Nghiên cứu phương pháp động học huỳnh quang xác định tyrosin dựa trên phản ứng với phức Ruteni(II) polypiridin

Sự tạo thành phổ huỳnh quang - cơ chế của sự phát quang Theo thuyết lượng tử, mỗi hạt sơ cấp ion, nguyên tử, phân tử có một hệ thống duy nhất các trạng thái năng lượng.. sau một thời g

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

PHẠM THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỘNG HỌC HUỲNH QUANG

XÁC ĐỊNH TYROSIN DỰA TRÊN PHẢN ỨNG VỚI PHỨC

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp tại Bộ môn Hóa phân tích, Viện kỹ thuật hóa học, trường Đại học Bách khoa Hà Nội tôi đã học hỏi được nhiều kiến thức bổ ích Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin trân trọng cám ơn TS Nguyễn Thị Ánh Hường, TS Nguyễn Xuân Trường đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, Thầy cô trong Bộ môn Hóa phân tích, trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hoá Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh và động viên để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Tyrosin 2

1.2 Phương pháp phân tích Tyrosin 7

1.2.1 Phương pháp so màu 7

1.2.2 Phương pháp quang phổ đo quang 8

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 8

1.2.4 Phương pháp phổ huỳnh quang 10

1.3 Tổng quan về phương pháp phổ huỳnh quang phân tử 10

1.3.1 Hiện tượng huỳnh quang 10

1.3.2 Sự tạo thành phổ huỳnh quang - cơ chế của sự phát quang 10

1.3.3 Cường độ huỳnh quang 11

1.3.4 Phổ huỳnh quang 12

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành huỳnh quang 13

1.3.5.1 Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang 13

1.3.5.2 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang 14

1.3.6 Máy quang phổ huỳnh quang 15

1.3.7 Thiết bị đo quang phổ huỳnh quang theo thời gian 17

1.3.8 Ứng dụng của quang phổ huỳnh quang 18

1.3.9 Động học các quá trình phát quang 19

1.3.9.1 Xác định thời gian sống của trạng thái kích thích 19

1.3.9.2 Xác định hằng số tốc độ của các quá trình giải hoạt 20

1.4 Tổng quan về phức chất Ruteni(II) polypiridin 22

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 24

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 24

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.1.2.1 Nghiên cứu đặc trưng quang phổ của phức chất Ruteni(II) polypiridin 24

2.1.2.2 Ảnh hưởng của pH tới động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức [Ru(bpy) 3 ]Cl 2 và phức Tyrosin 24

2.1.2.3 Ảnh hưởng của ion lạ tới động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức [Ru(bpy) 3 ]Cl 2 và Tyrosin 25

2.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của lực ion tới động học phản ứng của phức chất Ruteni(II) polypiridin và amino axit Tyrosin 25

2.1.2.5 Xây dựng quy trình định lượng amino axit Tyrosin dựa trên phản ứng với phức chất Ruteni(II) polypiridin 27

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 28

2.2.1 Hóa chất 28

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 28

2.4 Thẩm định phương pháp 28

2.5 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu protein phân tích Tyrosine 30

2.6 Sử dụng phương pháp HPLC làm phương pháp đối chiếu 32

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis 34

3.2 Phổ phát xạ phân tử trạng thái dừng 36

3.3 Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian (time-domain) 37

3.4 Ảnh hưởng của pH tới động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức [Ru(bpy)3]Cl2 và phức Tyrosin 38

3.5 Ảnh hưởng của ion lạ tới động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức [Ru(bpy)3]Cl2 , phức Tyrosin 40

3.6 Ảnh hưởng của lực ion tới động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức [Ru(bpy)3]Cl2 , và Tyrosin 42

3.7 Thẩm định phương pháp định lượng Tyrosin dựa trên phản ứng quang oxi hóa khử với phức [Ru(bpy)3]Cl2 và phức 44

3.7.1 Độ lặp lại của phương pháp 46

3.7.2 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 48

3.7.3 Khoảng tuyến tính 49

3.7.4 Độ đúng của phương pháp 51

3.8 Phân tích Tyrosin trong mẫu protein 53

3.8.1 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu protein phân tích Tyrosin 53

3.8.2 Kết quả phân tích Tyrosin trong mẫu protein 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

PHỤ LỤC 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng Tyrosin trong một số mẫu thực tế……….7

Bảng 1.2 Tổng hợp các dẫn xuất xác định axit amin bằng HPLC……… 9

Bảng 3.1:Sự phụ thuộc của hằng số tốc độ phản ứng giữa phức [Ru(bpy)3]Cl2, và Tyrosin vào pH……….39

Bảng 3.2: Hằng số tốc độ phản ứng quang oxi hóa-khử (kq) giữa phức [Ru(bpy)3]Cl2 và Tyrosin khi I thay đổi……… 43

Bảng 3.3: Hằng số tốc độ phản ứng quang oxi hóa-khử (kq) giữa phức

và Tyrosin khi I thay đổi……….43

Bảng 3.4: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp dựa trên phản ứng với phức [Ru(bpy)3]Cl2…… 47

Bảng 3.5: Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp dựa trên phản ứng với phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 47

Bảng 3.6: Kết quả xác định LOD và LOQ dựa trên phản ứng với phức [Ru(bpy)2]Cl2…….48

Bảng 3.7: Kết quả xác định LOD và LOQ dựa trên phản ứng với phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2.49 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính xác định Tyrosin dựa trên phản ứng với phức [Ru(bpy)3]Cl2 và phức ……….50

Bảng 3.9: Kết quả xác định độ thu hồi xác định Tyrosin dựa trên phản ứng với phức [Ru(bpy)3]Cl2……….52

Bảng 3.10: Kết quả xác định độ thu hồi xác định Tyrosin dựa trên phản ứng với phức ……….52

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát thể tích NaOH dùng để thủy phân mẫu protein………53

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân mẫu protein………53

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân mẫu protein 54

Bảng 3.14: Kết quả phân tích Tyrosin trong mẫu protein theo phương pháp động học huỳnh quang và phương pháp đối chiếu HPLC……… 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 (a) Cấu trúcphân tử của Tyrosin; (b) Cấu trúc lập thể của Tyroin……… …… 2

Hình 1.2 Một số cấu trúc đồng phân của Tyrosin………3

Hình 1.3: Sự vận chuyển electron trong pha sáng của quá trình quang hợp (sơ đồ hình chữ Z ) ……… 3

Hình 1.4 : Quy trình tổng hợp tyrosin từ prephenate………4

Hình 1.5: Quá trình chuyển đổi phenylalanine và tyrosin từ các chất dẫn xuất sinh học…….5

