Nghiên cứu tính đa hình thái đơn của gen ALDH2 trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát

Ngoài nguy cơhay gặp gây UTGNP là nhiễm virut viêm gan B, C… thì yếu tố di truyền liên quan đến gen, trong đó có ALDH2 và tình trạng sử dụng rượu kéo dài của bệnh nhân là nguy cơ quan t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN ĐỨC TRANH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN

CỦA GEN ALDH2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN

NGUYÊN PHÁT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

TRẦN ĐỨC TRANH

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN

CỦA GEN ALDH2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ GAN

Hà Nội - 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả trong khóa luận này được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein,Trường Đại học Y Hà Nội chưa được đăng tải trên bất

cứ một tạp chí hay một công trình khoa học nào khác Các bài trích dẫn đều là những tài liệu đã được công nhận

Hà Nội, ngày 29 tháng 12năm 2016

Học viên

Trần Đức Tranh

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến

PGS TSHoàng Thị Mỹ Nhung và TS Trần Huy Thịnh - người thầy đã tận tình

chỉ bảo, hướng dẫn và bổ sung các kiến thức cần thiết cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS Tạ Thành Văn - Giám đốc trung

tâm Gen và Protein, Trưởng bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội và

PGS.TS Trần Vân Khánh - Phó giám đốc trung tâm Gen và Protein trường Đại

học Y Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô, các anh, các chị và các bạn học viên đã tạo điều kiện và hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập kỹ thuật, hoàn thiện quy trình kỹ thuật và phân tích kết quả tại Trung tâm

Xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Sinh học Tế bào, các thầy cô trong khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, tạo điều kiện và củng cố thêm rất nhiều kiến thức cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Đồng thời cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn

bè đã ủng hộ và động viên tôi trong suốt quãng thời gian vừa qua

Hà Nội, ngày29 tháng 12 năm 2016 Học viên cao học khóa

Trần Đức Tranh

iii

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về ung thư gan nguyên phát 3

1.1.1 Tỷ lệ mắc UTGNP trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ 4

1.1.3 Lâm sàng và cận lâm sàng của UTGNP 6

1.1.4 Điều trị và tiên lượng UTGNP 7

1.2 Hệ thống enzym ADH và ALDH và chuyển hóa rượu tại gan 7

1.2.1 Hệ thống enzym ADH và ALDH 7

1.2.2 Chuyển hóa rượu tại gan 11

1.2.3 Chuyển hóa rượu và ung thư gan 12

1.3 Sơ lược về gen ALDH2 16

1.3.1 Vị trí và liên quan 16

1.3.2 Chức năng của gen ALDH2 16

1.3.3 Tính đa hình của gen ALDH 17

1.3.4 Gen ALDH2 và bệnh ung thư 19

1.4 Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2 20

1.4.1 Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP) 20

1.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 28

2.3.2 Cỡ mẫu 28

2.3.3 Cách thức tiến hành 29

iv

2.3.4 Trang thiết bị và hóa chất 31

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

2.5 Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Đặc điểm của nhóm nghiên cứu 35

3.1.1 Đặc điểm về tuổi 35

3.1.2 Đặc điểm về giới 36

3.2 Tỷ lệ kiểu gen và alen ALDH2 trong nhóm nghiên cứu 38

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA 38

3.2.2 Kết quả khuếch đại vùng gen ALDH2 chứa SNP tại codon 487 40 3.2.3 Kết quả kiểu gen và alen ALDH2 41

3.3 Mối liên quan gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ khác 47

3.3.1 Gen ALDH2 và độ tuổi phát hiện bệnh UTGNP của các kiểu gen 47

3.3.2 Mối liên quan của gen ALDH2 với giới tính trong nhóm ung thư gan nguyên phát 48

3.3.3 Mối liên quan của gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu 49

3.3.4 Mối liên quan của gen ALDH2 vớí nhiễm virut HBV 50

KẾT LUẬN 52

KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình của enzym ADH 8

Hình 1.2 Chuyển hóa rượu ở gan và vai trò hình thành ung thư gan 15

Hình 1.3 Vị trí của gen ALDH2 16

Hình 1.4 Sơ đồ quá trình chuyển hóa ethanol tại gan 18

Hình 1.5 Minh họa hiện tượng đa hình đơn gen (SNP) 22

Hình 1.6 Nguyên lý kỹ thuật PCR 23

Hình 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 39

Hình 3.2 Hình ảnh minh hoạ điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng SNP gen ALDH2 của nhóm bệnh trên agarose 1,5% .40

Hình 3.3 Hình ảnh minh hoạ điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng SNP gen ALDH2 của nhóm chứng trên agarose 1,5% 41

Hình 3.4 Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 bằng enzym MboII trên mẫu đối chứng 42

Hình 3.5 Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 bằng enzym MboII trên mẫu của bệnh nhân UTGNP 43

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các isoenzym ADH ở người 9

Bảng 1.2 Vị trí cắt của một số enzym giới hạn 24

Bảng 3.1 Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu 35

Bảng 3.2 Đặc điểm giới của nhóm nghiên cứu 36

Bảng 3.3 So sánh giới của bệnh nhân UTGNP với các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam 37

Bảng 3.4 Đặc điểm mắc viêm gan B và uống rượu của nhóm UTGNP 37

Bảng 3.5 Một số kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA 39

Bảng 3.6 Tỷ lệ kiểu gen ALDH2 và alen của 2 nhóm 44

Bảng 3.7 Tỷ lệ kiểu gen, alen ALDH2 của 2 nhóm và nguy cơ mắc UTGNP 45 Bảng 3.8 Tỷ lệ kiểu gen ALDH2 kết hợp của 2 nhóm và nguy cơ mắc UTGNP 46

Bảng 3.9 Trung vịtuổi phát hiện bệnh của các kiểu gen ALDH2 47

Bảng 3.10 Gen ALDH2 và giới trong nhóm bệnh 48

Bảng 3.11 Gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu 49

Bảng 3.12 Gen ALDH2 với tình trạng nhiễm virus viêm gan B 50

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADH : Alcohol Dehydrogenase

ADH1A, ADH1B, ADH1C: Alcohol Dehydrogenase 1A,1B, 1C

ALDH : Aldehyde Dehydrogenase

bp : base pair (cặp ba-zơ)

CI : Confidence Interval (Độ tin cậy)

Nu : Nucleotide (hoặc Deoxyribonucleotide)

(Phản ứng khuyếch đại gene)

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

(Hiệntượng đa hình chiều dài của các đoạn DNA cắt bằng enzyme giới hạn)

ROS : Radioactive Oxygen Species (gốc tự doôxy hóa)

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

(Hiện tượng đa hình đơn Nucleotide)

UTBMTBG : Ung thư biểu mô tế bào gan

UTGNP : Ung thư gan nguyên phát

viii

Bảng viết tắt các acid amin:

Glu Glutamic acid Phe Phenylalanine

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nghiện rượu là một trong những nguy cơ gây ung thư gan cao Khi rượu vào

cơ thể, ethanol sẽ được chuyển hóa và tạo thành acetaldehyde, đây là chất gây độc

và làm hủy hoại tế bào gan Acetaldehyde còn là chất gây ung thư do gắn với DNA tạo sản phẩm DNA “adduct” làm cho khối u phát triển [61], [38], [65], [29], [16]

Sự chuyển hoá ethanol tại gan được xúc tác bởi enzym alcohol dehydrogenase (ADH) Tiếp đó, acetaldehyde đi vào ty thể, được oxy hoá thành acetat bởi một trong những enzym aldehyde dehydrogenase (ALDH) ALDH có tác dụng oxy hóa hơn 90% acetaldehyde được tạo ra từ phản ứng chuyển hóa đầu tiên của ethanol [25], [5], [71], [24], [22]

