Nghiên cứu ứng dụng phương pháp quang phổ lò graphit (GHA AAS) để định lượng chì (pb) trong máu và nước tiểu 2008 (tt)

Xác định các điều kiện xử lý mẫu máu, nước tiểu và quy trình phân tích Pb trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử lò Graphit 2.. Một số phương pháp xử lý mẫu trước khi phân tích Đối tượng

Đặt vấn đề

Ngày nay, con người ngày càng nhận thức được ảnh hưởng to lớn của sự ô nhiễm các kim loại nặng mặc dù ở lượng rất nhỏ Đó là một trong những mối nguy hiểm tiềm tàng trong môi trường sống

Mức độ sử dụng các hoá chất nói chung và các kim loại nặng như chì (Pb) ngày càng tăng là điều không thể tránh khỏi trong thời kỳ công nghiệp hoá hiện đại hoá đất nước Tuy nhiên, trong quá trình khai thác, chế biến, sử dụng các kim loại ngoài giá trị to lớn về kinh tế đồng thời cũng gây ra những tác hại đáng kể đối với sức khoẻ con người Những ngành sản xuất sử dụng chì như khai khoáng, luyện kim, đúc, chất dẻo, sản xuất ắc quy chì, hàn điện cực, pha chế sơn vecni, mực in, đồ gốm…[10] đã dẫn đến ô nhiễm trầm trọng môi trường lao động và môi trường sống, làm ảnh hưởng sâu sắc đến sức khoẻ công nhân cũng như người dân sống ở các khu vực quanh các cơ sở sản xuất

Tỷ lệ người bị nhiễm độc chì ngày càng gia tăng đòi hỏi phải có những phương pháp xét nghiệm chính xác, với độ nhạy cao, thời gian phân tích nhanh và có thể phân tích hàng loạt để giúp cho việc theo dõi chẩn đoán sớm các trường hợp nhiễm độc Việc định lượng Pb được thực hiện trước đây tại Phòng TN Sinh hoá - Huyết học BNN chủ yếu là sử dụng máy cực phổ xung vi phân Phương pháp này có

ưu điểm là giới hạn phát hiện thấp, độ nhạy cao, độ chọn lọc cao và lượng mẫu cần dùng để phân tích nhỏ Tuy vậy, sử dụng phương pháp này, người phân tích phải tiếp xúc với thuỷ ngân, nguyên tố có khả năng bay hơi ngay cả ở nhiệt độ phòng Đồng thời, việc loại các yếu tố nhiễu còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là đối với các mẫu

có thành phần phức tạp như mẫu máu và nước tiểu

ở Việt nam, việc nghiên cứu bệnh nhiễm độc chì đã đợc tiến hành từ những năm 1960 Từ trớc tới nay trong các phòng thí nghiệm ở Việt nam thờng định lợng chì trong máu và nớc tiểu bằng phơng pháp trắc quang, cực phổ sóng vuông, cực phổ xung vi phân

Trong đề tài này, chúng tôi chọn nghiên cứu ứng dụng QPHTNT tử kỹ thuật lò graphit để định lượng một số kim loại nặng bước đầu là Pb Do những ưu điểm đáng

kể của phương pháp có độ nhạy, độ chính xác, độ chọn lọc, ít bị ảnh hưởng bởi các

yếu tố gây nhiễu như Zn, Cu, Cd… lượng mẫu sử dụng ít, thời gian phân tích nhanh, phân tích hàng loạt rất thuận lợi để đưa phương pháp này vào ứng dụng thực tế là bảo

vệ, chăm sóc sức khoẻ người lao động cũng như cộng đồng

Mục tiêu nghiên cứu

1 Xác định các điều kiện xử lý mẫu máu, nước tiểu và quy trình phân tích Pb trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử lò Graphit

2 Khảo sát hàm lượng Pb trong máu và nước tiểu của người bình thường bằng Quang phổ hấp thụ nguyên tử kỹ thuật lò Graphit để lấy giá trị tham khảo

Phần 1 Tổng quan tμi liệu 1.1 Đại cương về tính chất hoá lý của chì

Chì là kim loại có trong tự nhiên, màu xám xanh được tìm thấy một lượng nhỏ (1 10-4%) trong vỏ của trái đất Chì không mùi, không vị, không tan trong nước, không đốt cháy được Chì nóng chảy ở 3270C, sôi ở 15150C, nhưng từ khoảng 550 –

600 0C chì đã bay hơi [7] Chì có thể kết hợp với một số chất hoá học khác để tạo thành muối chì Một số muối chì hoà tan được trong nước Càng dễ hoà tan bao nhiêu, chì càng độc bấy nhiêu [9]

