cấu trúc các hợp chất steroit từ cây bình bát (Annona reticulata L.)

Cây bình bát (Annona reticulata L.) là loài cây phổ biến ở các nước Việt Nam, Trung Quốc và được dùng làm thuốc chữa bệnh, đồ gỗ… nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học. Nghiên cứu thành phần hóa học của cây bình bát ở Việt Nam, chúng tôi thu được 4 hợp chất. Cấu trúc của 4 hợp chất này bằng các phương pháp phổ MS và NMR. Cấu trúc của các chất này là sitosterol (1); stigmasterol (2); sitosterol 3ODglucopyranozit (3); 6hydroxy24etylcholesta4en3on (4). Trong đó, hợp chất (4) lần đầu tiên được tìm thấy từ loài cây này.

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa nên có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài, bao gồm hơn 300 họ và 1.200 chi Nguồn thực vật phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị Các sản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau của cuộc sống, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh Các loại thuốc thảo mộc ít gây tác dụng phụ và ít độc hại cho người sử dụng Chúng được dùng như tác nhân điều trị trực tiếp, làm chất

dò sinh hoá để làm sáng tỏ nguyên lí dược học hoặc làm chất chuẩn để phát triển các loại thuốc mới Chính vì vậy việc nghiên cứu hoá học cũng như hoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụng một cách hợp lý và có hiệu quả, nhất là nguồn tài nguyên thiên nhiên này

Từ trước đến nay trên thế giới các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học luôn đóng một vai trò quan trọng trong đời sống của con người Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học được dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp dược phẩm làm thuốc chữa bệnh, công nghiệp thực phẩm, hương liệu và mỹ phẩm Thảo dược là nguồn nguyên liệu trực tiếp hoặc là những chất dẫn đường để tìm kiếm các loại biệt dược mới Theo số liệu thống kê cho thấy khoảng trên 60% các loại thuốc đang được lưu hành hiện nay hoặc đang trong giai đoạn thử nghiệm có nguồn gốc từ các loại hợp chất thiên nhiên [5]

Ở nước ta, số loài thuộc chi Na (Annona) có 4 loài trong đó 3 loài là cây trồng [2] Na xiêm (Annona muricata L.) có nguồn gốc châu Mỹ và được nhập sang các nước nhiệt đới khác Quả chín ăn ngon (ăn tươi hoặc nghiền pha thành “kem sinh tố”) Lá dùng làm gia vị và chữa sốt rét, chữa ho; quả chữa kiết lỵ; hạt để duốc cá, làm thuốc trừ sâu [1,2]

Cây bình bát (Annona reticulata L.) là loài cây phổ biến ở các nước Việt Nam, Trung Quốc và được dùng làm thuốc chữa bệnh, đồ gỗ… nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất steroit từ cây bình bát (Annona reticulata L.) ở Việt Nam” từ đó góp phần xác định thành phần hoá học của bình bát và tìm ra nguồn nguyên liệu cho ngành dược liệu, hương liệu

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất của bình bát (Annona reticulata L.)

- Sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn để phân lập các hợp chất

- Sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc các hợp chất thu được

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là bình bát (Annona reticulata L.) thuộc họ Na (Annonaceae) ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Chi Na (Annona)

1.1.1 Đặc điểm thực vật chi Na

Họ Na (Annonaceae) còn được gọi là họ Mãng cầu, là một họ thực vật

có hoa bao gồm các loại cây thân gỗ, cây bụi hay dây leo Với khoảng 2.300 đến 2.500 loài trong 120 - 130 chi, đây là họ lớn nhất của Bộ mộc lan (Magnoliales) Chi điển hình của họ này là Annona (Na hay Mãng cầu ta; Mãng cầu xiêm hay Mãng cầu gai) Họ này sinh trưởng chủ yếu ở vùng nhiệt đới, và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn đới Khoảng 900 loài ở Trung

và Nam Mỹ, 450 loài ở Châu Phi, và các loài khác ở châu Á [2]

