PHÂN TÍCH một số CHỈ TIÊU VI SINH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG AN TOÀN vệ SINH THỰC PHẨM ở các mẫu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG VŨ THỊ CHÂM PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM Ở CÁC MẪU TIẾT CANH TR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG

VŨ THỊ CHÂM

PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM Ở CÁC MẪU TIẾT CANH TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẢI DƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM Y HỌC

HẢI DƯƠNG, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG

VŨ THỊ CHÂM

PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU VI SINH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM Ở CÁC MẪU TIẾT CANH TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HẢI DƯƠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM Y HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.BS TRẦN QUANG CẢNH

HẢI DƯƠNG, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Luận văn này là đề tài nghiên cứu thực sự của cá nhân tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Trần Quang Cảnh

Các số liệu, những kết quả nghiên cứu được trình bày trong khóa luận này trung thực và chưa được công bố dưới bất cứ hình thức nào

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Hải Dương, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Vũ Thị Châm

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, sau một thời gian với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi cũng đã nhận được không ít sự giúp đỡ, quan tâm và động viên của thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết,tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương là môi trường giúp tôi học tập được nhiều kiến thức và khoa Xét nghiệm đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bài khóa luận này cùng với sự góp ý chân thành của thầy cô trong Hội đồng khoa học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới thầy TS.Trần Quang Cảnh đã hướng dẫn và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm khóa luận

Tôi cũng chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Xét nghiệm đặc biệt là Labo An toàn Vệ sinh Thực phẩm trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, tôi hết lòng cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người đã giúp đỡ tôi về vật chất cũng như về tinh thần và là động lực rất lớn để tôi vượt qua khó khăn trong thời gian làm khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hải Dương, ngày 3 tháng 7 năm 2015

Sinh viên

Vũ Thị Châm

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATVSTP : An toàn vệ sinh thục phẩm

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình ngộ độc do tiết canh 3

1.1.1 Trong nước 3

1.1.2 Trên địa bàn Hải Dương 3

1.2 Tầm quan trọng của an toàn vệ sinh thực phẩm 3

1.3 Một số chỉ tiêu vi sinh có trong tiết canh 4

1.3.1 Coliform 4

1.3.2 Escherichia coli 5

1.3.3 Salmonella 6

1.3.4 Staphylococcus aureus 8

1.3.5.Streptococcus suis (liên cầu lợn) 9

1.4 Các con đường VSV nhiễm vào tiết canh và giới hạn cho phép các chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm 11

1.4.1 Các con đường nhiễm VSV vào tiết canh 11

1.4.2 Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu VSV trong thực phẩm 12

CHƯƠNG 2:ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.1 Mẫu tiết canh 13

2.1.2 Các chỉ tiêu xét nghiệm vi sinh 13

2.2 Vật liệu nghiên cứu 13

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 13

2.2.2 Môi trường, hóa chất 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu 15

2.3.2 Phương pháp định lượng Coliforms – kỹ thuật đếm khuẩn lạc 15

2.3.3 Phương pháp định lượng E.coli dương tính β – glucuronidase 18

2.3.4 Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch 21

2.3.5 Phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng coagulase dương tính (S.aureus) 25

2.3.6 Quy trình phân lập, xác định S.suis 29

2.3.7 Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang và hồi cứu 31

2.3.8 Cỡ mẫu và chọn mẫu 31

2.3.9 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 32

2.3.10 Biện pháp hạn chế sai số 32

2.3.11 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 33

2.3.12 Đạo đức nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Một số chỉ tiêu vi sinh trong các mẫu tiết canh 34

3.2 Mức độ ô nhiễm VSV của từng loại vi khuẩn trong các mẫu tiết canh nghiên cứu 36

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 38

4.1 Thông tin chung 38

4.2 Một số chỉ tiêu vi sinh trong tiết canh 38

4.3 So sánh mức độ ô nhiễm giữa các loại tiết canh 42

KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Giới hạn cho phép các chỉ tiêu VSV trong thực phẩm 12 Bảng 2.1 Cỡ mẫu được chọn có chủ đích với số lượng như sau: 31 Bảng 2.2 Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu VSV trong mẫu tiết canh 32

Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm Coliforms, E.coli, S.aureus trong tất cả các mẫu tiết

canh 34

Bảng 3.2: Tỷ lệ nhiễm Salmonella và S.suis trong từng loại tiết canh 34 Bảng 3.3: Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Coliforms, E.coli, S.aureus trong từng loại

tiết canh 35

Bảng 3.4: Tỷ lệ đồng thời vượt hai hoặc ba chỉ tiêu vi khuẩn Coliforms, E.coli

và S.aureus trong tất cả các mẫu tiết canh 35 Bảng 3.5: Mức độ ô nhiễm của Coliforms trong các mẫu tiết canh nghiên cứu.

36

Bảng 3.6: Mức độ ô nhiễm của E coli trong các mẫu tiết canh nghiên cứu 36 Bảng 3.7: Mức độ ô nhiễm của S.aureus trong các mẫu tiết canh nghiên cứu.