1.2 ảnh hưởng của chì tới sức khoẻ

Chì có tự nhiên trong môi trường, tuy nhiên ô nhiễm chì được tìm thấy đều xuất phát từ các hoạt động của con người Chì được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp, khai khoáng, luyện kim, đúc, chất dẻo, sản xuất ắc quy chì, hàn điện cực, pha chế sơn vecni, mực in, đồ gốm, sản xuất vũ khí và các vật liệu tấm lợp Chì còn

được sử dụng rộng rãi trong các thiết bị Y học (tấm chắn phóng xạ, bộ phận cách

điện, máy bơm tĩnh mạch, một số dụng cụ trong phẫu thuật), các thiết bị điện tử, và thiết bị quân sự Trước khi việc sử dụng xăng pha chì (chì hữu cơ) bị cấm thì một lượng lớn chì được giải phóng vào không khí là từ khí thải ô tô Ngoài ra còn có những nguyên nhân khác dẫn tới sự có mặt của chì trong không khí: đốt nhiên liệu (dầu, than), các chất thải rắn

Năm 1976, nhiễm độc chì đã được đưa vào danh mục 8 bệnh nghề nghiệp

được bảo hiểm đầu tiên của Việt Nam và tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm độc chì nghề nghiệp đã được đưa thành tiêu chuẩn chẩn đoán ngành, ban hành theo quyết định 424-BYT/QĐ - 16/5/1985 [11]

Các đường xâm nhập: Chì xâm nhập vào cơ thể qua 3 con đường: đường tiêu

hoá, hô hấp, qua da

Độc hại cấp tính: Nhiễm độc chì vô cơ cấp tính xảy ra khi hấp thu vài mililit

axetat chì Tử vong trước ngày thứ tư hoặc nếu khỏi thì thời gian hồi phục kéo dài

Đối với chì hữu cơ thường gặp các biểu hiện nhiễm độc kiểu viêm não Bệnh não do chì hữu cơ tiên lượng xấu, phần lớn tử vong Một số trường hợp khỏi thì tiên lượng rất xấu[ 6]

Sự tích luỹ chì trong cơ thể:

Sự phân bố chì trong cơ thể không đồng đều Sau khi được hấp thu vào máu chì được vận chuyển tới các mô như gan, thận, não, lách, xương Chỉ 20 giờ sau khi xâm nhập vào cơ thể 70 - 90% lượng chì được tích luỹ vào xương, xương là kho dự trữ và từ các kho tích luỹ này, chì có thể bài tiết ngược vào máu [32]

Tác động đặc hiệu của chì vô cơ trong cơ thể là lên cơ quan tạo máu ở tuỷ xương chì gây ảnh hưởng rất lớn đến chức năng tạo máu của tuỷ xương cụ thể là quá trình tổng hợp Hemoglobin, biểu hiện rất sớm [17, 22] Vì vậy, ở những người thấm nhiễm chì có thể tìm thấy những tổn thương sinh học trong quá trình tạo máu khá sớm

Chì gây rối loạn sinh tổng hợp Hem do tác động vào các phản ứng bằng cách

ức chế hoạt động các enzym δ-ALA dehydrase là enzym nhạy cảm nhất và bị ức chế sớm nhất, đồng thời ức chế luôn cả Hem – syntetase làm cho lượng protoporphyrin

IX tăng lên và chính chất này có tác dụng ức chế lại δ-ALA dehydrase theo cơ chế ngược chiều

Hiện tượng giảm Hemoglobin và gây thiếu máu xuất hiện khi hàm lượng chì máu ở giới hạn cao (50 – 80 μg/dl) [10, 21]

Hậu quả của sự tác động của chì lên cơ quan tạo máu sẽ dẫn đến

- Tăng δ-ALA trong máu và nước tiểu

- Tăng Copropophyrin trong máu và nước tiểu

- Tăng Protoporphyrin IX trong hồng cầu

- Hồng cầu non, hồng cầu hạt kiềm xuất hiện

Các triệu chứng lâm sàng

Chì gây suy nhược thần kinh, viêm não dưới dạng động kinh, tổn thương tiểu não, rối loạn vận động do viêm đa dây thần kinh vận động Chì gây tổn thương các ống thận, sơ hoá kẽ và lan toả quanh ống thận, gây táo bón, cơn đau bụng chì

Chì gây rối loạn điều hoà ngoài tim, tăng trương lực mạch, nhất là mạch não, tăng huyết áp, gây tổn thương thần kinh vận mạch, rối loạn tuần hoàn ngoại vi

