Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo dòng lan dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (cymbidium mosaic virus CyMV)

Do vậy, các biện pháp hiệu quả hơn vẫn đang được nghiên cứu, mà một trong số đó là tạo ra khả năng kháng virus cho cây bằng kỹ thuật chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA RNAi.. Việc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN XUÂN DŨNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi

ĐỂ TẠO D NG N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG

VI U HẢ VÀNG Cymbidium mosaic virus)

LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Dươ Hoa Xô

2 PGS TS C H H

LỜI C ĐO N

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Kết quả nghiên cứu hoàn toàn trung thực, khách quan Các số liệu được trình bày trong công trình này một phần đã được công bố trên các Tạp chí Khoa học-công nghệ cùng các đồng tác giả, phần còn lại chưa được công bố bởi bất kỳ ai trong bất kỳ công trình nào

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Xuân Dũng

LỜI CẢ ƠN

Để hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu của mình, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và sự ủng hộ, tạo điều kiện của các cơ quan và tổ chức

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Dương Hoa Xô - Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, là người hướng dẫn chính cho công trình nghiên cứu này Thầy đã truyền đạt ý tưởng, định hướng nghiên cứu, cũng như kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận án Ngoài ra, với tư cách là thủ trưởng đơn vị, thầy đã chấp thuận và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được tham gia chương trình đào tạo nghiên cứu sinh

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS TS Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người hướng dẫn thứ hai cho công trình nghiên cứu này Thầy đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện hỗ trợ về mặt kỹ thuật cũng như đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến:

- Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh đã chấp thuận, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

- Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam đã hết sức giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

- Ban lãnh đạo Sở Khoa học và Công nghệ TP Hồ Chí Minh đã hỗ trợ một phần kinh phí cho tôi để thực hiện công trình nghiên cứu này

- PGS.TS Phạm Văn Toản và tất cả cán bộ thuộc Ban Đào tạo sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc tế- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, đã tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập

- GS TS Bùi Chí Bửu và tất cả quý thầy cô (đã giảng dạy và tham gia Hội đồng đánh giá đề cương, chuyên đề nghiên cứu của nghiên cứu sinh) đã truyền đạt kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Những lời cảm ơn chân thành của tôi cũng xin được gởi đến:

- Các cán bộ, sinh viên đã và đang làm việc trong nhóm nghiên cứu chuyển gen thực vật thuộc Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh, đã nhiệt tình tham gia, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình làm việc và thực hiện luận án

- Các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ về mặt kỹ thuật trong quá trình thực hiện luận án

- Quý thầy cô giáo đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi qua các giai đoạn học tập, các anh chị em đồng nghiệp và bạn bè thân hữu đã cùng cộng tác và

hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu

Cuối cùng, xin gởi lời tri ân sâu sắc và những tình cảm ấm áp nhất đến Ba,

Mạ (người mẹ đã khuất) và tất cả những người thân yêu trong gia đình đã hết lòng động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình trưởng thành, học tập và nghiên cứu

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Xuân Dũng

MỤC LỤC

Trang

LỜI C ĐO N i

LỜI CẢ ƠN ii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG xi

DANH SÁCH HÌNH xiii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết 1

2 Mục tiêu và yêu cầu 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

5 Đóng góp mới của luận án 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Sơ lược về hoa lan 5

1.1.1 Giới thiệu về họ hoa lan 5

1.1.2 Giống lan Dendrobium 5

1.1.3 Sơ lược về PLBs (Protocorm like bodies) 6

1.2 Sơ lược về Cymbidium mosaic virus 7

1.2.1 Phân loại, hình dạng phân tử và cấu trúc bộ gen 7

1.2.2 Sự lây nhiễm và di chuyển của virus CyMV trong cây 9

1.2.3 Triệu chứng bệnh do virus CyMV gây ra 9

1.2.4 Tình hình bệnh do virus CyMV gây ra trên các giống lan ở Việt Nam 10

1.3 Phương pháp chọn giống hoa lan 11

1.3.1 Chọn giống bằng phương pháp cổ điển 11

1.3.2 Chọn giống bằng phương pháp chuyển gen 11

1.3.3 Phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 11

1.3.3.1 Sơ lược về phương pháp 11

1.3.3.2 Các dạng Agrobacterium tumefaciens dùng cho chuyển gen 13

1.3.3.3 Cơ chế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens 13

1.3.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở hoa lan 14

1.4 Sự can thiệp RNA (RNAi) và vai trò của nó trong chọn giống cây trồng 19

1.4.1 Lịch sử phát hiện RNAi 20

1.4.2 Cơ chế của RNAi 23

1.4.3 Sự khởi đầu và khuếch đại tín hiệu RNAi 25

1.4.4 Sự di chuyển của các tín hiệu RNAi 27

1.4.5 Mối liên hệ giữa virus gây bệnh cây trồng và RNAi 29

1.4.6 Vai trò của RNAi trong chọn giống cây trồng kháng virus 30

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Nội dung nghiên cứu 36

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 36

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 39

2.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia 40

2.2.1.1 Xác định các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen 40

2.2.1.2 Xác định nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs 41

2.2.1.3 Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen 42

2.2.2 Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV 43

2.2.2.1 Thu thập mẫu lan nhiễm virus 43

2.2.2.2 Phân lập gen CP 44

2.2.2.3 Nhân dòng gen CP 44

2.2.2.4 Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự 46

2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi và biến nạp vào A tumefaciens 46

2.2.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP 46

2.2.3.2 Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và ORF2-4+CP bằng hệ thống Gateway 47

2.2.3.3 Tạo chủng A tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi

pK7GWIWG2(II)/CP hoặc pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP 48

2.2.4 Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP 48

2.2.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 48

2.2.4.2 Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens 49

2.2.4.3 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển 49

2.2.4.4 Kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen 50

2.2.4.5 Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển và kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong cây 50

2.2.5 Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen bằng lây nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro 51

2.2.5.1 Lây nhiễm virus CyMV vào cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro 51

2.2.5.2 Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen 52

2.2.6 Phân tích và xử lý số liệu 52

2.2.7 Điều kiện nuôi cấy 53

2.2.8 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 53

CHƯƠNG 3 ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs 54

3.1.1 Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen 54

3.1.1.1 Nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro 54

3.1.1.2 Môi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro 55

3.1.1.3 Môi trường thích hợp cho sự tăng sinh và phát triển PLBs 57

3.1.2 Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs 58

3.1.2.1 Trường hợp chủng C58 58

3.1.2.2 Trường hợp chủng EHA105 59

3.1.2.3 Trường hợp chủng LBA4404 60

3.1.2.4 Về mức độ biểu hiện gen GUS 61

3.1.3 Các điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen 62

3.1.3.1 Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs 62

3.1.3.2 Nồng độ hygromycin và kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen 63

3.2 Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV 66

3.2.1 Phân lập gen CP 66

3.2.2 Tạo dòng gen CP 67

3.2.3 Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự 69

3.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và CP + ORF2-4 71

3.3.1 Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP 72

3.3.1.1 Khuếch đại gen CP từ vector nhân dòng và gen ORF2-4+CP từ vector pBSK/ORF2-4+CP 72

3.3.1.2 Gắn đoạn gen CP và ORF2-4+CP vào vector pENTR 72

3.3.1.3 Thiết kế vector chuyển gen RNAi bằng kỹ thuật Gatewway 76

3.3.1.4 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi 78

3.4 Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP 79

3.4.1 Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua trung gian vi khuẩn A tumefaciens 79

3.4.1.1 Giai đoạn đồng nuôi cấy 79

3.4.1.2 Giai đoạn khử khuẩn 81

3.4.2 Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển 82

3.4.3 Kiểm tra sự hiện diện gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen 83

3.4.4 Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển 85

3.5 Khả năng kháng CyMV của cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro 90

3.5.1 Về biểu hiện triệu chứng nhiễm virus CyMV 90

3.5.2 Về sự hiện diện của virus trong cây lan 92

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 95

1 Kết luận 95

2 Đề nghị 96

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 97

TÀI LIỆU THAM KHẢO 98

Tài liệu tiếng Việt 98 Tài liệu tiếng Anh 99

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Môi trường nuôi cấy thực vật và vi khuẩn

Phụ lục 2 Một số triệu chứng nghi nhiễm virus trên các mẫu lan thu thập

Phụ lục 3 Quy trình chuyển gen vào PLBs của lan Dendrobium Sonia qua trung gian

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phụ lục 4 Kết quả so sánh trình tự gen CP và gen ORF2-4 của CyMV

Phụ lục 5 Kết quả xử lý thống kê

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

ORSV Odontoglossum ringspot virus

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 1.1 Kết quả ứng dụng RNAi trên nhiều loại virus thực vật khác nhau 31

