Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)

Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị (LA tiến sĩ)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HUỲNH VĂN CHƯƠNG

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HUỲNH VĂN CHƯƠNG

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017

Tác giả luận án

Huỳnh Văn Chương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự

hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng

nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn

sâu sắc tới thầy cô PGS.TS Đinh Thị Bích Lân, PGS.TS Nguyễn Hữu Nam đã tận tình

hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình

học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ

môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học

và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học- Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá

trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều

kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017

Nghiên cứu sinh

Huỳnh Văn Chương

2.1.4 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng 15

2.2.2 Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu hiện

2.3 Công nghệ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng bằng phương pháp gây miễn

2.3.1 Trọng lượng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk Immunoglobulin) 24

3.4.1 Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà 33 3.4.2 Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang

3.4.3 Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định

3.4.4 Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp 33 3.4.5 Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh 33

3.5.1 Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể,

3.5.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng 34 3.5.3 Phương pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà 35 3.5.4 Phương pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 35 3.5.5 Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng

3.5.6 Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu

3.5.7 Phương pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lượng

3.5.8 Phương pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh

3.5.9 Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế

4.1 Tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể,

4.2.3 Kết quả nghiên cứu hàm lượng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu

4.4 Kết quả nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene 3-1E 63 4.4.1 Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng 63

4.4.3 Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu hiện

4.4.4 Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng

đuôi dung hợp 6His với cột Ni2

4.5 Tối ưu điều kiện biểu hiện của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 70

4.5.1 Kết quả sinh trưởng của E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã

4.5.4 Kết quả tốc độ lắc tối ưu lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn E coli

4.6 Tách chiết, tinh sạch, định lượng và xác định tính đặc hiệu của kháng

4.6.1 Tách chiết, tinh sạch và định lượng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E 78

4.7 Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà 79 4.7.1 Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà 79 4.7.2 Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà 80

4.7.4 Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ 82

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid Sợi ADN bổ sung

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ

gắn enzyme

HI Hemagglutination inhibition Ức chế ngƣng kết hồng cầu

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside

PBS Phosphate buffer saline Dung dịch muối đệm phốt phát PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

xạ

RT – PCR Reverse transcription polymerase chain

reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp phiên mã ngƣợc

SARS Severe acute respiratory syndrome Hội chứng viêm phổi cấp tính SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide

gel electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamide

DANH MỤC BẢNG

4.1 Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng trên đàn gà tại một số xã của huyện Phú

4.5 Tần suất xuất hiện các giai đoạn phát triển của cầu trùng gà trên tiêu bản vi thể

4.8 Hàm lượng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng 58

4.10 Sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên

4.11 Sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên

4.12 Sinh trưởng của chủng E coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên

4.13 Kết quả kiểm tra lượng kháng thể trong long đỏ trứng của gà được gây miễn

4.17 Lượng Oocyst trong phân gà trước và sau điều trị 86

4.19 Ảnh hưởng của kháng thể kháng sinh lên sinh trưởng của gà 87

DANH MỤC HÌNH

4.1 Gà mắc bệnh cầu trùng, phân lẫn máu, đứng co cụm, mào yếm nhợt nhạt 47

4.6 Chất chứa lẫn máu trong ruột gà mắc cầu trùng, màu đỏ tươi, HE 10x 524.8 Giai đoạn tiền Schizont của cầu trùng trong ruột gà, HE.40x 534.7 Hồng cầu tràn ngập trong ruột gà mắc cầu trùng, HE 40x 53

4.10 Thâm nhiễm bạch cầu ái toan ở hạ niêm mạc ruột của gà mắc cầu

4.12 Sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho một số loài Eimeria 594.13 Ảnh điện di ARN tổng số trên agarose gel 1% có sử dụng

4.15 Ảnh điện di sản phẩm sau tinh sạch trên agarose gel1% 62

4.17 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid pGEM T-easy-3-1E trong

4.18 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên agarose

4.19 Mức độ tương đồng giữa gene 3-1E được phân lập với gene 3-1Eđã

4.20 Mức độ tương đồng của trình tự amino a xít của kháng nguyên

3-1E đã phân lập và kháng nguyên 3-3-1E đã được công bố

4.22 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm plasmid TOPO-3-1E sau khi tách từ

4.26 Ảnh hưởng của môi trường lên mức độ biểu hiện kháng nguyên tái

4.32 Kết quả Western blot kiểm tra tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E 794.33 Ảnh điện di định lượng kháng thể IgY trên gel SDS-PAGE 12% 82

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

4.1 Kết quả kiểm tra lƣợng kháng thể trong trứng của gà đƣợc gây miễn dịch với

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Họ và tên nghiên cứu sinh: Huỳnh Văn Chương

Tên luận án: Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị

Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi; Mã số: 62 64 01 02

Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Mục đích nghiên cứu

Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của gà mắc bệnh cầu trùng tại Thừa Thiên Huế và tạo ra chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà, sử dụng cho đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cầu trùng gà

Phương pháp nghiên cứu

Luận án sử dụng các phương pháp: Các biểu hiện lâm sàng được xác định bằng

phương pháp thường quy, thu Oocyst cầu trùng bằng phương pháp phù nổi và kiểm tra trên

kính hiển vi Tất cả những gà chết do cầu trùng được mổ khám thu mẫu bệnh phẩm để xác định bệnh lý đại thể và vi thể, mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formon 10 , tiêu bản vi thể được làm theo quy trình tẩm đúc parafin và nhuộm bằng Haematoxylin- Eosin Một số chỉ tiêu huyết học được xác định bằng máy tự động Cell Dyn 3700

ARN tổng số của cầu trùng gà được phân lập bằng Kit “SV Total RNA Isolation System (Promega)” tổng hợp sợi ADN bổ sung từ khuôn ARN được thực hiện bằng Kit

“First Strand cDNA Synthesis (Fermentas) ” và được sử dụng làm khuôn để khuếch đại bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA GCGCCCTGGTACA-3’) Sản phẩm PCR được gắn vào vector pGEM-T Easy (Promega), gene 3-1E được cắt từ vector pGEM-T Easy/3-1E và tinh sạch bằng Kit “Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System (Promega)”, sau đó gắn vào vector biểu hiện pET200 D-TOPO, phản ứng gắn được thực hiện ở 4°C qua đêm

Mức độ biểu hiện của protein 3-1E được xác định bằng SDS-PAGE (15% w/v), sau

đó gel được nhuộm với Coomassie Blue R-250 Protein 3-1E được tinh sạch bằng Kit

“ProBondTM Puriication System (Invitrogen, USA)”, theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Kết quả chính và kết luận

Gà mắc bệnh cầu trùng biểu hiện các triệu chứng chủ yếu như: ủ rũ, ít vận động,

tiêu chảy, phân có màng nhầy, có bọt và lẫn máu

Biến đổi bệnh lý chủ yếu tập trung ở ruột non và manh tràng xuất huyết, manh tràng căng phồng lên và lớp niêm mạc bị bào mòn Các tổn thương vi thể như sung huyết, xuất huyết nặng, thoái hóa, hoại tử tế bào, thâm nhiễm tế bào viêm tại manh tràng, ngoài ra cũng có các tổn thương bệnh lý tại hồi tràng và trực tràng Trên tiêu bản vi thể quan sát được các giai đoạn phát triển khác nhau của cầu trùng ở tế bào biểu mô ruột

Gà mắc bệnh cầu trùng dẫn đến các chỉ tiêu hệ hồng cầu giảm, số lượng bạch cầu tăng, công thức bạch cầu cũng thay đổi, số lượng bạch cầu trung tính và ái toan tăng, trong khi số lượng tế bào lympho giảm Protein tổng số, lượng Albumin và tỷ lệ A G đều giảm

Phân lập đoạn mã hóa gene 3-1E từ Oocyst cầu trùng thu được đoạn gene có chiều

dài là 513 bp, mã hóa chuỗi polypeptide chứa 170 amino a xít, tương đồng 99 so với gene3-1E được công bố trên GeneBank (mã số: AF113613) Phân tích điện di SDS cho thấy protein dung hợp 3-1E có khối lượng phân tử khoảng 26 kDa

Môi trường nuôi cấy LB cho khả năng sinh trưởng tốt nhất với tỷ lệ tiếp giống 2 (OD600 = 0,8), lắc 200 vòng phút ở 37ºC sau 11 giờ nuôi cấy Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của protein dung hợp 6xHis-3-1E lại cho kết quả tốt nhất trên môi trường YJ trong cùng một điều kiện tối ưu (nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,8 mM, nuôi lắc ở 200 vòng phút, nhiệt độ cảm ứng 20ºC trong thời gian 10 giờ) Sắc ký lọc gel 6xHis cho thấy sản phẩm protein dung hợp 6xHis-3-1E có khối lượng phân tử khoảng 26 kDa Bằng phương pháp đông khô đã thu được 6-7g bột lòng đỏ từ mỗi quả trứng, sau khi hoàn nguyên với PBS theo tỷ lệ 1:9 (w w), chế phẩm có hiệu giá kháng thể đặc hiệu đạt

1 280.000 Sử dụng bột lòng đỏ chứa kháng thể kháng 3-1E tái tổ hợp cho kết quả tốt

trong phòng và điều trị bệnh cầu trùng do Eimeria acervulina, Eimeria tenella, Eimeria maxima ở gà, như làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải Oocyst,

tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trưởng ở gà.