Macur

ở phụ nữ tiếp xúc với chì có hiện tượng đẻ non, rối loạn chu kỳ kinh nguyệt, chu kỳ rụng trứng Đối với nam, chì làm giảm khả năng sinh sản ở nam giới: tinh trùng yếu, số lượng ít và biến đổi hình dạng Người ta cho rằng chì có khả năng gây tác hại cả trên bộ máy di truyền, gây rối loạn tổng hợp ADN, sai lạc nhiễm sắc thể [10, 17, 26]

Đào thải chì ra khỏi cơ thể: Chì đào thải ra khỏi cơ thể bằng nhiều con

đường khác nhau

Qua nước tiểu: Là đường đào thải chủ yếu, nó cho biết độ lớn của dòng chì tuần hoàn nếu thận hoạt động bình thường Mọi nguyên nhân làm tăng chì máu sẽ làm tăng thứ phát chì trong nước tiểu Người ta thấy rằng, mỗi ngày chúng ta chỉ thải khoảng 0,02% tổng lượng chì có trong cơ thể [10,15]

Qua phân: Một lượng nhỏ chì đào thải ra phân do mật bài tiết ra

Tóc có thể xem là đường đào thải chì tự nhiên của cơ thể Ngoài ra, chì còn

được đào thải qua mồ hôi, niêm mạc, sữa và nước bọt

Các xét nghiệm đặc trưng cho nhiễm độc chì:

Dựa vào các cơ chế tích luỹ, đào thải và gây bệnh của chì, người ta đã xây dựng các phương pháp chẩn đoán nhiễm độc chì từ những giai đoạn sớm nhằm kịp thời phát hiện, chẩn đoán, điều trị và giám định bệnh nghề nghiệp

Nghiệm pháp tiếp xúc (xét nghiệm đánh giá sự tiếp xúc)

1 Định lượng chì máu và chì niệu

Nghiệm pháp thấm nhiễm (xét nghiệm đánh giá sự thấm nhiễm)

2 Định lượng acid δ - aminolevulinic niệu (δ - ALA)

3 Xét nghiệm hồng cầu hạt ưa kiềm

Chỉ điểm sinh học: Các mẫu sinh học hiện đang được lựa chọn để xét nghiệm

đánh giá sự tiếp xúc, theo dõi và chẩn đoán nhiễm độc chì là nước tiểu, máu, tóc, móng [14] Việc phát hiện sớm bệnh nhiễm độc chì chủ yếu dựa vào các nghiệm pháp tiếp xúc Định lượng chì trong máu và nước tiểu là nghiệm pháp tiếp xúc trực tiếp

Mẫu máu

Máu là một tổ chức liên kết đặc biệt gồm hai phần là huyết tương và các thành phần hữu hình Huyết tương gồm nước và các chất hoà tan, trong đó chủ yếu là các loại protein, ngoài ra còn có các chất điện giải, chất dinh dưỡng, enzym, hormon, khí và các chất thải Thành phần hữu hình là các tế bào, bao gồm tế bào hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu Khối lượng máu trong cơ thể chiếm từ 7 đến 9% khối lượng cơ thể (khoảng 1/13 thể trọng) Trung bình người trưởng thành có khoảng 4 đến 5 lít máu ở nam giới lượng máu nhiều hơn ở nữ giới [5]

Lượng máu thay đổi theo trạng thái sinh lý của cơ thể: Lượng máu tăng sau bữa ăn và khi mang thai, lượng máu giảm khi đói và khi cơ thể mất nước Trạng thái sinh lý bệnh thường có khoảng 1/2 lượng máu lưu thông trong mạch , còn 1/2 dự trữ trong các kho chứa (lách: 16%, gan 20%, dưới da 10%) Khối lượng máu giảm đột ngột sẽ gây nguy hiểm đến tính mạng vì làm cho huyết áp giảm nhanh

Việc phân tích hàm lượng chì trong mẫu máu có vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng, hàm lượng chì trong mẫu máu phản ánh một cách trực tiếp lượng chì đưa vào cơ thể

Năm 1975, Grinffin đã nghiên cứu trên các nữ thanh niên tình nguyện tiếp xúc với chì trong không khí 23 giờ/ngày trong vòng 3-4 tháng, kết quả cho thấy lượng chì trong máu là 20μg/dl, 27μg/dl và 37μg/dl tương ứng với mức tiếp xúc ở ngưỡng 3,2μg/m3, 10,9μg/m3 chỉ sau 5 tuần tiếp xúc [27]

Theo báo cáo của Cools (1976) thì ngưỡng chì máu trung bình của người không có tiếp xúc nghề nghiệp là 17,2μg/dl [20]

Năm 1988, Nguyễn Thị Xuân Thuỷ đã tiến hành định lượng chì trong máu của 30 người khoẻ mạnh trên máy cực phổ sóng vuông cho kết quả: hàm lượng chì dao động từ 9,76 - 37,76μg/dl Hàm lượng chì máu trung bình : 18,64μg/dl [8] Tất cả số mẫu đều chứa hàm lượng chì dưới 40 μg/dl

