Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh virus cũng đã được triển khai ở Việt Nam, trên một số loại cây trồng, để tạo ra khả năng kháng với các
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
- -
NGUYỄN XUÂN DŨNG
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi
ĐỂ TẠ D NG N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG
I U HẢ NG Cymbidium mosaic virus)
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62.62.01.11
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP
TP Hồ Chí Minh, 2017
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC KỸ THUẬT NÔNG NGHIỆP MIỀN NAM
Người hướng dẫn khoa học: 1 T DƯƠNG H XÔ
Có thể tìm hiểu luận án tại:
1 Thư viện Quốc gia
2 Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3 Thư viện Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết
Dendrobium là giống lan được trồng phổ biến ở Việt Nam Đây là một
giống chiếm ưu thế trong họ hoa lan, bao gồm nhiều loài có hoa đẹp, có thể sử
dụng cho mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu Dendrobium đã thực sự
trở thành một giống lan chủ lực đối với ngành sản xuất hoa lan ở Việt Nam trong nhiều năm qua Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một trong những trung tâm
sản xuất hoa lan lớn nhất cả nước, cùng với lan Mokara, Dendrobium là một
trong hai giống lan đóng góp chính vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu
và 68,9 triệu cành hoa lan (đạt giá trị 613,9 tỷ đồng) của ngành sản xuất hoa lan thành phố trong năm 2015 (UBND Tp Hồ Chí Minh, 2016) Tuy nhiên,
hiện tại việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng và hoa lan nói chung tại Thành
phố Hồ Chí Minh cũng như cả nước vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước Hoa lan vẫn được nhập khẩu từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc để cung cấp cho thị trường trong nước Việc nghiên cứu nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan là một trong những vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối với ngành sản xuất hoa lan Việt Nam
Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng hoa lan, trong đó bệnh hại là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất
Nhiều loại bệnh khác nhau gây hại trên lan Dendrobium cũng như hoa lan nói
chung đã được ghi nhận, nhưng đáng chú ý nhất là bệnh do virus gây ra Hiện
có hai loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng
(Cymbidium mosaic virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) (Zettler và cs, 1990) Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus
CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở Việt Nam (Dũng và cs,
2009, Hồng và cs, 1999; Quỳnh và cs, 2007), và đặc biệt là lan Dendrobium
được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV (Dũng và cs, 2009) Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng
trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam
Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng và chất lượng hoa, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng thu hoạch
Trang 4Quan trọng hơn, do virus có khả năng phát triển tiềm ẩn và lan truyền nhanh chóng qua các dụng cụ làm vườn, nên thiệt hại thường diễn ra trên phạm vi lớn với mức độ rất nghiêm trọng Đến nay, biện pháp duy nhất để kiểm soát bệnh virus vẫn là phòng tránh thông qua loại trừ các tác nhân lây nhiễm trong quá trình sản xuất giống và canh tác Việc triển khai các quy trình kiểm soát bệnh gây tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí và không phải lúc nào cũng mang lại hiệu quả như mong muốn Do vậy, các biện pháp hiệu quả hơn vẫn đang được nghiên cứu, mà một trong số đó là tạo tính kháng virus cho cây bằng kỹ thuật chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA (RNAi)