ALDH gồm nhiều isoenzym trong đó có 2 lớp chính là ALDH1, enzyme tìm

thấy trong bào tương tế bào và được mã hoá bởi gen ALDH1A1, và ALDH2, enzyme tìm thấy trong ty thể, được mã hoá bởi gen ALDH2 Gen ALDH2 là loại gen

đa hình được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn nucleotide gen mã hóa cho enzym ALDH2 liên quan đến nhiều loại hình ung thư [66]

Ung thư gan nguyên phát (UTGNP) là khối u sinh ra từ tế bào biểu mô gan

và tổ chức liên kết, đại đa số xuất phát từ biểu mô gan ( >90%) Hiện nay, ung thư gan là bệnh đứng hàng thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 3 trong các loại ung thưtrên thế giới, ước tính khoảng 500.000 đến 1.000.000 ca mắc mới trong một năm [39] Phẫu thuật khối u, tiêm cồn hoặc tiêm hóa chất là phương pháp điều trị thông dụng hiện nay cho các bệnh nhân nhằm kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tuy nhiên chẩn đoán bệnh thường muộn, nên việc điểu trị ít hiệu quả Do vậy, xác định và kiểm soát yếu tố nguy cơ để có những biện pháp cảnh báo, chẩn đoán sớm và phòng ngừa bệnh là yếu tố then chốt góp phần không nhỏ vào chiến lược ngăn ngừa và phòng chống ung thư gan [5], [10] Ngoài nguy cơhay gặp gây UTGNP là nhiễm virut viêm gan B, C… thì yếu tố di truyền liên quan đến gen,

trong đó có ALDH2 và tình trạng sử dụng rượu kéo dài của bệnh nhân là nguy cơ

quan trọng rất cần được đi sâu tìm hiểu và nghiên cứu

2

Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát thuộc nhóm cao nhất thế giới, tình trạng lạm dụng rượu rất cao và khó kiểm soát [5], [4] Hiện nay, các nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình thái gen mã hóa cho enzym ALDH2 với UTGNP chưa được nghiên cứu tìm hiểu một cách đồng bộ và bài bản Chính vì vậy,

đề tài “Nghiên cứu tính đa hình đơn của gen ALDH2 trên bệnh nhân ung thư

gan nguyên phát”được thực hiện với mục tiêu cụ thể như sau:

1 Xác định tỷ lệ kiểu gen và alen của gen ALDH2 trên bệnh nhân ung thư gan nguyên phát

2 Khảo sát mối liên quan giữa gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ hay gặp trênbệnh nhân ung gan nguyên phát

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về ung thư gan nguyên phát

1.1.1 Tình hình mắc UTGNP trên thế giới và Việt Nam

Ung thư gan nguyên phát là loại ung thư phát sinh từ các tế bào trong gan và thường là chính từ tế bào gan UTGNP là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến nhất trên thế giới, bệnh thường phát hiện muộn, tiên lượng rất xấu, tỷ lệ tử vong cao, thời gian sống của người bệnh kể từ thời điểm phát hiện bệnh ngắn Theo công

bố Globocan năm 2012, trên toàn thế giới có tới 782.000 bệnh nhân mới được chẩn đoán và 746.000 người tử vong do loại ung thư này Khi xét riêng theo giới, UTGNP là loại ung thư đứng hàng thứ 5 ở nam giới và đứng hàng thứ 9 ở nữ giới

vè tỷ lệ mắc, trong đó đại đa số là ung thư biểu mô tế bào gan [39]

Tuy nhiên tỷ lệ mắc UTGNP khác nhau tùy theo từng khu vực địa lý trên thế giới Vùng có tỷ lệ mắc bệnh cao tức là từ 30 trường hợp/100.000 dân/1 năm trở lên gồm khu vực Đông Á đặc biệt là Trung Quốc, Đông Nam Á và châu Phi (trừ Bắc Phi) Vùng có tỷ lệ mắc bệnh trung bình là từ 3-30 trường hợp/100000 dân/1 năm như khu vực Nam Âu, Bắc Phi, Ấn Độ, Nhật Bản.Vùng có tỷ lệ mắc bệnh thấp là <3/ trường hợp/100000 dân/1 năm bao gồm khu vực Bắc Âu, Australia, Anh quốc [39]

UTGNP có tỷ lệ mắc ở các tuổi khác nhau thì rất khác nhau và thường được phát hiện thấy ở lứa tuổi từ 50-60 Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy tuổi trung bình ở các nước Đông Nam Á và Châu Phi thường thấp hơn các nước khác, vàtuổi phát bệnh sớm có thể ởđộ tuổi 20 [39]

Nếu xét về sự tương quan với giới tính thì ở tất cả các thống kê, nam giới bị ung thư gan nhiều hơn nữ giới và thường gấp từ 2 đến 6lần Tỷ lệ này tăng cao hơn

ở các nước có tỷ lệ mắc bệnh cao Ở Hoa Kỳ, tỷ lệ nam/nữ khoảng3/1,4 trong khi ở các nước châu Á tỷ lệ này là 4/1,1 [62] Nguyên nhân nam giới mắc bệnh nhiều hơn

nữ giới chưa được hiểu biết đầy đủ, nhưng cũng có thể giải thích nam giới tiếp xúc nhiều yếutố nguy cơ hơn như nghiện rượu và viêm gan [39] Tại Việt Nam tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát ở nam và nữ trong nghiên cứu của Trần Văn Huy năm

2003 là 4,56/1 [3]

4

Tại Việt nam, theo một số nghiên cứu thì UTGNP đứng hàng thứ 3 ở nam giới và đứng hàng thứ 6 ở nữ giới trong các loại ung thư Ở bệnh viện Trung ương Huế, tác giả Trần Văn Huy (2003) đã nghiên cứu thấy UTGNP là loại ung thư phổ biến trong các loại ung thư tiêu hóa và chỉ đứng sau ung thư dạ dàyvớisố lượng bệnh nhân tăng nhanh trong vòng 10 năm tại thời điểm tác giả nghiên cứu[3] Ở các tỉnh miền Nam, UTGNP chiếm hàng đầu trong các loại ung thư ở nam giới Như vậy, Việt Nam là nước nằm trong khu vực có tỷ lệ mắc bệnh cao, UTGNP là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở Việt Nam cho cả hai giới nam và nữ [39]

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ của UTGNP

- Viêm gan virus B

Đây là yếu tố được công nhận là yếu tố nguy cơ hàng đầu của UTGNP, trên thế giới ước tính có khoảng 360 triệu người bị nhiễm viêm gan B và khoảng 1/4 trong số

đó bị UTGNP Tại Việt Nam tỷ lệ mắc viêm gan B cao, theo tác giả Nguyễn Cường Thịnh công bố năm 2009, tỷ lệ viêm gan B trong nhóm UTGNP chiếm tới 70% [6]

- Viêm gan virus C

Viêm gan C là yếu tố thứ 2 sau viêm gan B Trên thế giới khoảng 170 triệu người HCV, mỗi năm tăng 3-4 triệu người mắc mới Người ta ước tính khoảng2-4% của những người nhiễm HCV mạn tính sẽ phát sinh ung thư gan Tại Việt Nam hiện

tỷ lệ mắc HCV mạn tính không cao chỉ khoảng 1-1.8% Sự đồng nhiễm HBV và HCV có thể làm tăng tỷ lệ mắc ung thư gan [5]