Vũ Khánh Vân đã xác định hàm lượng chì huyết trung bình của 200 người không tiếp xúc với chì bằng phương pháp cực phổ xung vi phân cho kết quả hàm lượng chì trung bình là 2,06 ± 1,05 μg/dl [13]

Mẫu nước tiểu

Nước tiểu là một thành phần được tạo ra bởi quá trình bài tiết với mục đích

đào thải các chất cặn bã, các chất thừa ra khỏi cơ thể, giúp cho cơ thể đào thải các chất độc và cân bằng nội môi Nước tiểu được tạo thành ở nephron - đơn vị chức năng của thận Quá trình này bao gồm giai đoạn lọc máu ở cầu thận (nang Bowman) tạo thành nước tiểu đầu Tiếp theo là quá trình hấp thu lại các chất cần thiết và bài tiết các chất không cần thiết, tạo thành thành nước tiểu chính thức Nước tiểu chính thức được đổ vào bể thận, theo ống dẫn nước tiểu và tích trữ ở bàng quang Khi đủ một lượng nhất định nước tiểu sẽ được thải ra ngoài Mỗi ngày có thể loại ra khoảng

từ 1 đến 2 lít nước tiểu [5]

Hàm lượng chì trong nước tiểu phản ánh khả năng tự đào thải chì của cơ thể

và là chỉ số phân tích cận lâm sàng rất quan trọng để theo dõi hiệu quả gây thải chì trong điều trị nhiễm độc chì

Theo tiêu chuẩn chẩn đoán năm 1985, giới hạn chì niệu là 80μg/24 giờ (phân tích theo phương pháp dithizon), trên 80μg/24 giờ là có thẫm nhiễm bệnh lý, trên 150μg/24 giờ có thể có biểu hiện lâm sàng [10]

1.3 Một số phương pháp xử lý mẫu trước khi phân tích

Đối tượng chính của phép đo Quang phổ hấp thụ nguyên tử là phân tích vi lượng các nguyên tố trong mẫu vô cơ hoặc mẫu hữu cơ Bất kỳ phương pháp phân tích nào cũng cần qua 2 giai đoạn

- Giai đoạn 1: Xử lý mẫu để đưa nguyên tố kim loại cần xác định về trạng thái dung dịch theo kỹ thuật phù hợp để chuyển được hoàn toàn nguyên tố đó vào dung dịch đo phổ

- Giai đoạn 2: Phân tích các nguyên tố dựa trên phổ hấp thụ nguyên tử của nguyên tố đó trong những điều kiện thích hợp

Trong đó giai đoạn một là rất quan trọng vì xử lý mẫu không tốt có thể dẫn

đến mất nguyên tố phân tích (sai số âm) hoặc nhiễm bẩn mẫu (sai số dương) làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm người ta đã sử dụng các phương pháp vô cơ hoá mẫu khác nhau, tuỳ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đối tượng mẫu,

điều kiện trang thiết bị mà lựa chọn phương pháp xử lý mẫu

Phương pháp vô cơ hoá khô

Nguyên tắc: Đốt cháy các hợp chất hữu cơ trong mẫu bằng nhiệt để giải phóng kim loại dưới dạng oxit hoặc muối của chúng Sau đó hoà tan bằng axit thích hợp

Phương pháp này có ưu điểm: đơn giản, triệt để nhưng lại có nhược điểm chính là làm mất mẫu của nguyên tố dễ bay hơi và không áp dụng cho các nguyên tố

có áp xuất hơi cao như: Cd, As, Hg thời gian xử lý mẫu kéo dài Để khắc phục nhược điểm này người ta thường cho thêm các hợp chất bảo vệ như: Mg(NO3)2, MgO, KNO3, và chọn nhiệt độ thích hợp

Phương pháp vô cơ hoá ướt

Nguyên tắc: Dùng axit mạnh (ví dụ HCl, H2SO4 ), hay axit mạnh có tính oxy hoá (HNO3, HClO4) hoặc hỗn hợp 2 axit (HNO3, H2SO4), 3 axit (H2SO4, HNO3, HClO4) để phân huỷ mẫu trong điều kiện đun nóng trong bình Kjeldahl, trong các cốc thuỷ tinh (hệ hở) Thời gian xử lý mẫu thường từ vài giờ đến vài chục giờ [3] Axit nitric thường được sử dụng nhiều nhất vì nó không tạo thành các muối không tan trong quá trình vô cơ hoá mẫu như HCl và H2SO4 Hydroperoxit (H2O2) cũng có thể được thêm vào để tăng khả năng oxy hoá [19]