Hình 1.6: Con đường tổng hợp catecholamines và các amin trong não người……….6

Hình 1.7 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang……… 16

Hình 1.8 Sơ đồ khối hệ thiết bị quang phổ huỳnh quang phân giải thời gian……… 17

Hình 1.9 Cấu trúc bát diện của phức ……… 22

Hình 2.1 Thế khử chuẩn của Tyrosin theo pH……… 24

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu protein phân tích Tyrosin và Tryptophan ………… 31

Hình 3.1: (a) Phổ hấp thụ của phức [Ru(bpy)3]Cl27.5 M;(b) axit amin Tyrosin và (c) hỗn hợp phức [Ru(bpy)3]Cl2+Tyrosin, pH 12……… 35

Hình 3.2: (a) Phổ hấp thụ của phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2 7.5 M;(b) axit amin Tyrosin và (c) hỗn hợp phức [Ru(dpq)2bxbg]Cl2+Tyrosin, pH 12……… 36

Hình 3.3: Phổ phát xạ phân tử trạng thái dừng của (a) phức [Ru(bpy)3]Cl2 7.5 M, pH 12; (b) phức 7.5M, pH12……… 37

Hình 3.4: Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian của (a) phức [Ru(bpy)3]Cl2 7.5 M, pH 12; (b) phức 7.5 M, pH 12……… 38

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hằng số tốc độ phản ứng của phức và Tyr vào pH……… 39

Hình 3.6: (a) Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian của dung dịch phức [Ru(bpy)3]Cl2 7.5 M và Ca2+ M; (b) [Ru(bpy)3]Cl2 7.5 M + Tyrosin M và Ca2+ M; pH 12, I = 0.05M……….41

Hình 3.7: (a) Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian của dung dịch phức

và Ca2+ M và (b) + Tyrosin M và Ca2+ M; pH 12, I = 0.05M……….42

Hình 3.8: Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian của phức [Ru(bpy)3]Cl2 khi tăng dần nồng độ Tyrosin……… 44

Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn 0 / -1 của phức [Ru(bpy)3]Cl2 và [TyrOH]; pH 12, I = 0.05M,

kq = 1,10.109M-1s-1 ………45 Hình 3.10: Phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian của phức khi tăng dần nồng độ Tyrosin……… 45 Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn 0 / -1 của phức và [TyrOH]; pH 12, I = 0.05M

kq = 1.99 109 M-1s-1… ……… 46 Hình 3.12: Đường hồi quy tuyến tính xác định Tyrosin dựa trên phản ứng với phức phản [Ru(bpy)3]Cl2………50 Hình 3.13: Đường hồi quy tuyến tính xác định Tyrosin dựa trên phản ứng với phức

……….51

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Deoxyribonucleic axit Axit đêôxy ribônuclêic

glycoluril

Bis(o-xylene)bipyridin glycoluril

quinoxaline

dipyrido[3,2-d:2,3-f] quinoxaline

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tyrosin là một trong 12 amino axit không thiết yếu nhưng rất cần thiết cho cơ thể Nó

là nguyên liệu cho quá trình tổng hợp một số chất dẫn truyền thần kinh (dopamin, adrenalin,…) trong não bộ [11], giúp cho quá trình truyền thông tin liên lạc giữa các tế bào thần kinh tác động đến tâm trạng của con người [14,19,29] Đồng thời Tyrosin ảnh hưởng đến các hoạt động của tuyến thượng thận, tuyến giáp và tuyến yên, giữ nhiệm vụ sản xuất và điều chỉnh các nội tiết tố (melanin,…) Trong thực tế, Tyrosin thường được bổ sung vào cơ thể từ những loại thực phẩm như sữa, phô mai, trứng, đậu nành [42]… Mặt khác, Tyrosin là một mắt xích quan trọng trong chu trình quang hợp (photosytem II - PS II) của cây xanh, nó đóng vai trò như một chất cho electron dẫn đến phản ứng tạo thành O2 và H2O

Định lượng axit amin rất quan trọng trong các nghiên cứu phân tích đánh giá thành phần dinh dưỡng của thực phẩm Định lượng một số axit amin như Tyrosin, Tryptophan,… cũng rất quan trọng trong y sinh học khi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng các tiền chất tham gia trong quá trình sinh tổng hợp và trong quá trình trao đổi chất ở cơ thể sống Tyrosin có thể được xác định bằng phương pháp so màu [32], quang phổ đo quang [48], phổ huỳnh quang phân tử [43] và phổ biến nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ huỳnh quang (HPLC/FLD) [4,34,39] Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những hạn chế riêng Chẳng hạn như với HPLC/FLD, thường phải tạo dẫn xuất axit amin để tăng

độ nhạy của phép phân tích Việc tạo dẫn xuất phải trải qua nhiều bước để cho hợp chất huỳnh quang ổn định, tách tốt và có độ lặp lại cao Nói chung, phương pháp truyền thống trên có nhược điểm là tốn thời gian để chuẩn bị mẫu và đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền Mục tiêu của luận văn này nhằm nghiên cứu một phương pháp mới đơn giản và tiết kiệm thời

gian để định lượng amino axit Tyrosin Do đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp động học huỳnh quang xác định Tyrosin dựa trên phản ứng với phức Ruteni(II) polypiridin” .

Hình 1.1 (a) Cấu trúc phân tử của Tyrosin; (b) Cấu trúc lập thể của Tyrosin

 Đồng phân cấu trúc của Tyrosin

Tyrosin có ba loại đồng phân cấu trúc đó là para-tyrosin, meta-tyrosin và ortho-tyrosin đều có trong tự nhiên Tuy nhiên m-tyr và o-tyr ít xuất hiện hơn p-tyr nhƣng chúng có thể đƣợc tổng hợp [30] m-tyrosin đƣợc ứng dụng khá rộng rãi trong cuộc sống đặc biệt là y học, m-tyr có thể dùng để chữa một số bệnh nhƣ Parkinson, Alzheimer và bệnh viêm khớp [21]

Hình 1.2 Một số cấu trúc đồng phân của Tyrosin

Tyrosin là một amino axit kỵ nước, và hòa tan kém trong nước so với các phenylalanine

do sự ưa nhiệt động học của các liên kết hydro giữa nhóm hydroxyl của một phân tử Tyrosin

và nhóm carboxyl của các phân tử khác Tuy là một amino axit không thiết yếu, được tìm thấy từ protein Casein, nhưng lại rất cần thiết cho cơ thể

Trong quang hợp, Tyrosin là một mắt xích rất quan trọng Nó đóng vai trò như một chất cho electron dẫn đến phản ứng tạo thành O2 và H2O ở diệp lục

Hình 1.3: Sự vận chuyển electron trong pha sáng của quá trình quang hợp (sơ đồ hình chữ Z)