- Rượu

Rượu là yếu tố nguy cơ quan trọng trong UTGNP Tuy rượu không có tác dụng gây ung thư trực tiếp nhưng vai trò độc hại của việc sử dụng rượu kéo dài nhiều năm đã được chứng minh là có liên quan chặt chẽ đến nhiều loại hình ung thư [35] Uống rượu kéo dài nhiều năm sẽ gây nguy cơ xơ gan và là cơ sở chắc chắn gây UTGNP, thực tế phần lớn UTGNP phát triển trên nền gan xơ Ở California, một nghiên cứu trên những người nghiện rượu cho thấy nguy cơ UTGNP tăng lên gấp 4 lần ở người uống rượu nhiều >80g/ngày [17] Ở nghiên cứu khác trên bệnh xơ gan cho thấy nguy cơ UTGNP cao gấp 13 lần ở những người uống rượu nhiều so với

5

những người không uống rượu [53] Ngoài số lượng rượu uống, thì thói quen uống rượu cũng gây tăng tỷ lệ bệnh gan do rượu Người ta nhận thấy cùng lượng rượu nếu tỷ lệ sử dụng rượu vang cao thì nguy cơ mắc bệnh gan thấp hơn uống rượu bia bình thường

Mặc dù ung thư gan nguyên phát gặp ở nam giới nhiều hơn nữ giới nhưng những trường hợp phụ nữ cùng uống lượng rượu như nam giới có nguy cơ mắc bệnh về gan lại cao hơn nam giới Một số tác giả cho rằng enzym ADH ở dạ dày ở

nữ thấp hơn nam giới, nhưng điều này còn chưa có bằng chứng thuyết phục và còn được các nhà nghiên cứu đang tìm hiểu thêm Hiện nay, các giả thuyết nghiêng về estrogen làm tăng nhạy cảm với nội độc tố từ ruột và gây bệnh gan Bởi vậy ngưỡng nguy hiểm ở nam giới thường được xem là khoàng 40g/ngày còn ở phụ nữ chỉ là 20g/ngày [5], [4] Ngoài ra, nghiên cứu ở Mỹ cho thấy những người nguồn gốc Tây Ban Nha có nguy cơ mắc bệnh gan do rượu cao hơn người Mỹ da đen và da trắng Các bệnh lý phối hợp: viêm gan B, C,tình trạng rối loạn chuyển hóa, béo phì, đái tháo đường… làm tăng cảm thụ với tổn thương gan do rượu do đó làm hạ ngưỡng nguy

cơ của rượu [34], [49]

- Aflatoxin (AF)

Là một mycotoxin được tiết ra từ chủng nấm mốc Aspergillus flavus,

thường được mọc trên lạc và các hạt ngũ cốc ẩm ướt Độc tố từ loại nấm này làm thương tổn và thay đổi cấu trúc DNA của nhiều gen khác nhau trong đó có gen p53 làm mất kiểm soát chu kỳ phân chia tế bào dẫn đến sự hình thành và phát

Triệu chứng thực thể: Gan to, tràn dịch màng bụng, có thể gặp tràn máu màng bụng, lách to, tuần hoàn bàng hệ (do tăng áp lực tĩnh mạch cửa) [13], [48], [52]

- Triệu chứng cận lâm sàng

 Xét nghiệm huyết học: Thiếu máu, tăng hoặc giảm bạch cầu

 Xét nghiệm hóa sinh:

Albumin giảm, bilirubin tăng, GOT, GPT, LDH, ALP tăng

Alpha-Fetoprotein huyết thanh:

AFP huyết thanh là một dấu ấn ung thư hữu ích giúp chẩn đoán UTGNP Hàm lượng AFP huyết thanh có liên quan chặt chẽ đến độ biệt hóa của tế bào ung thư và kích thước khối u Đối với bệnh nhân UTGNP có khối u <2 cm có biệt hóa tế bào cao thì có hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc trung bình Như vậy, vẫn còn tỷ lệ ung thư gan (khối u nhỏ) thì hàm lượng AFP huyết thanh thấp hoặc không tăng, làm hạn chế khả năng chẩn đoán sớm ung thư gan [13], [48], [52]

 Siêu âm

Siêu âm 2D: Hình ảnh một khối u giai đoạn sớm <3 cm, giai đoạn muộn có thể

10 cm, cấu trúc âm khối đặc tăng âm hoặc giảm âm (thể 1ổ), hoặc thấy nhiều khối đặc nằm rải rác phân thùy gan phải, trái (thể nhiều ổ) Trong thể lan tỏa không có hình khốithấy vùng tăng âm và giảm âm xen kẽ, giới hạn không rõ [48], [52], [26] Siêu âm Doppler: giúp nghiên cứu sự phân bố mạch trong u, khoảng 75% UTGNP thấy hình tăng mạch máu trong khối u [48], [26]

Ngoài ra, sử dụng các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh khác như chụp cắt lớp vi tính (CTscanner), chụp cộng hưởng từ (MRI)… được sử dụng để giúp xác định kích thước và vị trí khối u, và tình trạng di căn của tổ chức ung thư

1.1.4 Điều trị và tiên lượng UTGNP

1.1.4.1.Điều trị

Tùy theo giai đoạn của ung thư lựa chọn các phương pháp điều trị [26], [52]

- Giai đoạn rất sớm: Phẫu thuật khối u, cắt thùy gan

- Giai đoạn sớm: Phá hủy khối u bằng tiêm ethanol qua da dưới hướng dẫn siêu âm hoặc sóng cao tần

- Giai đoạn phát triển: Nút mạch bằng hóa chất

- Giai đoạn muộn: Liệu pháp điều trị đích

- Giai đoạn cuối: Chống đau và điều trị triệu chứng

Các phương pháp điều trị [5], [26], [52]

1.1.4.2.Tiên lượng

Bệnh nhân UTGNP tiên lượng rất xấu, thường chẩn đoán giai đoạn muộn khi khối u đã xâm lấn di căn nhiều nơi Thời gian sống trung bình bệnh nhân từ khi chẩn đoán thường là 6 tháng đến 12 tháng Tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ là < 5% ở các bệnh nhân UTGNP [4], [52]

1.2 Hệ thống enzym ADH và ALDH trong mối liên quan đến chuyển hóa rƣợu

tại gan

1.2.1 Hệ thống enzym ADH và ALDH

Enzym ADH (alcohol dehydrogenase)có chức năngtham gia xúc tác cho phản ứng oxy hóa ethanol thành acetaldehyde với sự thamgia của coenzym NADH Enzym ADH có cấu tạo dạng protein dimer có trọng lượng 40.000 dalton, cấu tạo trung tâm hoạt động gồm nguyên tử Zn gắn với acid amin Cystein và Histidin và vị trí gắn cofactorNAD+ và alcohol (hình 1.1)

8

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc không gian của enzym Alcohol dehydrogenase

ADH là enzym có nhiều biến thể khác nhau (gọi là isozyme) Dựa vào trình tự của acid amin và hoạt độ của enzym mà ADH được chia thành 5 nhóm (bảng 1.1), ADH nhóm I chuyển hóa phần lớn rượu trong cơ thể Các isozyme này là phân tử dimeric được tạo bởi các tiểu đơn vị α, β, γ(αα, αβ, γγ…) Các gen mã hóa cho các

enzym ADH này nằm trên nhiễm sắc thể số 4, trong đó có ba gen ADH1A, ADH1B, ADH1C mã hóa cho enzym nhóm I, trong đó ADH1B và ADH1C là gen đa hình

thái, và đặc trưng cho từng chủng tộc [41]