Bả 3.1 Tỷ lệ đoạn thân mang chồi ngủ lan Dendrobium Sonia sống vô trùng

sau 14 ngày nuôi cấy 54

Bả 3.2 Tỷ lệ mẫu lát cắt mỏng mô thân cây lan Dendrobium Sonia in vitro

cảm ứng với môi trường sau 4 tuần nuôi cấy 55

Bả 3.3 Sự thay đổi trọng lượng PLBs trên các môi trường 57

Bả 3.4 Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo

thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A tumefaciens C58 59

Bả 3.5 Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo

thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A tumefaciens EHA105 60

Bả 3.6 Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo

thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A tumefaciens LBA4404 61

Bả 3.7 Khả năng diệt khuẩn của cefotaxime ở các nồng độ khác nhau trên PLBs 63

Bả 3.8 Tỷ lệ PLBs chết do tác động của hygromycin ở các nồng độ khác nhau

theo thời gian nuôi cấy 64

Bả 3.9 Tỷ lệ PLBs chết do tác động của kanamycin ở các nồng độ khác nhau,

theo thời gian nuôi cấy 65

Bả 3.10 Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân lập

ở các khu vực khác nhau tại Việt Nam 70

Bả 3.11 Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân lập

ở các khu vực tại Việt Nam và một số khu vực trên thế giới 71

Bả 3.12 Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt vector tái tổ hợp

pK7GWIWG2(II)/CP; pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP bằng XbaI

và HindIII 77

Bả 3.13 Tỷ lệ PLBs giả định chuyển gen thu được sau giai đoạn sàng lọc với

kanamycin 82

Bả 3.14 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong PLBs chuyển gen 85

Bả 3.15 Tần suất xuất hiện của các dạng kiểu hình cây lan Dendrobium Sonia thu

được từ cụm PLBs chuyển gen 87

Bả 3.16 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong cây lan phát triển từ

PLBs chuyển gen 89

Bả 3.17 Kết quả đánh giá khả năng kháng virus của cây lan phát triển từ PLBs

chuyển gen sau 4 tuần lây nhiễm virus 93

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hoa lan Dendrobium Sonia 6

Hình 1.2 Hình dạng của CyMV 7

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gen của virus CyMV 8

Hình 1.4 Triệu chứng khảm vàng lá và khảm màu hoa lan Dendrobium 10

Hình 1.5 Sự phục hồi (kháng lại virus) ở cây thuốc lá bị nhiễm virus TRSV 20

Hình 1.6 Hoa dã yên thảo với các gen quy định sắc tố hoa đã bị im lặng bởi RNAi 22

Hình 1.7 Cơ chế hoạt động của RNAi 24

Hình 1.8 Hoạt động của protein RdRp trong việc khuếch đại tín hiệu RNAi [20] 26

Hình 1.9 Ảnh hưởng của đột biến RdRp lên sự truyền tín hiệu RNAi ở cây A thaliana 29

Hình 3.1 Chồi ngủ lan Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường MS sau 4 (A) và 8 (B) tuần nuôi cấy 54

Hình 3.2 Sự hình thành PLBs từ lát cắt mỏng thân Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy 56

Hình 3.3 Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau, sau 10 tuần nuôi cấy 57

Hình 3.4 Các mức độ biểu hiện gen GUS của PLBs chuyển gen 61

Hình 3.5 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP 66

Hình 3.6 Kết quả điện di kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi F-CCP và R-CCP định vị trên gen 67

Hình 3.7 Kết quả điện di kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi pJET1.2 định vị trên vector 68

Hình 3.8 Kết quả điện di sự kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn bằng phản ứng cắt với enzyme BamHI và EcoRI 68

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự gen CP với các trình tự được công bố trên ngân

hàng gen NCBI 69

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP (A) và ORF2-4+CP (B) 72 Hình 3.11 Sơ đồ tạo vector tái tổ hợp pENTR/CP và pENTR/ORF2-4+CP 73 Hình 3.12 Kết quả kiểm tra phân đoạn gen CP trong các dòng vi khuẩn biến nạp

vector pENTR/CP với cặp mồi M13 74

Hình 3.13 Kết quả kiểm tra phân đoạn gen ORF2-4+CP trong các dòng vi khuẩn biến

nạp vector pENTR/ORF2-4+CP với mồi M13 74

Hình 3.14 Sơ đồ vector pENTR/CP và pENTR/ORF2-4+CP với vị trí cắt

của enzyme NotI và SalI 75

Hình 3.15 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của phân đoạn gen CP (A) và ORF2-4+CP

(B) trong các dòng vi khuẩn bằng enzyme SalI và NotI 75

Hình 3.16 Kết quả kiểm tra gen CP (A) và gen ORF2-4+CP (B) trong các dòng khuẩn

lạc với cặp mồi của đoạn gen 76

Hình 3.18 Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt vector pK7GWIWG2(II)/CP và

pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP bằng enzyme XbaI và HindIII 78

Hình 3.19 Khuẩn lạc A tumefaciens C58 phát triển trên môi trường chứa 50mg/l

ampicilin, 100mg/l spectinomycin và 50mg/l rifamycin sau khi được biến nạp với vector pK7WIWG2(II)/CP/ORF2-4+CP 79

Hình 3.20 PLBs của lan Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường đồng nuôi

cấy sau 3 ngày lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens 80

Hình 3.21 PLBs của Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường khử khuẩn sau

7 ngày (A) và 14 (B) ngày nuôi cấy 81

Hình 3.22 PLBs lan Dendrobium Sonia nuôi cấy trên môi trường sàng lọc sau

60 ngày 82

Hình 3.23 Kết quả kiểm tra gen CP trong cụm PLBs giả định chuyển gen 84

Hình 3.24 Kết quả kiểm tra gen ORF2-4+CP trong cụm PLBs giả định

chuyển gen 84

Hình 3.25 Sự tăng trưởng của PLBs lan Dendrobium Sonia chuyển gen trên

môi trường ½ MS (A) Tăng sinh PLBs, (B) Tăng trưởng chồi 86

Hình 3.26 Kiểu hình cây lan Dendrobium Sonia thu được từ PLBs chuyển gen sau 6

tháng nuôi cấy trên môi trường ½ MS 87

Hình 3.27 Kết quả kiểm tra gen CP trong cây lan chuyển gen 88 Hình 3.28 Kết quả kiểm tra gen ORF2-4+CP trong cây lan chuyển gen 89

Hình 3.29 Các triệu chứng nhiễm virus trên cây lan in vitro sau 3 tuần lây nhiễm nhân

tạo với virus CyMV 91

Hình 3.30 Cây lan in vitro sau 4 tuần lây nhiễm nhân tạo với virus CyMV 91

Hình 3.31 Kết quả kiểm tra virus CyMV trong các cây lan giả định chuyển gen được

lây nhiễm virus trong điều kiện in vitro sau 4 tuần 92

Hình 3.32 Cây lan Dendrobium Sonia chuyển gen (dòng 36-176) tăng trưởng trong

điều kiện nhà kính 94

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết

Dendrobium là giống lan được trồng phổ biến ở Việt Nam Đây là một giống

chiếm ưu thế trong họ hoa lan, bao gồm nhiều loài có hoa đẹp, có thể sử dụng cho

mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu Dendrobium đã thực sự trở thành một

giống lan chủ lực đối với ngành sản xuất hoa lan ở Việt Nam trong nhiều năm qua Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một trong những trung tâm sản xuất hoa lan lớn nhất

cả nước, cùng với lan Mokara, Dendrobium là một trong hai giống lan đóng góp

chính vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu và 68,9 triệu cành hoa lan (đạt giá trị 613,9 tỷ đồng) của ngành sản xuất hoa lan thành phố trong năm 2015 [10]

Tuy nhiên, hiện tại việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng và hoa lan nói chung tại

Thành phố Hồ Chí Minh cũng như cả nước vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong nước Hoa lan vẫn được nhập khẩu từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc để cung cấp cho thị trường trong nước Nghiên cứu nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan là một trong những vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối với ngành sản xuất hoa lan Việt Nam

Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng hoa lan, trong đó bệnh hại là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất

Nhiều loại bệnh khác nhau gây hại trên lan Dendrobium cũng như hoa lan nói

chung đã được ghi nhận, nhưng đáng chú ý nhất là bệnh do virus gây ra Hiện có hai

loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng (Cymbidium mosaic

virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum ringspot virus - ORSV) [88]

Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở

Việt Nam [2], [5], [7], và đặc biệt là lan Dendrobium được trồng ở một số khu vực

thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%,

mà không bị nhiễm virus ORSV [2] Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang

lây nhiễm rất nghiêm trọng trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam

Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng và chất lượng hoa, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng thu hoạch Quan trọng hơn, do virus có khả năng phát triển tiềm ẩn và lan truyền nhanh chóng qua các dụng cụ làm vườn, nên thiệt hại thường diễn ra trên phạm vi lớn với mức độ rất nghiêm trọng Đến nay, biện pháp duy nhất để kiểm soát bệnh virus vẫn là phòng tránh thông qua loại trừ các tác nhân lây nhiễm trong quá trình sản xuất giống và canh tác Việc triển khai các quy trình kiểm soát bệnh gây tiêu tốn nhiều thời gian, chi phí và không phải lúc nào cũng mang lại hiệu quả như mong muốn Do vậy, các biện pháp hiệu quả hơn vẫn đang được nghiên cứu, mà một trong số đó là tạo ra khả năng kháng virus cho cây bằng kỹ thuật chuyển gen dựa trên cơ chế can thiệp RNA (RNAi)

Cho đến nay, nhiều giống cây trồng kháng virus đã được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên thế giới [34] Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo giống cây trồng kháng bệnh virus cũng đã được triển khai

ở Việt Nam, trên một số loại cây trồng, để tạo ra khả năng kháng với các loại virus khác nhau như thuốc lá kháng virus TMV [12], virus CMV [11] và kháng đồng thời

cả hai loại virus TMV và CMV [3]; cà chua kháng virus TYLCV [13]; đu đủ kháng virus PRSV [4], đậu tương kháng virus SMV và BYMV [9] Tuy nhiên, hiện vẫn

chưa có nghiên cứu nào được triển khai trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng

kháng với virus CyMV, trong khi tình trạng nhiễm virus CyMV vẫn đang diễn ra rất nghiêm trọng trên giống lan này

Đề tài “Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi

để tạo dòng lan Dendrobium có khả năng kháng virus khảm vàng (Cymbidium mosaic virus - CyMV)” được thực hiện nhằm mục đích đánh giá hiệu quả của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi trên lan Dendrobium để tạo ra khả năng kháng với virus CyMV, từ đó tiến đến tạo ra các dòng lan Dendrobium có

khả năng kháng virus, phục vụ cho việc nâng cao năng suất và sản lượng hoa lan

2 Mục tiêu và yêu cầu

Nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi

trong việc tạo ra khả năng kháng virus CyMV cho cây lan Dendrobium Sonia trong điều kiện nuôi cấy in vitro:

- Nghiên cứu chọn được vùng trình tự bảo thủ của gen CP và ORF2-4 từ virus CyMV phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen RNAi

- Nghiên cứu xây dựng được quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium để

tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP hoặc ORF2-4+CP

- Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen

trong điều kiện in vitro

3 Đ ượng và phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu được thực hiện trên lan Dendrobium Sonia và virus CyMV gây

bệnh trên lan Các dòng lan chuyển gen được tạo ra qua việc chuyển cấu trúc RNAi của gen CP hoặc ORF2-4+CP của virus CyMV vào PLBs lan bằng kỹ thuật chuyển

gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

- Các thí nghiệm khảo sát, đánh giá trong nghiên cứu, bao gồm việc đánh giá

khả năng kháng virus của cây chuyển gen, được giới hạn trong điều kiện in vitro

4 Ý ĩa k a c và thực tiễn

* Ý ĩa k a

- Góp phần làm sáng tỏ vấn đề về mức độ bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus CyMV tại Việt Nam

- Góp phần hoàn thiện kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens trên đối tượng lan Dendrobium

- Tạo tiền đề quan trọng cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để tạo

ra khả năng kháng virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung

* Ý ĩa ự ễ

Tạo ra được các dòng lan Dendrobium chuyển gen có khả năng kháng virus CyMV trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo

giống lan kháng virus thông qua lai tạo

5 Đóng góp mới của luận án

- Chứng minh được tính bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus CyMV

tại Việt Nam

- Khẳng định được tính khả thi của kỹ thuật chuyển gen RNAi trong việc tạo

khả năng kháng virus cho lan Dendrobium

- Góp phần hoàn thiện phương pháp đánh giá khả năng kháng virus của cây

lan chuyển gen trong điều kiện nuôi cấy in vitro

- Tạo ra được các dòng lan Dendrobium Sonia có khả năng kháng virus trong

điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu quan trọng cho nghiên cứu tạo giống lan kháng

virus

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược v hoa lan

1.1.1 Giới thiệu v h hoa lan

Họ hoa lan (Orchidaceae) bao gồm khoảng 900 giống và 2500-3500 loài

Đây là một trong những họ thực vật lớn nhất và nhận được sự quan tâm đặc biệt do

có hoa đẹp, lâu tàn cũng như rất đa dạng về màu sắc, hình dạng và kích thước Chúng được xem là các loại hoa cắt cành và hoa chậu phổ biến về mặt kinh tế trên toàn thế giới Nhiều loài mới mang những tính trạng cải tiến của họ này vẫn đang tiếp tục được tạo ra để đáp ứng cho nhu cầu của thị trường [46]

1.1.2 Gi ng lan Dendrobium

Giống lan Dendrobium được Olof Swartz đặt tên vào năm 1799 Chữ

Dendrobium có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp Dendro có nghĩa là cây lớn, bio là sống,

vì tất cả các loài của Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ

Dendrobium rất phong phú về chủng loại, là giống chiếm ưu thế trong họ hoa lan,

với khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều

nhất ở Đông Nam Á và châu Úc [8] Trong đó, Dendrobium Sonia là dòng lan lai được tạo ra từ tổ hợp lai Dendrobium Caesar x Dendrobium Tomie Drake bởi tác

giả Chittraphong và được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1984 [29]

Về hình thái, đây là loài lan đa thân, bao gồm nhiều giả hành, mỗi giả hành

có nhiều lóng, thường có 2-3 lá dai, bền, không rụng ở đỉnh Hoa màu tím (gồm 3 cánh hoa màu tím pha trắng ở phần gốc cách hoa, 3 lá đài có màu tương tự như cánh hoa nhưng phần màu tím nhạt hơn và môi màu tím đậm), họng trắng (Hình 1.1)

Hình 1.1 Hoa lan Dendrobium Sonia

Phát hoa phát sinh ở cả giả hành cũ và mới Ở giả hành mới, chồi non nhất ở gần ngọn là chồi đầu tiên phát triển thành phát hoa, những chồi già bên dưới phát triển sau Nói cách khác, sự phát triển phát hoa từ chồi xảy ra theo thứ tự từ ngọn đến gốc, và thường có 1-4 chồi phát triển thành phát hoa cùng lúc (mô tả theo [8])

Về sinh trưởng, đây là loài lan có đặc điểm sinh trưởng liên tục, không có thời gian nghỉ hay thời gian nghỉ rất ngắn Tương tự như hầu hết các loài trong

giống lan Dendrobium, Dendrobium Sonia thích nghi với ánh sáng từ 70-80% ánh

sáng tự nhiên Ánh sáng quá mức có thể gây ra hiện tượng vàng lá, cháy lá; ngược lại thiếu sáng cây sẽ phát triển kém, ít ra hoa, số hoa trên phát hoa ít Nhiệt độ thích

nghi cho sự phát triển của lan Dendrobium Sonia khoảng 25oC [8]

Lan Dendrobium Sonia là một loại hoa phù hợp cho cả mục đích sản xuất

hoa cắt cành và hoa chậu So với nhiều loại lan khác, nhu cầu của thị trường đối với

hoa lan Dendrobium Sonia vẫn không ngừng gia tăng trong nhiều năm qua Do vậy,

việc nghiên cứu chuyển gen nhằm cải thiện chất lượng loài lan này là một vấn đề có

ý nghĩa quan trọng

1.1.3 ơ lược v PLBs (Protocorm like bodies)

Sự hình thành protocorm là một đặc tính riêng của sự phát triển ở họ hoa lan Trong đó, thuật ngữ “protocorm” được Treub sử dụng lần đầu tiên vào năm 1980,

để thay cho thuật ngữ “embryonic tuber” (củ phôi), đã được sử dụng trước đó để mô

tả một cấu trúc dạng củ (tuberidiform), có lông ở phần bên dưới, được hình thành trong quá trình nẩy mầm của phôi ở cây thạch tùng Thuật ngữ này cũng được

Balfour (1905) sử dụng để chỉ dạng cây mầm (seeding) của hoa lan Trước đây, việc xác định protocorm là cây mầm hay phôi vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau từ các nhà nghiên cứu [19] Tương tự với protocorm, PLBs (protocorm like bodies) được Morel sử dụng lần đầu tiên vào năm 1960 trong thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi

(shoot-tip) của lan Cymbidium do có các đặc điểm về phát triển và cấu trúc giống

với protocorm Ở các giai đoạn phát triển sớm, PLBs có đặc điểm phân chia tế bào tương tự với sự phát triển phôi hợp tử, và vì vậy có thể kết luận PLBs thực sự là phôi vô tính của họ lan [48] Như vậy, với bản chất là một phôi vô tính, việc nuôi cấy PLBs có thể dẫn đến hai trường hợp đó là PLBs có thể tăng trưởng thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể tiếp tục phân chia để hình thành các PLBs thứ cấp Việc tạo các PLBs thứ cấp chỉ có thể xuất phát từ một tế bào ban đầu, trãi qua các giai đoạn hình thành phôi và cuối cùng tạo thành một PLBs (phôi) hoàn chỉnh

1.2 Sơ lược v Cymbidium mosaic virus

1.2.1 Phân loại, hình dạng phân tử và cấu trúc bộ gen

Cymbidium mosaic virus (CyMV) (giống Potexvirus, họ Flexiviridae) hay còn

gọi là virus khảm vàng, được mô tả lần đầu tiên bởi Jensen (1951) Đây là một trong

những virus quan trọng và phổ biến nhất gây nhiễm các loại lan trên thế giới [83]

Phần tử virus có dạng sợi (Hình 1.2), không màng bao, dài 480 nm, rộng 13 nm [59]

Hình 1.2 Hình dạng của CyMV [59]

Bộ gen chứa RNA mạch đơn, sợi dương, có mũ chụp ở đầu 5’ và đuôi polyA ở đầu 3’ Tổ chức bộ gen được bảo tồn cao, bao gồm 3 vùng: RdRp (RNA-

dependent RNA polymerase - RNA polymerase phụ thuộc RNA), TGB gene-block - bộ ba gen ức chế) và CP (coat protein - protein vỏ) (Hình 1.3) RNA

(triple-bộ gen có chiều dài 6227 nucleotide không tính đuôi poly A ở đầu tận cùng 3’

Tương tự như các virus khác trong nhóm Potexvirus, bộ gen của CyMV có 5 khung

đọc mở (ORF1-5) [83] ORF1 mã hóa cho protein sao chép kích thước 160 kDa, protein này bao gồm ba vùng bảo thủ được công nhận, cụ thể là, protein methyl transferase ở đầu N, RNA helicase và RNA phụ thuộc RNA polymerase (RdRp) ở đầu C Các ORF2-4 thường mã hóa cho bộ ba protein ức chế gen (TGB), có kích thước tương ứng là 26, 13 và 28 kDa, tham gia vào quá trình di chuyển của virus giữa các tế bào và ức chế sự bất hoạt RNA ORF5 mã hóa cho protein vỏ (CP) (24 kDa), cần thiết cho sự tạo vỏ capsid và quá trình di chuyển của virus giữa các tế bào [45], [77] Ngoại trừ khung đọc mở ORF4, tất cả các khung đọc mở của các

protein mã hóa ở giống Potexvirus đều chứa các motif bảo tồn Các protein được

mã hóa bởi virus CyMV có mức độ tương đồng cao với các protein tương ứng của

các thành viên khác trong giống Potexvirus Trình tự nucleotide vùng 5’ không mã

hóa (noncoding region - NCR) của virus CyMV và tất cả các thành viên khác của giống đều khởi đầu bằng GAAAA và CyMV là virus có vùng 5’ NCR ngắn nhất

trong tất cả các Potexvirus Dựa trên sự so sánh về phát sinh loài của protein sao

chép và protein vỏ cho thấy virus CyMV có mối liên hệ gần với các virus như PAMV, NMV, WC1MV và SMYEaV [83]

Hình 1.3 Cấu trúc bộ gen của virus CyMV [83]

1.2.2 Sự lây nhiễm và di chuyển của virus CyMV trong cây

Virus CyMV lây nhiễm vào cây chủ yếu qua vị trí vết thương, không lây nhiễm qua hạt và côn trùng Trong số khoảng 25-30 loại virus khác nhau gây nhiễm trên hoa lan [84], chỉ có virus CyMV và ORSV có thể lan truyền theo con đường này, do chúng có khả năng sống sót rất lâu trên các dụng cụ làm vườn, chậu và ngay

cả trên giá thể, nơi cây lan bị nhiễm virus được trồng trước đó Đây là một trong những lý do khiến các nhà nghiên cứu đặt nhiều nỗ lực vào việc phát triển các biện pháp chẩn đoán và kiểm soát hai loại virus này [82]

Một khi đã lây nhiễm vào ký chủ, virus di chuyển theo cơ chế vận chuyển không tạo ống, trong đó các protein TGB sẽ liên kết với RNA tạo thành phức hợp nucleoprotein [42] Phức hợp này sẽ được vận chuyển qua cầu liên bào bởi các protein ký chủ, cùng với sự tham gia của bộ khung tế bào Những nghiên cứu về

Potexvirus chỉ ra rằng các protein vận chuyển TGB (TGB1, TGB2, TGB3) và

protein vỏ CP cùng phối hợp để thúc đẩy sự di chuyển của virus giữa các tế bào và

sự di chuyển hệ thống trong tế bào cây ký chủ [18], [67] CyMV mất ít nhất 3 ngày

để di chuyển theo hệ thống giữa các tế bào trong lá, 10 ngày để di chuyển từ lá đến

rễ và 20 ngày để di chuyển đến các lá tiếp theo tính từ thời điểm lây nhiễm [39] Như vậy, virus cần ít nhất 20 ngày để hoàn tất quá trình di chuyển theo hệ thống trong toàn bộ cây sau khi lây nhiễm

1.2.3 Triệu chứng bệnh do virus CyMV gây ra

Cây lan bị nhiễm virus CyMV thường biểu hiện một loạt các triệu chứng khác nhau, bao gồm các vệt lõm úa vàng hay hoại tử trên lá và hoa [46] Sự hoại tử

lá gây ra bởi virus CyMV có lẽ là bệnh virus phổ biến nhất trên nhiều loại lan Cây

bị nhiễm virus có các đốm và vệt mô chết kéo dài, màu nâu đến đen, không đều trên

cả 2 mặt của các lá già Các lá có triệu chứng này thường lão hóa nhanh và khô [72]

Ở các giống lan Phalaenopsis, Cattleya, Dendrobium và nhiều giống khác, virus

gây ra các đốm hoại tử đen và các kiểu đường hoại tử với các vết lõm xuống trên lá [52] Triệu chứng trên hoa thường ít biểu hiện, nhưng hoa có thể nở với hình dạng kém phát triển Nếu lá chết trước khi trưởng thành, hoa thường có kích thước nhỏ

và số lượng hoa ít [72] Trong trường hợp có triệu chứng, trên hoa có thể xuất hiện các vệt hoại tử trong một vài ngày khi hoa đang nở Tuy nhiên, các triệu chứng trên hoa thường chỉ biểu hiện sau khoảng 2 tuần và đặc biệt dễ dàng nhận thấy trên hoa

Cattleya trắng [52] Ngoài ra, virus này còn tạo ra sự khảm màu (thường đậm hay

nhạt hơn màu hoa) trên hoa Cattleya [56] Đặc biệt, trong một số trường hợp, cây bị

nhiễm virus nhưng hoàn toàn không có biểu hiện bất kỳ triệu chứng nào Đây là một trong những nguyên nhân làm gia tăng sự lây lan của bệnh [5]

Hình 1.4 Triệu chứng khảm vàng lá và khảm màu hoa lan Dendrobium

1.2.4 Tình hình bệnh do virus CyMV gây ra trên các gi ng lan ở Việt Nam

Virus CyMV gây nhiễm trên các giống lan được trồng tại một số vùng trồng lan chính của Việt Nam Mức độ nhiễm khá cao tại các vùng có tiềm năng sản xuất hoa lan lớn của nước ta như Thành phố Hồ Chí Minh (37,33%), Đà Lạt (37,14%)

và Hà Nội (26,67%) [5] Tỷ lệ nhiễm virus CyMV cao hơn so với virus ORSV

(Odontoglossum ringspot virus) - một loại virus gây hại phổ biến khác trên lan [2],

[5], [7] Trường hợp đặc biệt, tỷ lệ nhiễm lên đến 100% đối với virus CyMV và 43% đối với virus ORSV trên các mẫu lan trưởng thành được lấy từ vườn sản xuất

[7] So với nhiều giống lan khác, giống lan Dendrobium được trồng ở một số vườn

lan tại Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm với virus CyMV (65,7%) mà hoàn toàn không bị nhiễm với virus ORSV [2] Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang gây nhiễm rất nghiêm trọng trên các giống lan được trồng ở Việt Nam, đặc

biệt là đối với giống lan Dendrobium Điều này cho thấy việc nghiên cứu tạo ra giống lan Dendrobium kháng virus là một trong những vấn đề cần thiết