Cho đến nay, nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên thế giới (Gottula và Fuchs, 2009) Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh virus cũng đã được triển khai ở Việt Nam, trên một số loại cây trồng, để tạo ra khả năng kháng với các loại virus khác nhau như thuốc lá kháng virus TMV (Vân và cs, 2009), virus CMV (Vân và cs, 2008) và kháng đồng thời cả hai loại virus TMV và CMV (Hà và cs, 2009); cà chua kháng virus TYLCV (Yến và cs, 2011); đu đủ kháng virus PRSV (Hà và cs, 2011), đậu tương kháng virus SMV
và BYMV (Thu và cs, 2014) Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào
được triển khai trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV,
trong khi tình trạng nhiễm virus CyMV vẫn đang diễn ra rất nghiêm trọng trên giống lan này
Đề tài “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi
để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)” được thực hiện nhằm mục đích đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên lan Dendrobium để
tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, từ đó tiến đến tạo ra các dòng lan
Dendrobium có khả năng kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao năng suất và
sản lượng hoa lan
2 Mục tiêu và yêu cầu
Nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi
trong việc tạo ra khả năng kháng virus CyMV cho lan Dendrobium trong điều kiện nuôi cấy in vitro
Trang 53 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên lan Dendrobium Sonia và virus CyMV gây
bệnh trên lan Các dòng lan chuyển gen được tạo ra qua việc chuyển cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP từ virus CyMV vào mô lan (PLBs) bằng kỹ
thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) Các thí nghiệm khảo sát, đánh giá trong nghiên cứu được giới hạn trong điều kiện in vitro
4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Tạo tiền đề quan trọng cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để
tạo ra khả năng kháng virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung
* Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra được các dòng lan Dendrobium chuyển gen có khả năng kháng virus CyMV trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu cho nghiên cứu tạo giống lan
kháng virus thông qua lai tạo
5 Đóng góp mới của luận án
- Chứng minh được tính bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus
CyMV tại Việt Nam
- Khẳng định được tính khả thi của kỹ thuật chuyển gen RNAi trong việc
tạo khả năng kháng virus cho lan Dendrobium
- Góp phần hoàn thiện phương pháp đánh giá khả năng kháng virus của cây
lan chuyển gen trong điều kiện nuôi cấy in vitro
- Tạo ra được các dòng lan Dendrobium Sonia có khả năng kháng virus
trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo giống
lan kháng virus
6 Cấu trúc của luận án
Luận án bao gồm có 107 trang chia thành các phần: Mở đầu (04 trang); Tổng quan tài liệu (31 trang); Nội dung và Phương pháp nghiên cứu (18 trang);
Trang 6Kết quả và Thảo luận (41 trang); Kết luận và Đề nghị (2 trang); và Danh mục các công trình đã công bố (01 trang Luận án gồm có 18 bảng số liệu; 40 hình ảnh minh họa; và 88 tài liệu tham khảo bao gồm 13 tài liệu tiếng Việt và 75 tài liệu tiếng Anh Ngoài ra luận án còn bao gồm 5 phụ lục đính kèm
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Dendrobium Sonia là dòng lan lai được tạo ra từ tổ hợp lai Dendrobium Caesar x Dendrobium Tomie Drake bởi tác giả Chittraphong, và được giới
thiệu lần đầu tiên vào năm 1984 (Yang và cs, 2003) Đây là một loại hoa phù hợp cho cả mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu So với nhiều loại lan
khác, nhu cầu của thị trường đối với hoa lan Dendrobium Sonia vẫn không
ngừng gia tăng trong nhiều năm qua