Trong đó, chi Annona (8 loài) gồm: Annona cherimola, A.glabra, A.montana, A.muricata, A.reticulata, A.squamosa, A.artemoya (A cherimola

x squamosa), A.Purpurea

1.1.2 Thành phần hóa học

Những năm gần đây họ Na được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu Đặc biệt, nhóm nghiên cứu của Y C Wu (Đài Loan) [41] đã tìm được hơn 100 hoạt tính sinh học của các chất tách ra từ cây họ Na (Annonaceae) Trong đó có nhiều chất có độc tính, hoạt tính kháng vi trùng,

ức chế sự tái tạo tế bào HIV, chống đông tụ tiểu cầu

Nhóm nghiên cứu của D.Q Yu (Trung Quốc) [52] đã nghiên cứu và tách được các chất có khả năng chống u bướu từ thực vật họ Na: có khoảng

50 acetogenin, 12 styrylpyron và 25 polyoxygenat cyclohexen mới được tách

ra từ 5 loài Uvaria, 4 loài Goniothalamus và 1 loài Annona Bước đầu kiểm tra hoạt tính sinh học, phần lớn các chất mới tách ra có các hoạt tính chống u, bướu quan trọng Trong quả có 72% glucose, 14,52% saccharose, 1,73%

tinh bột, 2,7% protid và vitamin C Trong lá có một alcaloit vô định hình, không có glucozit, lá xanh chứa 0,08% dầu Hạt chứa 38,5-42% dầu, trong đó thành phần axit béo là: axit stearic(9,3%), axit oleic (37%), axit linoleic (10,9%), acid arachidic (3,3%) và isoricinoleic acid (9,8%) [26] Trong hạt có một alcaloit vô định hình gọi là anonain Chất độc trong hạt và rễ là các glycerit và các axit có phân tử lớn Lá, vỏ và rễ chứa axit hydrocyanic Vỏ chứa anonain

NH

o

o

Anonain (1) Trong các bộ phận khác của Na có alkaloit, chẳng hạn như aporphine, roemerine,norcorydine, corydin, norisocorydine, glaucine và anonain (Kowalska và Puett, 1990) [29]

1.1.2.1 Hợp chất acetogenin

Các hợp chất acetogenin thiên nhiên có mạch cacbon dài từ 35-37, nó được bắt nguồn từ axit béo C-32/C-34 kết hợp với một đơn vị 2-propanol, các acetogenin có tính chất như một chuỗi dài aliphatic gắn vào vòng -lacton có nối đôi ở vị trí ,  trên vòng còn mang một nhóm metyl, đôi khi kết hợp với ketolacton, ngoài ra còn gắn với một, hai hoặc ba vòng tetrahyđrofuran, trên mạch chính có gắn các nhóm thế hyđroxyl, acetoxyl, keton, epoxid và diol, trên mạch chính của một vài hợp chất acetogenin còn

có liên kết đôi C=C [10], [18], [42],[45]

Bảng 1.4 Một số hợp chất acetogenin trong các bộ phận của cây

19 cis-10-R-annonacin A-on 61 muricin E

20 Trans-10-R-annonacin A-on 62 muricin F

26 Annopentocin C 68 Murihexocin 3

39 Gigantetrocin A & B 81 Uvariamicin I

42 Goniothalamicin

Các nhà khoa học đã xác định cấu tạo hóa học và thử tác dụng sinh học của chúng (về tim mạch, độc tính và các hoạt tính dược lí khác) Một số hợp chất có tiềm năng ứng dụng rất lớn để sản xuất thuốc chữa bệnh

* Các acetogenin thuộc kiểu monotetrahydrofuran:

Trong cấu trúc của phân tử các hợp chất loại này có vòng tetrahydrofuran, hai hay nhiều nhóm – OH, có hoặc không có liên kết đôi C=