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Huynh Van Chuong

Thesis title: Research on pathological characteristics of chicken infected with coccidia

and development of bioproduct for prevention and treatment of coccidiosis in chicken

Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals Code: 62 64 01 02

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

Survey on some mainly pathological characteristics of chicken infected with coccidiosis in Thua Thien Hue provine and produce a bioproduct containing specific IgY antibodies against 3-1E antigen of chicken coccidia used in for prevention, treatment efficacy of coccidiosis in chicken

Materials and Methods

The clinical parameters were determined by conventional method, Oocyst

isolation by flotation method All died chickens caused by coccidiosis were slaughtered

to collect the samples for determination of both macroscopic and microscopic pathological changes Tissue samples were fixed in 10% neutral buffered formalin and stained with Haematoxylin- Eosin stain The change of several hematological parameters were determined by automated Cell Dyn 3700 sytem

Total RNA of coccidia was isolated by SV Total RNA Isolation System Protocol (Promega) First strand cDNA from RNA templates was made First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) and was then used as template in PCR amplification with the specific primers (topo3-1E.F: 5’-CACCATGGGTGA AGA GGC TGA TAC-3’; topo3-1E.R: 5’TTA GAA GCGCCCTGGTACA-3’) PCR products (3-1E gene) were ligated into pGEM-T Easy vector (Promega), The 3-1E gene was cut from pGEM-T Easy/3-1E vector, and purified by Wizard® SV Gel and PCR CleanUp System Kit (Promega),they were then ligated into pET200/D-TOPO expression vector, The ligation mix was incubated at 4°C overnight Expression levels of 3-1E protein were determined by sodium dodecyl sulfate-15% polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 15% w/v) The gel slice was then stained with Coomassie Blue R-250 The 3-1E protein was purified by ProBondTM Purification System kit (Invitrogen, USA), according to the manufacturer’s instructions

Main findings and conclusions

Chickens infected with coccidia consist of mainly clinical signs such as: droop,

inactiveness, watery diarrhea with mucus, bloody or creamy exudate feces

The main macroscopic lesions of infected chickens showed hemorrhagic and huge necrosis in intestine and caecum, distended caecum and eroded mucosal layer The microscopic lesions consisted of severe hemorrhage, necrosis, degeneration of epithelial cells, inflammatory infiltrations in caecum, on the other side, pathogenic characteristics could also be observed in ileum and rectum The different stages of coccidia were also observed in the epithelial cells

Erythro-system parameters decreased, leukocytes number increased and its formula was changed, number of neutrophils and eosinophils increased, in case of lymphocytes decreased The protein total of serum, its formula and A/G ratio were decreased

We cloned and expressed a gene coding 3-1E antigen from Eimeria isolated from

Thua Thien Hue province, Vietnam The open reading frame of 3-1E gene has 513 bp in length, encoding a polypeptide chain with 170 amino acid residuces Homology search

showed that our 3-1E gene is 99% similarity with 3-1E gene of Genebank (accession

number: AF113613) SDS electrophoresis showed that expression of the 3-1E gene in

E coli BL21 (DE3) produced a fusion protein with molecule of ~26 kDa

Improvement of the recombinant antigen expression level in E coli strain BL 21 Star TM (DE3) encoding gene 3-1E of Eimeria was conducted The result showed that

LB medium has given the best growth of E coli BL 21 (DE3) in comparison with other

media in the same 2% initial seed inoculum size (OD600 = 0.8), shaking 200 rpm at

37oC for 11hrs However, the highest level of fusion protein (6xHis-3-1E) was obtained from YJ medium in the same optimum culture condition (0.8 mM IPGT-Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside for 10hrs at 20oC) Molecular weight of purified 6xHis-3-1E protein from 6xHis affinity chromatography was about 26 kDa

By using lyophilized method, 6-7g of powder from 1 egg, after reverting with PBS (1: 9, w/w) the solution presented specific antibody titer reaching 1/128.000 Using egg yolk powder containing antibodies against recombinant 3-1E antigen showed good

results in prevention and treatment of coccidiosis that caused by E acervulina, E tenella, E maxima in chicken, such as: reducing morbidity, mortality, Oocyst shedding

as well as increasing recovery rate and growth performance

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh cầu trùng gà là nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm (Allen and Fetterer, 2002) Trên toàn thế giới hàng năm ước tính thiệt hại trên 2 tỷ USD (Williams, 1998) Bệnh có khả năng lây lan rất nhanh, tỷ

lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao ở gà con (30 - 100 ), làm tăng số gà còi cọc, giảm tốc độ tăng trưởng cho toàn đàn, giảm sản lượng trứng ở gà đẻ từ 20 - 40%, giảm chất lượng thịt và tăng tiêu tốn thức ăn (Edgar, 1955; Tyzzer, 1932) Bệnh gây ra

bởi ký sinh trùng đơn bào (Protozoa), thuộc phân lớp Coccidia, họ Eimeriidae và chi Eimeria (Finlay et al., 1993; Lillehoj and Lillehoj, 2000) Gà ở tất cả các lứa

tuổi đều có thể nhiễm cầu trùng, trong đó thường gặp nhất là gà ở giai đoạn 2- 3

tuần tuổi (Lillehoj and Lillehoj, 2000; Lillehoj et al., 2004)

Hiện nay có nhiều loài Eimeria gây bệnh trên gà, trong đó có 7 loài gây bệnh chủ yếu: E tenella, E acervulina, E maxima, E necatrix, E brunetti,

E praecox và E mitis (Shirley, 1986) Mỗi một loài Eimeria khác nhau có vị trí gây

bệnh khác nhau trong đường tiêu hóa (Nguyễn Hữu Hưng, 2010; Fanatico, 2006) Cho đến nay, để phòng trị bệnh cầu trùng người chăn nuôi chủ yếu dùng kháng sinh bổ sung vào trong thức ăn và nước uống Tuy nhiên, phương pháp

này còn nhiều hạn chế như: Xuất hiện một số chủng Eimeria có khả năng kháng

kháng sinh (Chapman, 1997), tạo ra một loại thuốc mới đòi hỏi chi phí cao (Lillehoj and Lillehoj, 2000), bổ sung kháng sinh kéo dài dẫn đến tồn dư trong sản phẩm gia cầm làm ảnh hưởng đến người tiêu dùng Vì vậy, tạo ra các chế phẩm có tác dụng phòng và trị bệnh cầu trùng, thay thế kháng sinh là nhu cầu cấp bách của thực tiễn

Protein 3-1E là một kháng nguyên bề mặt có khung đọc mở dài 513 bp, mã hóa đoạn polypeptide dài 170 amino a xít với khối lượng phân tử là 18.523 kDa,

tồn tại ở giai đoạn Sporozoite và Merozoite của một số loài như E acervulina,

E.tenella, E maxima Đã có những nghiên cứu sử dụng kháng nguyên 3-1E tái tổ

hợp làm vắc xin chống lại E acervulina, E tenella và E maxima (Lillehoj et al.,

2000) Tiêm chủng bằng vắc xin ADN dựa trên gene 3-1E cũng gây được đáp

ứng miễn dịch chống lại cầu trùng gà (Lillehoj et al., 2000; Ma et al., 2011)

Áp dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E và dùng kháng nguyên này để gây tối miễn dịch cho gà sẽ tạo được kháng thể có khả năng chống lại đồng thời nhiều loài cầu trùng Đây là lợi thế của phương pháp tiếp cận mới có áp dụng công nghệ cao so với các phương pháp tách chiết kháng nguyên truyền thống

Công nghệ chế tạo kháng thể truyền thống dùng cho điều trị bệnh ở người

và động vật thường sử dụng các gia súc lớn như ngựa, cừu Tuy nhiên, công nghệ này có nhược điểm là kích thước động vật lớn, đòi hỏi lượng kháng nguyên để gây miễn dịch phải nhiều, để có kháng thể phải lấy máu động vật tách huyết thanh hoặc huyết tương rồi tinh chế kháng thể với qui trình chế tạo phức tạp, việc lấy máu động vật không được thường xuyên dẫn đến sản lượng kháng thể thu được từ mỗi cá thể động vật không nhiều (Hoàng Ngọc Hiển và Nguyễn Văn Việt, 1998; Lê Thu Hồng, 2004)

Loài gà có khả năng sinh kháng thể tương tự như động vật có vú Trong số các kháng thể trong máu gà mái có một lớp kháng thể được chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng, được gọi là IgY (yolk immunoglobulin) Muốn sản xuất kháng thể IgY chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng Gà mái ở độ tuổi đẻ ổn định, việc thu hoạch trứng được thực hiện hàng ngày với lượng kháng thể thu được từ mỗi quả trứng rất lớn so với kích thước của gà mẹ Kỹ thuật tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng cũng tương đối đơn giản, từ đó công nghệ chế tạo IgY bằng cách gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch kháng thể từ lòng

đỏ trứng do gà đẻ ra trở nên đặc biệt hấp dẫn cho yêu cầu sản xuất lượng lớn kháng thể sử dụng cho chẩn đoán và điều trị bệnh ở động vật cũng như cho người

(Dias da Silva and Tambourgi, 2010; Schade et al., 2005)

Kháng thể lòng đỏ trứng gà đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và hiệu quả của nó trong phòng và trị bệnh nhiều bệnh truyền nhiễm đã được chứng minh Mặt khác, kháng thể lòng đỏ có giá thành thấp, dễ bảo quản, có độ an toàn

và tính đặc hiệu cao, đặc biệt là chỉ tác động lên mầm bệnh, không ảnh hưởng đến vi sinh vật có lợi trong cơ thể, không gây ra hiện tượng kháng thuốc và không làm ảnh hưởng đến chất lượng của thực phẩm Bên cạnh đó việc dùng kháng thể trong phòng và điều trị bệnh là một giải pháp được lựa chọn hàng đầu trong định hướng phát triển của ngành chăn nuôi, để hạn chế lạm dụng kháng

sinh trong phòng trị bệnh ở vật nuôi

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Xác định được các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà trên đàn gà được nuôi tại Phú Vang- Thừa Thiên Huế

Sản xuất được kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E làm nguyên liệu tạo kháng thể kháng cầu trùng gà

Xác định được hiệu quả phòng trị bệnh cầu trùng gà của chế phẩm sinh học chứa kháng thể IgY đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Về thời gian: Các nghiên cứu được thực hiện từ 2012-2015, tại Viện công

nghệ sinh học- Đại học Huế và Bộ môn bệnh lý, Khoa thú y- Học viện Nông nghiệp Việt Nam

cầu trùng ở gà Tre nuôi thịt tại địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