1.3 P ươ p áp n gi ng hoa lan

1.3.1 Ch n gi ng bằng p ươ p áp cổ đ ển

Trước đây, để tạo ra giống hoa lan mới, các nhà chọn giống đã sử dụng phương pháp chọn giống truyền thống, thông qua việc lai hữu tính giữa các loài có quan hệ gần gũi và tương hợp về sinh sản, để chọn lọc ra các cây lai có đặc điểm mới Tuy nhiên, việc chọn giống theo phương pháp truyền thống thường tiêu tốn nhiều thời gian do hầu hết các loài hoa lan đều cần ít nhất từ 3-6 năm để hoàn tất quy trình từ lúc gieo hạt cho đến khi cây trưởng thành và ra hoa; và giai đoạn chọn lọc kéo dài vẫn đang được xem là một rào cản lớn đối với việc tạo ra các loài lan mới Hơn nữa, với các kỹ thuật lai tạo hoa lan thông thường, nhà chọn giống cũng không thể dễ dàng tác động trên các tính trạng cụ thể về hoa cũng như một số đặc điểm mong muốn khác như vòng đời và thời gian ra hoa [24] Do đó, cần có một phương pháp chọn giống khác để khắc phục những hạn chế của phương pháp này

1.3.2 Ch n gi ng bằng p ươ p áp ển gen

Phương pháp chuyển gen đã được phát triển để đưa các gen ngoại sinh có liên quan đến những tính trạng mới vào cây Với kỹ thuật này, nhà chọn giống có thể đưa vào cây các gen mong muốn từ bất kỳ nguồn nào bất chấp ranh giới về loài

Vì vậy, chọn giống bằng phương pháp chuyển gen được xem là một công cụ triển vọng hơn cho việc tạo ra khả năng kháng bệnh, chống chịu điều kiện bất lợi môi trường, biến đổi hình dạng, màu sắc hoa và kéo dài vòng đời so với phương pháp lai tạo cổ điển [43] Nhiều phương chuyển gen khác nhau đã được sử dụng cho việc

chuyển gen vào hoa lan như chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium,

chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện (electroporation), vi tiêm (microinjection), chuyển gen thông qua liposome hay PEG và chuyển gen bằng súng bắn gen [43]

Trong đó, chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium là phương pháp

được ưu tiên sử dụng, do có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp khác

về vấn đề an toàn sinh học và thương mại hóa của cây trồng chuyển gen [53]

1.3.3 P ươ p áp ển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens

1.3.3.1 ơ lược v p ươ p áp

Đây là phương pháp chuyển gen được sử dụng phổ biến để đưa các đoạn DNA chuyên biệt vào bộ gen thực vật, được thông báo lần đầu tiên bởi Block và cs

(1984) [16] Việc chuyển gen được thực hiện qua trung gian vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens), là một vi khuẩn gram âm gây bệnh

khối u ở nhiều loại thực vật Vi khuẩn này có khả năng chuyển, cài nhập và biểu hiện các gen định vị trên T-DNA của nó vào bộ gen thực vật, là nguyên nhân của

sự hình thành các khối u [1] Lợi dụng khả năng này, việc chuyển gen vào thực vật

có thể thực hiện bằng cách tạo ra các chủng vi khuẩn A tumefaciens có mang gen

mục tiêu, sau đó cho lây nhiễm với mô thực vật cần chuyển gen

Tuy nhiên, trong tự nhiên, A tumefaciens chỉ gây nhiễm trên các thực vật

hai lá mầm Do đó, sự chuyển gen vào nhiều loài thực vật quan trọng vẫn chỉ có thể đạt được bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp Sự chuyển gen qua trung

gian A tumefaciens vào các cây một lá mầm vẫn không thể thực hiện cho đến gần

đây, khi các phương pháp hiệu quả được thiết lập trên lúa, chuối, bắp và lúa mì Số

lượng cây chuyển gen được tạo ra bằng phương pháp chuyển gen qua trung gian A

tumefaciens đang ngày càng gia tăng [16] Phương pháp này cũng đã được áp dụng

thành công cho việc chuyển gen trên nhiều loại hoa lan khác nhau như

Dendrobium, Oncidium và Phalaenopsis [53]

Phương pháp chuyển gen qua trung gian A tumefaciens có ưu điểm hơn các

phương pháp chuyển gen khác như có thể dung hợp gen chuyển vào vào bộ gen thực vật ở một locus duy nhất với số bản sao gen thấp Đây là một đặc điểm quan trọng, vì việc dung hợp của hai hay nhiều bản sao T-DNA vào bộ gen thực vật gây ảnh hưởng đáng kể đến sự ổn định và di truyền của gen chuyển và có thể dẫn đến

sự im lặng gen [53] Việc chuyển gen qua trung gian A tumefaciens còn có thể tạo

ra cây chuyển gen có khả năng sinh sản và gen chuyển được di truyền theo luật di

truyền Menden [16] Vì vậy, phương pháp chuyển gen qua trung gian A

tumefaciens thường được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu tạo giống cây

trồng chuyển gen Đối với hoa lan, phương pháp này lần đầu tiên đã được Nan và

cộng sự (1998) áp dụng để thực hiện việc chuyển gen vào giống lan Dendrobium

[70] Vì vậy, việc sử dụng phương pháp này cho nghiên cứu tạo giống lan

Dendrobium kháng virus, thông qua cơ chế can thiệp RNA (RNAi), là một trong

những cách tiếp cận phù hợp với xu hướng nghiên cứu chuyển gen hiện tại

1.3.3.2 Các dạng Agrobacterium tumefaciens dùng cho chuyển gen

Tùy thuộc vào hợp chất opine (một amino acid chuyên biệt) tạo ra, vi khuẩn

A tumefaciens được phân thành 3 dạng khác nhau: agropine, octopine và nopaline,

tương ứng với các chủng A tumefaciens thường sử dụng trong nghiên cứu chuyển

gen: EHA105, LBA4404 và C58 Trong đó, chủng EHA mang 3 gen cần cho sự tổng hợp và dị hóa agropine, khối u không biệt hóa và chết dần; chủng LBA4404 mang 3 gen cần cho sự tổng hợp octopine trong thực vật và dị hóa trong vi khuẩn, khối u không biệt hóa nhưng vẫn duy trì ở dạng mô sẹo; chủng C58 mang 3 gen cần cho sự tổng hợp nopaline trong thực vật và cho sự dị hóa trong vi khuẩn, khối u

có thể biệt hóa thành dạng teratoma (dạng khối u có cả mô và cơ quan) [37]

1.3.3.3 Cơ ế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens

Trong bước khởi đầu của quá trình lây nhiễm, A tumefaciens gắn vào tế bào

của cây ở vị trí vết thương hở Sau đó, vi khuẩn này tạo ra một mạng lưới sợi

cellulose liên kết chặt nó vào bề mặt tế bào Ban đầu, sự lây nhiễm A tumefaciens

vào cây bị thương được cho là do các rào cản vật lý của vách tế bào đã bị bẻ gãy do tổn thương, do đó tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập Tuy nhiên, sau đó nguyên nhân đã được xác nhận là do các vi khuẩn này đáp ứng với các hợp chất phenol như acetoxyringone và hydroxyacetoxyringone được tiết ra bởi cây bị thương Các hợp chất này gây cảm ứng các gen độc (vir) trên plasmid Ti của vi khuẩn Các gen vir được định vị ở vùng 35 kb của plasmid Ti, nằm ngoài vùng T-DNA Có 25 gen vir sắp xếp thành 7 operon trên plasmid Ti Các sản phẩm của gen vir cần thiết cho sự chuyển và cài nhập T-DNA vào bộ gen của tế bào thực vật [1]

Sau khi A tumefaciens bám vào tế bào thực vật chủ và các gen vir được cảm

ứng, T-DNA được chuyển vào tế bào bởi một quá trình tương tự như sự chuyển plsmid từ tế bào cho sang tế bào nhận trong quá trình tiếp hợp vi khuẩn T-DNA được chuyển là một phân tử sợi đơn, mạch thẳng từ plasmid Ti, đi vào tế bào, và cuối cùng được cài nhập vào DNA nhiễm sắc thể Đầu 5’ của T-DNA mang trình tự biên phải, và trình tự biên trái ở đầu 3’ [1]

T-DNA sợi đơn được tạo thành bằng việc cắt đặc hiệu ở hai vị trí biên phải

và biên trái của T-DNA nguyên vẹn Sự cài nhập T-DNA vào bộ gen thực vật phụ thuộc vào trình tự đặc hiệu được định vị ở biên phải của T-DNA Biên này có một trình tự lặp lại 25 bp (5’-TGNCAGGATATATNNNNNNGTNANN-3’) Mặc dù

