thuộc vào các yếu tố như: tính tan trong dung môi, độ ổn định của chất, lượng chất có trong hỗn hợp [23]

Các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học khác nhau được phân tách từ

chủng vi khuẩn lam Spirulina platensis bằng phương pháp chiết lỏng cao áp (PLE-

Pressurized Liquid Extraction) Các yếu tố như: dung môi phân cực (methanol, ethanol, n- hexan, nước), nhiệt độ tách chiết, thời gian và sự phân bố mẫu bên trong tế bào tách chiết được tối ưu Bằng cách kết hợp PLE với các kĩ thuật sắc kí khác như: sắc kí bản mỏng TLC để kiểm tra độ phân tách của các băng chất, sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp với đầu dò (HPLC-DAD) để xác định chất được phân tách ở mỗi băng, các chất được phát hiện có thể là α- và β-carotene, β-cryptoxanthin,…Ngoài ra, TLC còn được dùng phối hợp với phương pháp điện di mao quản kết hợp khối phổ (EC/MS- Capillary electrophoresis - Mass spectrometry) để tăng hiệu quả tách chiết lượng chất giàu phycobiliprotein trong thời gian ngắn nhất [18]

Hàm lượng carotenoid có mặt trong loài vi khuẩn lam S platensis được xác

định bằng phương pháp chiết siêu tới hạn (SFE- Supercritical fluid extraction)

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

14

Đây là phương pháp sử dụng dung môi CO2 ở nhiệt độ và áp suất vượt qua giới hạn của chất Kết quả cho thấy, hàm lượng carotenoid thu được từ loài vi khuẩn lam này cao hơn hẳn khi sử dụng các phương pháp khác [18]

Như vậy, ngoài các phương pháp tách chiết truyền thống như: chiết rắn (SLE- Solid liquid extraction), chiết lỏng-lỏng (LLE- Liquid–liquid extraction) với nhược điểm sử dụng một lượng lớn dung môi và tốn nhiều thời gian tách chiết nhưng hiệu quả tách chiết không cao thì sự ra đời của một số phương pháp mới như: chiết lỏng cao áp, chiết chất lỏng siêu tới hạn,…để tăng hiệu quả tách chiết

lỏng-và phân đoạn các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam Ngoài ra, người ta cũng có thể dùng phối hợp các phương pháp phân tích để đem lại hiệu quả nghiên cứu tốt nhất như: sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ (LC/MS- Liquid chromatography- mass spectrometry), sắc kí khí kết hợp khối phổ GC/MS (Gas chromatography- mass spectrometry), sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp hai lần khối phổ (LC/MS-MS- Liquid chromatography- mass spectrometry/mass spectrometry) nhằm dự đoán khối lượng và cấu trúc của phân tử hợp chất quan tâm

Lịch sử nghiên cứu việc phân lập các chất tinh khiết từ vi khuẩn lam có những hướng đi thay đổi tiến bộ theo thời gian, thay vì sử dụng phương pháp vật

lí, hóa học để tìm ra nhiệt độ sôi, sự khác biệt so với các chất đã biết và xác định khối lượng phân tử cần một lượng mẫu lớn, thời gian xử lí mẫu lâu, phức tạp thì các phương pháp hiện đại được sử dụng như khối phổ, công hưởng từ hạt nhân giúp xác định chất quan tâm nhanh chóng, dễ dàng với 1 lượng mẫu nhỏ giúp quá trình phân tách chất đạt hiệu quả tối đa

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

chủng thuộc chi Nostoc (APA4, APD4, AHK7, APA5, APD3, NMA4 và TNV9)

và 2 chủng thuộc chi Calothrix (TVN12 và TVN202) Mười tám dịch chiết được

cung cấp ở dạng cao khô với hàm lượng 20mg/cao dịch chiết Các dịch chiết được thống kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

- Dòng tế bào ung thư vú MCF7 (MCF7 ATCC® HTB-22TM): được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640), có