Hầu hết các mô trong cơ thể đều có enzym ADH ADH lớp I chủ yếu có ở gan ADH1A xuất hiện trong những ngày đầu của bào thai, và hoạt tính enzym này kém trong thời kỳ thai nghén và thời kỳ trưởng thành, trong khi đó ADH1B và ADH1C có tổng hoạt enzym tính mạnh nhất trong nhóm ADH4 liên quan ít đến oxy hóa ethanol, có nhiều ở gan, nhưng nồng độ thấp ở dạ dày, tụy và ruột non ADH5 có mặt mọi mô trong cơ thể, nhưng oxy hóa ethanol kém ADH6có ở gan, dạ dày, chức năng chuyển hóa ethanol hiện nay vẫn chưa biết rõ ADH7 có nhiều ở dạ dày và đường tiêu hóa trên, tham gia chuyển hóa ethanol [25], [24], [71]

Mô Mới Cổ điển

I

ADH1B*1 ADH2*1 β1 Arg48, Arg370

Gan, Phổi

ADH1B*2 ADH2*2 β2 His48, Arg370

ADH1B*3 ADH2*3 β3 Arg48, Cys370

ADH1C*1 ADH3*1 γ1 Arg272, Ile350

Gan, Dạ dày

ADH1C*2 ADH3*2 γ2 Gln272,Val350

III ADH5 ADH5 Χ Mọi mô

IV ADH7 ADH7 σ(µ) Dạ dày

V ADH6 ADH6 Gan, Dạ dày

1.2.1.1 Đặc điểm của hệ enzyme Aldehyde Dehydrogenase (ALDH)

Ở người, có ít nhất 4 lớp ALDH isozyme đã được phát hiện là có tác dụng xúc tác phản ứng chuyển acetaldehyde thành acetate, làm loại bỏ chất độc aldehyde ảnh hưởng đến cơ thể ALDH có tác dụng oxy hóa hơn 90% acetaldehyde được tạo ra từ phản ứng chuyển hóa đầu tiên của ethanol [25], [24], [71]

Các isoenzym của ALDH có 2 lớp chính là ALDH1, enzyme tìm thấy trong

bào tương tế bào và được mã hoá bởi gen ALDH1A1, và ALDH2, enzyme tìm thấy trong ty thể, được mã hoá bởi gen ALDH2 Gen ALDH1A1có kích thước khoảng 52kb nằm trên nhiễm sắc thể số 9 còn gen ALDH2 có kích thước khoảng 43 kb nằm

trên nhiễm sắc thể số 12 Cả hai gen đều có cấu trúc tương tự nhau bao gồm 13 exon Thêm vào đó, các protein tương ứng của 2 gen này có trình tự giống nhau tới

70% và cấu trúc không gian cũng tương tự nhau [64] Có lẽ, gen ALDH2 được mã

10

hóa bởi gen đa hình thái được nghiên cứu nhiều và biết rõ hơn cả Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng hiện tượng đa hình đơn mã hóa cho enzym ALDH2 liên quan đến nhiều loại hình ung thư [70], [69], [14], [19]

ALDH2*2 là do sự thay thế glutamate bằng lysine ở vị trí acid amin 504 Hậu

quả dẫn đến sự tạo thành enzyme ALDH2 gần như mất hoạt tính oxy hoá

acetaldehyde thành acetate Các nghiên cứu dịch chiết gan cho thấy alen ALDH2*2 trội so với alen ALDH2*1 (những người mang một alen ALDH2*2và một alen ALDH2*1, dạng dị hợp tử) cũng không phát hiện thấy hoạt tính của enzyme ALDH

[23] Các nghiên cứu tạo dòng các alen này trên tế bào nuôi cấy cũng thu được kết quả tương tự [55]

Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều

Tiên Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi [32], [64], [67]

Những người mang alen ALDH2*2 lượng acetaldehyde trong máu tăng từ mức

gần như không phát hiện được tới mức cao và gây nên các phản ứng bao gồm nôn nặng, buồn nôn, nhịp tim nhanh và các phản ứng như khi dùng các thuốc điều trị nghiện rượu Một số nghiên cứu đã cho thấy tác dụng bảo vệ chống tình trạng phụ

thuộc rượu khi có mặt alen ALDH2*2[15], [64]

Nghiên cứu tiến hành so sánh 2 nhóm nam giới Trung Quốc, một nhóm mang

2 alen hoạt động ALDH2*1 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1 , một nhóm mang 1 alen bất hoạt ALDH2*2 và 2 bản sao bình thường của alen ADH1B*1

Kết quả cho thấy OR của người nghiện rượu giữa 2 nhóm là 0,33 Nếu có thêm alen

ALDH2*2, người đó mang ít nhất 1 alen tăng hoạt động ADH1B*2, thì OR còn

giảm xuống 0,05

Ở người đồng hợp tử ALDH2*2, tác động của lượng nhỏ rượu cũng rất nặng nề

Điều này càng chứng tỏ enzyme ALDH2 ty thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình đào thải acetaldehyde ra khỏi cơ thể và giữ nồng độ acetaldehyde cực thấp

Tương tự như bất kỳ tác động của gen nào đối với nguy cơ bệnh tật của con

người thì tác dụng bảo vệ của alen ALDH2*2còn chịu sự chi phối của môi trường

Điều này được minh chứng bởi nghiên cứu của Higuchi và cộng sự (1994) Nghiên

11

cứu này được tiến hành từ năm 1979 đến năm 1992 Trong nhóm những người

nghiện rượu Nhật Bản, tỷ lệ người mang alen ALDH2*2 tăng từ 2,5% lên 13% Qua

đó cho thấy, tác dụng bảo vệ chống nghiện rượu của alen ALDH2*2 giảm dần qua thời

gian Trong trường hợp này, nguyên nhân là do sự gia tăng sử dụng rượu ở Nhật

Enzym ALDH1 cũng tham gia đào thải acetaldehyde, giúp kiểm soát nồng độ

acetaldehyde ở những người mang alen ALDH2*2 Trong một số nghiên cứu, người

ta đã nhận thấy một số tính đa hình của vùng điều hoà gen ALDH1A1ảnh hưởng tới

sự biểu hiện của gen này [42]

Mặc dù vậy, tỷ lệ của các alen này thấp và tác động tới nguy cơ nghiện rượu còn chưa sáng tỏ Một nghiên cứu cho thấy người Tây Nam California mang alen

ALDH1A1*2 có tỷ lệ phụ thuộc rượu thấp và làm giảm lượng rượu uống trong 24

giờ [17]

Ngược lại, trong cộng đồng người Úc, enzyme ALDH1 có hoạt tính không

có mối liên quan với tình trạng nghiện rượu hay phản ứng với rượu [51]

Sự khác biệt trong kết quả nghiên cứu này có thể là do thực tế là các gen điều hoà hoạt động không giống nhau trong các loại tế bào Và có thể lượng enzym có hoạt tính trong máu không phản ảnh được lượng enzym trong tế bào gan

1.2.2 Chuyển hóa rượu tại gan

Khi rượu vào cơ thể, 2-8% đào thải qua mồ hôi, nước tiểu và hơi thở, 92-98% được chuyển hóa trong cơ thể Trong số đó, một lượng nhỏ rượu sẽ được chuyển hóa tại dạ dày và 92-95% từ đường tiêu hóa vào máu tới gan và được chuyển hóa tại

gan Quá trình chuyển hóa tại gan có 2 con đường là oxy hóa và không oxy hóa

Quá trình oxy hóa ethanol tại gan gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn chuyển từ ethanol thành acetaladehyde:

Có 3 loại enzym tham gia giai đoạn này

 Enzym ADH có tác dụng oxy hóa ethanol thành acetaldehyde, vận chuyển proton H+gắn với coenzym NAD+ thành NADH ADH hoạt động trong bào tương tế bào gan