 Quá trình tổng hợp Tyrosin

Ở thực vật và hầu hết các vi sinh vật, Tyrosin được tổng hợp thông qua prephenate nhờ chất trung gian là axit shikimate [11] Prephenate là chất oxi hóa để khử carboxyl với việc

giữ lại nhóm hydroxyl và tạo ra p-hydroxyphenylpyruvate, một chất chuyển hóa các axit amin tạo ra tyrosin và -ketoglutarate

Hình 1.4 : Quy trình tổng hợp tyrosin từ prephenate

Ở động vật có vú, tyrosin đƣợc tổng hợp từ amino axit thiết yếu phenylalanine (phe) có nguồn gốc từ thực phẩm Sự chuyển đổi phe thành Tyrosin nhờ chất xúc tác là ezyme phenylalanine hydroxylase

 Quá trình chuyển hóa của Tyrosin và phenylalanine [40]:

Hình 1.5: Quá trình chuyển hóa phenylalanine và tyrosin thành các chất dẫn xuất sinh học

Tyrosin còn là nguyên liệu nền cho một số chất dẫn truyền thần kinh trong não bộ [42], giúp cho quá trình truyền thông tin liên lạc giữa các tế bào thần kinh tác động đến tâm trạng của con người [14,19,29] Trong hệ thống dopaminergic ở não bộ, tyrosin được chuyển thành L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) [11] nhờ ezyme tyrosine hydroxylase (TH) Ngoài ra, đối với các hormon ở tuyến giáp như triodothyronine ( và thyroxine ( cũng được tạo thành từ Tyrosin

Hình 1.6: Con đường tổng hợp chất dẫn truyền thần kinh catecholamines ở não bộ

Tyrosin giúp cơ thể sản sinh ra melanine, là một sắc tố quy định màu da và tóc Đồng thời Tyrosin ảnh hưởng đến các hoạt động của tuyến thượng thận, tuyến giáp và tuyến yên, giữ nhiệm vụ sản xuất và điều chỉnh các nội tiết tố [19] Nếu hàm lượng Tyrosin trong cơ thể thấp, chúng ta có thể mắc một số bệnh như huyết áp thấp, thân nhiệt giảm, tuyến giáp hoạt động kém hiệu quả

 Hàm lượng Tyrosin trong một số mẫu thực tế:

Trong thực tế, Tyrosin được cung cấp vào cơ thể qua rất nhiều loại thực phẩm khác nhau, mỗi loại thực phẩm chứa hàm lượng Tyrosin nhất định Hàm lượng Tyrosin trong một

số mẫu thực tế được thể hiện ở bảng 1.1:

Mẫu

Hàm lượng Tyr/100g khẩu phần ăn được Mẫu

Hàm lượng Tyr/100g khẩu phần ăn được

Bảng 1.1: Hàm lượng Tyrosin trong một số mẫu thực tế

1.2 Phương pháp phân tích Tyrosin

1.2.1 Phương pháp so màu

Tác giả Otto Folin và W Denis [32] đã sử dụng phương pháp so màu để xác định Tyrosin trong tóc, móng, protein,… Mẫu được chuẩn bị như sau: cân chính xác một gam protein khô, chuyển vào bình Kjeldahl 50 ml và thêm 25 ml axit hydrochloric 20% Mẫu được thủy phân trong 12 giờ, lấy mẫu, để nguội và chuyển mẫu sang bình định mức 100 ml Thêm 5 ml thuốc thử Tyrosin, sau 5 phút thêm 25 ml dung dịch Na2CO3 Hỗn hợp sau đó

được làm lạnh Màu của mẫu rõ nhất sau khoảng 10 phút, vì vậy phải đo màu trong khoảng

10 phút này Sử dụng thiết bị đo màu Duboscp để so sánh màu với dung dịch Tyrosin chuẩn

và xác định nồng độ của Tyrosin trong mẫu Kết quả phân tích hàm lượng Tyrosin trong một

số mẫu như sau: lông cừu chứa 6,0 %, tóc người 4,3 %, đậu trắng 4,5 %, …

Bằng việc sử dụng phương pháp so màu, tác giả và cộng sự đã xác định được Tyrosin trong một số mẫu Phương pháp khá đơn giản tuy nhiên cho kết quả chưa sát với phương pháp truyền thống Bên cạnh đó, khi sử dụng phương pháp so màu, thuốc thử có thể phản ứng với các amino axit khác trong protein gây ảnh hưởng đến quá trình phân tích

1.2.2 Phương pháp quang phổ đo quang

Năm 1985, C.S.P Sastry và cộng sự đã nghiên cứu định lượng Tyrosin bằng phương pháp quang phổ đo quang [38] Phổ hấp thụ được đo trên máy quang phổ Systronics 105 (MKI) Phương pháp phân tích như sau:

- Xây dựng đường chuẩn: Lấy 0,3 – 3 ml Tyrosin cho vào bình định mức 10 ml Thêm 7,9

ml nước cất, 0,1 ml NH4OH, 0,5 ml sodium metaperiodate, 1,5 ml 4-minophenazone Đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 470 nm, hàm lượng Tyrosin trong mẫu được xác định từ đường chuẩn

- Thủy phân protein: Cân 0,2 g protein cho vào bình thủy phân, thêm 20 ml HCl 20 % Mẫu được thủy phân theo phương pháp của Udenfriend và Cooper (1952) trong 24 giờ Hỗn hợp sau khi thủy phân được pha loãng ở tỷ lệ thích hợp ( 50 g tyrosin cho mỗi ml) Khoảng tuyến tính phân tích Tyrosin nằm trong khoảng 1,5-15 µg/ml Hệ số hấp thụ mol và độ nhạy Sandell tương ứng là 6,88 (l.mol-1.cm-1) và 0,026 µg.cm-2 Khi phân tích trên 8 mẫu riêng biệt, độ lệch chuẩn tương đối và sai số tương đối lần lượt là 1,56 % và 1,2 %, độ thu hồi đạt 95,1 – 97% Kết quả phân tích hàm lượng Tyrosin trong một số mẫu protein như sau: albumin từ trứng 2,78mg/100mg, vitellin 2,81mg/100mg, conalbumin 3,75mg/100mg Phương pháp này cho kết quả định lượng Tyrosin khá phù hợp với một số phương pháp quang phổ đo quang nghiên cứu trước đó Phương pháp có thể xác định Tyrosin mà không cần tách các amino axit khác tuy nhiên độ thu hồi của phương pháp chưa cao

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Bảng 1.2: Tổng hợp các dẫn xuất xác định axit amin bằng HPLC

Ổn định, tách tốt, độ nhạy, độ đúng, độ lặp lại cao

2 Dabsylclorid

(4-4)