(5’-TGGCAGGATATATNNNNNTGTAAAN-3’) nhưng các nghiên cứu đột biến mất đoạn cho thấy vùng này không liên quan đến quá trình cài nhập Trong quá trình cài nhập T-DNA vào DNA nhiễm sắc thể thực vật, các đoạn ngắn DNA thực vật thường bị mất đi tại các vị trí nối giữa T-DNA và DNA nhiễm sắc thể thực vật Ngoài ra, trong quá trình chèn T-DNA vào DNA thực vật tại các vị trí ngẫu nhiên, các biên T-DNA biểu hiện một số tương đồng với DNA thực vật tại vị trí cài nhập Hầu hết các gen được định vị trong vùng T-DNA chỉ được hoạt hóa sau khi T-DNA được chèn vào bộ gen thực vật [1]

1.3.3.4 Các yếu t ả ưở đến sự chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ở hoa lan

Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến sự chuyển gen qua trung gian vi

khuẩn A tumefaciens ở hoa lan, trong đó bao gồm các yếu tố quan trọng như mô cấy, chủng Agrobacterium, vector chuyển gen, điều kiện ủ và đồng nuôi cấy, và

nuôi cấy mô,…[43]

* Mô cấy và vấn đề tiền xử lý mô cấy

Sự chuẩn hóa mối tương tác giữa A tumefaciens và cây là một trong những

khía cạnh quan trọng nhất được xem xét Sự gắn kết của vi khuẩn với tế bào cây chủ là bước khởi đầu trong quá trình xâm nhiễm Tần số gắn kết có thể thay đổi theo chu kỳ tế bào, loại tế bào, tuổi của mô hay cây và các thông số sinh lý khác Loại mô cấy là một nhân tố quan trọng, và nó phải phù hợp cho sự tái sinh để tái tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh Protocorm like bodies (PLBs) được xem là mô cấy phù hợp nhất cho sự chuyển gen ở hoa lan Điều này có lẽ liên quan đến vai trò của

các hợp chất phenol trong việc tăng cường sự biểu hiện gen vir của Agrobacterium,

do đó làm tăng tần xuất chuyển gen Một hợp chất có tên là coniferyl alcohol đã

được nhận thấy có vai trò như chất cảm ứng gen vir cần thiết cho sự chuyển gen qua trung gian A tumefaciens ở lan Dendrobium Chất này hiện diện với nồng độ

cao trong PLBs và có lẽ vì vậy PLBs là nguồn vật liệu khởi đầu phù hợp nhất cho

sự chuyển gen Ở lan Dendrobium, PLBs đã được cắt thành những lát mỏng và sử

dụng cho các thí nghiệm tiếp ptheo, mặc dù PLBs nguyên vẹn cũng đã được nhận

thấy phù hợp cho chuyển gen Ở lan Phalaenopsis, PLBs được cảm ứng từ nụ chồi

trên phát hoa cũng đã được sử dụng làm nguồn vật liệu khởi đầu cho chuyển gen

Sự chuyển gen qua trung gian A tumefaciens cũng đã được thực hiện thành công ở PLBs của lan Oncidium và Cymbidium Ngoài ra, các nhà khoa học cũng nhận thấy

có một mối tương quan giữa sự phân chia của các tế bào được cảm ứng bởi vết

thương và khả năng mà các tế bào này được chuyển gen bởi A tumefaciens Ở

nhiều cây một lá mầm, các tế bào ở vị trí vết thương có xu hướng bị lignin hóa hay hóa cứng mà không có sự phân chia tế bào rõ ràng Do đó, hầu hết các cây một lá

mầm đều không phải là kí chủ thuận lợi cho A tumefaciens Ở hoa lan, việc gây vết

thương PLBs được nhận thấy cần thiết cho sự chuyển gen hiệu quả và sự sản xuất PLBs tiếp theo Điều này có lẽ do vi khuẩn bị thu hút đến mô bị thương do sự đáp ứng với tín hiệu hóa học được giải phóng từ mô mà sau đó chúng sẽ gắn kết vào [43]

* Chủng vi khuẩn Agrobacterium và vector

Một số chủng vi khuẩn và vector chuyển gen, được thiết kế dựa trên nền tảng của cơ chế chuyển gen tự nhiên, đã được phát triển; và các vector như vậy đã được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật di truyền Khả năng chuyển gen vào tế bào

thực vật của Agrobacterium được xác định bởi vật liệu di truyền mã hóa cho tất cả

các thành phần của bộ máy phục vụ cho sự gắn kết và vận chuyển DNA Các chủng

Agrobacterium đã được sử dụng thành công cho sự chuyển gen ở hoa lan là

EHA101, EHA105 và LBA4404; và những chủng này được sử dụng với nhiều vector khác nhau Chủng LBA4404 mang vector pBI21-DOH1 đã được sử dụng

cho chuyển gen ở lan Dendrobium Trong đó, vector pBI21-DOH1 mã hóa cho gen

ngược chiều (antisense) DOH1 gây ra sự hình thành các chồi bất thường và ra hoa

sớm Sự chuyển gen vào lan Dendrobium nobile cũng đã được thực hiện thành

công với chủng Agrobacterium AGL1 (pCAMBIA1301) and EHA105 (pCAMBIA1301) Ở lan Phalaenopsis, hai chủng LBA4404 mang vector

pTOK233 và EHA101 mang vector pIG121Hm đã được sử dụng cho chuyển gen

Trong đó, vector pTOK233 được chèn các gen virB, virC và virG có nguồn gốc từ

Ti-plasmid pTiBo542 là một plasmid có vai trò làm gia tăng độc tính của

Agrobacterium tumefaciens Khả năng tạo ra hiệu quả chuyển gen cao hơn của

Ti-plasmid pTiBo542 đã được quan sát lần đầu tiên ở các cây hai lá mầm, và gen vir

từ plasmid này cũng đã được sử dụng rộng rãi trong các vector chuyển gen ở cây

một lá mầm Các kết quả chuyển gen trên lan Phalaenopsis cho thấy LBA4404

(pTOK233) tạo ra tỷ lệ chuyển gen cao hơn so với EHA101 (pIG121Hm) Ở lan

Oncidium, chủng EHA105 và LBA4404 mang vector biểu hiện pCAMBIA1301

được nhận thấy thích hợp cho sự chuyển gen vào PLBs Ngoài ra, PLBs của lan

Phalaenopsis và Cymbidium cũng đã được chuyển gen với chủng EHA101 mang

vector PIG121Hm Ở loài lan hoang dại Phalaenopsis amabilis, chủng LBA4404

mang vector pG35SKNAT1 cũng đã được sử dụng cho chuyển gen [43]

* Sự ủ vi khuẩn và đồng nuôi cấy

Sự lây nhiễm Agrobacterium được chia thành hai giai đoạn: đầu tiên là giai

đoạn ủ và tiếp theo là giai đoạn đồng nuôi cấy Giai đoạn ủ thường kéo dài từ vài phút đến vài giờ, trong đó mô cấy được nhúng chìm trong huyền phù vi khuẩn Giai đoạn đồng nuôi cấy được thực hiện sau khi mô cấy được chuyển ra khỏi huyền phù

vi khuẩn và thường kéo dài trong vài ngày Sự tối ưu hóa các thông số cho việc ủ

và đồng nuôi cấy rất quan trọng để có được hiệu quả chuyển gen cao và nó có thể thay đổi theo kiểu gen và loại mô cấy được sử dụng Sự tăng trưởng của vi khuẩn

có ý nghĩa quan trọng cho việc chuyển gen hiệu quả Vi khuẩn tăng trưởng qua đêm hoặc tăng trưởng trong 3 ngày đều có thể được sử dụng cho chuyển gen Việc

bổ sung acetosyringone (100-200 µM) trong nuôi cấy vi khuẩn cũng đã làm tăng

độc tính của các chủng vi khuẩn lên nhiều lần Các loại lan như Dendrobium cũng

có khả năng cung cấp một mức độ nhất định các phân tử tín hiệu làm tăng độc tính

của Agrobacterium Trong một vài loại lan, việc bổ sung acetosyringone được nhận

thấy cần thiết, bởi vì các loại lan này không thể sản xuất đủ mức phân tử tín hiệu Mức độ biểu hiện tạm thời của enzyme β-glucuronidase (GUS) sau khi đồng nuôi cấy thấp hơn khi acetosyringone bị loại trừ Sự chuyển T-DNA được khởi đầu ở giai đoạn đồng nuôi cấy sớm dưới sự hiện diện của acetosyringone và việc tiền xử

lý mô cấy với chất này không có ý nghĩa quan trọng Tuy nhiên, việc tiền xử lý vi khuẩn với acetosyringone dẫn đến kết quả làm tăng hiệu quả chuyển gen Một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất ở cây một và hai lá mầm là bổ

sung acetosyringone vào môi trường đồng nuôi cấy Ở lan Phalaenopsis, PLBs đã

được gây vết thương được nhúng chìm trong huyền phù vi khuẩn 30 phút để lây nhiễm và đồng nuôi cấy tiếp theo Khoản thời gian của giai đoạn đồng nuôi cấy giữ

vai trò qua trọng đối với hiệu quả chuyển gen Ở lan Dendrobium, khi các lát cắt

mỏng PLBs được sử dụng, giai đoạn đồng nuôi cấy chia thành hai pha Trong pha đầu tiên, mô cấy được đặt trong môi trường đồng nuôi cấy không bổ sung kháng sinh trong 3 ngày Trong pha thứ hai, việc đồng nuôi cấy được thực hiện trong 3-4 tuần trên môi trường chứa kháng sinh [43]