Đối với mẫu máu, các tác nhân phân huỷ mẫu trong quá trình này gồm: tác dụng phá huỷ các hạt mẫu của axit đặc và tác nhân phá huỷ mẫu của năng lượng nhiệt khi đun sôi mẫu Các tác nhân này bào mòn dần các hạt mẫu từ ngoài vào, làm cho các hạt mẫu bị mòn dần rồi tan hết

Phương pháp này đơn giản, không đắt tiền, dễ thực hiện, bảo toàn được chất phân tích nhưng phải dùng một lượng axit khá nhiều, do vậy yêu cầu các axit phải có

độ tinh khiết cao

Phương pháp xử lý mẫu trong lò vi sóng

Nguyên tắc: Đây cũng là kỹ thuật vô cơ hoá ướt, chỉ khác là dùng thêm năng lượng của vi sóng để xử lý mẫu, thay cho cách đun nóng bình thường Hơn nữa, việc

vô cơ hoá được thể hiện trong bình kín, áp suất cao nên nhiệt độ sôi cao hơn thúc

đẩy quá trình phá huỷ mẫu rất nhanh và đây là tác nhân phá huỷ mạnh nhất Vì thế việc xử lý mẫu trong lò vi sóng chỉ cần thời gian ngắn (50 – 70 phút) mà rất triệt để [3]

Đây là phương pháp xử lý mẫu hiện đại nhất hiện nay, làm giảm đáng kể thời gian xử lí mẫu, không làm mất mẫu và vô cơ hoá một cách triệt để, được thực hiện trong bình kín và có thể vô cơ hoá được nhiều mẫu trong một lần Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi thiết bị đắt tiền mà nhiều cơ sở phân tích không đủ điều kiện trang

bị

1.4 Phương pháp định lượng chì

Trên thế giới đã sử dụng nhiều phương pháp để xác định chì, tuy nhiên tuỳ thuộc mục đích, yêu cầu của việc phân tích hàm lượng của chì trong môi trường mẫu nào mà lựa chọn phương pháp phân tích cho thích hợp: Phương pháp trắc quang, phương pháp von-ampe hoà tan, phương pháp phổ phát xạ nguyên tử hay phổ hấp thụ nguyên tử (dùng ngọn lửa đèn khí F-AAS hay năng lượng nhiệt của dòng điện ETA – AAS còn gọi kỹ thuật lò Graphit)…

Phương pháp đo màu: Dựa vào khả năng tạo phức màu của nguyên tố cần xác

định với thuốc thử thích hợp và đo màu các phức này trên máy trắc quang, mỗi nguyên tố ứng với với một bước sóng nhất định Phương pháp này tuy kỹ thuật đơn giản nhưng độ nhạy không cao nên thường sử dụng khi hàm lượng các kim loại khá lớn hoặc phải được làm giàu trước

Đối với định lượng chì, sau khi vô cơ hoá nước tiểu bằng axit, chì được tạo phức với dithizon để cho dithizonatchì màu đỏ Chì dithizonat được chiết bằng cloroform ở pH 9 – 11 Đo màu ở bước sóng 520nm, độ nhạy của phương pháp 0,2μg/8ml [12]

Phương pháp cực phổ:

Cực phổ cổ điển: Dựa vào khả năng bị khử của ion Pb2+ trên bề mặt catot giọt thuỷ ngân ở thế từ -0,45V đến – 0,6V Cường độ dòng khuếch tán tỉ lệ với nồng độ ion chì trong dung dịch Dựa vào đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ ion chì và chiều cao sóng cực phổ để tính được nồng độ Pb trong mẫu cần đo

Phương pháp cực phổ xung vi phân: để loại trừ được ảnh hưởng của dòng tụ

điện, người ta phân cực điện cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính và vào cuối mỗi chu kỳ giọt Trên khung điện áp biến đổi một chiều, đặt thêm một xung vuông góc thường có độ nhạy 10-6 – 10-7M Phương pháp này có ưu điểm là giới hạn phát hiện của phương pháp thấp, độ nhạy cao 10-7 – 10-8M , độ chọn lọc cao

và lượng mẫu cần dùng để phân tích nhỏ Tuy vậy, sử dụng phương pháp này, người phân tích phải tiếp xúc với thuỷ ngân, nguyên tố có khả năng bay hơi ngay cả ở nhiệt

độ phòng Đồng thời, việc loại các yếu tố nhiễu còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là

đối với các mẫu có thành phần phức tạp như mẫu máu và nước tiểu

Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

Nguyên tắc: Khi chiếu chùm bức xạ có bước sóng thích hợp vào đám hơi nguyên tử chứa nguyên tố cần đo thì các nguyên tử tự do của nguyên tố này sẽ hấp thụ bức xạ để đưa nguyên tử từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích Cường