37

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 KL Salmonella trên môi trường XLD 22

Hình 2.2 KL Salmonella trên môi trường HE 22

Hình 2.3 KL Salmonella trên môi trường BPLS 23

Hình 2.4 Hình thể KL và vi khuẩn S suis trên thạch máu 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển của kinh tế xã hội thì đời sống của con người cũng ngày càng được nâng cao Do đó, ATVSTP được coi là vấn đề quan trọng và được đặt lên hàng đầu Một trong những yếu

tố dẫn đến ngộ độc thực phẩm là thói quen ăn uống không đảm bảo vệ sinh của người dân như ăn tiết canh, gỏi, Mặc dù đã được Bộ y tế khuyến cáo nhưng nhiều thói quen của người dân vẫn chưa được thay đổi và dẫn đến nhiều vụ ngộ độc thực phẩm [12]

Ở nước ta, mỗi năm có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 người và 100-200 ca tử vong, trong đó nguyên nhân do VSV chiếm 33-49% [11]

Tiết canh là một món ăn ưa thích của người dân Việt Nam từ đồng bằng tới miền núi và đã có từ rất lâu Hiện nay, tiết canh đang được bày bán nhiều ở khắp nơi Hầu hết người dân Việt Nam biết đến tiết canh như một món ăn ngon Tuy nhiên, theo nghiên cứu của trung tâm dinh dưỡng thành phố Hồ Chí Minh thì món tiết canh chứa nhiều sắt nhưng sắt trong tiết canh

cơ thể không hấp thụ được vì dễ bị oxy hóa thành Fe3+ khi chế biến Ngoài ra, trong tiết canh có chứa rất nhiều chất đạm, ít chất béo và đường, các loại vitamin A, B2, Ca, P là môi trường thuận lợi cho nhiều mầm bệnh gây bệnh

phát triển như giun sán, các loại vi khuẩn thường gặp như: S.aureus, E.coli,

Salmonella, đặc biệt là liên cầu lợn [11] Do đó, những người dân có thói

quen ăn tiết canh có nguy cơ bị ngộ độc rất cao và có thể dẫn đến tử vong

Có rất nhiều vụ ngộ độc do ăn tiết canh như: ở Lào Cai với hơn 30 người bị ngộ độc tiết canh ngựa và ở huyện Đắk GLong cũng xảy ra vụ ngộ độc tập thể do ăn tiết canh lợn với hơn 20 người bị nạn [13]

Để người dân ý thức hơn và loại bỏ thói quen ăn tiết canh thì việc tìm

hiểu về nguyên nhân dẫn đến ngộ độc do các VSV như: Coliforms, E.coli,

Salmonella, tụ cầu vàng, liên cầu lợn và mức độ nguy hiểm của chúng gây ra

là rất cần thiết Tại thành phố Hải Dương, chưa có nghiên cứu nào thực hiện phân tích các chỉ tiêu vi sinh liên quan đến ngộ độc thực phẩm do ăn tiết canh

Trong đề tài này, nghiên cứu tập trung xác định: E.coli, S.aureus, Salmonella,

Coliforms và S.suis là một trong số các chỉ tiêu quy định trong kiểm tra VSV

đã được ghi danh trong mục tiêu chuẩn vi sinh thực phẩm theo Quyết định

867 của Bộ Y tế năm 1998 [8] Chính vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Phân tích một số chỉ tiêu vi sinh đánh giá chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm ở các mẫu tiết canh trên địa bàn thành phố Hải Dương” với

mục tiêu nghiên cứu như sau:

1 Xác định một số chỉ tiêu vi sinh đánh giá chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm ở các mẫu tiết canh trên địa bàn thành phố Hải Dương

2 So sánh mức độ ô nhiễm VSV giữa các loại tiết canh trên địa bàn thành phố Hải Dương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ngộ độc do tiết canh

- Vụ ngộ độc thực phẩm tại bếp ăn tập thể của một gia đình tại Lào Cai với tổng số 53 người ăn (có 22 người ngộ độc) được Chi cục An toàn vệ sinh

thực phẩm Lào Cai kết luận là do căn nguyên vi khuẩn tụ cầu vàng, E.coli

trong tiết canh lợn và canh rau ngót nấu tiết [12]

- Sáng 4/12, tại thôn 4, xã Đắk P’Lao, huyện Đắk GLong xảy ra vụ ngộ độc tập thể do ăn tiết canh lợn với hơn 20 người bị nạn, hầu hết là thanh niên, trong đó 10 người bị ngộ độc nặng phải đưa đi cấp cứu tại bệnh viện [13]

- Ngày 17/09/2012 Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương xác nhận chỉ trong vòng 1 tháng có 3 bệnh nhân tử vong do ăn tiết canh lợn [14]

1.1.2 Trên địa bàn Hải Dương

- Ngày 29/10/2011 bệnh viện huyện Nam Sách đã tiếp nhận, điều trị 5 người bị ngộ độc do ăn tiết canh lòng lợn ở xã Nam Đồng [14]

- Ngày 27/1/2014 sau 1 tuần lấy ngẫu nhiên 10 mẫu tiết canh trên địa bàn thành phố Hải Dương để xét nghiệm, Chi cục ATVSTP đưa ra kết quả tất

cả các mẫu tiết canh đều nhiễm vi khuẩn E.coli và S.aureus [14]