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

370 C, 5% CO2

- Dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCT116 (HCT116 ATCC®

CCL-247TM): Được nuôi cấy trong môi trường DMEM, có bổ sung 5% FBS và 0,5% Penicillin Tế bào được nuôi ở điều kiện môi trường 370 C, 5% CO2

Cả ba dòng tế bào trên hiện đang được nhân nuôi và bảo quản tại Phòng nuôi cấy tế bào người và động vật, bộ môn Sinh học tế bào, khoa Sinh học, trường Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội

2.2 Các nội dung chính trong nghiên cứu

a Đánh giá khả năng ức chế tăng trưởng 3 tế bào ung thư bởi dịch chiết từ 9 chủng vi khuẩn lam

b Chuẩn bị dịch chiết từ vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 và phân tách các dịch

chiết có hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào ung thư và các phân đoạn dịch chiết này bằng sắc kí cột silica gel

c Đánh giá hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào ung thư bởi các phân đoạn từ

dịch chiết của chủng Nostoc sp APD4

d Xác định hợp chất quan tâm bằng phương pháp LC/MS

2.3 Các phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Đánh giá khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào

2.3.1.1 Phương pháp hoạt hóa tế bào [21]

Tế bào bảo quản trong ni-tơ lỏng -196oC được lấy ra rã đông trong bể ổn nhiệt 37oC Dung dịch được ly tâm 1500 rpm trong 5 phút để bỏ dịch nổi Sau đó,

tế bào lắng sau ly tâm được hòa trong môi trường nuôi cấy RPMI hay DMEM phù hợp với từng dòng, cho vào đĩa nuôi cấy đặt trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 Môi

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

18

trường nuôi cấy được thay mới sau 2-3 ngày nuôi cấy Tế bào được cấy chuyển khi mật độ tế bào đạt 70- 90% bề mặt nuôi cấy bằng Trysin 1x trong 5 phút ở

37oC, 5% CO2 Số lượng tế bào được xác định bằng buồng đếm Thomas

2.3.1.2 Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào bằng thử nghiệm

Sulforhodamine B

Nguyên tắc của phương pháp:

Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein Sau đó, SRB liên kết với protein tế bào sẽ được hòa tan lại tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào [39]

Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu đối chứng phản ánh hoạt tính ức chế tăng sinh đối với tế bào của chất nghiên cứu

Cách tiến hành thí nghiệm như sau:

 Chuẩn bị tế bào: Tế bào đã được nuôi cấy khỏe mạnh, không nhiễm nấm

mốc mọc khoảng 80% đĩa được thu lại bằng Trysin 1X Số lượng tế bào được xác định bằng cách sử dụng buồng đếm và sau đó được chia vào các giếng thử nghiệm với mật độ 4000 tế bào/1 giếng/180µl môi trường nuôi cấy

 Chuẩn bị thuốc thử và ủ thuốc: Các mẫu dịch chiết (hoặc phân đoạn dịch

chiết) vi khuẩn lam thử nghiệm (mẫu thử) được pha trong môi trường 0,5% MeOH với dải nồng độ thử nghiệm 400; 200; 100; 50 và 25µg/ml Đối chứng dung môi (DCDM) là môi trường nuôi cấy tương ứng với tế bào có

bổ sung 0,5% MeOH Sau đó, 20µl mẫu thử được bổ sung vào giếng thử nghiệm tương ứng, mỗi nồng độ lặp lại 4 lần Tế bào có môi trường nuôi cấy đã được bổ sung mẫu thử được ủ trong 48h ở điều kiện 37o C, 5% CO2

 Nhuộm SRB: Tế bào trong giếng được cố định bằng TCA 50%, 1h, 4oC với

thể tích 50µl/giếng đã có sẵn 200µl môi trường nuôi cấy (nồng độ cuối của

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

19

TCA trong giếng là 10%), sau đó TCA được rửa sạch và để khô Mỗi giếng thí nghiệm được thêm 100µl SRB 4%/ 1 giếng và ủ ở nhiệt độ phòng trong

10 phút Lượng SRB dư thừa được rửa 5 lần bằng acid acetic 1% và được

để khô ở nhiệt độ phòng Thuốc nhuộm SRB đã bám vào protein được hòa tan bằng 100µl dung dịch Tris-base 10mM/giếng