Các nhân tố khác trong giai đoạn đồng nuôi cấy như ánh sáng, môi trường, nhiệt độ cũng được thông báo giữ một vai trò quan trọng trong sự chuyển gen Vai trò thúc đẩy của ánh sáng trong sự chuyển gen qua trung gian vi khuẩn

Agrobacterium vào tế bào thực vật cũng đã được báo cáo Trong hầu hết các nghiên

cứu ở hoa lan, việc đồng nuôi cấy được thực hiện thành công bằng cách ủ mô cấy trong tối 2-3 ngày Giai đoạn đồng nuôi cấy với 16 giờ sáng và 8 giờ tối đã được

thực hiện thành công ở lan Dendrobium [43]

Các loại môi trường khác nhau cũng được nhận thấy có sự chuyên biệt theo kiểu gen Thành phần của môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tái sinh của mô cấy đã được chuyển gen vì môi trường có thể hỗ trợ cho hoạt động phân chia tế bào xảy ra thích hợp hơn Các loại môi trường rắn thường được ưu tiên sử dụng hơn môi trường lỏng Môi trường KC rắn

có cải tiến được nhận thấy thích hợp cho việc đồng nuôi cấy ở lan Dendrobium

Chai và cộng sự đã sử dụng môi trường VM bổ sung 100 g/l khoai tây trong giai

đoạn đồng nuôi cấy Môi trường G10 bổ sung 200μM acetosyringone và dịch nuôi

cấy tế bào huyền phù thuốc lá thích hợp cho lan Oncidium Men và cộng sự cũng

đã thông báo về việc đồng nuôi cấy PLBs lan Dendrobium được thực hiện thành

công trên môi trường ½ MS bổ sung 1 mg/l BA và 100μM acetosyringone Lan

Phalaenopsis và Cymbidium cũng đã được chuyển gen thành công bằng cách đồng

nuôi cấy trên hai loại môi trường rắn tương ứng là ND và 10 ND cùng với việc bổ

sung 100μM acetosyringone PLBs lan Phalaenopsis cũng đã được chuyển gen qua

việc đồng nuôi cấy trên môi trường NP cải tiến có chứa 1mg/l 2,4-D [43]

Ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình đồng nuôi cấy lên sự phân phối DNA lần đầu tiên được nghiên cứu trên các loài cây hai lá mầm Nhiệt độ 22oC được nhận thấy tối ưu cho sự phân phối T-DNA ở lá cây thuốc lá Tuy nhiên, trong một nghiên cứu khác, đồng nuôi cấy ở 25oC thu được số lượng cây thuốc lá chuyển gen cao nhất, mặc dù nhiệt độ tối ưu cho sự phân phối T-DNA là 19oC Ở lớp một

T-lá mầm, nhiệt độ đồng nuôi cấy cho hầu hết các loại cây trồng từ 24oC đến 25oC, và trong một số trường hợp là 28oC Nhiệt độ đồng nuôi cấy tối ưu cho Brassica

juncea là 25oC, ở mức nhiệt độ cao hơn, số lượng cây chuyển gen thu được rất thấp Tương tự, hiệu quả chuyển gen ở khoai tây ngọt cũng gia tăng từ 22oC đến

28oC nhưng giảm mạnh ở 30oC Cùng với các nghiên cứu trước đây, những kết quả này cho thấy rằng bộ máy vận chuyển T-DNA hoạt động hiệu quả hơn ở nhiệt độ dưới 28oC Tuy nhiên, tần số chuyển gen cao hơn lại được ghi nhận trong sự chuyển gen vào phôi non của bắp ở nhiệt độ từ 20oC đến 23oC [16] Ở hoa lan, nhiệt độ đồng nuôi cấy cho hầu hết các loài là 25oC Tuy nhiên, nhiệt độ 20oC cũng

đã được sử dụng cho việc chuyển T-DNA ở lan Cymbidium [43] Do đó, nhiệt độ

tối ưu cho sự chuyển gen ổn định nên được đánh giá với từng loài thực vật chuyên

biệt và chủng Agrobacterium liên quan [16]

* Các chỉ thị chọn lọc và promoter

Các chỉ thị chọn lọc được sử dụng phổ biến nhất ở cây một lá mầm là các

(hpt), phosphinothricin acetyl transferase (pat hay bar) and neomycin

phosphotransferase (nptII) Việc sử dụng những gen chỉ thị này dưới sự điều khiển của các promoter như promoter 35S từ virus khảm súp lơ (Cauliflower mosaic

virus) hay promoter ubiquitin từ bắp đã mang lại hiệu quả trong sự chọn lọc các tế

bào chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium cũng như súng bắn gen Đối với măng tây và chuối, gen nptII dưới sự điều khiển của promoter nopaline synthase đã

được sử dụng để chọn lọc thành công các thể chuyển gen ổn định với kanamycin, tương tự với nhiều quy trình chuyển gen chuẩn ở cây hai lá mầm Hầu hết hệ thống gen chỉ thị chọn lọc đã được thông báo cho sự chuyển gen qua trung gian

Agrobacterium đều dựa trên sự chọn lọc kháng sinh bằng cách sử dụng gen htp hay nptII Các gen này mã hóa cho enzyme phosphotransferase, tạo ra khả năng chống

chịu với các kháng sinh dạng aminoglycoside như kanamycin, neomycin, paromomycin, G418 và hygromycin Việc phát hiện và chọn lọc các sự kiện chuyển gen thường dựa vào sự tăng trưởng khác nhau giữa mô chuyển gen và không chuyển gen trong môi trường có sự hiện diện của tác nhân chọn lọc Quá trình chọn lọc có thể kéo dài lên đến vài tuần và cần các mức độ nhân tố chọn lọc khác nhau để tránh việc bỏ sót các mẫu không chuyển gen Các loài lan khác nhau

biểu hiện sự nhạy cảm khác nhau đối với các nhân tố chọn lọc Gen nptII đã được

sử dụng rộng rãi như một gen chỉ thị chọn lọc trong các thí nghiệm chuyển gen với

Agrobacterium Gen này cũng là một chỉ thị được sử dụng phổ biến ở hoa lan Tuy

nhiên, gen hpt cũng đã được sử dụng như một chỉ thị chọn lọc trong một vài loài

lan Trong hầu hết các nổ lực thành công về sự chuyển ở hoa lan, các gen chỉ thị chọn lọc đã được đặt dưới sự điều khiển của promoter 35S từ virus khảm súp lơ Promoter này dường như có khả năng điều khiển sự biểu hiện gen đủ mạnh cho sự chọn lọc các thể chuyển gen ở mức độ lớn hơn [43]

1.4 Sự can thiệp RNA (RNAi) và vai trò của nó trong ch n gi ng cây tr ng

Sự can thiệp RNA (RNA interference-RNAi) là hiện tượng im lặng gen sau phiên mã được cảm ứng bởi phân tử RNA mạch kép được công bố ban đầu ở giun

tròn (Ceanorhabditis elegans) Hệ thống im lặng gen này đã cung cấp một công cụ di

truyền ngược hữu ích cho nghiên cứu chức năng bộ gen ở nhiều sinh vật nhân chuẩn [84] RNAi hữu hiệu đối với gen mà mã di truyền của nó khớp với mã di truyền của

phân tử RNA được đưa vào Ngoài ra, RNAi còn có thể lan truyền giữa các tế bào và thậm chí được di truyền sang đời sau [32]

Hiện nay, RNAi không chỉ được sử dụng trong nghiên cứu chức năng bộ gen,

mà còn được ứng dụng trong nghiên cứu chọn giống cây trồng, đặc biệt là vấn đề chọn giống cây trồng kháng virus Nhiều giống cây trồng kháng virus khác nhau đã được tạo ra bằng kỹ thuật chuyển gen RNAi [34]