1.2 Tầm quan trọng của an toàn vệ sinh thực phẩm

Chất lượng ATVSTP là một trong những mối quan tâm hàng đầu hiện nay Thực phẩm là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng cho sự phát triển của cơ

thể, đảm bảo cho sức khỏe con người nhưng đồng thời cũng là nguồn gây bệnh nếu không đảm bảo vệ sinh Về lâu dài, thực phẩm không những tác động thường xuyên tới sức khỏe con người mà còn ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống

Sử dụng các thực phẩm không đảm bảo vệ sinh trước mắt có thể bị ngộ độc cấp tính với các triệu chứng dễ nhận thấy, nhưng vấn đề nguy hiểm là sự tích lũy dần các chất độc hại trong cơ thể và sau một thời gian mới biểu hiện bệnh

Ngoài ra, ATVSTP cũng tác động không ít tới kinh tế Đối với Việt Nam và nhiều nước đang phát triển khác, lương thực, thực phẩm là loại sản phẩm chiến lược, ngoài ý nghĩa kinh tế còn có ý nghĩa chính trị, xã hội rất quan trọng Chất lượng ATVSTP không đảm bảo gây ra những thiệt hại như:

- Thiệt hại do các bệnh gây ra từ thực phẩm đối với cá nhân là chi phí khám bệnh, phục hồi sức khỏe, chi phí do chăm sóc người bệnh, sự mất thu nhập do phải nghỉ làm việc,

- Đối với nhà sản xuất, đó là những chi phí do phải thu hồi, lưu giữ sản phẩm, huỷ hay loại bỏ sản phẩm, những thiệt hại do mất lợi nhuận do thông tin quảng cáo và thiệt hại lớn nhất là mất lòng tin của người tiêu dùng

- Ngoài ra còn có các thiệt hại khác như phải điều tra, khảo sát, phân tích, kiểm tra độc hại, giải quyết hậu quả

Do vậy, vấn đề đảm bảo ATVSTP để phòng các bệnh gây ra từ thực phẩm có ý nghĩa thực tế rất quan trọng trong sự phát triển kinh tế xã hội, bảo

vệ môi trường sống của các nước đã và đang phát triển, cũng như nước ta [13]

1.3 Một số chỉ tiêu vi sinh có trong tiết canh

1.3.1 Coliform

1.3.1.1 Đặc điểm chung

Coliforms là nhóm sinh vật chỉ thị mức độ ATVSTP vì số lượng nhất

định hiện diện trong thực phẩm, trong nước hay trong mẫu môi trường được coi như dấu hiệu chỉ thị khả năng có mặt của các VSV gây bệnh khác [5]

1.3.1.2 Phân loại

Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, Coliforms được chia thành 2 nhóm nhỏ

là Coliforms và Coliforms phân Coliforms phân được quan tâm nhiều hơn và

có nguồn gốc từ người, động vật máu nóng bao gồm các giống Escherichia (bao gồm: E.coli), Klebsiella, Enterobacter

Coliforms có nguồn gốc từ phân phát triển nhanh khoảng thời gian 16

giờ trong môi trường dinh dưỡng ở 44oC

Coliforms không có nguồn gốc từ phân, chúng có nguồn gốc từ thủy

sinh, hay từ đất, mọc nhanh ở 4oC trong 3- 4 ngày và trong 10oC trong 1 ngày Loại vi khuẩn này không mọc ở 41oC và ở 44oC ức chế hoàn toàn [8]

1.3.1.3 Đặc điểm sinh vật hóa học

Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có phản

ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của β – galactosidase Vi khuẩn này

có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính

bề mặt khác có tính ức chế tương tự, có khả năng lên mên lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24- 48h [8]

1.3.1.4 Sự hiện diện của Coliforms

Coliforms là nhóm vi khuẩn rất phổ biến, có mặt ở khắp mọi nơi, có thể

tìm thấy cả trong đất, da, nước sông, nước ao hồ, rau cải và trong phân động vật

Sự có mặt của Coliforms trong nước hay rau được xem là một chỉ số về

sự tinh khiết của nước hay rau

Nhưng chỉ số này cũng không đáng tin cậy, bởi vì Coliform có thể sống

sót trong nước ấm, nhất là ở những vùng nhiệt đới như nước ta; do đó, sự hiện

diện của Coliform trong nước không hẳn có nghĩa là nước bị nhiễm phân [13]

1.3.2 Escherichia coli

1.3.2.1 Hình thể

Trực khuẩn E.coli có hình thẳng, kích thước dài ngắn khác nhau, trung

bình dài 2-3 µm, rộng 0,5 µm Ở môi trường không thích hợp, trực khuẩn có

thể dài như sợi chỉ Một số ít chủng có vỏ, hầu hết có lông và di động, không sinh nha bào, bắt màu gram âm

1.3.2.2 Sức đề kháng

Thuốc sát khuẩn thông thường như nước Javen 1/200, phenol 1/200 giết chết vi khuẩn này sau 2-4 phút, ở nhiệt độ 55oC vi khuẩn này chết sau 1 giờ, 60oC chết sau 30 phút