Hiện có hai loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng
(Cymbidium mosaic virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) (Zetter và cs, 1990) Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus
CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở Việt Nam (Dũng và cs,
2009; Hồng và cs, 1999; Quỳnh và cs, 2007) và đặc biệt là lan Dendrobium
được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV (Dũng và cs, 2009) Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng
trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam
Sự can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) là hiện tượng im lặng gen sau phiên mã do phân tử RNA mạch kép cảm ứng, được công bố ban đầu ở
giun tròn (Ceanorhabditis elegans) (Yamada và cs, 2007) Việc khám phá ra
RNAi đã cách mạng hóa lĩnh vực nghiên cứu chọn giống cây trồng RNAi hiện diện như một công cụ mới đầy tiềm năng cho việc chọn giống cây trồng qua việc áp dụng các đoạn trình tự RNA không mã hóa nhỏ, có khả năng kiểm soát
sự biểu hiện gen một cách chuyên biệt trình tự (Abhary và Rez, 2015) RNAi cũng được xem là một cơ chế quan trọng để tạo ra khả năng kháng virus cho cây trồng (Baulcombe, 2004) Hiệu quả của RNAi trong việc tạo ra khả năng kháng virus lần đầu tiên đã được thông báo với kết quả kháng virus PVY
(Potato virus Y) ở khoai tây Nhiều nghiên cứu ứng dụng RNAi để tạo ra khả
năng kháng các loại virus thực vật khác nhau đã được công bố (Abhary và Rez,
Trang 72015) Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng RNAi để tạo ra khả năng kháng
virus cho lan Dendrobium hiện còn rất hạn chế Đối với nghiên cứu ở nước
ngoài, công trình duy nhất về vấn đề này đã được Chuphrom và cộng sự (2009)
công bố trên lan Dendrobium Sonia Trong đó, nhóm tác giả đã chuyển cấu
trúc RNAi của gen CP từ virus CyMV vào PLBs bằng phương pháp bắn gen Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu này chỉ mới dừng ở mức thu được các dòng lan có mang gen CP Còn nhiều vấn đề chưa được làm rõ như khả năng kháng virus và tính ổn định của gen chuyển như thế nào, hiệu quả tạo ra tính kháng virus khi áp dụng RNAi ra sao,… Ngoài ra, việc sử dụng phương pháp bắn gen
để đưa gen mục tiêu vào tế bào cũng là một vấn đề cần được xem xét, vì các cây chuyển gen được tạo ra bằng phương pháp bắn gen thường không có khả năng sinh sản và di truyền gen chuyển theo luật Menden (Alimohammadi và Bagherieh-Najjar, 2009) Đối với nghiên cứu trong nước, hiện vẫn chưa có công trình nào được công bố về vấn đề ứng dụng RNAi để tạo khả năng kháng
virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan Do đó, cần có những nghiên cứu
với nội dung, phương pháp hoàn thiện và phù hợp hơn để có thể tạo ra giống
lan Dendrobium có khả năng kháng virus phục vụ cho sản xuất
Chương 2 NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP
2.1 Nội dung nghiên cứu
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu
- Giả hành (thân) của cây lan Dendrobium Sonia trưởng thành; mẫu lá lan Dendrobium nghi nhiễm virus được thu thập từ vườn trồng lan
- Các chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105, LBA4404, C58 mang vector
pCambia 1301
- Các loại vector: pJET1.2, pENTRTM/D-TOPO®, pK7GWIWG2(II)
- Đoạn gen ghép nối ORF2-4+CP dài 496 bp, được tổng hợp nhân tạo và gắn vào vector pBSK/ORF2-4+CP
- Các trình tự mồi dùng cho khuếch đại gen:
Khuếch đại gen
Trang 8Kiểm tra gen
2.1.2 Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên cây lan Dendrobium Sonia trưởng thành và
virus CyMV gây bệnh trên hoa lan
Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs lan
Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens
Nội dung 2: Nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen CP của virus