C

Hợp chất (9) (0,0021%), (15) (0,0032%), (18) (0,0021%) được M.C Jaramillo và các cộng sự [26] phận lập và xác định cấu trúc vào năm 1999 từ

vỏ của quả na xiêm

O C

H3

(CH2)5

OH

(CH2)3OH

11 10 4

H3

(CH2)5

OH

(CH2)3OH

11 10 4

H3

(CH2)5

OH

(CH2)3OH

11 10 4

O O

O O

35

OH O

32

35 O O

O OH

OH

19 28

(1) Annocatalin

O O OH O

O O

37 O

O O OH

OH

(65) Muricin I Fang-Rong Chang and Yang-Chang Wu (Đài Loan) [17] đã phân lập

và xác định được bảy hợp chất cytotoxic monotetrahydrofuran acetogenin: muricin A-G (57-63), các hợp chất này được phân lập từ hạt của na xiêm

32

O O

19 22

23

(60) Muricin D

OH O

O O

O

OH OH

(61) Muricin E

O OH

O

H OH

(62) Muricin F

OH O

OH

OH

O O

H OH

(63) Muricin G Trong công trình nghiên cứu của Christophe Gleye (Pháp) và các cộng

sự [20] đã phân lập đồng thời xác định cấu trúc của các hợp chất acetogenin (72), (73), (74), (80), (81), (82) những hợp chất này thuộc loại cis-monotetrahydrofuran được trích từ rễ cây na xiêm

* Các acetogenin thuộc kiểu non-monotetrahydrofuran:

Hợp chất (52) thuộc loại non-tetrahydrofuran (THF), bốn nhóm –OH

và một liên kết đôi C = C gắn trên mạch dài aliphatic được De Yu LI (Trung

Quốc) và các cộng sự tách và xác định cấu trúc từ hạt của quả na xiêm [35]

CH3(CH2)13

OH

OH

OH (CH2)4

O OH

OH liền kề nhau và một liên kết đôi C = C

CH3

22 34

O O O

(30)Cohibins D Trong công trình nghiên cứu của C Gleye (Pháp) và các cộng sự phân lập hợp chất (46) từ rễ của cây na xiêm, hợp chất này thuộc loại acetogenin điol liền kề và trên mạch chính có chứa hai liên kết đôi C = C [21]

O

O O

34 33

2 17

32

(78) Sabadelin Các acetogenin quan trọng nhất là anonin hoặc anonacin: simicin, annonastatin, bullatacin, ullatacinone và squamocin Những chất nàycó tác dụng độc hại khi ăn côn trùng và có thể ức chế sự phát triển của côn trùng, phát triển và sinh sản Anonins gây độc tế bào Aedes aegypti với nồng độ chỉ

10 ppm, cơ chế hoạt động của nó là gây ức chế hô hấp (Londershausen et al,

1991 a, b) [37] Các asimicin có hiệu quả chống lại loại sâu bệnh, chẳng hạn như A.aegypti, A.vittatum, A gossypii, Colliphora vicina, Epilachna varivertis, Tetranychus urticae, và Caenoharbiditis Hợp chất này có 256 đồng phân được biết đến, trong đó bullatacin là độc nhất (Li et al, 1990) [31] Bullatacin nguyên nhân gây tử vong 80% của A aegypti, A.gossypii và Diabrotica undecimpunctata khi ở nồng độ 1, 10 hoặc 24 ppm, tương ứng Một số này acetogenin có thể được sử dụng như côn trùng thuốc chống (Hernández và Angel, 1997) [25]

Trong đó có 7 cấu định trúc mới được xác định là: squamocin - O1, - O2

(Araya et al., 2002) [14], squamosten - A (Araya et al., 1994a) squamocin –

N, - E, - B (Sahai et al., 1994) [14], và squamostanal – A (Araya et al.;1994b) [32]

O OH

O OH

(CH2)5

OH

(CH2)10

O O

Me Me

trans erythro

trans threo threo

56

H3

O O

CH3

O H OH

OH

Squamosin 2 (81)