1.3.2.3 Tính chất sinh vật hóa học

- E.coli len men nhiều loại đường và sinh hơi như glucose, manitol,

lactose, ngoại trừ loại EIEC lactose (-); Thử nghiệm MR (+), VP (-), H2S (-)

- Thử nghiệm Urease (-), Indole (+); Citratsimmons (-)

1.3.2.4 Khả năng gây bệnh

- Nhóm ETEC: gây bệnh do ngoại độc tố LT (Labiletoxin) LT là loại độc tố ruột giống độc tố của phảy khuẩn tả Loại độc tố náy bám vào thụ thể ở ruột làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết ion Cl- và HCO3-

- Nhóm EIEC: gây bệnh do có khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng, gây bệnh gây bệnh giống trực khuẩn lỵ

- Nhóm EAEC: gây bệnh do bám vào niêm mạc làm tổn thương chức năng ruột

- Nhóm EHEC: làm tổn thương xuất huyết ở ruột, độc tố của nhóm này

có cấu trúc kháng nguyên và cơ chế tác động giống ngoại độc tố của S.shiga 1.3.2.5 Sự hiện diện của E.coli

Trong tự nhiên: có trong đường ruột của các động vật nhai lại đặc biệt là trâu, bò, cừu Trong thực phẩm: có trong rau cải, thịt, các sản phẩm từ sữa [4]

1.3.3 Salmonella

1.3.3.1 Hình thể

Salmonella là những trưc khuẩn có kích thước trung bình dài 3µm, rộng

0,5µm, có nhiều lông xung quanh thân, rất di động, không có vỏ Không sinh nha bào, nhuộm bắt màu gram âm

1.3.3.2 Sức đề kháng

Trực khuẩn Salmonella bị chết ở nhiệt độ 50oC/1 giờ hoặc 100oC/5

phút Với các thuốc sát khuẩn thông thường, trực khuẩn Salmonella dễ bị tiêu diệt Trong nước, trực khuẩn Salmonella sống được 2- 3 tuần, trong nước đá

và trong phân sống được 2- 3 tháng

1.3.3.3 Tính chất sinh vật hóa học

- Lên men đường glucose kèm theo sinh hơi (trừ S.typphi), không lên

men đường lactose, sinh H2S (trừ S.paratiphy A sinh chậm)

- Lên men đường manitol, di động

- LDC (+), trừ S.paratyphi A

- MR (+),VP (-) và citratsimmons (+/-)

- Indol (-), ureas (-), ONPG (-)

1.3.3.4 Độc tố

- Nội độc tố: nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột lang

hoặc chuột nhắt liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết Ruột non chuột xung huyết, màng payer phù nề, đôi khi hoại tử Nội độc tố có vai trò quyết

định trong tính chất gây bệnh của Salmonella

- Ngoại độc tố: ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kị khí, ngoại độc tố có thể điều chế thành giải độc tố

1.3.3.5 Cơ chế gây bệnh

Ngộ độc do Salmonella là loại ngộ độc thường gặp và có thể gây tử

vong, điều kiện cần thiết để gây ngộ độc là thực phẩm phải nhiễm với số lượng lớn, vi khuẩn vào cơ thể phải phóng ra một lượng độc tố lớn, sức đề kháng của cơ thể bị suy giảm

Người tiêu dùng sử dụng thực phẩm bị nhiễm khuẩn, từ đó vi khuẩn sẽ vào trong ruột và phát triển làm phá hỏng tế bào niêm mạc ruột, sau đó vào máu và tiết ra độc tố gây viêm ruột Độc tố thấm qua thành ruột vào máu gây nên các triệu chứng liên quan đến dạ dày như: đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy,

sốt cao kéo dài đến vài ngày Ngoài ra, vi khuẩn Salmonella còn có thể theo

hệ thống bạch huyết và tuần hoàn gây nên nhiểm trùng máu

1.3.3.6 Sự hiện diện của Salmonella

Trong tự nhiên: Salmonella hiện diện trong đường ruột của động vật

trong nước, động vật có vú, các loài chim máu nóng, lạnh Trứng có thể bị nhiễm do tiếp xúc với phân

Trong thực phẩm: Salmonella hiện diện trong thịt gia súc, gia cầm, trứng,

rau cải, xà lách, các sản phẩm bơ, sữa, cá và các loại tôm cua sò ốc [4]

1.3.4 Staphylococcus aureus

1.3.4.1 Hình thể

Tụ cầu là những vi khuẩn hình cầu có đường kính 0,8-1 µm đứng tụ lại với nhau thành từng đám như chùm nho; đôi khi có thể đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi hay từng chuỗi ngắn Tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động, không sinh nha bào, bắt màu gram dương

1.3.4.4 Độc tố

- Dung huyết tố (hemolysin) có 3 loại:

+ Dung huyết tố (α ); gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37oC, huyết tố này cũng có thể gây hoại tử da và gây chết

+ Dung huyết tố ( β): có tác dụng làm tan hồng cầu cừu ở 4oC, ít độc hơn dung huyết tố

+ Dung huyết tố (γ); có tác dụng lên hồng cầu và gây hoại tử da

- Nhân tố diệt bạch cầu: nhân tố này làm bạch cầu mất tính di động và bị phá hủy nhân