- Giai đoạn chuyển hóa từ acetaldehyde thành acetate

Tham gia phản ứng này là enzymacetaldehyde dehydrogenase với vai trò chuyển aldehyde thành acetate và H+sẽ được gắn với NAD+tạo thành NADH Enzym này hoạt động trong ty thể và được tìm thấy trong tế bào ở nhiều cơ quan khác nhau trong đó nhiều nhất là ở tế bào gan [25], [24], [71] Khi acetate được tạo thành thì thường thoát khỏi tế bào gan vào máu và đi vào chu trình Krebs ở các cơ quan khác và tạo nên CO2 và các chất chuyển hóa gây tăng lượngAcetaldehyde“adducts”, ROS (các loại chất oxy hóa) và tăng tỷ lệ NADH/NAD+ Quá trình chuyển hóa acetate cũng làm tăng lượng Acetyl coA và tăng tổng hợp lipid, cholesterol[71]

1.2.3 Chuyển hóa rượu và ung thư gan

Các con đường chuyển hóa ethanol đã gây ra hậu quả bất lợi, làm tổn thương

mô và tế bào, gây bệnh ở những bệnh nhân nghiện rượu Hậu quả bao gồm thiếu oxy tại gan, hình thành các chất độc, các gốc tự do oxy hóa (ROS), thay đổi tỷ lệ NADH/ NAD+ (thay đổi oxy hóa khử của tế bào)

- Thiếu máu tại gan

Con đường chủ yến chuyển hóa ethanol dưới xúc tác của ADH và ALDH tạo

ra NADH sẽ tiếp tục tham gia vào vận chuyển electron trong ty thể hoặc chuỗi hô hấp tế bào Để đáp ứng quá trình vận chuyển electrons, tế bào gan cần lượng oxy nhiều hơn mức bình thường Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chuyển hóa rượu có xu hướng làm tăng hấp thụ oxy từ máu của tế bào gan Tiêu thụ rượu mãn tính gây thiếu oxy đến gan làm tổn thương tế bào gan Ngoài ra, ethanol gián tiếp gây tăng

sử dụng oxy do hoạt hóatế bào Kuffer ở gan, làm tình trạng thiếu oxy tại tế bào gan trở nên trầm trọng hơn Khi các tế bào này bị hoạt hóa, chúng giải phóng phân

13

tửnhư prostaglandin E2… gây kích thích một loạt các phản ứng khác đòi hỏi tiêu thụ nhiều oxy hơn tại gan [71]

- Hình thành chất độc

Chuyển hóa ethanol với sự xúc tác ADH và CYP2E1 hình thành acetaldehyde

và ROS tương tác protein và các phân tử khác hình thành chất độc bền vững và không bền vững Acetaldehyde là chất độc gây đột biến gen và ung thư, Acetaldehyde gắn với DNA hình thành “DNA adduct” Vai trò của Acetaldehyde gây ung thư do rượu có liên quan đến di truyền Hiện tượng đa hình thái hoặc biến đổi gen mã hóa có liên quan đến tăng hay giảm nồng độ AA [61]

Acetaldehyde tương tác với các acid amin (cystein, lysine, acid amin nhân thơm…) của các protein hình thành “adducts” [21] “Acetaldehyde-lysin adducts” được tìm thấy ở màng tế bào gan của chuột được uống rượu [57] Những chất độc này gián tiếp gây tổn thương tế bào gan do cơ thể nhận chúng là những kháng nguyên lạ, và sinhkháng thể chống lại, ví dụ kháng thể gây độc tế bào ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) gây phá hủy tế bào gan [71]

AA có khả năng làm thay đổi tính toàn vẹn của DNA bằng nhiều con đường Bản chất phản ứng của AA để tạo thành “DNA adduct” là N2-ethyl-2'-deoxyguanosine, N²-propano-dG (PdG) PdG được xem là chất gây đột biến DNA

trênđộng vật có vú trong các nghiên cứu in vivo[54], [40]

14

Chuyển hóa ethanol dưới sự xúc tác của CYP2E1 và oxy hóa NADH bởi chuỗi vận chuyển electron hình thành ROS, ROS tham gia vào quá trình lipid peroxidation hình thành các chất MDA, HNE AA–MDA–protein "adduct” gây tăng đáp ứng miễn dịch và phản ứng viêm tại gan gây ra bệnh lý tại gan [21]

- Hình thành ROS và sự giảm chất chống oxy hóa

ROS bao gồm các gốc tự do O•, H2O2, OH•, OCL• được tạo ra bởi nhiều phản ứng khác nhau trong cơ thể ROS hoạt động bằng cách lấy đi ion H+ từ các phân tử khác để chuyển các phân tử thành các gốc tự do có hoạt tính cao Ngoài ra, ROS kết hợp các phân tử có tính ổn định hình thành gốc tự do khác nhau Thông qua 2 cơ chế trên, ROS có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành ung thư Trong điều kiện bình thường, có sự cân bằng giữa ROS và các chất chống oxy hóa tồn tại trong các tế bào Khi cân bằng này bị xáo trộn, ROS sẽ bị dư thừa được gọi tình trạng stress oxy hóa Trong hầu hết các tế bào, ROS được gắn với chuỗi vận chuyển điện

tử ở ty thể Ngoài ra, ROS còn được tạo ra từ phản ứng do enzym CYP2E1 xúc tác

và tế bào Kuffer hoạt hóa tại gan [12] Tiêu thụ rượu mạn tính và cấp tính đều gây tăng ROS dẫn tới tình trạng stress oxy hóa [56], [20], [59]

Tăng mức ROS gây nên những ảnh hưởng có hại như ROS kích thích tế bào Kuffer giải phóng TNFα, cytokinelàm hoạt hóa quá trình viêm gây tổn thương mô

và hình thành tổ chức xơ tại gan Ngoài ra, ROS còn tương tác với lipid, protein, DNA được gọi peroxidation Peroxidation tại màng ty thể sẽ gây biến đổi màng ty thể, các phân tử ở ty thể được giải phóng ra bào tương, kích hoạt các chuỗi phản ứng hóa học gây hiện tượng chết tế bào (apoptosis) Hơn nữa, peroxidation các phân

tử màng tế bào và ty thể làm thay đổi điện tích qua màng, kết quảgiảm ATP trong tế bào gây hoại tử tế bào gan Như vậy, ROS không những làm tăng stress oxy hóa mà còn gây tổn thương DNA, đây là yếu tố quan trọng làm phát triển ung thư gan do rượu [12], [18], [71]

- Thay đổi tỷ lệ NADH/NAD + , hoạt hóa gen

Quá trình chuyển hóa ethanol làm tăng tỷ lệ NADH/ NAD+trong bào tương và

ty thể của tế bào gan Trong bào tương NADH được tạo ra từ phản ứng ethanol

15

thành acetaldehyde bởi enzym ADH, sau đó được vận chuyển vào ty thể Tại ty thể NADH được hình thành nhờ enzym ALDH Tỷ lệ này ảnh hưởng đến biểu hiện của gen, kích hoạt các gen [45]

Tóm lại: Quá trình chuyển hóa rượu gây nhiều yếu tố có hại cho tế bào, mô, các cơ quan, và các chuyển hóa khác trong cơ thể Tại gan, người ta thấy ảnh hưởng của rượu làm tổn thương tế bào gan là thường gặp nhất Nghiện rượu, giai đoạn đầu

là gan nhiễm mỡ, sau đó là hiện tượng viêm, xơ hóa vàxơ gan do rượu Stickel (2002) đã chứng minh rằng nghiện rượu có vai trò rất quan trọng phát triển UTGNP (hình 1.2) [28]

Hình 1.2 Chuyển hóa rƣợu ở gan và vai trò hình thành ung thƣ gan

Alcohol được chuyển hóa thành acetaldehyde dưới tác dụng của enzym ADH

và cytochrom P4502E1, acetaldehyde gắn với DNA tạo thành “DNA adduct” và gắn protein tạo thành sản phẩm gây độc cho cơ thể, có thể hình thành ung thư Enzym ALDH chuyển acetaldehyde thành sản phẩm không độc là acetate, chất này

đi vào chu trình Krebs Quá trình chuyển hóa ethanol hình thành ROS tạo ra chất MDA-4HNE có thể gắn DNA tạo “DNA adduct”, chất này tạo ra có thể hình thành ung thư gan

Chu trình Krebs

Hình thành ung thƣ gan?