Vis 436 nm < fmol 18-44 phút

dẫn xuất trước cột

Ổn định, tách tốt, độ nhạy, độ lặp lại cao

Nhiều sản phẩm phụ

3 Dabsylclorid

(5-1)

Huỳnh quang (  ex:360-385 nm;  em: 460- 495nm)

< pmol 60-90 phút

dẫn xuất trước cột

Ổn định, tách tốt

Loại amin bậc 2, nhiễu nền

(  ex:265nm;

 em: 320nm)

1 pM 20-45 phút

dẫn xuất trước cột

Ổn định, tách tốt

Nhiều sản phẩm phụ, phải loại bỏ thuốc thử

dư

6 Ninhydrin Vis 440 nm

(amin bậc 1), 570nm (amin bậc 2)

100 pM 30 phút dẫn

xuất sau cột

Độ lặp lại cao

Độ nhạy kém, độ phân giải thấp

(  ex:340nm;

 em: 455nm)

50 fmol 17-35 phút

dẫn xuất trước cột,

90 phút dẫn xuất sau cột

Tách tốt, độ nhạy, độ lặp lại cao

Loại amin bậc 2, phản ứng dẫn xuất chậm, không bền, nhiễu nền

dẫn xuất trước cột

Tách tốt, độ lặp lại cao

Ảnh hưởng bởi muối

1.2.4 Phương pháp phổ huỳnh quang

T.P Waalkes và cộng sự đã nghiên cứu phương pháp phổ huỳnh quang để xác định Tyrosin trong huyết tương và mô [43] Mẫu phân tích được chuẩn bị như sau: lấy 1 ml mẫu, pha loãng bằng 4 ml nước và 1 ml trichloroacetic 30% Để hỗn hợp trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm Lấy ra 2 ml dung dịch vào ống nghiệm, thêm 1 ml nitrosonaphthol và 1 ml axit nitric Đặt ống nghiệm trong bể điều nhiệt ở 550C trong 30 phút, sau đó làm lạnh, thêm 10

ml ethylene dichloride và rung siêu âm Mẫu tiếp tục được ly tâm, lọc lấy phần dung dịch và

đo phổ: ex = 460 nm, em = 570 nm Kết quả phân tích có độ thu hồi 91-100% Độ nhạy của phương pháp là 1 g/ml

1.3 Tổng quan về phương pháp phổ huỳnh quang phân tử

1.3.1 Hiện tượng huỳnh quang

Một chất khi hấp thụ năng lượng ở giới hạn nào đó sẽ làm kích thích hệ electron phân

tử Ở trạng thái kích thích phân tử chỉ tồn tại s, nó lập tức trở về trạng thái cơ bản ban đầu và giải tỏa năng lượng dưới dạng ánh sáng, hiện tượng này gọi là phát quang Khi tác nhân kích thích là các tia tử ngoại hoặc phần có bước sóng ngắn của ánh sáng khả kiến ta có hiện tượng phát quang quang học hay còn gọi là huỳnh quang [6, 8]

1.3.2 Sự tạo thành phổ huỳnh quang - cơ chế của sự phát quang

Theo thuyết lượng tử, mỗi hạt sơ cấp (ion, nguyên tử, phân tử) có một hệ thống duy nhất các trạng thái năng lượng Trạng thái năng lượng thấp nhất gọi là trạng thái cơ bản ( ) Khi

bị kích thích, như được hấp phụ photon ánh sáng thì năng lượng của photon sẽ được truyền sang hạt và hạt sẽ được chuyển sang năng lượng cao hơn gọi là trạng thái kích thích , , (ở mỗi trạng thái phân tử có thể tồn tại ở các phân mức năng lượng khác nhau 0, 1, 2, 3, ) sau một thời gian rất ngắn ( - giây) các hạt ở trạng thái kích thích sẽ trở về trạng thái cơ bản ban đầu theo một trong các hiện tượng dưới đây [6, 8]:

- Hiện tượng bất hoạt: Các phân tử ở mức năng lượng cao của trạng thái này trở về mức năng lượng thấp nhất của trạng thái và giải phóng ra năng lượng dưới dạng nhiệt do va chạm giữa các phân tử làm tăng nhiệt độ môi trường, gọi là hiện tượng phục hồi không bức xạ (thời gian phục hồi thường nhỏ hơn giây)

- Hiện tượng chuyển nội: Các nguyên tử từ mức thấp nhất của trạng thái kích thích chuyển về trạng thái cơ bản giải phóng ra năng lượng bằng cách bức xạ ra các photon

ánh sáng, gọi là sự phục hồi có bức xạ Ánh sáng có bức xạ này gọi là huỳnh quang (kéo dài - giây)

- Hiện tượng vượt nội hệ: Các phân tử ở trạng thái kích thích không chuyển về trạng thái cơ bản mà chuyển sang trạng thái siêu bền , sau đó từ T1 chuyển về S0

và bức xạ các photon ánh sáng làm cho quá trình phát quang chậm gọi là huỳnh quang chậm hoặc lân quang ( - 10giây)

Trong hiện tượng phát quang, một phần năng lượng của ánh sáng kích thích bị tiêu tốn chuyển thành nhiệt năng do hiện tượng bất hoạt vì vậy năng lượng ánh sáng kích thích bao giờ cũng lớn hơn năng lượng ánh sáng bức xạ, hay nói cách khác bước sóng của ánh sáng bức xạ luôn dài hơn bước sóng của ánh sáng kích thích, tạo ra sự dịch chuyển cực đại phát quang về phía bước sóng dài hơn so với cực đại hấp thụ, đó

là sự dịch chuyển Stokes Chất nào có độ dịch chuyển Stokes càng lớn thì phép đo huỳnh quang càng chính xác (vì ít bị ảnh hưởng của phổ hấp thụ)

1.3.3 Cường độ huỳnh quang

- Phương pháp huỳnh quang dựa trên nguyên tắc [1, 6]: Khi chiếu một chùm tia tử ngoại (bức xạ kích thích) vào một số chất, các chất này phát ra bức xạ nhìn thấy có bước sóng xác định tùy thuộc từng chất và có cường độ phụ thuộc vào hàm lượng của chúng

- Nếu ta chiếu xạ mẫu bằng một dòng bức xạ đơn sắc chứa photon có năng lượng ứng với hiệu năng lượng cần thiết cho quá trình hấp thụ thì một phần của cường độ bức xạ tới sẽ

bị hấp thụ và cường độ bức xạ truyền qua I sẽ nhỏ hơn cường độ bức xạ tới

Trong điều kiện nhất định cường độ bức xạ huỳnh quang Ih sẽ tỷ lệ thuận với cường độ bức xạ hấp thụ ( - I) theo:

=k( - I) (1.1) Hằng số k phụ thuộc vào chất phân tích, môi trường và có quan hệ với hiệu suất phát ra photon của nguyên tử hay phân tử khi từ trạng thái kích về trạng thái cơ bản Cường độ bức

xạ truyền qua có quan hệ với nồng độ chất phân tích theo định luật Lambert – Beer:

I= (1.2) Thế phương trình 1.2 vào phương trình 1.1 ta có:

=k(1- ) (1.3)

Phương trình 1.3 có thể triển khai thành chuỗi Taylor cho kết quả là:

= k [2,303 lC – + - ] (1.4)

Nếu lC < 0,01 thì các số hạng bậc cao có giá trị không đáng kể (<1%) nên có thể bỏ qua và:

= 2,303k lC = KC (1.5) Trong đó:

I0 : Cường độ bức xạ tới

I : Cường độ bức xạ truyền qua

Ih : Cường độ bức xạ huỳnh quang

: Hệ số hấp thụ mol của chất phân tích

l : Chiều dày của lớp dung dịch (cm)

C: Nồng độ chất phát quang trong dung dịch ( mol/l)

Tóm lại, trong điều kiện nồng độ bé (tức là có độ hấp thụ nhỏ, lC < 0,1), thì cường độ bức xạ huỳnh quang sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích và với cường độ bức xạ tới I0 Đây là cơ sở của phương pháp huỳnh quang phân tử dùng xác định nồng độ C của chất phân tích theo cường độ huỳnh quang Ih Nếu dung dịch C có nồng độ lớn ( lC > 0,1) thì sẽ xảy ra

sự tắt huỳnh quang, khi đó không còn sự tuyến tính giữa nồng độ và cường độ huỳnh quang nữa

1.3.4 Phổ huỳnh quang

- Phổ kích thích: Là đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang tương đối theo bước sóng của ánh sáng kích thích [1,6]

- Phổ phát xạ: Là đường biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ phát quang tương đối (cường

độ huỳnh quang của chất đã được hoạt hóa) theo bước sóng của ánh sáng phát xạ

Lưu ý: Khi ghi phổ huỳnh quang của một số chất ta thu được ngoài phổ huỳnh quang còn một số phổ khác như ánh sáng tán xạ của giải Raman, của dung môi và cốc đo, của ánh sáng tán xạ thứ cấp hay ánh sáng phản xạ nhưng phổ huỳnh quang của mẫu vẫn thể hiện rõ rệt nhất và dựa vào phổ này ta có thể xác định được cực đại bức xạ của chất đó

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành huỳnh quang

1.3.5.1 Ảnh hưởng của cấu trúc phân tử đến hiệu suất huỳnh quang

 Cấu tạo phân tử:

- Các chất có dây nối đôi liên hợp thì có khả năng phát quang Càng nhiều dây nối đôi liên

hợp thì khả năng phát quang càng cao Ví dụ:

Các chất vô cơ hay các chất hydrocacbon no hầu như không phát quang

Các hợp chất thơm có khả năng phát quang và càng nhiều vòng thơm ngưng tụ thì hiệu

suất huỳnh quang càng lớn

Các nhóm chức có khả năng cho điện tử thì làm tăng hiệu suất huỳnh quang Ví dụ: OH,

,

Các nhóm chức có khả năng nhận điện tử thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang Ví dụ:

, -COOH, -CHO,

- Vị trí các nhóm thế trên nhân thơm có thể làm tăng hoặc làm giảm hiệu suất huỳnh quang

Ví dụ: Vị trí para và ortho làm tăng sự không định vị của điện tử trên nhân thơm, cũng làm

tăng hiệu suất huỳnh quang Ngược lại vị trí meta thì làm giảm hiệu suất huỳnh quang

- Đồng phân cis làm tăng khả năng phát quang và đồng phân trans làm giảm khả năng phát

quang của hợp chất

 Độ cứng nhắc của phân tử

Các chất có cấu tạo cứng nhắc thì khả năng phát quang cao và ngược lại

Ví dụ: Flourene, Flourescein: Phát quang mạnh

Biphenyl, Malachite, phenophtalein: Không phát quang

 Chất tạo dẫn:

Có những hợp chất bình thường phát quang yếu nhưng khi tạo dẫn chất thì phát quang mạnh

Ví dụ:

Không phát quang Phát quang mạnh

Tetracyclin Tetracyclin + + Barbiturat

Hydrocortison Hydrocortison + + ethanol

Vitamin B1 Thiocrom

Adrenalin Adrenochrom

1.3.5.2 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang

 Sự có mặt của các chất tan khác nhau: Có thể gây ra hiện tượng sau:

- Hiệu ứng lọc nội: Các chất khác nhau có thể không phát quang nhưng lại hấp thụ ánh sáng của chất phát quang làm giảm cường độ huỳnh quang

- Sự làm tắt hóa học: Các chất khác làm tắt một phần hay toàn bộ cường độ phát quang do

va chạm hay làm biến đổi cấu trúc hóa học của chất phát quang

Khi đó Q đóng vai trò là chất làm tắt hóa học (quencher)

Ví dụ: là Q của Quinin cho nên trong môi trường HCl thì Quinin không phát quang ADN là Q của Acridin nên trong các xét nghiệm sinh hóa có thể sử dụng Acridin trong định lượng

 Nồng độ ion , vai trò của pH:

- pH có ảnh hưởng lớn đến cường độ phát quang Một số chất có tính axit yếu hay bazơ yếu thì cường độ phát quang phụ thuộc nhiều vào pH Ví dụ:

Ta có axit AH, trong nước AH phân ly theo phương trình:

AH  +

Nếu dạng phát quang là AH thì khi tăng, phản ứng xảy ra theo chiều nghịch, khi đó F tăng Nếu dạng phát quang là thì F sẽ giảm trong môi trường axit và tăng trong môi trường kiềm

 Ảnh hưởng của dung môi:

Cường độ phát quang và bước sóng cực đại thay đổi theo dung môi và những tác động khác nhau Ví dụ:

- Sự tắt huỳnh quang hóa học do dung môi: Quininsulfat phát quang mạnh trong môi trường , nhưng không phát quang trong môi trường HCl

- Oxi hòa tan trong dung môi làm biến đổi hóa học chất phát quang, do đó oxi có ảnh hưởng đến cường độ phát quang

1.3.6 Máy quang phổ huỳnh quang

Máy quang phổ huỳnh quang cũng có các bộ phận chính như: nguồn sáng, bộ phận đơn sắc hóa, buồng đo và bộ phận phát hiện