độ vạch hấp thụ và nồng độ nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi tuân theo định luật Lamber – Beer

Kỹ thuật nguyên tử hoá: Để tạo được đám hơi nguyên tử tự do từ mẫu phân tích, người ta sử dụng hai kỹ thuật:

- Kỹ thuật nguyên tử hoá bằng ngọn lửa (Flame – AAS, F- AAS) sử dụng nhiệt của ngọn lửa đèn khí để nguyên tử hoá mẫu

- Kỹ thuật nguyên tử hoá không ngọn lửa (Flameless – AAS, ETA – AAS) dùng năng lượng của dòng điện công suất lớn và trong môi trường khí trơ để nung đỏ tức khắc cuvet làm bằng graphit

Phần 2

Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Máu và nước tiểu của 92 người khoẻ mạnh sống ở 2 xã Hưng Công và Công

Lý Tỉnh Hà Nam với tiêu chuẩn lựa chọn thông qua thăm khám như sau:

Những người khoẻ mạnh, không bị mắc các bệnh mạn tính về gan, thận Không sống và làm việc gần nơi khai thác, chế biến, tái sử dụng chì

Không điều trị bằng các thuốc có chì

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

- Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm

- Nghiên cứu cắt ngang

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm ứng dụng QPHTNT lò graphit

Hoá chất và trang thiết bị

Hoá chất:

- Axit nitric đậm đặc loại PA (HNO3) 65%

- Hydroperoxyt (H2O2) 30% tinh khiết, dùng cho phân tích lượng vết

- Cloroform, Dithizon tiêu chuẩn cho phân tích

- Mẫu chuẩn Pb 1000mg/l của Merck

- Bom khí Argon (Ar) tinh khiết 99,995%

- Dung dịch Modifier

NH4H2PO4 4g

Mg(NO3)2 0,35g Hoà tan trong 100ml nước cất Thiết bị, dụng cụ:

- Bình phá mẫu lò vi sóng loại DAP- 60+ (60ml) bằng Teflon được ngâm trong dung dịch axit HNO310% một ngày, sau đó tráng rửa sạch bằng nước cất 2 lần

- Chai, lọ đựng thuốc thử, pipet các loại được ngâm rửa bằng dung dịch axit HNO3 10%

- Tuýp thuỷ tinh Schott Duran được ngâm qua đêm bằng dung dịch axit HNO3

10% rồi rửa bằng nước cất 1 lần, sau đó đổ tiếp dung dịch axit HNO3 10% sạch tói khoảng 2/3 ồng nghiệm đem đun cách thuỷ sôi trong 5 giờ Để nguội, xúc rửa ổng nghiệm bằng nước cất 1 lần cho tới hết axit rồi tráng rửa lại bằng dung dịch dithizon – cloroform 2 – 3 lần, sau đó tráng bằng cloroform sạch

Thiết bị

- Máy Quang phổ hấp thụ nguyên tử HGA Graphite Furnace - AAnalyst

700 của PerkinElmer - USA

- Lò vi sóng Speedwave MWS-3+ của Berghof - Đức

- Cuvet graphit hoạt hoá 100%

Lấy mẫu, bảo quản mẫu:

- Thu nước tiểu bãi buổi sáng vào lọ nhựa sạch (100ml), bảo quản nước tiểu bằng 3- 5 giọt HNO3 đặc

- Lấy máu tĩnh mạch: 2ml máu được đựng trong tuýp nhựa đã được làm sạch

và khử trùng có chứa sẵn chất chống đông (EDTA hoặc heparin) Lắc nhẹ nhàng để trộn đều máu và chất chống đông

- Bảo quản mẫu máu ở 4oC Mẫu ổn định trong vòng 3 tuần khi được bảo quản lạnh

Chương trình nhiệt độ của lò vi sóng xử lý mẫu máu

Thời gian duy trì nhiệt (phút) 5 5 5 5

Sau khi xử lý mẫu bằng lò vi sóng, mẫu được để nguội đến nhiệt độ phòng,

thêm 5 ml H2O2 và đun trên bếp điều nhiệt ở 100 - 150oC trong 30 phút sau đó để

nguội và định mức đến 25 ml bằng axit HNO3 0,2 %

Xử lý mẫu nước tiểu:

Lấy 3ml nước tiểu vào bình xử lý mẫu (Teflon 40 bar, 60ml) Thêm 7 ml

HNO3 đặc, sau 10 phút thêm 1ml H2O2 Để yên ít nhất 30 phút, lắc nhẹ nhàng, đậy

các nắp của bình xử lý mẫu Lắp các bình trên vào lò vi sóng, xử lý mẫu theo chương

trình nhiệt độ sau:

Chương trình nhiệt độ của lò vi sóng xử lý nước tiểu

Thời gian duy trì nhiệt (phút) 5 10 10 5

Sau khi xử lý mẫu bằng lò vi sóng, mẫu được để nguội đến nhiệt độ phòng

Chuyển mẫu sang tuýp đã được xử lý, tráng bình phá mẫu bằng 3 ml H2O2, đun nhẹ

trên bếp điều nhiệt ở từ 100 - 150oC trong 30 phút trong tủ hốt Định mức đến 20ml

bằng nước cất 2 lần và đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử kỹ thuật lò Graphit

Chế độ đo mẫu trên máy Quang phổ hấp thụ nguyên tử kỹ thuật lò Graphit

Nguồn đèn: HCL

Cường độ dòng đèn: 4mA

Bước sóng: 283,3 nm

Khe đo : 0,7nm

Khí môi trường: Argon

Số lần lặp lại trong một phép đo: 3

Cuvet graphit: hoạt hoá 100%

Thể tích mẫu đo: 50 àl

Thể tích Modifier: 5 àl

Chương trình nguyên tử hoá đo mẫu máu Giai đoạn Nhiệt độ (0C) Thời gian (giây) Tốc độ dẫn khí

2.4 Những vấn đề về y đức trong nghiên cứu

- Các đối tượng nghiên cứu được hỏi ý kiến, tự nguyện cộng tác nghiên cứu

- Giải thích cho đối tượng mục đích yêu cầu của nghiên cứu

- Lấy máu bảo đảm an toàn

Phần 3 Kết quả

3.1 Xác định điều kiện xử lý mẫu máu, nước tiểu và quy trình phân tích Pb trên

máy QPHTNT lò Graphit

3.1.1 Xác định điều kiện xử lý mẫu máu, nước tiểu

Qui trình phá mẫu máu và nước tiểu đã được chúng tôi trình bày phần phương

pháp nguyên cứu trên được kiểm chứng bằng cách: Thêm vào cùng một mẫu máu các

nồng độ chuẩn 40μg/dl, 80μg/dl Tương tự, thêm vào cùng một mẫu nước tiểu các

nồng độ chuẩn 25 μg/l, 50μg/l Kết quả kiểm định phương pháp phá mẫu chì máu,

chì niệu được thể hiện theo bảng 1:

Bảng 1: Kết quả kiểm chứng phương pháp phá mẫu máu, nước tiểu

Mẫu phân tích Diện tích

pic

Nồng độ Pb ngoại suy

Nồng độ Pb ngoại suy tương đương với nồng độ Pb chuẩn

Hiệu suất (%)

Kết quả trên cho thấy, khi thêm 40μg/dl, 80μg/dl chuẩn chì vào mẫu máu, xử lý

mẫu theo qui trình phá mẫu máu thu được nồng độ chì ngoại suy tương đương với

nồng độ chì chuẩn thêm vào mẫu là 36,87 μg/dl và 74,37 μg/dl đạt hiệu xuất 92,17 %

và 92,96% Đối với mẫu nước tiểu, nồng độ chì ngoại suy tương đương với nồng độ

chì chuẩn là 22,09 μg/l và 45,00 μg/l đạt hiệu suất 88,35% và 90,0% Độ thu hồi của

các mẫu kiểm chứng đạt giới hạn sai số cho phép của phép phân tích Qui trình phá

mẫu máu và nước tiểu là đáng tin cậy

3.1.2 Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Pb

3.1.2.1 Xác định khe đo

Trong phép đo phổ của Pb, tiến hành khảo sát các khe đo 0,2nm; 0,7nm; 2nm,

đây là 3 giá trị khe đo mà hãng sản xuất, chế tạo đã thiết kế cho thiết bị AAS Kết quả khảo sát được ở bảng 2

Bảng2: Khảo sát khe đo của chì

3.1.2.2 Khảo sát thể tích chất bổ trợ (Modifier)

Tiến hành phân tích mẫu máu và nước tiểu trên QPHTNT bằng chất bổ trợ

NH4H2PO4/Mg(NO3)2 Khảo sát thể tích chất bổ trợ trên cùng một mẫu máu và nước tiểu Mẫu được phá bằng qui trình phá mẫu trên Kết quả cho thấy ở hình 1

Hình 1: Khảo sát thể tích chất bổ trợ Qua kết quả thể hiện trên hình 1, chúng tôi nhận thấy khi khảo sát chất bổ trợ

với nhiều thể tích khác nhau (2, 4, 5, 6, 8, 10μl), sử dụng thể tích chất bổ trợ là 5 μl diện tích pic thu được là cao nhất trên cả mẫu máu và nước tiểu