O O

C

H3

O O

37

O H OH

R3

R1

Squamocin 2 (81) R1 = H R2 = H R3 = OH R4 = H Squamocin – C (82) R1 = H R2 = H R3 = H R4 = OH Squamocin –G (83) R1 = OH R2 = H R3 = H R4 = H Squamocin – L (84) R1 = H R2 = H R3 = H R4 = H Squamocin –O1,- (85)- O2 (86) R1 = H R2 = OH R3 = OH R4 = H

O O

C

H3

O O

37

O H OH

C

H3

O O

37

O H OH

C

H3

O

O O

37

OH R

Squamocin- B (93) R= OH Squamocin- J (94) R= H

O O

C

H3

O

O O

37

OH

R

Squamocin- E (95) R= OH

Squamocin- K (96) R= H

O O

C

H3

O O

o o

R Ranjan và M Sahai [44] đã tách và phân lập được 3 chất từ hạt na :

o o o

H OCH3

cleomiscosin A (105) R= H cleomiscosin C (106) cleomiscosin B (107) R= OMe

N-Nitrosoxylopin (110) Roemerolidin (111) Duguevallin (112) Hợp chất benzylisoquinolin đã được tách ra từ cây Annona squamosagồm: reticulin (113) là một chất thường thấy của benzyltetrahydroisoquinolin, coclaurin (114) và N-methylcoclaurin (115)

N

R1

H3CO

O H

R2

R3

1.1.2.4 Hợp chất xyclopeptit

Protit chiếm 2,7% hạt na, trong có cấu trúc được nhóm tác giả Y L Yang, K F Hua, P H Chuang, S.H Wu,K Yuhwu, F R Chang, và Y C

Wu [53] xác định gồm 2 chất mới là xiclosquamosin H (116) -1 và - I(117)-2,

và sáu hợp chất đã biết là squamin A (118)-3, squamin B (119)-4, xiclosquamosin A (120)-6, xi-closquamosin D (121)-7, xiclosquamosin E (122)-8,và cherimolacy-clopeptide B (123)-9

Các hợp chất xyclopeptit được Li Chao Ming lần đầu tiên tách ra từ hạt của quả bình bát (Annona glabra) [33] vào năm 1995 Ngày này đã có nhiều công trình nghiên cứu về việc phân tách loại hợp chất này từ na xiêm

C C

H2NH C CH NH C CH NH C

H C HN C

HC

N

C

H2C HN

O O

O

O O

N H

NH C

NH C CH

H N

C

H2C HN

H

C C

CH C

CH

H

O O

O

O

O

C NH2O

Asn Pro

Thr

Gly

Leu Trp

Ala

O

Annomuricatin B (125)

Năm 2004, Alassane Wélé và các cộng sự [50], từ hạt của na xiêm đã phân lập được hợp chất mới annomuricatin C (126)

NH C CH NH C CH

H N C HC HN C

H2C HN C

O

O

O O

Nhiều hợp chất diterpenoit kauran đã được tách ra từ cây na và trong

số đó nhiều chất có hoạt tính sinh học cao, như hợp chất axit dihydroxy-ent-kaurane-19-oic (131) được tách từ quả Annona squamosa có hoạt tính chống sự sao chép HIV trong tế bào bạch cầu H9 với giá trị ED50 = 0,8 µg/ml [36]