Hình 1.7 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ huỳnh quang

- Nguồn sáng trong máy quang phổ huỳnh quang có nhiệm vụ tạo ra bức xạ kích thích cần thiết Nguồn sáng thường dùng là đèn xenon có khả năng phát ra bức xạ trong khoảng rộng

200 – 800nm nhưng phổ bức xạ không đều, các tia UV mạnh hơn các tia Vis Ngoài ra người ta còn dùng nguồn cảm ứng laser

- Bộ đơn sắc hóa gồm 2 phần đơn sắc hóa bức xạ kích thích và đơn sắc hóa bức xạ huỳnh quang Hai bộ phận này được bố trí trước và sau buồng đo

- Buồng đo được bố trí sao cho phương nguồn sáng và phương thu tín hiệu vuông góc với nhau Do đó cuvet sử dụng phải là cuvet có hai mặt trong suốt vuông góc với nhau hay cả 4 mặt trong suốt Để tăng tín hiệu đến bộ phận thu người ta có thể bố trí thêm gương phía đối diện Nguyên tắc hoạt động: Nguồn sáng phát ra ánh sáng ở bước sóng kích thích của chất phân tích có trong mẫu Ánh sáng trước khi truyền đến mẫu phải đi qua bộ phận đơn sắc kích thích, chỉ cho phép bước sóng nhất định trong phổ kích thích của chất phân tích đi qua, còn các bước sóng khác sẽ bị cản lại Ánh sáng từ bộ đơn sắc kích thích đi qua mẫu chứa trong cuvet và kích hoạt chất phân tích Sau khi kích thích, chất phân tích hấp thụ và phát ra ánh sáng ở bước sóng phát xạ dài hơn bước sóng kích thích Ánh sáng phát xạ sẽ đi qua bộ lọc đơn sắc phát xạ ở vị trí góc bên phải so với ánh sáng kích thích Bộ đơn sắc phát xạ giảm thiểu tán xạ ánh sáng và sẽ quét ánh sáng phát xạ trước khi đến được bộ phận phát hiện (detector) Bộ phận phát hiện đo ánh sáng phát ra, hiển thị giá trị huỳnh quang và tạo ra các

tín hiệu huỳnh quang của chất phân tích Giá trị huỳnh quang là tỷ lệ thuận với nồng độ của các chất phân tích trong mẫu

1.3.7 Thiết bị đo quang phổ huỳnh quang theo thời gian

Sơ đồ khối thiết bị quang phổ huỳnh quang theo thời gian time-domain được biểu diễn

như ở hình 1.8

Hình 1.8 Sơ đồ khối hệ thiết bị quang phổ huỳnh quang phân giải thời gian

(1) Nguồn sáng LED kích thích: Kích thích phổ huỳnh quang của chất nghiên cứu

(2) Bộ tạo xung – Function generator: Bật và ngắt xung để theo dõi cường độ phát xạ huỳnh quang của chất nghiên cứu theo thời gian

(3) Nguồn cấp cho nguồn sáng LED

(4) Cuvet chứa mẫu

(5) Kính lọc sáng – long pass filter: Tránh ánh sáng tán xạ ảnh hưởng tín hiệu phát xạ huỳnh quang

(6) PMT - ống nhân quang: Bộ phận thu nhận và chuyển đổi tín hiệu quang phát xạ thành tín hiệu điện

(7) Nguồn cấp cho PMT

(8) Bộ hiện sóng- Oscilloscope: thu tín hiệu phát xạ huỳnh quang theo thời gian

Bộ hiện sóng

Kính lọc sáng Cuvet chứa

mẫu Nguồn sáng

(9) Máy tính điều khiển: Xử lý số liệu, tính toán kết quả phân tích

1.3.8 Ứng dụng của quang phổ huỳnh quang

- Định tính: Có thể dựa vào bước sóng kích thích và bước sóng huỳnh quang để định tính

các hợp chất

- Định lượng: Do phương pháp huỳnh quang có độ nhạy và độ đặc hiệu cao:

 Có thể đo cường độ huỳnh quang và dùng phương pháp so sánh để định lượng các

hợp chất có khả năng phát huỳnh quang lớn

 Với những chất không có huỳnh quang có thể tác dụng với thuốc thử không huỳnh

quang để tạo ra dẫn chất có huỳnh quang hay dùng thuốc thử có huỳnh quang để đo và sử

dụng các cách xử lý thích hợp

- Phân tích động học – động học huỳnh quang:

Phản ứng làm tắt huỳnh quang của phân tử chất phát quang S* bởi sự tương tác với phân tử

Q như sau:

S* + Q  S + Q Vận tốc phản ứng:

 và  tương ứng là thời gian tồn tại hay thời gian “sống” (lifetime) của chất phát

quang S* khi không có và khi có tương tác với Q

Do đó, giá trị kq được tính từ hệ số góc của đường thẳng biểu diễn mối quan hệ giữa đại

lượng  ⁄ và [Q] 

Ngoài ra ghi phổ huỳnh quang còn được sử dụng trong bộ phận phát hiện của sắc ký lỏng,

vì tính đặc hiệu cao và độ nhạy của nó với nguồn sáng laser nên giới hạn phát hiện có thể tới

g

1.3.9 Động học các quá trình phát quang

Một chất khi hấp thụ bức xạ, phân tử được chuyển từ mức năng lượng này lên mức năng lượng khác cao hơn [9] Năng lượng mà phân tử được bổ sung khi hấp thụ bức xạ không được giữ lâu, khoảng - (s) Có nhiều cách để phân tử làm biến đổi năng lượng hấp thụ đó, sự va chạm giữa các phân tử dẫn tới việc phân bố lại năng lượng giữa chúng Do đó năng lượng dư mà phân tử có được do hấp thụ bức xạ có thể chuyển thành các dạng năng lượng khác Vì thế khi một chất hấp thụ bức xạ bị nóng lên, từ trạng thái kích thích e có thể trở về trạng thái cơ bản bằng con đường phát huỳnh quang và lân quang Do đó khi nghiên cứu động học các quá trình quang hóa cần biết thời gian sống của trạng thái kích thích, hiệu suất lượng tử và hằng số vận tốc các quá trình

Cơ chế của phản ứng quang hóa:

S1 h + S0 (phát huỳnh quang) kH[S1]

SI S0 + (nhiệt chuyển dời nội phân tử) ks[S1]

SI T1 + (nhiệt chuyển dời ngoại phân tử) kST[S1]

T1 S0 + h (phát lân quang) kL[T1]

T1 S0 + (nhiệt chuyển dời chéo) kT[T1]

Với I là tốc độ (cường độ) hấp thụ photon, [S1] và [T1] là nồng độ mol/l các trạng thái tương ứng

1.3.9.1 Xác định thời gian sống của trạng thái kích thích

Giả thiết trạng thái kích thích singlet bị giải hoạt bằng con đường phát huỳnh quang, nghĩa là:

S1  S0 + h

Vậy , [S1] = [ và ln (1.7)

Trong đó [ là nồng độ phân tử bị kích thích ở thời điểm t=0

Theo định nghĩa, thời gian sống của trạng thái kích thích là thời gian cần thiết để số phân tử kích thích ban đầu giảm e lần, và vậy thay [ /[S1] =e vào 1.7 ta có:

= (1.8) Khi đó là thời gian sống của trạng thái kích thích khi nó bị giải hoạt theo phương thức duy nhất là phát bức xạ Trong thực tế, bên cạnh sự phát tia bức xạ, phân tử còn có thể bị giải hoạt bằng nhiều con con đường phi bức xạ khác như chuyển dời nội, chuyển dời chéo, phản ứng hóa học, cho nên thời gian sống xác định bằng thực nghiệm sẽ bé hơn 0 và có giá trị:

= ∑ (1.9)

Trong đó ki là hằng số tốc độ của quá trình giải hoạt i (bức xạ và phi bức xạ)

Như vậy, thời gian sống của trạng thái kích thích được đặc trưng bằng nghịch đảo của tổng các hằng số tốc độ giải hoạt trạng thái đó

Mặt khác, thời gian sống cũng có thể xác định trên cơ sở phổ hấp thụ theo công thức gần đúng sau:

 

giây (1.10) Trong đó:

1.3.9.2 Xác định hằng số tốc độ của các quá trình giải hoạt

Giả thiết trạng thái cơ bản S0 được kích thích lên trạng thái singlet S1 Từ S1 nếu không

có các quá trình truyền kích thích lưỡng phân tử thì phân tử có thể phát huỳnh quang (hằng

số tốc độ kH), chuyển dời nội (kS) về S0 hoặc chuyển dời chéo (kST) về trạng thái triplet T1 Sau dó từ T1 phân tử có thể trở về trạng thái S0 hoặc bằng cách phát lân quang (kL), hoặc chuyển dời chéo (kT)

Áp dụng nguyên lý riêng độ ổn định cho các trạng thái S1 và T1 ta có:

I = ( kH + kS + kST )[S1] (1.11) Và: kSTS1 = (kL + kT)[T1] (1.12)

 [S1] =

(1.13)

[T1] =

(1.14) Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (H) và lân quang (L) là tỉ số giữa tốc độ các quá trình tương ứng và tốc độ hấp thụ, nghĩa là:

H = (1.15)

L = (1.16)

(

) (1.17)

Tỉ số được xác định bằng cách so sánh cường độ của phổ lân quang và huỳnh quang, kL

và kH được xác định dựa vào giá trị 0

+ Xác định kT và kST: Giả thiết rằng tất cả các phân tử bị kích thích, nếu không phát lân quang hoặc huỳnh quang thì con đường giải hoạt phi bức xạ chủ yếu là qua trạng thái T1, trong trường hợp đó có thể viết:

hoặc kT kL* + (1.18)

Nếu biết kT, dựa vào biểu thức 1.18 ta tính được kST Nếu kT << kL, ta có thể bỏ qua kT Khi đó:

kST = = (1.19) Trong đó : thời gian sống ở trạng thái singlet S1

1.4 Tổng quan về phức chất Ruteni(II) polypiridin

Phức chất Ruteni(II) được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như quang hóa học [44, 45], xúc tác quang hóa [24], pin mặt trời hữu cơ [16] và dùng làm đầu dò huỳnh quang phát hiện một

số phân tử sinh học [17,18,25,35] Trong đó, phức chất Ruteni(II) polypiridin cho cường độ tín hiệu huỳnh quang lớn, thời gian phát xạ huỳnh quang dài và độ dịch chuyển Stockes lớn nên chúng được xem là lựa chọn tối ưu để thiết kế đầu dò phát hiện amino axit, peptit, polypeptit, protein, ADN….Trong các phản ứng, phức tris(bipyridin) Ruteni(II) chloride – được xem là chất chuẩn để so sánh với các loại phức Ruteni(II) polypiridin Ion kim loại chuyển tiếp trung tâm tạo thành phức bát diện với ba phối tử -bipyridin (bpy)

Hình 1.9 Cấu trúc bát diện của phức

Phối tử (bpy) vừa có khả năng cho electron (-donor) do có cặp electron tự do ở nguyên

tử N, vừa có khả năng nhận electron (-acceptor) do orbital  không định vị ở vòng thơm Orbital phản liên kết  *

của (bpy) có mức năng lượng thấp hơn orbital phản liên kết  *

của

Ru2+, nên ở trạng thái cơ bản phức rất dễ hấp thụ năng lượng để chuyển lên trạng thái kích thích do bước chuyển dời điện tử kim loại – phối tử (MLCT) Do đó phức chất của Ruteni(II) có khả năng phát xạ huỳnh quang với hiệu suất lượng tử huỳnh quang lớn

Công trình nghiên cứu [45] cho thấy, phức tương tác chọn lọc với amino

axit Tyrosin trong môi trường kiềm mạnh Trong đó, phản ứng giữa phức [Ru(bpy)3]Cl2 ở

trạng thái kích thích và axit amin Tyrosin là phản ứng cho nhận electron (sơ đồ 1) Tyrosin

đóng vai trò là chất khử cho electron (donor) và [Ru(bpy)3]2+* là chất oxi hóa nhận electron

(acceptor)

Sơ đồ 1: Phản ứng quang oxi hóa-khử giữa phức [Ru(bpy) 3 ]Cl 2 và axit amin Tyrosin; pH 12

Hằng số tốc độ phản ứng quang oxi hóa-khử (kq) được xác định theo phương trình

Stern-Volmer:

 ⁄   (1.20)

Trong đó:

 và  tương ứng là thời gian tồn tại hay thời gian “sống” (lifetime) của phức ở trạng

thái kích thích khi không có và khi có Tyrosin;  được xác định từ dữ liệu phổ huỳnh

quang phân tử phân giải thời gian theo điều kiện ghi phổ

: nồng độ Tyrosin trong dung dịch

Từ các giá trị  đo được, kq sẽ được tính từ hệ số góc của đường thẳng biểu diễn mối quan hệ

giữa đại lượng  ⁄ và [Tyr] (phương trình Stern-Volmer) 

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu phương pháp động học huỳnh quang xác định Tyrosin dựa trên phản ứng

với phức Ruteni(II) polypiridin bằng phương pháp phổ huỳnh quang phân tử phân giải thời gian

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

2.1.2.1 Nghiên cứu đặc trưng quang phổ của phức chất Ruteni(II) polypiridin

Tiến hành khảo sát phổ hấp thụ và phổ phát xạ của phức Ruteni(II) polypiridin để chon bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ thích hợp