CyMV ở Việt Nam
Nội dung 3: Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen RNAi mang phân đoạn
gen CP và gen ORF2-4 của virus CyMV
Nội dung 4: Nghiên cứu tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của
gen CP và gen ORF2-4+CP
Nội dung 5: Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan
chuyển gen bằng phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia
* Xác định các điều kiện thích hợp để tạo PLBs
Thực hiện thí nghiệm nuôi cấy để xác định các yếu tố: nồng độ Ca(OCl)2
(15-30%) để khử trùng đoạn thân mang chồi ngủ; nồng độ BA (0,1-0,5 mg/l), NAA (0,5-5 mg/l) bổ sung vào môi trường MS để tạo PLBs từ lát cắt thân cây
lan in vitro và sự tăng sinh của PLBs
Trang 9* Xác định nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen
Thực hiện thí nghiệm chuyển gen vào PLBs với các yếu tố thay đổi: chủng
vi khuẩn (C58, EHA105, LBA4404), nồng độ AS (0-300 µM), thời gian nuôi cấy Đánh giá hiệu quả chuyển gen bằng nhuộm GUS
* Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs
Thực hiện thí nghiệm nuôi cấy PLBs trên môi trường MS bổ sung các nồng độ khác nhau của cefotaxime (0-700 mg/l) hay kanamycin (0-700 mg/l), hygromycin (0-15 mg/l) để loại vi khuẩn từ PLBs hay sàng lọc PLBs chuyển gen
2.2.2 Phân lập và xác định trình tự gen CP của CyMV
* Phân lập gen CP của CyMV ở các tỉnh của Việt Nam
Tiến hành ly trích RNA virus từ mẫu lá (Berendzen và cs, 2005) và thực hiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi được thiết kế để khuếch đại toàn bộ gen CP
* Dòng hóa gen CP phân lập được vào vi khuẩn
Gen CP được gắn vào vector pJET1.2 và biến nạp vào tế bào E.coli Sàng lọc tế bào mang vector tái tổ hợp trên môi trường LB + 100 mg/l ampicilin Kiển tra gen bằng PCR khuẩn lạc với mồi pJET1.2 và enzyme cắt hạn chế
BamHI và EcoRI (nằm ở 2 đầu vị trí gắn gen)
* Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng
Vector mang gen được giải trình tự và phân tích bằng chương trình BLAST
2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi
* Tạo vector pENTR TM /D-TOPO ® có gắn gen mục tiêu
Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen CP (450 bp) và gen ghép nối ORF2-4+CP (500 bp), gắn vào vector và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli Sàng lọc tế bào mang vector tái tổ hợp trên môi trường LB + 50mg/l kanamycin Kiểm tra gen bằng PCR khuẩn lạc với mồi M13 và enzyme cắt hạn
chế SalI (trên gen) và NotI (trên vector)
* Thiết kế vector RNAi và biến nạp vào A tumefaciens
Thực hiện phản ứng tái tổ hợp giữa vector pENTR và pK7GWIWG2(II) để đưa gen mục tiêu vào vector pK7GWIWG2(II) bằng kỹ thuật Gateway Sản phẩm phản ứng được biến nạp vào tế bào E.coli và sàng lọc trên môi trường
LB + 100 mg/l spectinomycin Kiểm tra gen bằng PCR khuẩn lạc với mồi M13
và enzyme cắt hạn chế XbaI và HindIII (nằm trên vector) Biến nạp vector tái
tổ hợp vào A tumefaciens C58 và sàng lọc trên môi trường LB + 50 mg/l
ampicilin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin
Trang 102.2.4 Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi
* Chuyển cấu trúc RNAi vào PLBs bằng A tumefaciens
Lây nhiễm PLBs với A tumefaciens C58 mang vector RNAi, nuôi cấy trên
môi trường MS + 0,3 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 100 M AS trong 3 ngày, loại
vi khuẩn với 300 mg/l cefotaxime Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển với
500 mg/l kanamycin và kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR
* Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển
PLBs mang cấu trúc gen chuyển được nuôi cấy trên môi trường ½ MS để
thu nhận cây lan hoàn chỉnh
2.2.5 Đánh giá khả năng kháng CyMV của cây lan chuyển gen
Ly trích dịch virus từ mẫu lá lan nhiễm virus, lọc vô trùng và tiêm vào cây