Hình 1.3 Vị trí của gen ALDH2 trên nhiễm sắc thể số 12 ở người

1.3.2 Chức năng của gen ALDH2

- Các enzyme mã hóa bởi gen ALDH này thuộc về họ Aldehyd dehydrogenase của các enzym xúc tác biến đổi hóa học từ acetaldehyde để thành acid acetic

- Enzyme ALDH có hai đồng dạng lớn là: bào tương và ty lạp thể, có thể được phân biệt bởi tính điện di linh động, tính chất động học

- Enzyme ALDH2 gồm có 517 acid amin, trọng lượng phân tử là 56000 Dalton

- Enzyme ALDH2 được thấy ở một vài mô trong cơ thể người với nồng độ cao nhất ở mô gan Vị trí tồn tại cũng như hoạt động của nó là chất nền của ty thể Enzyme ALDH2 tham gia vào quá trình chuyển hóa rượu tại gan trong cơ thể, chính xác hơn là nó xúc tác biến đổi hóa học từ acetaldehyde thành acid acetic

17

1.3.3 Tính đa hình của gen ALDH

1.3.3.1 Tính đa hình của gen

Genome của loài người có những biến thể di truyền khác nhau và điểm đó làm nên sự khác nhau giữa các cá thể trong cộng đồng Phần lớn những biến thể đó là do sựkhác biệt của hàng triệu các điểm đa hình tại những vị trí Nucleotide nhất định nằm giải rác trên toàn bộ genome đã làm thay đổi mã di truyền hoặc làm thay đổi hoạt động của gen Những điểm khác biệt đó được gọi là những điểm đa hình đơn

nucleotide (single nucleotide polymorphisms, SNP) Về mặt tiến hóa, những điểm

khác biệt này được giả thuyết là các dạng đột biến trung tính tạo nên sự đa dạng về mặt di truyền giữa các cá thể loài người Tuy nhiên, một số điểm đa hình SNP có thể liên quan đến khả năng mẫn cảm với bệnh [58], [37], [27]

1.3.3.2 Tính đa hình của gen ALDH2

Trong cùng một cách thức như ADHs của người là tính đa hình, trình tự mã

hóa của gen ALDH2 ở người mang một sự thay đổi một Nucleotide có tính chất

quyết định tại codon 487 (G  A trong exon thứ 12, nghĩa là GAA đối với allen ALDH2.1 và AAA đối với ALDH2.2) Ở cấp độ Protein, sự đa hình gen tương ứng với sự thay thế Glutamat (dạng 1) thành Lysine (dạng 2) dẫn đến việc không hoạt hóa sự hoạt động của Enzyme Trong các dị hợp tử, sự bất thường của allen ALDH2 trội hơn so với allen ALDH1 bởi vì sự liên hợp giữa allen ban đầu và alen đột biến làm bất hoạt các protein nhiều đơn vị [63]

Một vài nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng được tiến hành để xác định tần

số của ALDH2.2 ở người bình thường và người người nghiện rượu Thông thường, kiểu hình của ALDH được biểu diễn bằng sự điện dihoặc từ việc sinh thiết gan Phương pháp này có thể không đáng tin cậy vì sự bất hoạt của ALDH trong hệ Protein Vì mục đích xác định sự đa hình của gen A2, ta cải tiến bằng phương pháp giải trình tự gen ALDH ty thể từ mẫu máu, lỏng hoặc khô trên giấy lọc Hai allen này được phân biệt với nhau thông qua kết quả cắt giới hạn sau PCR và gây đột biến trong vùng đa hình của gen

18

Trong điều kiện sinh lý bình thường thì acetaldehyde sinh ra trong tế bào sẽ lập tức được chuyển hóa thành acetate là một chất không độc nhờ hoạt tính của ALDH (giai đoạn 2) Tuy nhiên nếu cơ thể tiếp xúc với một lượng chất cồn quá nhiều, trong một khoảng thời gian dài và cùng với những thay đổi trong hoạt tính của ADH, CYP2E1 và ALDH, có thể do đột biến hay do tác động bởi các kiểu gen khác nhau sinh ra từ các SNP, thì lượng acetaldehyde tăng cao và sẽ là nguồn gốc cho sự hình thành và phát triển ung thư[46], [72]

Hình 1.4 Sơ đồ quá trình chuyển hóa ethanol tại gan

Rượu được chuyển hóa thành acetaldehyde nhờ hoạt tính enzym của ADH và CYP2E1 Acetaldehyde là một chất có độc tính tiếp tục được chuyển hóa thành một chất không độc acetate nhờ ALDH (hình 1.4) Hiện tượng đa hình thái của ADH và ALDH tạo ra các kiểu gen khác nhau có thể gây tích lũy acetaldehyde và dẫn đến sự phát sinh phát triển ung thư

Gen ALDH2 có các đa hình đơn (SNP) tạo ra các isoenzym có thuộc tính động học khác nhau Sự thay đổi 2 acid amin tại các vị trí xác định trên gen ALDH2 (exon 12) tạo ra 2 alen đa hình thái là ALDH2*1 và ALDH2*2 Enzym được mã hóa bởi alen ALDH2*1 có Glu ở vị trí 487 Enzym được mã hóa bởi alen ALDH2*2 có

Lys ở vị trí 487, là enzym có hoạt tính thấp, gần như bất hoạt trong việc chuyển hoá acetaldehyde thành acetate

Tỷ lệ alen ALDH2*2 bất hoạt phổ biến ở người Trung Quốc, Nhật Bản và Triều

Tiên Tuy nhiên tỷ lệ này rất thấp ở người Châu Âu hoặc Châu Phi[64], [32]

19

Sự đa hình thái của gen mã hóa cho các enzym ALDH2 làmcho các enzym có

hoạt tính thay đổi Alen ALDH2*1 mã hoá enzyme có khả năng oxy hóa acetaldehyd trong khi alen ALDH2*2 mã hoá enzyme gần như mất hoạt tính

Trong một quần thể hay nhiều quần thể khác nhau, thì tốc độ chuyển hóa rượu

của từng cá thể khác nhau tùy thuộc cá thể đó mang kiểu gen và alen ALDH2 nào

[9] Vì vậy, bên cạnh rượu có ảnh hưởng gián tiếp đến tổn thương các tế bào và mô

cơ quan trong cơ thể thì yếu tố di truyền là yếu tố nguy cơ quan trọng trong việc hình thành và phát triển ung thư

1.3.4 Gen ALDH2 và bệnh ung thư

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sự tác động sự đa hình thái của

genALDH2 và lượng rượu tiêu thụ của bệnh nhân có nguy cơ gây ra một số loại ung thư

- Gen ALDH2 và ung thư đại trực tràng(UTĐTT)

Hua Zhao và cộng sự (2014) công bố nghiên cứu phân tích tổng hợp nhiều nghiên cứu khác nhau để tìm mối liên quan đa hình thái Glu487Lys của gen ALDH2 với nguy cơ UTĐTT [72] Kết quả phân tích 11 nghiên cứu bệnh-chứng trên 2909 bệnh nhân và 4093 người thuộc nhóm chứng cho thấy những người có chứa alen ALDH2*2có nguy cơ UTĐTT thấp hơn