Kết quả luận án cho thấy triệu chứng lâm sàng, tổn thương đại thể, vi thể và thay đổi các chỉ tiêu huyết học của gà Tre mắc bệnh cầu trùng tại thừa Thiên Huế Đồng thời, xuất phát từ lợi thế của công nghệ sản xuất globulin miễn dịch

từ lòng đỏ trứng (kháng thể IgY), từ nhu cầu có các chế phẩm kháng thể đặc hiệu thay thế cho thuốc kháng sinh chống lại bệnh cầu trùng gà Đề tài được tiến hành

để tạo ra một chế phẩm sinh học có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà Điểm mới trong nghiên cứu này là ứng dụng công nghệ sinh học để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E và gây miễn dịch cho gà mái đẻ Sau đó thu trứng có chứa kháng thể đặc hiệu kháng kháng nguyên 3-1E Thành công trong nghiên cứu này là đã chế tạo được bột lòng đỏ trứng có chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà và sử dụng trong phòng và điều trị bệnh cho kết quả tốt như: Làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải

Oocyst, tăng tỷ lệ khỏi bệnh và tăng khả năng sinh trưởng của gà

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Đây là một công trình nghiên cứu trong lĩnh vực sinh học phân tử để tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E, làm nguyên liệu cho việc sản xuất kháng thể để phòng và điều trị bệnh cầu trùng cho gà, góp phần làm giảm thiệt hại kinh tế và nâng cao hiệu quả cho ngành chăn nuôi gia cầm

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CẦU TRÙNG GÀ

2.1.1 Căn bệnh cầu trùng

Bệnh cầu trùng đã được phát hiện bởi Rivolta (1983), căn bệnh là một loại ký

sinh trùng có trong phân gà, đến năm 1864 mới xác định được Eimeria là nguyên sinh động vật sinh sản theo bào tử thuộc lớp Sporozoa, bộ Cocoidie, họ Eimeriaidae

Ngày nay bệnh cầu trùng ở gà thế giới đã xác định có khoảng 12 loài

Eimeria Trong đó có 9 loài đã được xác định rõ tên, kích thước, màu sắc gồm

E tenella, E acervulina, E mitis, E brunetti, E necatrix, E maxima, E praecox,

E hagani, E mivatti Có 7 loài cầu trùng gà trong số 9 loài trên gây bệnh phổ

biến (trừ Eimeria hagani, Eimeria mivatti) (Conway and Mckenzie, 2007)

2.1.1.1 Phân loại cầu trùng ở gà

Cầu trùng thuộc giống Eimeria với hình thái và kích thước khác nhau được

xác định là có khả năng gây bệnh cầu trùng trên gà Trong đó có một số loài gây bệnh chủ yếu sau

a Eimeria tenella

Các Oocyst của E tenella có hình ovan, vỏ bọc màu trắng xám hoặc xanh nhạt, không có lỗ sinh dục (Micropil), cực của Oocyst có nhân phân cực Kích thước Oocyst từ 14,2 - 31,2 x 9,5 - 24,8 μm Quá trình tạo thành bào tử nang ở

môi trường bên ngoài kéo dài 24 - 48 giờ, chúng ký sinh không những trên bề mặt niêm mạc mà còn thâm nhập sâu vào trong các lớp của màng dịch thuộc manh tràng và trực tràng (Lê Văn Năm, 2004)

b Eimeria acervulina

Các Oocyst của E acervulina có hình quả trứng gà hoặc hình ovan Đầu nhỏ của Oocyst có một lỗ sinh dục, đầu to có nhân phân cực Oocyst có vỏ bọc nhẵn, có kích thước là 17,7 - 20,2 x 13,7 - 16,3 μm Oocyst có hai lớp vỏ, không

có thể cặn Sporocyst có hình trứng, không có thể cặn Thời gian hình thành bào

tử nang ở môi trường bên ngoài là 24 giờ E acervulina ký sinh ở vùng đầu của ruột non Oocyst nằm trong ruột tạo nên những điểm màu trắng hay xám hoặc lan rộng ở mặt ruột non (Lê Văn Năm, 2004)

c Eimeria maxima

Oocyst của E maxima có hình quả trứng hoặc hình ovan Vỏ bọc của

Oocyst xù xì, màu nâu nhạt Tại đầu nhỏ của Oocyst có một lỗ sinh dục và phía

dưới là nhân phân hạt Kích thước của Oocyst là 24,4 - 42,5 x 16,5 - 29,8 μm tức

là loại Oocyst lớn Thời gian hình thành bào tử nang ở môi trường bên ngoài cơ

thể là 48 giờ, ký sinh không những trong các lớp tế bào biểu bì, bề mặt niêm mạc

mà còn trong các lớp sâu của màng dịch thuộc đoạn tá tràng và đoạn dưới

tá tràng (Lê Văn Năm, 2004)

d Eimeria mitis

Oocyst của E mitis có dạng hình tròn, vỏ bọc không màu, không nhân phân

hạt Kích thước nhỏ 11,0 - 19,0 x 10 - 17,1 μm Thời gian hình thành bào tử nang trong môi trường bên ngoài là 48 giờ, loài này ký sinh trong tá tràng và ruột non dưới tá tràng (Lê Văn Năm, 2004)

e Eimeria necatrix

Phân bố rộng trên thế giới, giai đoạn sinh sản vô tính thứ nhất và thứ hai xảy ra ở ruột non, giai đoạn sinh sản vô tính thứ 3, tiền giao tử và giai đoạn sinh sản giao tử xảy ra ở ruột già

Oocyst của E necatrix có hình ovan hoặc hình tròn và nhân phân hạt, kích

thước nhỏ 13 - 22,7 x 11,3 - 18,3 μm Vỏ Oocyst cứng và bào tử nang hình thành trong 48 giờ E Necatrix ký sinh chủ yếu ở ruột non ngay dưới tá tràng Sporocyst hình trứng, có thể Stieda, không có thể cặn (Lê Văn Năm, 2004)

f Eimeria praecox

Loài này phân bố rộng, định vị trên 1/3 phía trên ruột non của gà Oocyst của E praecox có hình trái xoan, vỏ cứng không màu Nhân phân cực nằm một

bên hoặc xen kẽ giữa các nguyên bào tử Kích thước nhỏ 16,6 - 27,7 x 14,8 - 19,4

μm Thời gian tạo thành bào tử nang là 24 - 36 giờ, loài này ký sinh ở đầu ruột non Giai đoạn sinh sản xảy ra ở tế bào biểu mô nhung mao ruột thường dọc theo một phía của nhung mao và ở phía dưới của nhân tế bào, có 3 hoặc 4 quá trình sinh sản vô tính (Lê Văn Năm, 2004)

g Eimeria hagani

Oocyst hình bầu dục, kích thước 15,8 - 29,9 x 14,3 - 29,5 μm, không có lỗ

noãn, không màu Thời gian sản sinh bào tử là 48 giờ Loài này ký sinh ở phần đầu ruột non (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008)

h Eimeria brunetti

E brunetti là loài cầu trùng có độc lực cao gần như E tenella Nang trứng

hình bầu dục không màu, kích thước 20,7 - 30,3 x 18,1 - 24,2 μm E brunetti

sinh sản bào tử kết thúc trong vòng 24 giờ, trong nang trứng có một cực hay một

số hạt cực, trong thời kỳ nội sinh phát triển trong ruột già, phần cuối ruột non cũng như trực tràng, lỗ huyệt cũng có thể bị nhiễm (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008)

2.1.1.2 Vòng đời phát triển của cầu trùng

Chu kỳ sinh học của cầu trùng giống Eimeria gồm 3 giai đoạn: giai đoạn

sinh sản vô tính, giai đoạn sinh sản hữu tính và giai đoạn sinh sản bào tử Hai giai đoạn đầu thực hiện trong tế bào biểu mô ruột còn giai đoạn thứ ba diễn ra ở ngoài

cơ thể vật chủ (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008)

a Giai đoạn sinh sản vô tính

Khi các Oocyst xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hóa, dưới tác dụng của

dạ dày cơ và các enzyme trong dịch tiêu hóa làm cho vỏ Oocyst bị phá hủy, giải phóng các Sporocyst và sau đó nhanh chóng xâm nhập vào tế bào biểu bì ruột,

thận, mật,…đôi khi vào mô bào dưới niêm mạc Tại đây cùng với sự phân chia

của hạt nhân các Oocyst lớn lên nhanh chóng có hình tròn, hình ovan hoặc hình elip với nhiều nhân gọi là thể phân lập thuộc thế hệ 1 (Schizont 1)

Ở Schizont 1, xung quanh mỗi nhân nguyên sinh chất xuất hiện và bao quanh

để hình thành dạng ký sinh nhỏ, hình bầu dục Lúc này chúng được gọi thể phân

lập trung gian (Merozoite) Các Merozoite thế hệ 1 (kích thước 5 x 15 µm) sinh trưởng rất nhanh làm tan vỡ tế bào biểu bì của vật chủ (số lượng Merozoite trong một Schizont thay đổi rất lớn tùy loài dao động từ 8 đến 16, có khi tới 120.000

Merozoite) Khi các tế bào biểu bì nơi cư trú bị phá hủy thì các Merozoite lập tức

tấn công sang các tế bào biểu bì mới và quá trình phát triển này được lặp lại như

cũ Đến đây các ký sinh này thuộc thế hệ thứ hai và được gọi là Schizont 2

Tùy theo các loài cầu trùng và vật chủ có thể hình thành tiếp các thế hệ

Schizont 3, Schizont 4,…một cách ồ ạt theo cấp số nhân kiểu phản ứng dây

chuyền nguyên tử làm cho hàng loạt tế bào biểu bì của vật chủ bị phá vỡ gây tổn

thương nặng nề cho niêm mạc nơi bị nhiễm (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008) Mỗi chủng cầu trùng khác nhau có giai đoạn sinh sản vô tính khác nhau, để hình thành nên các thể phân lập và số thế hệ thể phân lập tùy theo loài Sau khi kết thúc giai đoạn sinh sản vô tính chúng chuyển sang giai đoạn sinh sản hữu tính

này nó được gọi là noãn nang (Oocyst) có hình bầu dục, hình tròn hoặc hình trứng hay hình quả lê Đến đây các Oocyst rơi vào trong lòng ruột và kết thúc quá trình sinh sản hữu tính

