BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁTMỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS VIÊM GAN B

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS VIÊM GAN B TS... Đặt vấn đề  Nhiễm virus viêm gan B: vấn đề mang tính toàn cầu • Việt Nam: vùng lưu hành dịch cao  Sự xuất hiện c

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN TẠI VÙNG GEN S VIRUS

VIÊM GAN B

TS Bạch Khánh Hoà

VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG

Huế, 06-2006

Đặt vấn đề

 Nhiễm virus viêm gan B: vấn đề mang tính toàn cầu

• Việt Nam: vùng lưu hành dịch cao

 Sự xuất hiện các đột biến trong hệ gen virus gây khó khăn cho việc chẩn đoán, dự phòng lây nhiễm & điều trị

• Các đột biến vùng gen S gây biến đổi kháng nguyên bề mặt

o Mạn tính (xơ gan, viêm gan, ung thư gan)

• Con đường lây truyền:

o Từ mẹ sang con

o Tiêm chích

o Tình dục

Hình 1 Mô hình cấu trúc HBV

Pre-S1 Pre-S2 HBsAg

HBcAg

ADN

Hình 2 Cấu trúc hệ gen virus viêm gan B

Hình 3 Mô hình quyết định kháng nguyên “a” trên HBsAg

12 4

137 139

142

145 147

Các kỹ thuật phát hiện virus viêm gan B

• Thử nghiệm miễn dịch đồng vị phóng xạ (RIA)

• Thử nghiệm miễn dịch gắn men (ELISA)

• Phản ứng khuếch đại trình tự gen (PCR)

• Phản ứng phát hiện axit nucleic (NAT)

Các dạng đột biến virus viêm gan B

• Đột biến vùng gen S

• Đột biến gen lõi (precore, core)

• Đột biến gen polymerase

• Đột biến gen X

Mục đích nghiên cứu

• Tìm hiểu tần suất đột biến kháng nguyên bề mặt ở

nhóm đối tượng mang HBsAg chưa qua điều trị.

• Khảo sát một số dạng đột biến hay gặp ở vùng gen

S virus viêm gan B.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (1)

• Đối tượng:

o 75 bệnh nhân được chỉ định theo dõi viêm gan B

(1 - 12/2005) tại Viện Huyết học - Truyền máu TW

o Độ tuổi: 18-43

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (2)

 Phương pháp nghiên cứu

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (3)

 Khuếch đại gen bằng PCR

• Tách chiết ADN từ máu toàn phần sử dụng bộ kit

QIAamp DNA Blood Mini kit (QIAGEN, Mỹ)

• Phản ứng PCR: Kit PCR Master mix (PROMEGA, Mỹ)

• Cặp mồi sử dụng: theo nghiên cứu của Kobayashi &

Koike (4)

 Sản phẩm phản ứng được điện di trên agarose

gel 1,5% và được phát hiện bằng tia UV.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (4)

 Giải trình tự nucleotide & axit amin tương ứng:

• Sử dụng kit sinh phẩm và máy của hãng

AppliedBioSystem (Mỹ).

• Phần mềm xử lý số liệu: Sequencing analysis,

SeqSpace, DNA Star.

S nhờ PCR

Tách ADN từ gel agarose

Điện di ADN trên gel agarose

Định lượng và đánh giá

độ tinh sạch của ADN

Giải trình tự gen S

Phân tích kết quả

l ớ n Những m ẫ u này nhi ề u kh ả năng ch ứ a đ ộ t bi ế n HBsAg, vì v ậ y chúng tôi l ự a ch ọ n đ ể ti ế p t ụ c ti ế n hành

ph ả n ứ ng PCR

– 01 mẫu không phát hiện thấy sản phẩm điện di

Hình 4 Ảnh điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%

Kết quả và bàn luận (3)

 Giải trình tự nucleotide và axit amin tương ứng

- 08 mẫu hiện băng sản phẩm PCR được sử dụng tiếp cho việc giải trình tự nucleotide Trình tự thu được sẽ được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng để xác định trình tự axit amin tương ứng

- Trình tự axit amin của 8 mẫu trên được so sánh với

trình tự axit amin chuẩn (bình thường) AB031266 nhằm

tìm ra những đột biến nếu có.

Hình 5 Phần mềm giải trình tự nucleotide

vùng gen S virus viêm gan B

So sánh trình tự axit amin của 8 mẫu HBV với mẫu

chuẩn AB031266

Mẫu 108

118 128 138 AB03126 6 G12 G27 G28 G41 G79 G88 G124 G130 PLIPGSSTT S - - -

- - - - - - - - G - - -

- - -

- -D-E T

- -L - -T - - -R - I - - -

TGPCRTCTTP - - -

A

A

R K P S

K

- - - - - - - - - R AQGTSM FPSC - - - - F

-CCTK PTDGNC

Mẫu 148

158 168 178 AB031266 G12 G27 G28 G41 G79 G88 G124 G130    TCIPIPSSWA

-F AK Y L W E W AS - -T F

- - -

F

C

F

T F

-VRFSWLSLV

-F I

- PF - -

- -

- -

- -

- -

- -

- -

Kết quả và bàn luận (4)

Tần số và phân bố ĐB điểm trên gen S:

• Trong số 8 mẫu xác định được 41 ĐB (26 ĐB sai nghĩa +

15 ĐB im lặng) tại 27 vị trí, trung bình: 5 ĐB/mẫu.

• Mỗi mẫu đều có ít nhất một đột biến sai nghĩa.

• Tần suất đột biến HBsAg ở nghiên cứu này là

10,7%, thấp hơn kết quả của TTT.Huy và cs (2003), LTT.Thuy & cs (2005), do:

o Chưa giải trình tự nucleotide cho tất cả các mẫu

o Đối tượng nghiên cứu không thuộc nhóm có áp lực miễn dịch cao

Kết quả và bàn luận (5)

Kết quả và bàn luận (6)

- Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Huyết học - Truyền máu TW, Labo trung tâm Y sinh - Đại học Y Hà Nội, công ty BioRad và những cán bộ, bệnh nhân đã

giúp đỡ chúng tôi tiến hành nghiên cứu này;

- Xin cảm ơn sự theo dõi của quý vị đại biểu!