lan trong điều kiện in vitro để lây nhiễm Đánh giá khả năng kháng virus của
cây lan bằng quan sát hình thái và phản ứng RT-PCR
2.2.6 Phân tích và xử lý số liệu
Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Số liệu nghiên cứu được được phân tích ANOVA, so sánh khác biệt ở mức p< 0,05 và phân hạng (nếu có) theo Duncan bằng phần mềm SPSS
2.2.7 Điều kiện nuôi cấy
Mẫu thực vật được nuôi cấy ở điều kiện: ánh sáng 2.500 500 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ 25 2oC, ẩm độ 55 5% Vi khuẩn được nuôi cấy trong tối, nhiệt độ 28oC (A tumefaciens) hay 37oC (E coli), lắc 200 vòng/phút
2.2.8 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trong thời gian từ 01/2011-12/2015 tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN
3.1.1 Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs
* Nồng độ chất khử trùng để tạo mẫu cấy in vitro
Sau 14 ngày, tỉ lệ mẫu sống vô trùng đạt cao nhất ở nồng độ 25% Việc tiếp tục tăng nồng độ Ca(OCl)2 lên mức cao hơn 25% không làm tăng mà làm giảm
tỷ lệ mẫu sống vô trùng (Bảng 3.1)
Như vậy, Ca(OCl)2 25% thích hợp cho khử trùng mẫu Chồi ngủ từ các mẫu cấy tăng trưởng thành chồi sau 8 tuần (Hình 3.1)
Trang 11* ôi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro
Sau 4 tuần nuôi cấy, ở tất cả các môi trường đều có sự cảm ứng của lát cắt
mô thân với các biểu hiện như lát cắt vẫn giữ được màu xanh và có sự gia tăng kích thước (phồng lên) so với ban đầu Tỷ lệ mẫu cảm ứng tương đối thấp (26,67%) và không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức (Bảng 3.2)
Bảng 3.2 Tỷ lệ mẫu lát cắt mỏng mô thân cây lan Dendrobium Sonia in
vitro cảm ứng với môi trường sau 4 tuần nuôi cấy
(%)
Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%)
Dendrobium Sonia tăng trưởng
trên môi trường MS sau 4 (A) và
8 (B) tuần nuôi cấy
Bảng 3.1 Tỷ lệ đoạn thân mang chồi ngủ
sống vô trùng sau 14 ngày nuôi cấy
Chứng âm
*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05
Trang 12Đến 6 tuần nuôi cấy, bắt đầu có sự hình thành cấu trúc mới từ các lát cắt Tuy nhiên, chỉ có môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l kết hợp với NAA 0,5 hay 1,0 mg/l phù hợp cho lát cắt tạo PLBs và tiếp tục nhân lên (Hình 3.2 - K, L)
Hình 3.2 Sự hình thành PLBs từ lát cắt thân Dendrobium Sonia trên môi
trường MS bổ sung BA và NAA, sau 6 tuần (A - E) 0,1 mg/l BA + 0,5, 1, 2,
3, và 5 mg/l NAA, (F – J) 0,3 mg/l BA + 0,5; 1; 2; 3 và 5 mg/l NAA, (K – O) 0,5 mg/l BA + 0,5; 1; 2; 3 và 5 mg/l NAA
* ôi trường cho tăng sinh và phát triển PLBs
Sau 10 tuần, ở các môi trường đều có sự tăng sinh PLBs Trong đó, môi trường có 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA cho kết quả tốt nhất Số lượng và trọng lượng PLBs trên môi trường này cao hơn so với các môi trường còn lại (Hình 3.3, Bảng 3.3) Kết quả này cho thấy NAA và BA có tác động tích cực với sự tăng sinh của PLBs và phù hợp với nghiên cứu của Atichart và cộng sự (2007)
Hình 3.3 Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ
sung BA và NAA sau 10 tuần nuôi cấy (A) MS, (B) 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA, (C) 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA, (D) 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA
Bảng 3.3 Sự thay đổi trọng lượng PLBs trên các môi trường
Trang 133.1.2 Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs
* Trường hợp chủng C58
Tỷ lệ mẫu dương tính GUS đạt cao nhất (71,67%) ở thời điểm 3 ngày với cả hai trường hợp có (100 µM) và không có AS (Bảng 3.4)
Bảng 3.4 Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS
theo thời gian nuôi cấy với chủng A tumefaciens C58
Nồng độ
AS (µM)
Số mẫu chuyển gen
Bảng 3.5 Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo
thời gian nuôi cấy với chủng A tumefaciens EHA105