Thời gian nội sinh kết thúc, Oocyst theo phân gà ra bên ngoài môi

trường Thời gian sinh sản hữu tính kéo dài từ 3-22 ngày tùy vào từng loài cầu

trùng Thời gian từ khi gà chứa Oocyst có sức gây bệnh đến khi gà thải Oocyst trong phân là 4,5-5 ngày (đối với loài E acervulina, E mitis) và 6,5 ngày với loài E tenella (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008)

c Sinh sản bào tử

Khi Oocyst theo phân ra ngoài, trong lớp vỏ bọc bên ngoài đã chứa đầy

nguyên sinh chất Ở ngoại cảnh, gặp điều kiện thuận lợi như nhiệt độ, độ ẩm sau vài giờ trong nguyên sinh chất đã xuất hiện khoảng sáng và nguyên sinh chất bắt đầu phân chia Sau 13 - 48 giờ tùy vào từng loài cầu trùng nguyên sinh chất sẽ

hình thành 4 túi bào tử (Sporocyst) Trong mỗi túi bào tử, nguyên sinh chất lại phân chia, kéo dài ra tạo thành 2 bào tử con (Sporozoite) Lúc này, trong Oocyst

đã hình thành 8 bào tử con và trở thành Oocyst có sức gây bệnh Giai đoạn sinh sản bào tử kết thúc Những Oocyst có sức gây bệnh lẫn vào thức ăn, nước uống

và được gà nuốt vào trong đường tiêu hóa (Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008)

2.1.1.3 Tính chuyên biệt của cầu trùng

Bệnh cầu trùng khác với các bệnh do vi khuẩn và vi rút về bản chất tự giới hạn trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nó Điều đó có được là do tính chuyên biệt của cầu trùng

Tính chuyên biệt của cầu trùng là sự thích nghi phức tạp và lâu dài của cầu trùng với cơ thể ký chủ hoặc cụ thể hơn đối với các cơ quan, các mô bào hay tế bào nhất định phù hợp cho sự tồn tại và phát triển của chúng

Gần đây đã có nhiều tài liệu chứng tỏ rằng giống cầu trùng Eimeria có tính

chuyên biệt nghiêm ngặt và chỉ có thể nhiễm vào loại ký chủ mà chúng đã thích nghi trong quá trình tiến hóa Ví dụ: cầu trùng cừu không thể nhiễm sang trâu, bò

và các loài gia súc khác được, cầu trùng thỏ chỉ nhiễm vào kí chủ của nó mà không thể nhiễm vào bất kỳ loài nào khác, cầu trùng gà không gây bệnh cho gà tây và ngược lại

Tính chuyên biệt nghiêm ngặt của cầu trùng giống Eimeria biểu hiện không

chỉ đối với ký chủ của chúng mà còn đối với nơi chúng ký sinh trong cơ thể gia

súc và gia cầm Ví dụ: E tenella chỉ sống trong niêm mạc manh tràng, E

acervulina trong tá tràng của gà, E Bukidnon Ensis ký sinh ở niêm mạc ruột non

bò trong khi đó E cylindrica cũng ký sinh trong đường tiêu hóa của bò nhưng lại

ký sinh ở niêm mạc ruột già (Lê Văn Năm, 2004)

Như vậy, có thể nói rằng tùy theo loài cầu trùng mà chúng có thể sống ở trên vật chủ này hay vật chủ khác, hoặc các vị trí ký sinh khác nhau trên cùng một cơ thể gia súc gia cầm Điều này có ý nghĩa quan trọng giúp một phần trong việc phân loại cầu trùng được chính xác

2.1.1.4 Một số kháng nguyên của cầu trùng gà

a Kháng nguyên 3-1E

Protein 3-1E là một kháng nguyên bề mặt có ở giai đoạn Sporozoite và

Merozoite của E acervulina (Lillehoj et al., 2000; Zhao et al., 2011) Theo

Laurent et al (1994), kháng nguyên này còn có mặt ở một số loài Eimeria như:

E tenella, E maxima, E acervulina, E falciform Việc tiêm vắc xin ADN có thể

gây được đáp ứng miễn dịch chống lại bệnh cầu trùng gà (Lillehoj et al., 2000;

Ma et al., 2011)

Theo Xu et al (2006a) thì gene kháng nguyên (3-1E) của E tenella và gene

interferon gamma (ChIFN - γ) của gà cùng được tạo dòng vào vector proVAX để hình thành hai plasmid proE và proI, sau đó được liên kết lại bởi sự duỗi thẳng và gắn kết chồng lên nhau của phản ứng PCR để xây dựng plasmid proIE và rIE sau

đó được biểu hiện trong E coli có chứa plasmid pGEX IE Gà được tiêm chủng với proE, proIE và rIE, sau đó gây nhiễm với E tenella Kết quả cho thấy giảm đáng kể Oocyst thải ra phân, tăng hiệu giá kháng thể và tăng trọng lượng của cơ

thể Như vậy, ChIFN - γ cùng biểu hiện với 3-1E có khả năng làm tăng cường

hiệu quả bảo vệ của vắc xin ADN chống lại E tenella

Ma et al (2012) cho biết, miễn dịch chống lại cầu trùng gà được tăng cường khi sử dụng vắc xin ADN chứa gene 3-1E và ChIL - 15 Kết quả cho thấy vắc xin ADN làm giảm đáng kể lượng Oocyst thải ra, giảm các điểm tổn thương trong tá

tràng, cải thiện tăng trọng của cơ thể Ngoài ra, ChIL - 15 có tác dụng làm tăng khả năng miễn dịch của vắc xin ADN 3-1E và đã kết luận rằng vắc xin ADN 3-1E

- linker - mChIl - 15 có khả năng tạo miễn dịch chống lại đồng thời nhiều

loài Eimeria

Zhao et al (2011) cho biết, gà 2 tuần tuổi được gây miễn dịch với plasmid

pcDNA3-1E liều 50 µg/gà, sau 15 ngày tiến hành thu thập mẫu mô và sau đó tách chiết ADN tổng số Kết quả cho thấy có băng kích thước 583 bp nhưng khi tinh sạch ADN và sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gene 3-1E không có băng nào được xác định, điều này chứng tỏ rằng plasmid pcDNA 3-1E tái tổ hợp tồn tại trong mô mà không có đi vào hệ gene của gà được gây miễn dịch Sau đó tiếp tục thử nghiệm cấp tính cho gà với 3 liều 100 µg, 500 µg và 2500 µg/gà và một nhóm đối chứng tiêm dung dịch sinh lý với liều 2500 µg/gà Kết quả cho thấy các triệu chứng lâm sàng không xảy ra với gà gây miễn dịch, chỉ tiêu sinh hoá của máu và cấu trúc các cơ quan nội tạng không bị ảnh hưởng đáng kể trong cả nhóm được gây miễn dịch và nhóm đối chứng Các kết quả nghiên cứu cho thấy plasmid pcDNA 3-1E là an toàn và có thể sử dụng trong các thử nghiệm thực tế cho gà

Zhang et al (2013) cho biết, kháng nguyên 3-1E của E acervulina sau khi

biểu hiện và tinh sạch thu được một băng protein 3-1E tái tổ hợp có kích thước khoảng 26 kDa được xác định bằng phương pháp điện di SDS - PAGE và Western Blot

Lillehoj et al (2005) cho rằng, gene 3-1E của E acervulina được tạo dòng

sau đó tiêm phòng cho gà con thông qua trứng để chống lại bệnh cầu trùng Khi sử dụng riêng lẻ hay kết hợp với gene mã hóa interleukin: IL - 1, IL - 2, IL - 6, IL - 8,

IL - 15, IL - 16, IL - 17, IL - 18, hoặc interferon (IFN - γ) thì kết quả cho thấy tăng

nồng độ kháng thể kháng 3-1E trong huyết thanh, giảm lượng Oocyst thải ra phân

và tăng tăng trọng cơ thể sau khi gây nhiễm thực nghiệm với E acervulina Khi sử

dụng riêng lẻ gene 3-1E, nồng độ kháng thể kháng 3-1E tồn tại trong một thời gian

ngắn Tương tự như vậy, việc giảm đáng kể lượng Oocyst thải ra trong phân và

tăng tăng trọng đã được quan sát thấy khi tiêm với liều 25 µg/trứng Khi tiêm kết hợp gene 3-1E và IL - 1, IL -2, IL - 15 hoặc gene IFN - γ dẫn đến hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cao hơn so với tiêm riêng lẻ 3-1E Gà nở từ phôi được nhận gene 3-1E cùng với gene IL - 2 hoặc IL - 15 đã thể hiện sự giảm đáng kể

lượng Oocyst thải ra trong phân, tăng đáng kể khả năng tăng trọng so với những gà

nở từ phôi chỉ nhận được gene 3-1E

b Kháng nguyên TA4

Brothers et al (1988) cho rằng, TA4 là một kháng nguyên bề mặt, có ở giai đoạn Sporozoite của E.tenella Kháng nguyên này được tổng hợp sau 16 - 20 giờ tính từ khi Oocyst bắt đầu phát triển Gene TA4 mã hóa cho một protein có kích

thước khoảng 25 kDa gồm 2 chuỗi có khối lượng 17 và 8 kDa liên kết với nhau

bởi cấu nối disulfide, protein này được tổng hợp trong E coli

Song et al (2009) cho biết, gene TA4 được tạo dòng vào vector

pcDNA3.1b thu được plasnid pcDNA3.1b - TA4 Đồng thời, gene chIL - 2 cũng được phân lập và gắn vào pcDNA3.1b - TA4 để tạo ra phức hợp pcDNA3.1b -