 Đo OD: Sử dụng máy Microplate Reader Model 680

Xử lý số liệu

 Dùng phần mềm Excel để xử lý số liệu, và phần mềm GraphPad Prism 6.1

tính chỉ số IC50 – Nồng độ mẫu thử có khả năng ức chế sự sống của 50% số

tế bào

 Chỉ số IC50 của một mẫu với một dòng tế bào được tính từ phương trình

hồi quy biểu diễn tương quan giữa x là nồng độ hoặc log nồng độ chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A (%) của dòng tế bào đó khi được ủ với mẫu thử ở các nồng độ khác nhau, khi y = 50 (%)

 A (%) được tính theo công thức:

A(%) = V/Vh x 100%

Trong đó:

V: Chỉ số OD đo được ở trong giếng thí nghiệm

Vh: Chỉ số OD đo được ở trong giếng đối chứng dung môi

2.3.2 Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp APD4

Đối với mỗi lần tách chiết, 3g sinh khối khô của chủng Nostoc sp APD4

được làm ướt bằng 10ml dung môi EtOAc trong vào cối sứ Hỗn hợp được nghiền cho đồng nhất rồi bổ sung 90ml dung môi EtOAc, sau đó được siêu âm trong 5-7 phút và khuấy từ trong 1h ở nhiệt độ phòng Tiếp đến, hỗn hợp được ly tâm để thu dịch nổi, phần cặn được chiết lặp lại với 100ml EtOAc Sau hai lần tách chiết, phần dịch nổi được gộp chung lại với nhau, phần cặn để khô và tiếp tục chiết với 2 lần với dung môi Methanol (100ml) bằng cách lặp lại các bước như đã thực hiện với dung môi EtOAc

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

20

2.3.3 Phương pháp sắc kí cột silica gel

Phương pháp sắc kí cột silica gel thường được dùng để phân tách và tinh sạch các hợp chất có độ phân cực khác nhau Cột sắc kí được sử dụng có kích thước 50x4cm với các hệ dung môi như sau:

Mỗi hệ dung môi có thể tích 100ml

Các bước tiến hành chính:

 Nhồi cột sắc kí: 30g silica gel sử dụng cho 1 cột chạy được ngâm trong hệ

dung môi 50% n-hex: 50% EtOAc trong thời gian 30 phút Sau đó, silica gel được cho lên cột thủy tinh và để ổn định trong 1 giờ

 Tra mẫu: Dịch chiết vi khuẩn lam trong 5ml MeOH được trộn với 1g silica

gel, để khô hoàn toàn và được cho lên phía trên nền silica gel

 Chạy cột và thu phân đoạn: Hệ dung môi như trên được lần lượt cho vào

cột từ hệ 1 đến hệ 6 với tốc độ dòng rửa giải là 0.8ml/phút Dịch rửa giải được thu vào các ống nghiệm thủy tinh

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

21

Sau khi đã tra mẫu lên bản TLC, mẫu được để trong tủ hút để bay hết dung môi Sau đó bản TLC được đặt vào lọ thủy tinh có chứa 10ml hệ dung môi chứa 10% MeOH: 90% EtOAc Khi dung môi di chuyển đến vạch đích thì tấm TLC được lấy ra khỏi lọ thủy tinh (dừng quá trình chạy sắc ký) và được để khô trong tủ hút cho bay hết dung môi Các băng chất trên sắc ký đồ của TLC được quan sát ở bước sóng 254nm, 365nm và ánh sáng tự nhiên

2.3.5 Phương pháp LC/MS

Nguyên tắc:

LC-MS là hệ thống có khả năng phân tách hỗn hợp chất bằng hệ thống sắc

kí lỏng (LC) kết hợp định lượng của khối phổ MS Các chất được phân tích sẽ được ion hóa bằng nhiều kĩ thuật khác nhau Trong chân không, các ion này được phát sinh và phân loại dựa trên cơ sở tỷ lệ khối lượng trên điện tích mỗi ion (m/z)

và sau đó tiến hành đo cường độ của chúng Số khối thu được trực tiếp từ khối phổ

là thông tin đặc trưng cho từng phân tử [20]