- Gen ALDH2 và ung thư thực quản

Tác giả Ming Wu và cộng sự (2013) đã so sánh yếu tố nguy cơ của ung thư thực quản liên quan đến mức độ tiêu thụ rượu giữa những người mang kiểu gen

ALDH2*1/*1 với người mang kiểu gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 và đồng hợp tử ALDH2*2/*2 Kết quả nghiên cứu trên 858 bệnh nhân ung thư thực quản và trên

nhóm chứng 1081 người Trung Quốc đã cho thấy người uống rượu trung bình -

nhiều và mang gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 có nguy cơ mắc ung thư thực quản cao

nhất (OR=2,34, 95% CI: 1,52-3,61) so với nhóm người không hoặc uống rượu ít có

gen đồng hợp tử ALDH2*1/*1[67]

20

1.4 Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2

1.4.1 Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP)

Hiện tượng SNP hay hiện tượng đa hình đơn Nucleotide là sự khác nhau về trình tự DNA khi một Nucleotide đơn A, C, T hay G trong một chuỗi ADNtương ứng (Hình 1.5) giữa các cá thể của một loài hay giữa các cặp NST của một cá thể.Bộ gen người có 23 cặp NST, trong đó có 22 cặp NST thường và 1 cặp NST giới tính chứa khoảng 3,2 tỷ bp Kết quả của dự án giải trình tự gen người cho thấy trình tự các nucleotid giống nhau đến 99,9% giữa các cá thể và sự khác nhau ở 0,1% còn lại biểu hiện bằng các đa hình đơn Chính sự khác nhau này đã quy định đặc điểm riêng của mỗi cá thể, liên quan tính cách, nguy cơ mắc bệnh và sự đáp ứng với điều trị

SNP là hiện tượng phổ biến theo ngân hàng dữ liệu của NCBI tính đến tháng 26/6/2012 có hơn 53 triệu SNPs ở người, xảy ra tần số khá cao từ 1/1000 bp đến 1/100-300 bp SNP được coi là hậu quả của đột biến điểm thay thế một cặp Nucleotide

SNP xảy ra ở cả vùng mã hóa và vùng không mã hóa của gen Các SNP tại vùng mã hoá của gen có thể làm thay đổi hoặc không làm thay đổi trình tự các acid amin và cấu trúc phân tử protein mà nó tạo ra Hầu hết các SNP xảy ra ở vùng không mã hóa và không làm thay đổi cấu trúc của gen, tuy nhiên các SNP có thể nằm ở vùng điều hoà của gen, làm thay đổi mức độ sao chép gen hay ảnh hưởng đến quá trình hoàn thiện RNA thông tin

Dựa vào trình tự acid amin của của phân tử protein do gen tổng hợp có thể chia làm 2 loại

- Biến đổi im lặng là những biến đổi không làm thay đổi sản phẩm gen, ví dụ

bộ ba mã hóa GAC và GAG đều mã hóa cho acid amin leucine, không thay đổi cấu trúc phân tử protein

- Biến đổi sai nghĩa là những biến đổi làm thay đổi trình tự chuỗi polynucleotide của ARN, do đó làm thay đổi trình tự chuỗi acid amin của phân tử

Ngoài ra, SNP trong vùng mã hóa, làm thayđổi cấu trúc phân tử protein ở nhiều mức độ khác nhau Ví dụ nếu SNP làm cho mã GAU thành GAG thay đổi acid amin từ aspartic thành glutamic, hai acid amin này có tính chất hóa học rất giống nhau Nếu SNP này chỉ làm thay đổi một phần protein và không phải quan trọng với chức năng của nó, thì kết quả hoàn toàn vô hại Trong điều kiện bình thường sự thay đổi SNP là tiềm ẩn, nhưng chỉ khi tiếp xúc với các tác nhân có hại môi trường như chất gây ung thư, hóa chất…thì chúng hoạt hóa và biểu hiện bệnh Như vậy sự khác biệt trong trình tự DNA ở người có thể ảnh hưởng đến sự phát triển bệnh tật, sự đáp ứng với tác nhân gây bệnh, hóa chất, thuốc, và vacxin và các tác nhân khác Do đó, ứng dụng lớn nhất của SNP trong nghiên cứu y sinh học

là so sánh các vùng gen giữa các nhóm đối tượng khác nhau (nhóm người không bị bệnh và nhóm người bị bệnh) để từ đó tìm ra mối liên quan giữa SNP với bệnh, từ

đó tìm ra yếu tố nguy cơ đối với sự hình thành và tiến triển bệnh

SNP và mối liên quan đến ung thư

Hiện nay các nhà khoa học đang cố gắng xác định SNP khác nhau trong bộ gen con người, và thiết lập hồ sơ SNP cho mỗi cá thể và xếp chúng theo nhóm (SNP profiles) SNP profiles có thể giúp xác định gen ung thư, và xác định yếu tố nguy cơ

có liên quan đến ung thư trong các quần thể lớn

22

Hình 1.5 Minh họa hiện tƣợng đa hình đơn nucleotide(SNP)

Nguồn SNP - Google Search.htm

1.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn nucleotide:

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được tăng lên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động xúc tác quá trình tổng hợp tốt nhất

Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài

từ 30 giây đến nhiều phút

23

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm khuôn mẫu để tổng hợp các đoạn DNA mới trong chu kỳ tiếp theo Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là các đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài xác định là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi[8]

Hình 1.6 Nguyên lý kỹ thuật PCR

Gen cầnkhuếch đại

DNA

mẫu

Phản ứng khuếch đại

2 36 = 68 tỷ bản sao

1 chukỳ

2chu

kỳ

3 chukỳ

35 chu kỳ

Bước 1: biến tính

Bước 2: bắt cặp

Bước 3: tổng hợp

24

1.4.2.2 Kỹ thuật PCR-RFLP

- Nguyên lý: PCR-RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc

một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzym cắt thích hợp Các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethidium bromide cho ta biết được tính đa hình thái của đoạn DNA cần phân tích [11]

- Enzym cắt giới hạn:

Enzym cắt giới hạn hay còn gọi enzym hạn chế, enzym cắt là enzym dưới nhóm quan trọng của các enzym endonuclease, enzym này cắt DNA ở các vị trí xác định dựa trên sự nhận biết đoạn trình tự đặc hiệu với từng enzym thành các đoạn DNA có kích thước khác nhau Enzym cắt giới hạn được dùng để xác định alen liên quan đến các SNP do sự thay đổi 1 nucleotid trong mỗi SNP làm thay đổi đoạn trình

tự đặc hiệu nhận biết bởi enzym cắt giới hạn trên đoạn DNA đó

Bảng 1.2 Vị trí cắt của một số enzym giới hạn

EcoRI Eschericia coli RY13 5'-G↓AATTC-3'

EcoRII Eschericia coli R245 5'-↓CCTGG-3'

BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 5'-G↓GATCC-3'

SmaI Serratia marcesclens Sb 5'-CCC↓GGG-3'

ApaI Acetobacter pasteurianus 5'-GGGCC↓C-3'

SspI * Sphaerotilus natans 5'-AAT↓ATT-3'

Các enzym giới hạn có đặc điểm sau:

- Đều được chiết tách từ vi khuẩn, và tên của enzym giới hạn mang tên viết tắt của vi khuẩn

25

- Cắt phân tử DNA xoắn kép ở những trình tự base đặc hiệu (hay gọi vị trí giới hạn) cho từng loại enzym