1.4.1 Lịch sử phát hiện RNAi

Hiện tượng đầu tiên về RNAi có lẽ bắt đầu từ việc phát hiện ra cây thuốc lá

có khả năng kháng lại sự nhiễm virus thứ cấp của Wingard (1928) Trong đó, chỉ có các lá nhiễm ban đầu ở bên dưới cây bị hoại tử và nhiễm bệnh do virus đốm vòng thuốc lá (TRSV) gây ra Các lá phía trên bằng cách nào đó đã trở nên miễn nhiễm với virus, và do đó không có triệu chứng bệnh cũng như có khả năng kháng lại sự nhiễm virus thứ cấp (Hình 1.5) Vào thời điểm đó, đây là một điều bí ẩn, hoàn toàn không có thông tin nào về cơ chế liên quan đến hiện tượng này, và người ta thậm chí cũng không biết rằng bộ gen của virus là RNA [20]

Hình 1.5 Sự phục hồi (kháng lại virus) ở cây thuốc lá bị nhiễm virus TRSV [20]

Trong một nghiên cứu khác, một bản sao cDNA của gen mã hóa cho protein

vỏ (CP) của virus khảm thuốc lá (TMV) đã được đưa vào các cây thuốc lá Khi các cây chuyển gen bị tấn công bởi virus TMV, chúng biểu hiện các triệu chứng ít nghiêm trọng hay chậm trễ hơn so với cây hoang dại Nói cách khác là các cây chuyển gen đã biểu hiện khả năng kháng với virus TMV, và điều này được mô tả như là sự miễn nhiễm với virus [14] Sau phát hiện này, các phương pháp tương tự

đã được áp dụng trên nhiều hệ thống virus - ký chủ khác nhau Phương pháp tạo tính kháng qua trung gian gen CP (CPMR) được sử dụng để bổ sung cho các phương pháp tiếp cận cổ điển, chẳng hạn như tìm kiếm nguồn gen từ các loài hoang dại để cải thiện giống cây trồng [71] Tuy nhiên, mặc dù đã được áp dụng rộng rãi cho nhiều loại cây trồng và cho thấy khả năng kháng virus đặc hiệu, cơ chế hoạt động cơ bản của hiện tượng này vẫn còn chưa được biết rõ Ban đầu, các nhà nghiên cứu dự kiến rằng các cây tích lũy gen CP ở mức độ cao hơn sẽ có khả năng miễn nhiễm mạnh hơn với virus Tuy nhiên, sự thật không phải như vậy, một số cây tích lũy gen CP ở mức thấp lại có khả năng miễn nhiễm mạnh hơn những cây có mức tích lũy gen CP cao Sau đó, người ta thông báo rằng các cây biểu hiện sản phẩm gen virus khác, chẳng hạn như gen mã hóa cho protein sao chép, cũng cho thấy khả năng kháng lại các virus ban đầu Thật thú vị là việc chuyển vào cây các gen trong

đó codon khởi đầu dịch mã đã bị biến đổi, hay đã bị cắt đều cho kết quả kháng virus tương tự như những gì được quan sát sau khi chuyển vào cây các gen virus hoang dại Mặc dù các gen chuyển bị đột biến theo một số cách, khả năng kháng của cây chuyển gen vẫn chuyên biệt với virus một cách rõ ràng [80] Điều này cho thấy rằng khả năng kháng mà các cây thuốc lá trong trường hợp này có được không phụ thuộc vào loại gen và tính toàn vẹn của gen chuyển vào, cũng như sự dịch mã tạo protein

từ những gen này Chắc chắn phải có một cơ chế nào đó đã tạo ra khả năng kháng virus của các cây thuốc lá

Hiện tượng tiếp theo ghi nhận được trong nghiên cứu làm thay đổi màu hoa của cây dã yên thảo (petunia) Các nhà nghiên cứu đã cố gắng làm cho hoa màu tím của loài cây này trở nên đậm màu hơn bằng cách đưa vào cây một gen được thiết kế

để sản xuất vượt mức enzyme chalcone synthase Tuy nhiên, trái với mong đợi ban

đầu, sự biểu hiện quá mức của gen chalcone synthase đã không làm tăng màu tím của hoa Thay vào đó, một số hoa bị mất màu hoàn toàn (màu trắng), và những hoa khác thể hiện sự khảm màu (Hình 1.6) Sự mất màu hoàn toàn ở một số hoặc tất cả các tế bào hoa đã chỉ ra một hiện tượng mới, đó là sự im lặng không chỉ xảy ra với các gen chuyển vào các tế bào này, mà còn với các gen chalcone synthase nội sinh của cây Vì vậy, thuật ngữ "đồng ức chế " (cosuppression) đã được sử dụng để mô

tả sự im lặng đồng thời của gen chuyển và gen nội sinh tương đồng của nó [58], [75] Ngoài ra, các nhà khoa học còn nhận thấy màu trắng của cánh hoa petunia cũng xuất hiện ở các thế hệ sau và dần dần các hoa chuyển sang màu tím Nghiên cứu sâu hơn về kiểu hình của cây đã chứng minh rằng việc mất điều khiển là do sự

ức chế biểu hiện gen sau phiên mã, thông qua việc tăng tỷ lệ phân huỷ mRNA [74]

Hình 1.6 Hoa dã yên thảo với các gen quy định sắc tố hoa đã bị im lặng bởi RNAi

A Cây hoang dại, B Cây có chứa gen chuyển vào với hoa bị mất màu hoàn toàn hay khảm màu [74]

Các hiện tượng trên đã thật sự không giải thích được cho đến năm 1997, khi các nhà khoa học bắt đầu nhận thấy rằng khả năng kháng lại virus trong trường hợp các cây thuốc lá có liên quan đến sự im lặng của gen mục tiêu, mà cụ thể trong trường hợp này là RNA virus [62], [28] Tuy nhiên, cơ chế cụ thể như thế nào vẫn chưa được biết rõ Và cơ chế thật sự chỉ được làm rõ khi khi Fire và Mello (1998)

A

B

thực hiện thí nghiệm đưa RNA mạch kép (dsRNA) gồm các đoạn dịch mã và đối mã vào giun tròn Họ phát hiện ra việc đưa độc lập từng loại các phân tử RNA xuôi chiều (sense) và ngược chiều (antisense) mã hoá cho một protein cơ bắp đã không làm thay đổi hành vi của giun tròn Tuy nhiên, khi đưa đồng thời cả RNA xuôi chiều và ngược chiều vào cơ thể giun tròn, hiện tượng giun bị co giật bắt đầu xuất hiện Hiện tượng tương tự cũng xảy ra ở giun bị khiếm khuyết gen mã hóa cho protein cơ bắp Hiện tượng này được giải thích do RNA xuôi chiều và ngược chiều kết hợp với nhau tạo thành RNA mạch kép, và phân tử mạch kép đó, có thể làm bất hoạt gen mang cùng mã di truyền với nó Hai nhà khoa học đã kiểm tra giả thuyết trên bằng cách đưa vào giun tròn các phân tử RNA mạch kép chứa các mã di truyền

mã hóa cho nhiều protein khác Ở mỗi thí nghiệm, việc đưa vào RNA mạch kép mang mã di truyền xác định làm cho gen tương ứng ngừng hoạt động, và protein được mã hoá bởi gen cũng không còn được tạo ra Sau nhiều thí nghiệm tương tự, Fire và Mello cho rằng RNA mạch kép là nguyên nhân làm cho gen ngừng hoạt động, và thuật ngữ “RNA interference” (RNAi) được đặt tên cho cơ chế này Cơ chế RNAi hữu hiệu đối với gen mà mã di truyền của nó khớp với mã di truyền của phân tử RNA được đưa vào Ngoài ra, cơ chế RNAi có thể lan truyền giữa các tế bào và thậm chí được di truyền sang đời sau Chỉ cần tiêm một lượng nhỏ phân tử RNA mạch kép là có thể đạt được một kết quả nào đó Do vậy, Fire và Mello cho rằng cơ chế RNAi là một tiến trình xúc tác [32] Phát hiện này đã làm sáng tỏ nhiều quan sát thí nghiệm mâu thuẫn và khó hiểu, đồng thời tiết lộ một cơ chế tự nhiên để kiểm soát dòng thông tin di truyền Khám phá cũng báo hiệu sự khởi đầu của một lĩnh vực nghiên cứu mới Fire và Mello đã vinh dự nhận giải thưởng Nobel về Y học và sinh lý học vào năm 2006 cho phát minh quan trọng này

1.4.2 Cơ ế của RNAi

Sự can thiệp RNA xảy ra với sự tham gia của các yếu tố như enzyme Dicer (một thành viên của họ enzyme RNase III), các phân tử siRNA (phân tử RNA nhỏ, dài từ 21 đến 25 nucleotide) và protein Argonaute Trong đó, Dicer là enzyme có vai trò phân cắt RNA (thường được tạo thành từ mRNA hoặc RNA mạch kép) thành siRNAs Sau đó, siRNA sẽ kết hợp với một nhóm protein, bao gồm protein Argonaute