- Các độc tố ruột: gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp Có 6 loại độc

tố ruột (Enterotoxine A, B, C, D, E, F) bền với nhiệt trong đó có 2 loại được

Ngoại độc tố của tụ cầu vàng khi vào dạ dày, nhanh chóng thấm vào

niêm mạc dạ dày, ruột và vào máu sau đó tác động lên hệ thần kinh thực vật làm cường phó giao cảm gây tăng nhu mô động ruột làm dạ dày co bóp dẫn đến triệu chứng ngộ độc

1.3.4.6 Sự hiện diện của Staphylococcus aureus

Trong tự nhiên: có khoảng 30-50% dân số mang Staphylococcus trong

mũi và họng, nó được tìm thấy ngẫu nhiên trên da và tóc

Trong thực phẩm: có trong thịt sống và các sản phẩm thực phẩm từ sữa, các thực phẩm đóng hộp [4]

1.3.5.Streptococcus suis (liên cầu lợn)

1.3.5.1 Hình thể

Liên cầu là những cầu khuẩn bắt màu gram dương, đường kính 0,6-0,8

µm, xếp liên tiếp nhau thành từng chuỗi, dài ngắn khác nhau và có thể đứng với nhau thành từng đôi hoặc từng đám Liên cầu không có lông, không di động, không sinh nha bào và có vỏ

1.3.5.2 Sức đề kháng

Vi khuẩn liên cầu lợn có sức đề kháng kém, chúng dễ bị tiêu diệt bởi

các chất sát khuẩn và tẩy uế thông thường như Chloramin, nước Javen, nước vôi hoặc vôi bột

Các điều kiện thuận lợi để liên cầu phát triển ở lợn, đó là điều kiện chuồng trại kém, nhiễm phân rác ở chuồng trại, không có thông khí, lợn được chăn nuôi tập trung

1.3.5.3 Tính chất sinh vật hóa học

Liên cầu lợn cũng như các liên cầu khác:

- Không có enzym catalase

- Liên cầu lợn không bị ly giải bởi muối mật: optochin (-), thử nghiệm ly

giải bởi muối mật (-)

- Không mọc trong môi trường có 6% NaCl

- Thủy phân bile esculine, CAMP test (-), Bacitracin test (-)

1.3.5.4 Sự hiện diện của liên cầu lợn

Liên cầu lợn luôn có mặt trong môi trường và ký sinh bình thường ở

lợn nhưng không gây bệnh, hoặc chỉ gây các bệnh viêm nhiễm không thành dịch như viêm họng, nhiễm trùng mủ, nhiễm trùng phổi Liên cầu lợn chủ yếu sống ở các loài lợn đã thuần hóa, nhưng đôi khi cũng tìm thấy ở các loài lợn rừng, ngựa, chó, mèo và chim

Nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn là ở đường hô hấp trên đặc biệt là mũi, đường tiêu hóa và đường sinh dục Hiện có 2 typ liên cầu lợn thường gây bệnh ở lợn, typ 1 hay gây dịch bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn dưới 8 tuần tuổi, typ 2 gây bệnh ở nhiều lứa tuổi khác nhau Cả 2 typ này đều cư trú ở amidal, tỷ lệ mang liên cầu lợn không triệu chứng trong một đàn lợn khoảng 60-100% Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao nhất [1],[6]

1.3.5.5 Khả năng gây bệnh

Gây bệnh ở lợn

Lợn bị liên cầu khuẩn có thể có các biểu hiện sau: da lợn có thể có các

màng đỏ, sần, các hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp

bị sưng và có dịch, màng não và não có thể bị tổn thương dạng phù nề, dịch não tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc, có

mủ, viêm phế quản, viêm phổi Vi khuẩn có thể gây các bệnh ở lợn là viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi, bại huyết, bệnh đường tiêu hoá, viêm khớp, xuất huyết ở da, gây sẩy thai và gây chết đột ngột

Gây bệnh ở người

Bệnh liên cầu lợn (Streptococcus suis) được phát hiện ở nhiều nơi trên

thế giới Người nhiễm đầu tiên được phát hiện vào năm 1960 và số lượng bệnh nhân nhiễm 4 ngày càng tăng

Nhiễm Streptococcus suis có thể gây ra những bệnh rất nặng và nguy

hiểm đến tính mạng bệnh nhân, hay gặp nhất là gây viêm màng não, nhiễm khuẩn máu, viêm màng trong tim, một số trường hợp tiến triển tối cấp rất nhanh dẫn đến sốc nhiễm độc khuẩn gây suy đa phủ tạng và tử vong mà không kịp điều trị gì Thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài giờ đến 3 ngày [1]

1.4 Các con đường VSV nhiễm vào tiết canh và giới hạn cho phép các chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm

1.4.1 Các con đường nhiễm VSV vào tiết canh

VSV nhiễm vào tiết canh do 4 con đường:

- Do môi trường không đảm bảo vệ sinh, VSV từ đất, nước bẩn, không khí, dụng cụ, và các vật dụng khác nhiễm vào tiết canh như dao, thớt bẩn,