Cách tiến hành:

1mg phân đoạn dịch chiết được hòa trong 1ml dung môi MeOH Cột sắc kí được sử dụng là C18-RP (4,6x150mm), kích thước hạt 5µm Dung môi sử dụng là gradient của MeOH từ 20%-100% trong nước khử ion Thời gian chạy là 30phút/mẫu với thể tích bơm mẫu là 5µl Sau đó, các mẫu được phân mảnh và được ion hóa bằng nguồn ESI dưới áp suất Nibunizer 30Psi, nhiệt độ ion hóa 325ºC và lưu lượng khí 8L/phút

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

22

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư

3.1.1 Kết quả hoạt hóa tế bào

Dòng tế bào ung thư vú MCF7 nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640, sau 24h hoạt hóa, tế bào có dạng sao, chiếm tỷ lệ 70-80% bề mặt đĩa nuôi cấy Dòng tế bào HCT116 và HepG2 được nuôi cấy trong môi trường DMEM, tế bào HCT116 có dạng dài, chiếm 70-80% bề mặt đĩa nuôi cấy; tế bào HepG2 có xu hướng co cụm, các tế bào liên kết chặt với nhau Cả ba dòng đều có các tế bào khỏe mạnh, sinh trưởng tốt, bám chặt vào bề mặt đĩa nuôi cấy, môi trường nuôi cấy sạch, không vẩn đục, bề mặt đĩa không nhiễm nấm mốc

3.1.2 Xác định chỉ số IC 50 của các dịch chiết từ vi khuẩn lam

Sử dụng 3 dòng tế bào ung thư phổ biến với tỷ lệ bệnh mắc phải ngày càng tăng ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế sự tăng

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

23

sinh tế bào dưới tác dụng của 18 dịch chiết vi khuẩn lam nhằm mục đích sàng lọc các chủng vi khuẩn lam có khả năng sản sinh các hợp chất kháng ung thư với dải nồng độ thử nghiệm: 400; 200; 100; 50 và 25µg/ml

Các dịch chiết khô được hòa tan trong môi trường có chứa 0,5% MeOH, đây là nồng độ trong giới hạn 0,1-1%, đây là giới hạn không có khả năng gây độc cho tế bào đã được đề cập bởi tác giả Elliott và cộng sự [12] Bên cạnh đó, để chứng minh đây là dải nồng độ an toàn, chúng tôi tiến hành so sánh giữa mẫu đối chứng sinh học và mẫu đối chứng dung môi Kết quả cho thấy không có sự khác biệt giữa hai mẫu này về hình dạng, kích thước và mật độ tế bào Tế bào ở mẫu đối chứng dung môi dạng sao, bám khỏe vào bề mặt nuôi cấy, khả năng phân chia tốt Như vậy, nồng độ 0,5% MeOH là nồng độ an toàn với tế bào và được sử dụng cho các phép thử tiếp theo Việc sử dụng dung môi này cũng giúp chúng tôi hạn chế được tương đối sự tạp nhiễm của các chủng vi sinh vật vào mẫu thử nghiệm

Hình 3.2 Tế bào MCF7 ở mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm Đối chứng sinh học (A) và đối chứng dung môi 0,5% MeOH (B) Sau 48h ủ mẫu, dưới ảnh hưởng của mẫu thử có hoạt tính, tế bào bị ức chế khả năng sinh trưởng, phân chia và có thể chết; thể hiện ở việc tế bào không còn dạng dài hoặc sao, bám trên bề mặt đĩa mà co tròn và mất đi khả năng bám dính Điều này được quan sát thấy ở hai dòng tế bào MCF7 và HCT116 Trong đó, MCF7 bị ức chế tăng sinh dưới tác dụng của dịch chiết từ ba chủng vi khuẩn lam: APA4, APD4, APA5 Tương tự, dịch chiết từ ba chủng vi khuẩn lam có tác dụng