16β,17-H C

H3

R3

R1

R2H

C

H3

Bảng 1.2.5: Các hợp chất diterpenoit kauran từ cây na

TT Hợp chất R1 R2 R3

129 axit 17-hydroxy-16α-hydro-ent-kauran-19-oic CH2OH H COOH

130 axit 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic CH2OH OH COOH

131 axit 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic OH CH2OH CH2OH

132 axit 16α-hydroxy-ent-kauran-19-oic CH3 OH COOH

133 axit 17-hydroxy-16β-hydro-ent-kauran-19-oic H CH2OH COOH

134 axit 17-acetoxy-16β-hydro-kauran-19-oic H CH2OAc COOH

135 17-dihydroxy-16β-hydro ent-kauran-19-al H CH2OH CHO

136 axit 19-formyl-ent-kauran-17-oic H COOH CHO

137 axit 4α-hydroxy-19-nor-ent-kauran-17-oic H COOH OH

Trà làm từ gốc rễ là tẩy cao, trong khi nó được làm từ các lá nhẹ là thuốc nhuận tràng (Leal, 1990) Nó có tác dụng bổ tiêu hóa đường ruột (Leal, 1990) Ethanol chiết xuất từ vỏ cây xuất hiện có tác dụng chống khối u hoạt động Chất chiết xuất từ hạt có độc tính rất cao với côn trùng [26]

Quả na vị ngọt, chua, tính ấm; có tác dụng hạ khí tiêu đờm Quả xanh làm săn da, tiêu sưng Hạt Na có vị đắng, hơi hôi, tính lạnh, có tác dụng thanh can, giải nhiệt, tiêu độc, sát trùng Lá cũng có tác dụng kháng sinh tiêu viêm, sát trùng Rễ cầm ỉa chảy

 Sử dụng:

Trồng na chủ yếu để lấy quả ăn tươi Quả Na ngon, ngọt, có mùi thơm thanh khiết nên được nhiều người ưa thích Nhiều nước như Ấn Độ, Braxin, Thái Lan đánh giá Na rất cao Quả na chín được dùng với tác dụng bổ dưỡng, rất tốt cho người cao tuổi, người mới ốm dậy và phụ nữ sau khi sinh

Ngoài ra quả na dùng chữa đi lỵ, tiết tinh, đái tháo, bệnh tiêu khát Quả xanh dùng chữa lỵ và ỉa chảy Quả Na điếc dùng trị mụn nhọt, đắp lên vú bị sưng Hạt thường được dùng diệt côn trùng, trừ chấy rận Lá na dùng trị sốt rét cơn lâu ngày, mụn nhọt sưng tấy, ghẻ Rễ và vỏ cây dùng trị ỉa chảy và trục giun

Ở Vân Nam (Trung Quốc), lá dùng trị xích lỵ cấp tính; lá dùng trị trẻ

em lòi dom; quả dùng trị phù thũng ác tính

Ở Thái Lan, lá tươi và rễ dùng trị chấy, mụn nhọt, nấm tóc và lang ben

Ở Ấn Độ, rễ được dùng gây xổ; hạt, quả và lá dùng diệt côn trùng, duốc cá, diệt chấy; hạt kích thích, chất chiết xuất từ những hạt Na được sử dụng để gây sẩy thai bởi các bộ lạc ở Madhya Pradesh (Salluja và Santani, 1990) [41], thường được kết hợp với lá của cây Zeylanica

1.2 Cây bình bát

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Annona reticulata L

Tên thường: bình bát (custard-apple)

Chi Na: Annona

Họ Na: Annonaceae

Cây có thể cao từ 6,0 đến 7,5 m, có nhiều nhánh bên, thân cây có dạng hình trụ, có nhiều lổ vỏ và có lông màu cà phê rất ngắn [41] Người ta cho rằng, mặc dù loài bình bát là loài cây được thuần hóa, nhưng quả của nó lại không ngon

Các lá có dạng thuôn dài hình mũi mác và màu xanh đen, chiều dài của

lá từ 25 đến 30cm và rộng khoảng 7cm, trên lá có từ 10 đến 20 cặp gân lá và

ở cuống lá có nhiều lông tơ

Hoa của nó rất giống với hoa của na (Annona squamosa), chỉ khác là, hoa thường tập hợp lại thành cụm từ 2 đến 10 hoa, với chiều dài của cuống hoa từ 1,5-3,0cm Loài cây này có khả năng thụ phấn tự nhiên thấp và khả năng đậu trái kém