- Do thiếu vệ sinh trong quá trình chế biến, có thể nhiễm từ tay bẩn của người chế biến

- Không che đậy để côn trùng vật nuôi tiếp xúc vào tiết canh có mang theo vi khuẩn như ruồi, gián

- Do bản thân của tiết canh là nguồn chứa các loại VSV gây bệnh VSV này có thể bị nhiễm trong quá trình giết mổ, vận chuyển, bảo quản, chế biến, đặc biệt là các loài động vật đã mang vi khuẩn từ trước [8]

1.4.2 Giới hạn cho phép của các chỉ tiêu VSV trong thực phẩm (Quyết định số 867 của Bộ Y tế ngày 4/4/1998) [8]

Bảng 1.1 Giới hạn cho phép các chỉ tiêu VSV trong thực phẩm

Giới hạn cho phép

số lượng vi khuẩn trong 1g hay 1ml thực phẩm

Thịt tươi: thịt đông

lạnh, thịt xay nhỏ, thịt

chế biến (Phải qua

xử lý nhiệt trước khi

sử dụng

Tổng số vi khuẩn hiếu khí

E.coli S.aureus Coliforms Salmonella B.cereus

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu tiết canh

Tiêu chuẩn:

- Được bán trên địa bàn thành phố Hải Dương

- Khối lượng mẫu lớn hơn 100g

2.1.2 Các chỉ tiêu xét nghiệm vi sinh

- Thiết bị khử trùng khô (lò sấy) và khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)

- Tủ ấm, để duy trì môi trường đã nuôi cấy, các đĩa và ống ở trong dải nhiệt độ 35oC ± 1oC hoặc 37oC ± 1oC

- Tủ sấy hoặc tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ từ 25oC ± 1oC đến 50oC

mm

- Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc nhựa

- Que cấy thẳng và pipet Pasteur

- Pipet chia độ xả hết, có dung tích 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng 0,1 ml; 0,1 ml và 0,5 ml

- Dụng cụ dàn mẫu vô trùng, bằng thủy tinh hoặc nhựa

- PH mét, có thể đọc chính xác đến 0,01 đơn vị pH ở 25oC, có thể đo chính xác đến ± 0,1 đơn vị PH

2.2.2 Môi trường, hóa chất

- Nước đệm pepton

- Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL)

- Canh thang mật lactoza lục sáng

- Tha ̣ch trypton – mâ ̣t – glucoronid (TBX agar)

- Môi trường thạch Baird Parker

- Huyết tương thỏ

- Môi trường Magie clorua – lục malachit ( Rappaport – Vasiliadis Broth)

- Môi trường Selenit – cystin ( Selenit Cystin Broth)

- Thạch đỏ phenol-lục sáng (Brilliant-Green - Phenol red Lactose Agar)

- Thạch Hektoen enteric (Hektoen Enteric Agar)

- Thạch dinh dưỡng (Nutrient agar)

- Thạch 3 đường sắt ( TSI agar)

- Thạch Ure ( Ure Christensen Agar)

- Môi trường L – Lysin decacboxyl

- Thuốc thử - Galactosidase

- Thuốc thử Voges – Proskauer (VP)

- Thuốc thử Indol

- Thuốc thử Kovacs

- Canh thang Trehalose

- Canh thang 1% Salicin

Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm

và được hấp tiệt trùng (121oC/15 phút) [11]

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu

- Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu

Mẫu tiết canh được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy Stomatcher trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất

Cân chính xác 25g tiết canh đã được chuẩn bị cho vào bình có chứa 225

ml nước pepton đệm, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1

Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton đệm, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử

10-2 Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch mẫu thử 10-3 [11]

2.3.2 Phương pháp định lượng Coliforms – kỹ thuật đếm khuẩn lạc

2.3.2.1 Cấy và ủ mẫu

- Chuẩn bị 2 đĩa petri

- Dùng pipet vô trùng cho vào tâm của mỗi đĩa 1ml của mẫu thử, hoặc các dung dịch pha loãng

- Rót khoảng 15ml môi trường VRBL ở 44oC đến 47oC vào mỗi đĩa petri

- Trộn đều dịch cấy với môi trường và để cho hỗn hợp đông đặc lại, đặt đĩa ở một mặt phẳng

- Đồng thời chuẩn bị một đĩa kiểm tra với 15ml môi trường để kiểm tra

độ vô trùng

- Sau khi đông đặc hoàn toàn, rót khoảng 4ml môi trường VRBL ở

44oC đến 47oC lên bề mặt của môi trường cấy, để cho đông lại

- Lật ngược các đĩa để vào tủ ấm ở 30oC hoặc 37oC trong 24 giờ

2.3.2.2 Đếm các KL

- Chọn các đĩa có từ 10 – 150 KL

- Đếm các KL màu đỏ ánh tía có đường kính 0.5 mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh) bằng mắt thường Các KL này được

coi là các KL Coliforms điển hình và không cần khẳng định tiếp

- Đếm các KL không điển hình (ví dụ: kích cỡ nhỏ hơn, .) Việc chuyển hóa đường không phải là đường lactoza có thể làm cho hình dạng KL

nhìn tương tự như Coliforms điển hình

2.3.2.3 Khẳng định (KL không điển hình)

- Cấy 5 KL của từng loại không điển hình (nếu có), cho vào các ống nghiệm canh thang mật lactoza lục sáng