TA4 - IL2 Trên cơ sở đó để tạo ra vắc xin ADN pcDNA - TA4 - IL - 2 của E

Tenella và tiêm thử nghiệm dưới da với liều 25 µg đã gây được đáp ứng miễn

dịch bảo vệ cho gà chống lại bệnh cầu trùng

c Kháng nguyên GX3262

Theo Miller et al (1989) thì kháng nguyên GX3262 là một đoạn ADN được tách chiết từ Oocyst của E tenella đã phát triển thành bào tử Đoạn ADN này chứa

gene kháng nguyên cầu trùng GX3262 được tạo dòng vào vector bacteriophage

lambda gt11 và biến nạp vào E coli để biểu hiện các sản phẩm của gene Plasmid

chứa GX3262 sau khi biểu hiện được xem như một protein dung hợp gồm 1006 a xít amin Kháng nguyên này được tinh sạch và sử dụng để tiêm chủng cho gà 1 tuần

tuổi hoặc gà mới nở Sau đó, gà được gây nhiễm với E tenella và mức độ bảo vệ

của hệ miễn dịch được đánh giá thông qua kiểm tra các điểm tổn thương ở manh tràng Gà 2 ngày tuổi có mức độ bảo vệ cao nhất được tìm thấy là sau khi tiêm

chủng E coli sống tái tổ hợp Kết quả cho thấy protein dung hợp GX3262 như một

vắc xin cầu trùng và điều này được minh chứng là gà con mới nở được tiêm chủng thành công ngay lần đầu tiên với kháng nguyên tái tổ hợp

d Kháng nguyên MIC2

Theo Bashar et al (2003) thì Micronemes là một protein của cơ quan đầu

tiên ở giai đoạn xâm nhập của ký sinh trùng, protein này rất quan trọng cho việc

di chuyển, bám dính và xâm nhập vào tế bào của ký chủ Gene mã hóa cho

protein Microneme - 2 (EtMIC - 2) đã phân lập thành công từ Oocyst của E

tenella bằng phản ứng RT- PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene EtMIC – 2 sau đó

được tạo dòng vào vector pGEM - T - easy và biến nạp trong E coli DH5

Ding et al (2005) đã kết luận rằng, protein EtMIC - 2 có khả năng gây đáp

ứng miễn dịch chống lại cầu trùng thông qua trứng gà khi nghiên cứu thử

nghiệm Gà sau khi nở 11 ngày, được gây nhiễm với Oocyst của E tenella Mẫu

huyết thanh được thu thập ở 1, 10, 17 ngày sau khi gây nhiễm (tức là 12, 21 và

28 ngày sau khi nở) và nồng độ kháng thể kháng EtMIC2 được xác định bằng phương pháp ELISA Kết quả cho thấy gà được tiêm protein EtMIC2 tái tổ hợp

đã tạo được đáp ứng miễn dịch chống lại E tenella Gà tăng trọng lượng và giảm thải Oocyst ra phân đáng kể so với nhóm đối chứng Gà được tiêm chủng với protein EtMIC2 cũng có được khả năng miễn dịch chống E acervulina, nhưng không chống được E maxima

e Kháng nguyên Rho

Theo Wang et al (2009) đã cho rằng, Rhomboid (Rho) là kháng nguyên bề mặt có ở đỉnh đầu Sporozoite của E tenella, chúng có vai trò giúp cho Sporozoite

dễ dàng xâm nhập vào tế bào vật chủ Gene này đã được phân lập từ sản phẩm

ADN của E tenella bởi phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của Rho, sau đó được

gắn vào vị trí PstI/ClaI của vector pMV261 và vị trí PvuII/ClaI của vector pMV361 theo thứ tự định sẵn Plasmids pMV261 - Rho và pMV361 - Rho được

biến nạp vào chủng Mycobacterium bovis BCG (rBCG) Gà được tiêm chủng với

BCG, rBCG pMV261 - Rho hoặc rBCG pMV361 - Rho vào khoảng 2 tuần tuổi đã gây được đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho cơ thể Kết quả cho thấy tăng đáng kể tỷ

lệ tế bào CD4+ và CD8+ so với nhóm đối chứng không tiêm BCG tái tổ hợp

Trong nghiên cứu này cả hai chủng rBCG đều gây ra đáp ứng miễn dịch chống lại

cảm nhiễm E tenella, tuy nhiên rBCG pMV261 - Rho gây ra kháng thể đặc hiệu

tốt hơn và đem lại miễn dịch bảo vệ cao hơn so với rBCG pMV361 - Rho

Li et al (2012) cho biết, hiệu quả của protein rhomboid - like của E tenella

như là một vắc xin tiểu đơn vị trong đáp ứng miễn dịch bảo vệ chống lại đồng thời nhiều loài cầu trùng gây bệnh ở gà Khi gà được tiêm chủng với kháng nguyên rhomboid tái tổ hợp, kháng thể đặc hiệu được xác định bằng phương pháp ELISA Hàm lượng interleukin - 2, interferon -γ, cũng như tỷ lệ CD4+ và CD8+ trong nhóm được tiêm chủng với protein rhomboid tái tổ hợp tăng lên đáng kể so với nhóm chỉ tiêm dung dịch PBS Trong thí nghiệm này, số lượng

Oocyst và các điểm tổn thương manh tràng giảm đáng kể, đồng thời tăng đáng kể

khả năng tăng trọng cho gà trong nhóm được gây miễn dịch so với nhóm đối chứng Kết quả nghiên cứu cho thấy protein rhomboid tái tổ hợp đã tạo được đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian qua tế bào

f Kháng nguyên Gam56

Xu et al (2013a) cho rằng, kháng nguyên Gam56 là một kháng nguyên bề mặt được sản sinh trong suốt giai đoạn Gametophyte của E maxima, đây là một

trong những protein được xác nhận có liên quan đến việc hình thành vỏ của

Oocyst Gene Gam56 của E maxima được khuếch đại bằng phản ứng RT- PCR

từ ARN tổng số của Gametocyte Sau đó được tạo dòng vào vector

pcDNA3.1(zeo)+ Plasmid pcDNA3.1 - Gam56 tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào COS - 7 và sự biểu hiện của protein Gam56 được xác định bởi phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Để đánh giá hiệu quả miễn dịch bảo vệ của vắc xin pcDNA3.1 - Gam56, gà 7 ngày tuổi được tiêm pcDNA3.1 - GAM56 với các liều lượng 100 μg, 50 μg, 25 μg gà và tiêm lại lần 2 sau 1 tuần Đồng thời pcDNA3.1 và PBS cũng được tiêm cho nhóm đối chứng Sau khi tiêm chủng lần

2 khoảng 1 tuần thì tiến hành gây nhiễm cho gà với 5×104 Oocyst của E maxima

Sau 8 ngày gây nhiễm, mẫu máu được thu nhận để kiểm tra, kết quả cho thấy tế bào lympho và nồng độ kháng thể đặc hiệu tăng cao ở 7 và 14 ngày và giảm sau

21 ngày sau khi tiêm chủng lần 1 Trong 3 nhóm được tiêm chủng với pcDNA3.1

- Gam56 thì nhóm được tiêm 50 μg gà cho hàm lượng tế bào lympho và hàm lượng kháng thể cao nhất, đồng thời còn tăng khả năng tăng trọng cho gà và giảm

lượng Oocyst thải ra

2.1.2 Đặc điểm dịch tễ

2.1.2.1 Nguồn bệnh

Nguồn bệnh là những gà ốm đã khỏi nhưng vẫn mang cầu trùng, những gà

bệnh này không biểu hiện triệu chứng và thường xuyên bài xuất Oocyst qua phân

ra ngoài môi trường Oocyst được phát tán rộng rãi ở ngoài tự nhiên và quá trình sản sinh bào tử bắt đầu tạo thành các Oocyst có khả năng gây bệnh

2.1.2.2 Con đường truyền lây

Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2008) cho rằng, đường tiêu hóa là đường truyền

lây duy nhất mà Oocyst cầu trùng có thể xâm nhập vào cơ thể gà để gây bệnh Cầu

trùng có thể lây nhiễm theo hai cách: lây nhiễm trực tiếp và lây nhiễm gián tiếp

a Lây nhiễm trực tiếp

Gà bệnh thải cầu trùng ra ngoài môi trường qua phân, do đó Oocyst sẽ dễ

dàng được phát tán trên khắp nền chuồng, máng ăn, máng uống và dụng cụ chăn nuôi Tập tính của gà hay nhặt, bới và tìm kiếm những mảnh thức ăn thừa, chất

độn ở nền chuồng,… nên dễ nuốt phải Oocyst có sức gây bệnh

b Lây nhiễm gián tiếp

Theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2008) thì bệnh cầu trùng lây lan qua vật môi giới trung gian truyền bệnh như các dụng cụ chăn nuôi, người chăn nuôi, giày

dép, ủng, phương tiện vận chuyển,… đã mang Oocyst cầu trùng từ bên ngoài vào

khu vực chuồng nuôi vào Ngoài ra, một số động vật sống trong chuồng nuôi gà

hoặc xung quanh chuồng nuôi có khả năng mang Oocyst cầu trùng gà, như: Ruồi, gián, kiến, chuột Chúng mang Oocyst cầu trùng ở chân, trên lông, da, cánh, trong khi di chuyển sẽ truyền Oocyst cầu trùng vào thức ăn, nước uống của gà, làm

cho gà nhiễm cầu trùng Theo Lê Minh (2008) thì tất cả các động vật và côn trùng đều có khả năng mang mầm bệnh trong đó ở kiến là 27,27%, ruồi là 22,22% và gián là 16,67% Vì vậy tác giả đã kết luận các loài côn trùng như: Gián, chuột,

ruồi, là tác nhân mang Oocyst cầu trùng từ bên ngoài vào

Phạm Văn Khuê và Phan Lục (1996) cho biết, khi Oocyst bị ruồi nuốt vào,

trong đường tiêu hoá của ruồi, chúng vẫn sống và còn khả năng gây bệnh trong vòng 24 giờ

Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2008) cho rằng, bệnh cầu trùng gà phân bố không đồng đều qua các tháng trong năm, những tháng có khí hậu ẩm ướt, mưa nhiều, nhiệt độ thích hợp từ 18 - 35°C bệnh thường xuất hiện và dễ bùng phát

hơn các tháng khác Vì vậy, ở nước ta mùa xuân và mùa hè là hai mùa có tỷ lệ nhiễm cầu trùng cao hơn mùa đông và mùa thu

Chuồng trại chăn nuôi là yếu tố quan trọng liên quan đến dịch tễ bệnh cầu trùng gà Nuôi gà trong lồng và nuôi trên nền chuồng có tỷ lệ nhiễm cầu trùng khác nhau Tỷ lệ nhiễm cầu trùng ở gà nuôi lồng là 0,37%, gà nuôi trong chuồng

có đệm lót là trấu nhiễm 22,49 - 57,38 Như vậy, gà nuôi trong lồng không tiếp xúc với phân thì tỷ lệ nhiễm cầu trùng rất thấp

Morgot (2000) cho rằng, cơ sở chăn nuôi có điều kiện chăm sóc tốt, vệ sinh chuồng trại nghiêm ngặt thì tỷ lệ nhiễm cầu trùng 5 - 10%, còn ở những cơ sở chăn nuôi không đảm bảo điều kiện vệ sinh thì tỷ lệ nhiễm là từ 30 - 69% (dẫn theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs., 2008)

2.1.3 Sinh bệnh học

Williams et al (1996) cho biết, gà nhiễm E tenella sau 3 ngày, niêm mạc

manh tràng phù nề, sung huyết Ngày thứ nhất sau khi bị nhiễm, trong ruột chứa

nhiều bào tử con (Sporozoite) được giải phóng ra từ Oocyst gây bệnh, các

Sporozoite xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột, lập tức sinh sản vô tính nhiều đợt,

tạo ra các Schizont thế hệ 1, từ đó tạo ra vô số Merozoite Ngày thứ 2, các

Merozoite lại tiếp tục xâm nhập tế bào biểu mô ruột lành, quá trình sinh sản vô

tính tạo ra các Schizont thế hệ 2, từ đó tạo ra hàng loạt các Merozoite thế hệ tiếp theo Merozoite thế hệ cuối cùng của quá trình sinh sản vô tính sau vài ngày sẽ phát triển trong tế bào biểu mô tạo thành các Schizont và biệt hoá thành các tiểu phối tử

và các đại phối tử Tiểu phối tử và đại phối tử giải phóng ra khỏi tế bào biểu mô sẽ kết hợp với nhau thành hợp tử

Theo Williamz and Dougald (1991) thì quá trình sinh sản vô tính và hữu tính của cầu trùng gà xảy ra trong tế bào biểu mô ruột thoạt đầu gây hiện tượng

sung huyết, sau đó là hoại tử và xuất huyết niêm mạc ruột Levine et al (2005)

và Shirley (1986) cho rằng, bào tử của Oocyst có chứa bốn Sporocyst và mỗi

Sporocyst chứa hai sporozoite Sự cảm nhiễm xảy ra thông qua đường phân -

miệng và gà trở nên bị cảm nhiễm khi ăn uống phải một hoặc nhiều bào tử

Oocyst từ môi trường Vỏ của Oocyst được phá vỡ trong dạ dày cơ và Sporozoite

được giải phóng từ Sporocyst trong ruột non dưới tác dụng của chymotrypsin và

muối mật sau đó xâm nhập vào tế bào biểu mô Theo Lê Văn Năm (2004) thì

Escherichia coli gây bại huyết luôn là bạn đồng hành của cầu trùng, trong đó cầu

trùng đóng vai trò quyết định, E coli đóng vai trò thúc đẩy Trường hợp gà bị cầu

trùng, nhất là cầu trùng cấp thì 100% số đàn bị bệnh đều bị bội nhiễm với E coli

a Thể cấp tính

Bệnh chủ yếu xảy ra ở gà con, thời gian phát bệnh nhanh, những triệu chứng lâm sàng điển hình là: Gà bỏ ăn, ủ rũ, lười đi lại, nằm hoặc đứng một chỗ

Eimeria ký sinh và phát triển trong tế bào biểu mô đường ruột, gây tổn thương

mô và làm thay đổi chức năng đường ruột (McDonald and Shirley, 2009; Williams, 1999) Theo các tác giả này thì bệnh cầu trùng có thể được đặc trưng bởi những triệu chứng như: chán ăn, xù lông, tụm thành đống, tử vong, tiêu chảy, phân có máu, giảm tăng trọng và giảm chuyển hóa thức ăn Giai đoạn mới phát bệnh gà ỉa khó, có biểu hiện táo bón, sau đó thì gà ỉa chảy toàn nước Phân sống lúc đầu có chất nhầy màu nâu vàng, sau chuyển thành nâu sáp, cuối cùng có lẫn

máu Đặc biệt, đối với gà nhiễm loài E tenella có triệu chứng hậu môn chảy ra

máu tươi, lông xung quanh lỗ huyệt lấm bẩn phân và máu, đôi khi còn quan sát thấy các biểu hiện triệu chứng thần kinh như liệt và bán liệt chân hoặc cánh, nằm

tụ lại một góc chuồng kêu khác lạ nhưng lại rất đặc trưng Thể cấp tính xảy ra rất nhanh chóng và chỉ kéo dài 2-3 ngày, gà bị chết sau 7-8 ngày nếu không có sự điều trị kịp thời Gà chết do cầu trùng thể cấp có thể chiếm tỷ lệ lên tới 90 - 95

%, thậm chí 100% nếu không điều trị

b Thể mãn tính

Bệnh thường quan sát thấy ở gà lớn từ 45 - 90 ngày tuổi, triệu chứng bệnh như được mô tả ở thể cấp tính nhưng mức độ biểu hiện nhẹ hơn, thời gian ốm kéo dài 7-15 ngày và tỷ lệ chết khoảng 25-40% (McDonald and Shirley, 2009; Williams, 1999)

c Thể không có triệu chứng lâm sàng

Gà lớn trưởng thành có mang mầm bệnh, quan sát bề ngoài gà hoàn toàn khỏe mạnh, ăn uống, đi lại bình thường Triệu chứng lâm sàng duy nhất là đôi khi gà bị ỉa chảy, tỷ lệ đẻ không đều, năng suất trứng giảm 15-25% Xét nghiệm

phân gà thấy có rất nhiều Oocyst cầu trùng (McDonald and Shirley, 2009;

Williams, 1999)

2.1.4.2 Bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng

Gà bị bệnh cầu trùng thường có bệnh tích như: mào, yếm, tích, kết mạc

trắng bệch Trường hợp gà bị cầu trùng cấp tính do E tenella hoặc bị ghép với

E coli bại huyết thì gà bệnh ỉa ra máu tươi hoàn toàn, xác gà chết còn béo tốt,

thịt trắng

Trường hợp dưới cấp tính hoặc mãn tính thì xác gà ướt, xung quanh lỗ huyệt dính bết đầy phân, gà chết rất gầy và thiếu máu

Gà bị bệnh cầu trùng dù ở thể cấp hay thể mãn tính thì các bệnh tích cũng tập trung chủ yếu ở đường ruột Điều đặc biệt cần chú ý là vị trí của các đoạn ruột và mức độ tổn thương của niêm mạc các đoạn ruột đó khác nhau tùy theo từng loài cầu trùng, tùy theo độ tuổi của gà và tùy theo mức độ nhiễm cầu trùng ở

gà Bệnh tích chủ yếu có ở 3 vị trí là: manh tràng, ruột non, trực tràng (Conway and McKenzie, 2007)

- Manh tràng: Bị viêm, sung huyết, xuất huyết, phình to, có chứa đầy phân

và máu, niêm mạc bị phá hủy làm vách manh tràng mỏng đi nhiều, tìm thấy chủ

yếu là E tenella

- Ruột non: Nhìn từ bên ngoài có những đốm xuất huyết lấm tấm kéo dài,

ruột non căng phồng chứa đầy chất không tiêu hóa được, niêm mạc có nhiều nốt xuất huyết và hoại tử, thành ruột dày, mỏng gồ ghề và có thể tìm thấy chủ yếu

các loài như E acevullina, E necatric, E maxima, E.mivatti, E praecox,

E hangami

- Trực tràng: Bị tổn thương từng điểm nhỏ, viêm, xuất huyết, nạo chất chứa

cho lên phiến kính soi thì có thể thấy E brunetti, E mitis

Trên cơ sở những triệu chứng, bệnh tích ở trên giúp chúng ta có thể sơ bộ chẩn đoán nhanh được bệnh cầu trùng để từ đó có hướng điều trị phù hợp và kịp thời

2.1.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà

Chẩn đoán bệnh cầu trùng gà và phân biệt các loài thường dựa vào các

dấu hiệu lâm sàng trong cơ thể và đặc tính sinh học của loài đó, bao gồm thời gian ủ bệnh, vị trí kí sinh trong ruột, hình thái kén hợp tử trong phân, niêm mạc trong ruột non và manh tràng (Conway and McKenzie, 2007)

Chẩn đoán theo dịch tễ: Gà bị ốm thường sau 10-14 ngày tuổi và bệnh

nặng nhất từ 18-45 ngày tuổi, từ 45-90 ngày luôn ở thể mãn tính, sau 90 ngày là thể mang trùng