3.1.2.3 Khảo sát thể tích mẫu đo:

Sau khi mẫu được sử lý bằng lò vi sóng, lấy mẫu vào cóng nhựa thể tích 3ml đặt vào vị trí của khay đựng mẫu của bộ lấy mẫu tự động máy QPHTNT Tiến hành khảo sát thể tích mẫu đo 30, 40, 50, 60μl bằng cách thay đổi chương trình hút mẫu của máy, giữ nguyên thể tích chất bổ trợ là 5 μl

Hình 2: Khảo sát thể tích mẫu máu

5 mẫu máu (M1, M2, M3, M4, M5) sau khi sử lý bằng lò vi sóng đặt các chế độ lấy mẫu với thể tích như đã nêu trên Kết quả ở hình 2 cho thấy, thể tích mẫu càng tăng thì diện tích pic của mẫu càng tăng Với thể tích mẫu là 60μl diện tích pic không

ổn định và không còn tăng tuyến tính nữa Chúng tôi nhận thấy rằng, với cả 5 mẫu máu khảo sát, thể tích mẫu là 50μl cho kết quả đo chì tốt nhất

3.1.2.3.2 Thể tích mẫu nước tiểu

Hình 3: Khảo sát thể tích mẫu nước tiểu

5 mẫu nước tiểu (M1, M2, M3, M4, M5) sau khi sử lý bằng lò vi sóng đặt các chế độ lấy mẫu với thể tích 30, 40, 50, 60μl, thể tích chất bổ trợ là 5 μl Kết quả hình

3 cho thấy, thể tích mẫu tăng đến 50 μl thì diện tích pic của mẫu tăng tương ứng Với thể tích mẫu là 60 μl diện tích pic không tăng nữa mà còn giảm Chúng tôi nhận thấy rằng, với cả 5 mẫu nước tiểu khảo sát, thể tích mẫu là 50μl cho kết quả đo chì tốt nhất

3.1.2.4 Khảo sát nhiệt độ nguyên tử hoá

Tiến hành khảo sát nhiệt độ nguyên tử hoá của phép đo ở 16000C, 17000C,

18000C, 19000C Kết quả thu được ở hình 4

Hình 4: Khảo sát nhiệt độ nguyên tử hoá

Khảo sát nhiệt độ nguyên tử hoá trên 5 mẫu phân tích Pb (M1, M2, M3, M4, M5) cho thấy ở nhiệt độ nguyên tử hoá 19000C các mẫu có diện tích pic cao nhất nhưng cũng xấp xỉ với nhiệt độ 18000C Vì vậy chúng tôi chọn nhiệt độ nguyên tử hoá của phép đo là 18000C

3.1.2.5 Khảo sát thời gian sấy đối với mẫu nước tiểu

5 mẫu nước tiểu (M1, M2, M3, M4, M5) được tiến hành khảo sát thời gian sấy

phân tích là cao nhất, tăng thời gian sấy lên 100s thì diện tích píc của các mẫu không tăng nữa Chúng tôi chọn thời gian sấy cho phép đo chì niệu là 90s

3.1.3 Xác định ngưỡng phân tích, khoảng tuyến tính của phép đo, độ chính xác của phương pháp

3.1.3.1 Xác định giới hạn phát hiện của phép đo

Đưa các dung dịch chuẩn vào mẫu máu và mẫu nước tiểu theo nồng độ giảm dần Phân tích lặp lại 3 lần chúng tôi thu được kết quả theo bảng 3

Bảng 3 : Giới hạn phát hiện của phương pháp

Mẫu phân tích Diện tích pic

Với nồng độ chì máu là 0,2μg/dl và chì niệu 2,24μg/l là nồng độ thấp nhất khi

đo cho diện tích pic lớn hơn tín hiệu đo ống trắng Theo bảng trên, ngưỡng phát hiện của phương pháp đo chì máu là 0,2μg/dl, chì niệu là 2,24μg/l

3.1.3.2 Xác định khoảng tuyến tính của phép đo

Đối với chuẩn Pb ở chương trình đo máu

Từ dung dịch chuẩn gốc Pb 1000mg/l (Merck) pha ra các nồng độ 10.000μg/l, 1000μg/l (dung dịch chuẩn sử dụng) Chúng tôi pha các nồng độ 2ppb, 5ppb, 10ppb, 15ppb, 20ppb, 30ppb, 40ppb Khoảng tuyến tính của phép đo Pb trong máu qua khảo sát diện tích pic tương quan tuyến tính với nồng độ Pb được thể hiện ở bảng 3, hình6