- Ủ các ống nghiệm trong tủ ấm ở 30oC hoặc 37oC trong 24h

- Quan sát kết quả: các ống Durham cho thấy có sinh khí thì được coi là

có chứa Coliform

2.3.2.4 Biểu thị kết quả

- Tổng số KL hoặc các KL điển hình

Tính số lượng (N) vi khuẩn có mặt trong mẫu thử theo trung bình từ 2

độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức:

Trong đó:

∑C: là tổng số KL đếm được trên hai đĩa được giữ lại từ hai độ pha

loãng liên tiếp và trong đó ít nhất một đĩa có chứa tối thiểu 10 KL

V: là thể tích dịch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng mililit

d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại (d = 1 khi sản phẩm dạng lỏng (mẫu thử) không pha loãng được giữ lại)

Làm tròn số các kết quả thu được đến 2 chữ số có nghĩa Lấy kết quả là

số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10, hoặc làm tròn số với hai chữ số có nghĩa

Biểu thị kết quả là N vi khuẩn trên 1g

- Trường hợp tính toán sau khi nhận dạng

Tính theo công thức:

a =

Trong đó:

a : số KL phù hợp tiêu chí trên mỗi đĩa

b: số KL phù hợp với các tiêu chí xác nhận trong số các KL đã nhận dạng A

C: tổng số KL giả định đếm được trên mỗi đĩa

Làm tròn kết quả tính được đến số nguyên gần nhất Nếu chữ số thứ nhất sau dấu phẩy nhỏ hơn 5 thì không thay đổi chữ số đứng trước nó, nếu lớn hơn hoặc bằng 5 thì tăng chữ số đứng trước lên một đơn vị

Tính số N, các vi khuẩn đã nhận dạng hoặc khẳng định có mặt trong

mẫu thử, thay ∑C bằng ∑a như trong 2.3.2.4 [11]

2.3.3 Phương pháp định lượng E.coli dương tính β – glucuronidase

2.3.3.1 Cấy va ̀ ủ

- Dù ng pipet vô trùng hoă ̣c micropipet vô trùng chuyển 1 ml di ̣ch pha loãng ban đầu (10-1) vào đĩa petri vô trùng

- Cấy vào hai đĩa ở mỗi đô ̣ pha loãng

- Lặp la ̣i quy trình trên cho các dung di ̣ch pha loãng thâ ̣p phân tiếp theo, sử du ̣ng mô ̣t pipet vô trùng mới cho mỗi đô ̣ pha loãng

- Ró t vào mỗi đĩa petri khoảng 15ml môi trường TBX đã được làm nguô ̣i đến 470C

- Trộn cẩn thâ ̣n di ̣ch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông

la ̣i, để các đĩa trên mă ̣t phẳng mát nằm ngang

- Lật ngươ ̣c các đĩa và để vào tủ ấm ở 44oC trong khoảng từ 18h đến 24h Tổng thời gian ủ không được quá 24h

Sau giai đoạn ủ, đếm các KL điển hình của Escherichia coli dương tính β-

glucuronidaza có màu xanh trên mỗi đĩa tha ̣ch chứa ít hơn 150 KL điển hình và ít hơn 300 KL tổng số (điển hình và không điển hình)

2.3.3.2 Ti ́nh toán kết quả

- Trườ ng hơ ̣p chung

Đếm các đĩa ở hai đô ̣ pha loãng liên tiếp, trong đó có ít nhất mô ̣t đĩa chứa ít nhất 15 KL điển hình và ít hơn 150 KL điển hình và ít hơn 300 KL tổng số

Số lươ ̣ng E.coli dương tính β- glucuronidase có mă ̣t trong mẫu thử trên

gam sản phẩm từ hai đô ̣ pha loãng liên tiếp được tính theo công thức:

V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml

n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất

n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai

d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất được giữ lại Lấy kết quả là số lượng E.coli dương tính β- glucuronidase trên gam

đươ ̣c biểu thi ̣ theo số nguyên đến hai chữ số có nghĩa theo số từ 1,0 đến 9,9

nhân lũy thừa của 10

- Ướ c tính các số lượng nhỏ

+ Nếu có hai đĩa của mẫu thử của huyển phù ban đầu hoă ̣c của đô ̣ pha loãng thứ nhất được cấy hoă ̣c được giữ la ̣i chứa ít hơn 15 KL điển hình, thì

tính số lượng E.coli dương tính β- glucuronidase có mă ̣t trong mẫu thử là

trung bình của hai đĩa song song theo công thức:

Trong đó:

∑C là tổng số KL điển hình đếm được trên hai đĩa

V là thể tích di ̣ch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml

d là hê ̣ số pha loãng tương ứng với dung dịch huyền phù ban đầu hoă ̣c

đô ̣ pha loãng thứ nhất được giữ lại

+ Nếu hai đĩa của mẫu thử huyền phù ban đầu đã cấy không chứa bất

kỳ KL điển hình nào thì biểu thi ̣ kết quả như sau: Ít hơn 1/d E.coli dương tính

β- glucuronidase trong gam

- Nếu tất cả các KL điển hình hoă ̣c không điển hình trên hai đĩa ở đô ̣ pha loãng thứ nhất d1 chứa nhiều hơn 300 KL có màu xanh có thể nhìn thấy, hoă ̣c trên hai đĩa ở đô ̣ pha loãng tiếp theo d2 chứa ít hơn 300 KL, không có