Chẩn đoán theo triệu chứng lâm sàng: Bệnh với những triệu chứng lâm sàng

điển hình như đã nêu ở trên cho phép chúng ta có cơ sở nghi đó là bệnh cầu trùng

Xét nghiệm phân: Phương pháp xét nghiệm phân chủ yếu nhằm mục đích

khẳng định bệnh và phân loại cầu trùng Thông thường 7-9 ngày sau khi mắc

bệnh hầu như không thể phát hiện Oocyst cầu trùng trong phân, do đó chẩn đoán

bệnh phải lấy ngay niêm mạc hoặc vật chất tại các vùng có biến đổi để xem xét

sự có mặt của thể phân lập (Schizont thế hệ 1 hoặc 2) hoặc nguyên bào trung gian (Merozoite)

Kiểm tra phần bệnh tích: Theo Zander et al (1991) thì phương pháp mổ

khám để kiểm tra bệnh tích là mổ để lộ ổ bụng, sau đó kéo phần ruột thẳng ra để kiểm tra toàn bộ chiều dài của đường ruột Quan sát hình thái bên ngoài của ruột,

có thể có một số thay đổi như bị xuất huyết, có thể chuyển từ màu đỏ sang màu

nâu hoặc trắng, bị sưng Nguyên nhân gây xuất huyết và sưng có thể do E

acervulina, E Necatrix hoặc E maxima Nếu dùng kéo để cắt phần ruột ra, có thể

nhận thấy thành ruột dày lên, xuất huyết, tụ huyết, cạo phần sinh khối trong ruột sau đó hòa thêm nước muối sinh lý để kiểm tra qua kính hiển vi

Conway and McKenzie (2007) cho rằng, để xác định sự khác biệt của mỗi loài cầu trùng thì dựa vào các đặc điểm sau: Phần ruột mà loài đó ký sinh, những

tổn thương xuất hiện trên cơ thể, hình thái của Oocyst, thời gian tối thiểu để hình thành Oocyst và ủ bệnh tối thiểu, Schizont và vị trí phát triển của nó, vị trí ký sinh

trong biểu mô ruột

Chẩn đoán bệnh cầu trùng gà bằng phương pháp ELISA: nhiều tác giả đã

sử dụng phương pháp ELISA để chẩn đoán các giai đoạn phát triển của E tenella như giai đoạn Sporozoite (Saravanan et al., 2014), Merozoite (Olson et al., 1990),

Sporozoite và Merozoite (Constantinoiu et al., 2007), Hiệu quả của việc gây

miễn dịch cho gà 2 lần vào lúc 15 và 20 ngày tuổi với kháng nguyên Gametocyte,

kết quả cho thấy kháng thể đặc hiệu tăng cao nhất vào tháng thứ 2, 3 sau khi tiêm

phòng vắc xin (Wallach et al., 2008)

PCR là phương pháp đã được phát triển sử dụng để chẩn đoán và phân biệt

các loài cầu trùng (Schnitzler et al., 1998) và nhiều tác giả đã sử dụng phương

pháp này để xác định tiểu đơn vị 5S rARN (Stucki et al., 1993); vùng ITS – 1 (Su

et al., 2003); vùng ITS – 2 (Woods et al., 2000)

- Thuốc Coccistop 2000 (hãng Intervet, Hà Lan), thuốc có tác dụng trên các

loài cầu trùng như E acervulina, E maxima, E tenella, E brunetti, E necatrix ở

giai đoạn sinh sản nội sinh

- Thuốc Baycox (Bayer, Đức) thành phần chính là tottrazuril với nồng độ

25 mg l nước uống 2 lần/ngày trong 2 ngày liền có hiệu quả phòng trị bệnh tốt,

kết quả làm giảm Oocyst thải ra và giảm tổn thương đường ruột (Mathis, 2004)

Bên cạnh đó, thuốc Esb3 (Novatis, Thụy sỹ), Ngoài ra hiện nay một số nghiên cứu đã sử dụng chế phẩm sinh học để phòng và trị cho hiệu quả cao dần dần thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh cầu trùng ở gà

2.1.7 Miễn dịch chống cầu trùng ở gà

2.1.7.1 Miễn dịch tế bào

Theo Adams and Hamilton (1984) thì vai trò thực bào của các đại thực bào

rất quan trọng trong quá trình ức chế sự phát triển của Schizont Ngoài đại thực

bào, bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu ái toan và bạch cầu ái kiềm cũng có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch cầu trùng

Lillehoj et al (1998) đã cho biết, tế bào NK (Natural killer) tăng cường

hoạt động trong giai đoạn sớm sau khi cảm nhiễm, chúng có vai trò trong việc kiểm soát sự sinh trưởng của ký sinh trùng Ngoài ra, trong suốt quá trình cảm nhiễm lần đầu, các đại thực bào làm nhiệm vụ nhằm loại bỏ ký sinh trùng, đồng thời chúng còn có vai trò cho việc trình diện kháng nguyên trong lần cảm nhiễm

tiếp theo, nơi mà tế bào lympho T (CD8+) gây ra đáp ứng miễn dịch (Vervelde et

al., 1996) Các tế bào CD8+ cùng với một kháng thể đơn dòng chống lại CD8+ bị

sự suy giảm dẫn đến làm tăng lượng Oocyst thải ra từ phân sau khi gà bị cảm nhiễm lần đầu với E acervulina và E tenella Tế bào CD4+ của TCRαβ+ có

chức năng trong việc chống lại hầu hết cảm nhiễm lần đầu, nhưng không phải

cho tất cả các loài Eimeria (Shirley et al., 2007)

Interleukin - 2 là một yếu tố tăng trưởng mạnh cho nhiều loại tế bào khác

nhau và được nhận thấy là tăng lên sau khi cảm nhiễm lần đầu tiên với E

acervulina (Choi et al., 1999) Các cytokine kháng viêm (TGF - β và IL - 4, IL -

5, IL - 10) đóng một vai trò quan trọng trong việc hạn chế bệnh lý miễn dịch, mà được liên kết với cytokine tiền viêm gây ra bởi sự cảm nhiễm Việc điều hòa ngược của Th1 được thực hiện bằng IL - 10, cytokine này làm thay đổi sự cân bằng Th1 - Th2 của phản ứng miễn dịch, IL -10 được tạo ra trong suốt quá trình

mắc bệnh cầu trùng (Rothwell et al., 2004) Sự gia tăng tế bào TCRαβ+ và CD8+

đã tìm thấy sau khi gà bị cảm nhiễm lần sau với chủng E acervulina và có vai trò

quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống lại bệnh cầu trùng Bên cạnh đó, gà bị

cảm nhiễm lần sau với E acervulina, có sự tăng lên đáng kể của các tế bào TCRγδ+ và số lượng IL- 2 ở tá tràng (Choi et al., 2000)

2.1.7.2 Miễn dịch dịch thể

Lillehoj (1996) cho rằng, gà nhiễm cầu trùng sẽ có kháng thể trong máu và dịch tiết của niêm mạc, kháng thể trong máu có chứa IgM và IgA Ngoài ra, IgA còn được phát hiện thấy trong ruột và dịch mật của gà nhiễm cầu trùng Kháng thể IgM và IgG trong huyết thanh gà cao nhất vào tuần thứ 2 và 3 sau khi nhiễm

E tenella, còn IgA được phát hiện sau 1 tuần trong dịch mật sau khi nhiễm E acervulina

Schizont và Merozoite xâm nhập vào các tế bào biểu mô ruột xảy ra rất

nhanh, vì vậy đáp ứng miễn dịch dịch thể càng đóng vai trò quan trọng Dưới sự

kích thích của Merozoite và Schizont, sự hỗ trợ của tế bào lympho T, tế bào

lympho B phân chia rồi biệt hóa thành tương bào (plasma), tương bào tiết ra

kháng thể chống lại các Merozoit và Schizont Ngoài ra, cytokin và lymphokin

cũng có vai trò trong miễn dịch ở gà

Lillehoj and Lillehoj (2000) cho biết, Eimeria sống bên ngoài cơ thể vật chủ

chỉ có một phần nhỏ của toàn bộ chu kỳ, phần lớn chu kỳ sống của nó được hoàn thành bên trong cơ thể vật chủ trong cả giai đoạn sinh sản vô tính và hữu tính

chúng xảy ra bên trong hay bên ngoài mô ruột Sau khi gà ăn phải Oocyst có khả

năng gây nhiễm, một chuỗi các đáp ứng xảy ra liên quan đến cả hai cơ chế bảo vệ đặc hiệu và không đặc hiệu của hệ miễn dịch

Sau khi gà bị cảm nhiễm cầu trùng khoảng hai tuần, lượng kháng thể đầu tiên được hình thành để chống lại ký sinh trùng Gà con của gà mẹ bị cảm nhiễm

giảm bài xuất ký sinh trùng là do nhận được kháng thể từ gà mẹ (Smith et al., 1994; Wallach et al., 1992) Điều này có nghĩa là kháng thể đóng một vai trò

quan trọng trong sự bảo vệ cơ thể vật chủ Tuy nhiên, nồng độ kháng thể trong huyết thanh và cả trong ruột không tương quan với mức độ bảo vệ sau khi bị

nhiễm cầu trùng qua đường miệng (Dalloul et al., 2003) Vai trò của kháng thể trong việc loại bỏ Eimeria được giải thích thông qua cơ chế ADCC (Antibody -

dependent cell mediated cytotoxicity) Vai trò này tiếp tục được chứng minh sau khi loại bỏ túi Fabricius, chúng không ảnh hưởng đến khả năng tạo ra một phản ứng miễn dịch của cơ thể động vật để bảo vệ thứ cấp, quá trình này được thể hiện

qua đáp ứng miễn dịch tế bào khi có cảm nhiễm với Eimeria (Lillehoj and Ruff,

1987; Rose, 1970)

2.1.8 Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà

2.1.8.1 Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vắc xin cầu trùng sống

Thành phần vắc xin là các Oocyst cầu trùng đã được xử lý theo yêu cầu

công nghệ Những loại vắc xin sống đã được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam như: Coccivac - B (Mỹ), Paracox (Canada),

Hầu hết các loại vắc xin sống bao gồm 3 loài E acervulina, E maxima,

E tenella được giảm độc lực, nó có hiệu quả trong trường hợp nhiễm các loài

này, tuy nhiên nó sẽ không chống lại được các loài Eimeria ít phổ biến, bao gồm

E bruneti, E mitis, E necatrix và E praecox (Chapman, 1996).