- Vị trí cắt thường có 4-8 Nu, đặc trưng quan trọng nhất của trình tự giới hạn

là đoạn DNA gồm 4-8 cặp Nu có trình tự giống nhau khi đọc theo chiều 3-5 và 5-3

Vì vậy, vị trí cắt của enzym giống nhau trên cả 2 mạch

- Sau khi bị cắt, DNA có các đầu kết dính ở các sợi đơn Cùng bị cắt với cùng loại enzym giới hạn, các phân tử DNA có các đầu kết dính với các Nu bổ sung cho nhau

Ưu điểm kỹ thuật PCR-RFLP:rẻ tiền, không đòi hỏi máy móc hiện đại Kỹ

thuật đơn giản, dễ dàng áp dụng vào nhiều các nghiên cứu, phân tích chủ yếu đa hình đơn nucleotide

Nhược điểm: Một vài enzym cắt giới hạn có giá đắt, khó khăn trong việc thiết

kế mồi đặc hiệu, và enzym cắt thích hợp để thu được sản phẩm có kích thước khác nhau giúp cho việc nhận định và phân tích kết quả Quy trình làm thủ công nên mất nhiều thời gian Hạn chế thấy rõ nhất là khó có thể xác định kiểu gen nếu có nhiều SNPs khác nhau trên đoạn gen bởi nó đòi hỏi nhiều cặp mồi và enzym cắt khác nhau Hơn nữa, kiểu gen và alen có thể bị nhận định sai nếu enzym cắt sản phẩm gen khuyếch đại không hoàn toàn [11]

1.4.2.3 Kỹ thuật giải trình tự gen

Hiện nay, người ta sử dụng máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn được thiết

kế trên nguyên tắc của Sanger Với các máy thế hệ mới sau này, người ta dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP Nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện trong một ống nghiệm và chỉ cần điện di trên một hàng

mà không phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây, hệ thống điện di thường là điện di mao quản Mỗi khi có một vạch điện di đi qua, phân tử ddNTP cuối cùng

ở đầu 3’ của đoạn DNA sẽ phát ra một màu huỳnh quang tương ứng, máy sẽ ghi nhận màu sắc này và chuyển về máy tính phân tích Dựa vào màu huỳnh quang

mà máy nhận diện được là nucleotid nào, từ đó biết được trình tự của DNA đích

26

Phương pháp giải trình tự gen cho phép phát hiện tất cả các đột biến, đặc biệt là các đột biến điểm, do đó kỹ thuật này được áp dụng cho việc phát hiện một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen, đồng thời cũng được sử dụng như một phương pháp đối chứng để kiểm tra độ chính xác, độ đặc hiệu của phương pháp PCR-RFLP [47], [31], [50]

27

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nhóm bệnh: 156 bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư gan nguyên phát

đang được theo dõi và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện K Trung ương

từ tháng 1/2014-12/2015

Bệnh nhân cả hai giới được chẩn đoán xác định UTGNP khi có một trong những tiêu chuẩn sau và đồng ý tham gia nghiên cứu [65]:

- Có bằng chứng về mô bệnh học hoặc tế bào học

- Có khối u gan + AFP > 400ng/ml và nhiễm HBV hoặc HCV

- Kiểm tra trên siêu âm thấy có u

- Kích thước 1-2 cm, chẩn đoán xác định khi

 Hình ảnh điển hình với 2 phương pháp chẩn đoán hình ảnh động, hoặc

 Hình ảnh điển hình với 1 phương pháp chẩn đoán hình ảnh động + AFP

> 200ng/ml

- Kích thước khối u > 2cm, chẩn đoán xác định khi

 Hình ảnh điển hình với 1 phương pháp chẩn đoán hình ảnh động, hoặc

 Hình ảnh không điển hình + AFP > 400 ng/ml

Tiêu chuẩn loại trừ

- Ung thư di căn từ cơ quan khác tới

- Bệnh nhân có ung thư cả những cơ quan khác ngoài gan

- Bệnh nhân không đồng ý hợp tác nghiên cứu

Nhóm chứng:159 người khỏe mạnh tình nguyện tham gia nghiên cứu

Khai thác thông tin sử dụng rượu: Hỏi trực tiếp đối tượng cần nghiên cứu

Phương pháp đo lượng rượu tiêu thụ: sử dụng bộ câu hỏi để thu thập các thông tin:

- Thời gian uống rượu: tính bằng số năm, từ khi bắt đầu uống rượu đến thời điểm nghiên cứu

- Tần suất sử dụng rượu: mức độ thường xuyên uống rượu, số lượng cốc trong ngày, số ngày trong tuần/tháng, số tháng trong năm

Tiêu chuẩn xác định nhiễm virus viêm gan B: HbsAg dương tính

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thực hiện nghiên cứu khóa luận từ 01/01/2014 đến 31/12/2015

- Địa điểm: Bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội

Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein, trường Đại học Y Hà Nội 2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang có nhóm chứng

2.3.2 Cỡ mẫu:

Chọn cỡ mẫu: Tính cỡ mẫu nghiêndựa theo công thức tính cỡ mẫu nghiên cứu bệnh chứngcủa Tổ chức Y tế thế giới:

n : cỡ mẫu, α=0,05 thì z 2α =1,96, β=0.2 thì z 2β =1,04

p1 : tỷ lệ mang gen ALDH2*1/*1 nhóm chứng , q1=1- p1

p1= 0,68 được lấy từ nghiên cứu tham khảo trên cộng đồng người Trung Quốc

[36]

p2 : tỷ lệ mang gen ALDH2*1/*1 nhóm bệnh , q2=1- p2

p=(p1+p2)/2, q=1-p

Ước lượng OR=2,5ta tính được p2=0,84

Thay vào công thức ta có : n= 127

29

Trong nghiên cứu này, cỡ mẫu lựa chọn là 156 bệnh nhân nhóm bệnh và 159 đối tượng trong nhóm chứng

2.3.3 Cách thức tiến hành

Tiến hành theo các bước sau:

- Xây dựng biểu mẫu thông tin bệnh nhân thống nhất đáp ứng với những tiêu chí đưa ra

- Lựa chọn nhóm đối tượng nghiên cứu theo tiêu chuẩn đã nêu

- Lấy mẫu nghiên cứu theo đúng tiêu chuẩn kỹ thuật

- Phân tích tỷ lệ kiểu gen và alen ALDH2 ở bệnh nhân UTGNP bằng kỹ thuật

PCR-RFLP theo phương pháp được thực hiện bởi Yokoyama và cộng sự

- Mối liên quan gen ALDH2 với một số yếu tố nguy cơ

Bước 1: Lấy mẫu

- Thực hiện lấy mẫu ngoại vi của nhóm bệnh nhân UTGNP và nhóm người lành làm chứng Mẫu máu lấy 3ml máu tĩnh mạch, có chống đông EDTA (1mg EDTA/1ml máu toàn phần)

Bước 2: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi gồm 3 khâu

- Tách chiết DNA

- Đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (OD: Optical Density)bước sóng A260/A280 trên máy Nanodrop 1000 Kết quả OD của mẫu DNA được coi là đạt khi nồng độ khoảng 50ng/µl trở lên Với những mẫu có nồng độ quá cao >300 ng/µl sẽ được pha loãng để đưa nồng độ

<100ng/µl Độ tinh sạch DNA được đo bằng tỷ số A260/A280, và mẫu DNA tinh sạch khi tỷ số này từ 1,8-2,0

- Điện di DNA trên gel Agarose để kiểm tra sự toàn vẹn của DNA

Bước 3: Thực hiện khuyếch đại đoạn gen ALDH2 bằng phương pháp PCR:

- Khuyếch đại đoạn gen ALDH2 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu

Mồi xuôi: 5’ -CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT- 3’

Mồi ngƣợc: 5’ -CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT- 3’