KL màu xanh nào cần đếm, thì biểu thi ̣ kết quả như sau: Ít hơn 1/d2 và nhiều

N =

∑C

V× n × d

hơn 1/d1 E.coli dương tính β- glucuronidase trong gam Trong đó, d1, d2 là các

hê ̣ số pha loãng tương ứng với các dung di ̣ch pha loãng d1và d2

- Nếu tất cả các KL điển hình hoă ̣c không điển hình trên hai đĩa ở đô ̣ pha loãng thứ nhất d1 chứa nhiều hơn 300, không có KL màu xanh nào, hoă ̣c trên hai đĩa ở đô ̣ pha loãng tiếp theo d2 chứa ít hơn 300 KL, không có KL màu xanh thì biểu thi ̣ kết quả như sau: Ít hơn 1/d2 Escherichia coli dương tính β- glucuronidase trong gam Trong đó d2 là hê ̣ số pha loãng tương ứng với dung

di ̣ch pha loãng d2

- Các trường hơ ̣p đă ̣c biê ̣t

+ Trên hai đĩa ở đô ̣ pha loãng d1 chứ a nhiều hơn 150 KL màu xanh, trên hai đĩa ở đô ̣ pha loãng tiếp theo d2 chứa ít hơn 15 KL màu xanh:

 Nếu số lươ ̣ng KL màu xanh trên từng đĩa ở đô ̣ pha loãng d1 nằm trong khoảng từ 150 đến 167 (giới ha ̣n trên của khoảng tin câ ̣y đối với giá tri ̣ trung bình bằng 150), thì sử du ̣ng phương pháp tính đối với trường hợp chung

 Nếu số lươ ̣ng KL màu xanh trên từng đĩa ở đô ̣ pha loãng d1 nhiều hơn 167 (giới ha ̣n trên của khoảng tin câ ̣y đối với giá tri ̣ trung bình bằng 150), thì chỉ tính đến kết quả của đô ̣ pha loãng d2 và thực hiê ̣n tiếp với viê ̣c đếm số lượng nhỏ

+ Số lượng KL màu xanh trên mỗi đĩa đối với tất cả các đô ̣ pha loãng đã

cấy có nhiều hơn 150, thì biểu thi ̣ kết quả như sau: Nhiều hơn 150/d E.coli

dương tính β- glucuronidase trong gam Trong đó d là hê ̣ số pha loãng tương ứng với dung di ̣ch pha loãng sau cùng

+ Trong trườ ng hơ ̣p chỉ có hai đĩa ở đô ̣ pha loãng thấp nhất (nồng đô ̣

cao nhất) chứa ít hơn 150 KL điển hình, thì tính số E.coli dương tính β-

glucuronidase có mă ̣t trong mẫu thử là trung bình số KL đếm được trên hai đĩa, theo công thức:

Trong đó:

∑C là tổng số điển hình đếm được trên hai đĩa, có ít nhất mô ̣t đĩa chứa tối thiểu là 15 điển hình

n là số đĩa được giữ la ̣i

V là thể tích di ̣ch cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml

d là hệ số pha loãng tương ứng với đô ̣ pha loãng được giữ lại [10]

2.3.4 Phương pháp phát hiện Salmonella trên đĩa thạch

2.3.4.1 Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc

- Cấy chuyển 0,1ml dịch nuôi cấy trong môi trường lỏng không chọn lọc vào ống nghiệm có 10ml môi trường canh thang RVS, ủ ở 41,5  10C /24 3h

- Cấy chuyển 1ml dịch nuôi cấy trong môi trường lỏng không chọn lọc vào ống nghiệm có sẵn 10ml môi trường MKTT, ủ ở 37  10C /24 3h

2.3.4.2 Phân lập và nhận dạng KL

Sau khi ủ 24 3h:

- Sử dụng dịch cấy thu được trong môi trường RVS cấy lên bề mặt của một đĩa petri cỡ lớn chứa môi trường chọn lọc đổ đĩa thứ nhất (môi trường thạch XLD) sao cho thu được các KL phân lập tốt

Trường hợp không có đĩa lớn (đường kính:140mm), sử dụng hai đĩa nhỏ (đường kính:90-100mm), chỉ dùng một que cấy vòng để cấy liên tiếp từng đĩa một

Ủ các đĩa nuôi cấy ở 35 - 370C / 24 3h

Tiến hành tương tự đối với môi trường đổ đĩa thứ hai (có thể sử dụng môi trường HE hoặc BPLS, ), sử dụng que cấy vô trùng và các đĩa petri như trên

- Sử dụng dịch cấy thu được trong môi trường MKTT cấy vào hai môi trường đổ đĩa chọn lọc tương tự như dịch cấy thu được trong môi trường RV

N =

∑C V× n × d