2.1.8.2 Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vắc xin chết

Lillehoj and Trout (1993) cho biết, gây miễn dịch miễn dịch bằng vắc xin nhằm kích thích hệ miễn dịch mạnh và cho đáp ứng miễn dịch rất tốt, do đó vắc xin là sự lựa chọn tốt để thay thế các loại thuốc kháng sinh chống cầu trùng khác

Theo Shirley et al (1995) thì vắc xin chết được sử dụng bằng cách lặp lại nhiều lần việc cung cấp một lượng nhỏ Oocyst cầu trùng vào cơ thể để tích tụ sự miễn

dịch vững chắc

Danforth (1998) đã cho biết, dùng vắc xin trong tuần đầu tiên sau khi gà nở

sẽ tạo miễn dịch vững chắc khi chúng được sử dụng một cách cẩn thận trong điều kiện chăn nuôi tốt Theo Phan Lục và Bạch Mạnh Điều (1999) thì vắc xin Coccivax được sử dụng phòng bệnh cầu trùng cho gà từ 6 ngày tuổi có tác dụng

bảo hộ đến 54 ngày tuổi

Những kết quả nghiên cứu chế tạo và sử dụng vắc xin phòng bệnh cầu trùng cho gà đã mở ra triển vọng cho những nghiên cứu tiếp theo trong tương lai, nhằm tiến tới khống chế bệnh cầu trùng ở gà, góp phần giảm thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia cầm nói riêng

2.1.8.3 Nghiên cứu chế tạo và sử dụng vắc xin thế hệ mới

Hiện nay có nhiều nghiên cứu chế tạo và ứng dụng vắc xin thế hệ mới trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà bằng cách phân lập và biểu hiện các gene

mã hóa cho nhiều kháng nguyên gây bệnh cầu trùng gà được sử dụng trong

phòng và trị bệnh cầu trùng một cách có hiệu quả và an toàn (Shivaramaiah et al., 2014), trong đó có protein tái tổ hợp 3-1E (Ma et al., 2011), TA4 (Brothers et al., 1988), MIC2 (Ding et al., 2005), Rho (Wang et al., 2009), Gam56 (Xu et al., 2013a), GX3262 (Miller et al., 1989)

2.2 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

2.2.1 Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp

Công nghệ ADN tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ sự phát triển các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình sinh học ở mức độ phân tử ADN tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gene hay kỹ thuật gene…) là tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi

và nghiên cứu các đoạn ADN Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là kết hợp ADN từ hai nguồn xa nhau Ví dụ: các gene từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gene người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn (Nguyễn Hoàng Lộc và cs., 2007)

Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp đã ứng dụng rất phổ biến trong sản xuất vắc xin đây là một lĩnh vực phát triển mạnh của công nghệ ADN tái tổ hợp Các loại vắc xin này được bào chế từ vi khuẩn đã được chuyển gene mã hóa tổng hợp một protein kháng nguyên của một loại vi rút hay một loại vi khuẩn gây bệnh nào đó (Nguyễn Hoàng Lộc và cs., 2007)

2.2.2 Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu

hiện gene trong E coli

2.2.2.1 Đặc điểm của hệ thống vector pET

Hiện nay, hệ thống vector pET (Invitrogen) là một trong những hệ thống

mạnh nhất được phát triển để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E

coli Trong các vector này, gene đích được đặt dưới sự kiểm soát của T7

promoter là một promoter mạnh của T7 bacteriophage Sự biểu hiện được cảm ứng bằng cách cung cấp một nguồn T7 ARN polymerase dưới dạng trans trong tế bào vật chủ T7 ARN polymerase có tính chọn lọc và hoạt động hiệu quả Khi sử dụng hệ thống pET và vật chủ phù hợp, lượng sản phẩm mong muốn có thể chiếm hơn 50 protein tổng số của tế bào sau vài giờ cảm ứng Một ưu điểm quan trọng của hệ thống này là khả năng duy trì trạng thái không phiên mã của gene đích khi không được cảm ứng Đầu tiên, gene đích được tạo dòng trong vật chủ không chứa gene T7 ARN polymerase để tránh sản xuất nhiều protein dẫn đến gây độc cho tế bào chủ Khi tiến hành biểu hiện, plasmid được chuyển vào vật chủ có chứa bản sao của gene T7 ARN polymerase dưới sự kiểm soát của lacUV5 promoter và sự biểu hiện được cảm ứng bằng cách bổ sung IPTG ở nồng

độ thích hợp (Mierendorf et al., 2000)

2.2.2.2 Đặc điểm của hệ thống vector tạo dòng pGEM-T-Easy

Vector pGEM-T Easy là những vector được thiết kế với cả hai đầu 3’có chứa thymidine (dT) Sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi các enzyme tổng hợp có gắn đầu dA tương thích với đầu dT nhô ra ở trên vector làm tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR vào vector bằng cách ngăn chặn việc tự gắn vòng của vector Vector này có số lượng bản sao cao, chúng có chứa các promoter T7 và SPS6 ARN polymerase nằm cạnh vùng tạo dòng, bên trong đoạn mã hóa cho α-peptide

và chọn đoạn mã cho enzyme β-glactosidase Sự bất hoạt do hoạt động chèn vào của đoạn α-peptide cho phép xác định các thể chuyển nạp hay không chuyển nạp bằng cách sàng lọc màu sắc xanh/trắng trên đĩa thạch Vector có chứa một số vị trí cắt của enzyme giới hạn trong vùng đa chọn lọc (MCR=Multiple Cloning Region)

Vị trí MCR của vector pGEM-T Easy nằm dọc theo các vị trí nhận biết của

enzyme EcoRI, BstZI và NotI, cho phép 3 enzyme riêng rẽ cắt đoạn chèn Cuối

cùng, một vị trí cắt đôi có thể được sử dụng để giải phóng đoạn chèn từ vector này hay vector khác Vector đều được cung cấp với đệm 2x rapid ligation buffer Phản ứng gắn có thể ủ trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ phòng Khoảng thời gian ủ có thể tăng thêm để làm tăng số lượng khuẩn lạc được biến nạp Thông thường, một quá trình ủ qua đêm ở 4°C cho số lượng thể biến nạp cao nhất

Trong vector này có chứa vị trí liên kết của gene pUC cho sự khuếch đại của

cặp mồi M13, do vậy khi tiến hành phản ứng PCR của plasmid tái tổ hợp bằng cặp mồi này, chúng ta sẽ thu được một đoạn ADN cho độ dài tương ứng bao gồm kích thước của gene và một đoạn khoảng 200 bp nằm trên vector pGEM®-T Easy do cặp mồi M13 khuếch đại giúp cho việc sàng lọc được các dòng khuẩn lạc dương tính một cách chính xác và hiệu quả (Robles and Doers, 1994)

2.2.2.3 Tạo dòng và biểu hiện gene trong tế bào E coli khả biến

Ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp và kỹ thuật nuôi cấy mật độ cao, nhiều protein tái tổ hợp được sản xuất với lượng thích hợp để nghiên cứu và ứng dụng trong đời sống Việc sản xuất các protein tái tổ hợp có thể thực hiện bằng nhiều hệ thống biểu hiện khác nhau (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và các tế bào động vật có vú) phụ thuộc vào loại sản phẩm và mục đích của nhà sản xuất Tuy

vậy, trong các hệ thống biểu hiện vi khuẩn, E coli là loại vi khuẩn gram âm được

ưa chuộng nhất để sản xuất protein tái tổ hợp Một trong những lý do là vì thao

tác kỹ thuật với E coli khá dễ dàng và chuẩn hóa ở mọi phòng thí nghiệm Mặt

khác, vi khuẩn này có tốc độ sản xuất nhanh, sinh khối lớn và dễ dàng nuôi cấy

trên các môi trường đơn giản (Choi et al., 2006; Miksch et al., 2008) Hệ gene của

chúng có thể được cải tiến một cách nhanh chóng và chính xác Sử dụng hệ thống này có thể tránh được sự kết hợp của các amino a xít hình thành liên kết disulfide

nội bào E coli có thể tích lũy protein tái tổ hợp lên đến 80% khối lượng khô của

chúng và sống được trong nhiều điều kiện môi trường khác nhau (Demain and Vaishnav, 2009)

Vật chủ thích hợp cho việc tạo dòng sử dụng hệ thống pET là các chủng

E coli K12, HMS174, HB101, JM109, DH5α, TOP10 và Nova Blue Các chủng

này là vật chủ thuận tiện cho tạo dòng gene và duy trì plasmid trong tế bào Trong khi đó, các chủng có nguồn gốc từ BL21, đặc biệt là BL21 (DE3) có khả năng tổng hợp T7 ARN polymerase là vật chủ thích hợp cho biểu hiện gene

(Mierendorf et al., 2000) Hệ thống biểu hiện pET đang ngày càng được ứng

dụng rộng rãi và hiện nay có nhiều hệ thống vector biểu hiện khác nhau phát triển

từ hệ thống vector này

Xu et al (2006b) đã thành công trong việc tạo dòng và biểu hiện gene

Human beta - defensin - 4(hBD4) (là một protein có tác dụng chống nhiễm khuẩn

ở người), sử dụng vector biểu hiện pET32 - smhBD4, phân tích sự biểu hiện của

gene hBD4 thành protein hBD4 đạt 1,9 g l và protein này đạt 2,68 g/l khi nuôi E