2.1.2.2 Ảnh hưởng của pH tới động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức [Ru(bpy) 3 ]Cl 2 và phức Tyrosin

Thế oxi hóa của phức [Ru(bpy)3]2+* trong nước không phụ thuộc vào pH hay nói cách khác khả năng oxi hóa của phức [Ru(bpy)3]2+* không bị ảnh hưởng bởi pH Tuy nhiên, thế khử của Tyrosin lại phụ thuộc vào pH của môi trường (hình 2.1) [21] Tyrosin có tính khử mạnh trong môi trường kiềm

Hình 2.1: Thế khử chuẩn của Tyrosin theo pH

Do đó ảnh hưởng của pH tới động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức

[Ru(bpy)3]Cl2 và phức Tyrosin cần phải được khảo sát

2.1.2.3 Ảnh hưởng của ion lạ tới động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức

[Ru(bpy) 3 ]Cl 2 và Tyrosin

Ion lạ có mặt trong dung dịch có thể gây ảnh hưởng tới khả năng phát huỳnh quang của

chất phân tích Tùy thuộc vào tính chất lý hóa của ion đó mà nó có thể làm giảm cường độ

huỳnh quang hoặc làm biến đổi tính chất hóa học của chất phát quang do đó phải hạn chế tối

đa sự có mặt của các ion lạ đó Vì vậy, ảnh hưởng của một số ion lạ

như đến động học phản ứng quang oxi hóa khử giữa phức

[Ru(bpy)3]Cl2 và với Tyrosin được nghiên cứu trong luận văn này

2.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của lực ion tới động học phản ứng của phức chất Ruteni(II)

polypiridin và amino axit Tyrosin

Trong môi trường kiềm mạnh, phân tử Tyrosin tồn tại ở dạng phân ly hoàn toàn (pKa3 = 10.1)

[26] có điện tích –2 và điện tích của ion phức là +2 Các chất phản ứng mang điện tích nên

một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tương tác giữa chúng là lực ion I của dung

dịch [33] Vì vậy, một phần trong luận văn này tôi nghiên cứu ảnh hưởng của lực ion tới

động học giữa phức [Ru(bpy)3]Cl2 và axit amin Tyrosin

Theo Lewis và Randall lực ion được tính bằng công thức:

I = 1/2cizi2 (2.1) Trong đó : ci – nồng độ(M)

zi – điện tích

- Phản ứng giữa 2 ion A và B, trước khi tạo ra sản phẩm chúng phải trải qua một trạng thái

chuyển tiếp X≠ = A.B:

k0 = k’K (2.7) Thay k0 = k’K vào biểu thức 2.6, ta có:

log (2.11) Khi đó phương trình (2.11) được biểu diễn như sau:

log = 2A (2.12)

Phương trình (2.12) cho thấy lực ion có ảnh hưởng tới hằng số tốc độ của phản ứng Sự ảnh hưởng này là khác nhau đối với các chất có điện tích khác nhau Lực ion càng cao, nó càng có ảnh hưởng mạnh đến tốc dộ phản ứng và ngược lại

2.1.2.5 Xây dựng quy trình định lượng amino axit Tyrosin dựa trên phản ứng với phức chất Ruteni(II) polypiridin

* Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Mẫu Tyrosin được đựng trong lọ thủy tinh sạch Mẫu được xử lý ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 0 - 6C

*Các bước tiến hành khảo sát lựa chọn điều kiện cho quá trình định lượng Tyrosin dựa trên phản ứng với phức chất Ruteni(II) polypiridin

 Khảo sát xác định khoảng nồng độ của Tyrosin trong thực nghiệm: với mẫu Tyrosin chuẩn, pha trong dung dịch có pH =12 Tăng dần khối lượng Tyrosin trong mỗi lần cân đến khi Tyrosin còn có thể tan hoàn toàn Tìm được nồng độ lớn nhất có thể dùng của Tyrosin

 Cố định bước sóng của xung kích thích, ghi phổ phát xạ phân tử của phức tại bước sóng phát xạ đã chọn theo thời gian

 Ghi phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian của phức Ruteni(II) polypiridin trong dung dịch có Tyrosin với nồng độ tăng dần Thiết lập mối quan hệ giữa đại lượng  ⁄ và [Tyr] theo phương trình 1.20 để định lượng amino axit Tyrosin

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Phức Ruteni(II) polypiridin với phối tử loại A gồm: [Ru(bpy)3]Cl2 và

Trong đó:

bpy: 2,2’-bipyrydine;

dpq: dipyrido[3,2-d:2,3-f] quinoxaline bis(o-xylene);

bxbg : bipyridineglycoluril

- Tyrosin, casein, albumin huyết thanh bò (BSA)

- Máy đo quang Aligent 8453

- Hệ thiết bị đo phổ phát xạ phân tử phân giải thời gian (PTN Bộ môn Hóa phân tích - Viện Kỹ thuật Hóa học, ĐHBKHN)

- Cuvet huỳnh quang (thạch anh)

Khảo sát khoảng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa thời gian tồn tại hay thời gian

“sống” (lifetime) của phức ở trạng thái kích thích và nồng độ axit amin theo phương trình (1.20) Thường làm từ 5-7 nồng độ của chất phân tích Ta nới rộng khoảng nồng độ của chất phân tích đến khi không còn sự tuyến tính giữa nồng độ và thời gian tồn của tại phức Ruteni(II) polypiridin nữa

Tín hiệu các lần đo của mỗi nồng độ phải có độ lặp lại đạt yêu cầu Khi thẩm định phương pháp, mỗi nồng độ cần được đo 3 lần để kiểm tra độ lặp lại của các nồng độ chuẩn Mối tương quan giữa nồng độ chất phân tích và thời gian tồn tại của phức ở trạng thái kích thích được biểu diễn bằng phương trình và hệ số tương quan hồi quy

Yêu cầu: Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và hệ số tương quan hồi quy nằm trong khoảng 0.99   1

 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp

- Tiến hành phân tích các khoảng nồng độ khác nhau (thấp, trung bình, cao) trên cùng một mẫu phân tích Mỗi nồng độ làm lặp lại 6 lần

- Tính kết quả dựa vào đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện

- Xác định độ lặp lại bằng cách tính độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối theo công thức:

SD = √∑

2.13) RSD% = CV% = 100 (2.14) Trong đó:

SD: Độ lệch chuẩn

RSD: độ lệch chuẩn tương đối

: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i”

n: Số lần thí nghiệm

x= Giá trị trung bình của các lần thí nghiệm

Nếu RSD càng nhỏ, phương pháp có độ lặp lại càng cao và ngược lại