Quả của nó nặng từ 0,1 đến 1,0 kg và thường có hình trái tim, nhưng đôi khi có dạng hình nón, hình trứng, thỉnh thoảng không có hình dạng cụ thể, chiều dài của quả từ 10 đến 12 cm Vỏ quả có có màu vàng hơi đo đỏ và dai, với các đường viền rất rõ trên lá noãn (khoảng 5 đến 6 hõm nghiêng) Thịt quả có màu trắng sữa và có mùi thơm nhưng vị thì nhạt nhẽo Quả bình bát được coi là loại kém ngon nhất trong các loại cây thuộc họ na được trồng để

ăn quả Mỗi quả có khoảng hơn 40 hạt, các hạt có dạng hình thuôn, màu đen

và hơi nâu

Bình bát được cho là có nguồn gốc tại Antilles và một số khu vực ở vùng ven Caribbean Từ Antilles , các nhà thám hiểm người Tây Ban Nha đã

mang loài này đến Mexico, và từ đó, chúng được phân bố đến châu Á và Châu Phi Tế bào nguyên thủy đầu tiên được Người Mĩ bản địa và những cư dân hoang dã ở vùng Costa Rica mang sang Ngày nay, mặc dù loài này phân

bố khá rộng rãi ở vùng nhiệt đới, nhưng quả của nó không có giá trị về mặt kinh tế

Bình bát là loài rất phổ biến, thường được tìm thấy ở các vườn nhà của các thành phố hoặc thị trấn ven biển ở khắp nhiệt đới Châu Mĩ Nó cũng được trồng nhiều ở Ấn Độ, Sri Lanka, Malay Archipelago, Polynesia, Philippin, Australia và hầu hết ở các nước châu Phi

1.2.2 Thành phần hóa học

Thịt quả chín có màu vàng kem, nhiều và có vị ngọt, hàm lượng axit thấp Tuy nhiên, mùi vị của quả không bằng của các quả từ loài khác trong chi Na (như là Annona cherimoya và Annona squamosa) Các thành phần cụ thể được trình bày ở bảng dưới đây [41]:

O H

H

H3CO

H3CO Reticulin (141) 1.2.2.2 Amin béo

O H

H

Một dãy các N-fatty acyl triptamin được Maeda và cộng sự [38] phân

lập từ hạt của bình bát Trong đó vị các gốc chứa nhóm acyl là từ

hexadecanoyl đến hexacosanoyl

1.2.2.3 Diterpen

Từ vỏ cây bình bát, Joseph và cộng sự [27] đã phân lập được

16,17-dihydroxykauran (150) và kaur-16-en-19-oat (151) lần đầu tiên được phân lập

từ các loài thuộc họ Na

CH2OH OH

COOCH3

16,17-dihydroxykauran (150) Kaur-16-en-19-oat (151)

1.2.2.4 Acetogenin

Chang và các cộng sự [15] đã phân lập và xác định được công thức một

acetogenin mới là cis/trans-Isomurisolenin (152) và một số acetogenin đã biết

( annoreticuin, annoreticuin-9-on, bullatacin, squamocin,

cis/trans-bullatacinon và cis/trans-murisolinon) từ hạt bình bát

O O

threo

trans threo

cis/trans-Isomurisolenin (152) 1.2.2.5 Cyclopeptit

Gần đây, xyclooctapeptit có tên là cycloreticulin A [51], lần đầu tiên được Wélé và cộng sự phân lập từ hạt bình bát vào năm 2008

NH

NH

O O O O

O

O O O

H

O

H

O N

1.3.2 Hoạt tính sinh học

Các acetogenin cho thấy có hoạt tính sinh học mạnh với các tế bào ung thư như: ung thư bàng quang [54], ung thư biểu mô vú [43], bạch cầu, ung thư phổi, ung thư biểu mô mũi-họng, ung thư ruột kết ác tính [16], ung thư gan [15] Các alkaloit cũng có khả năng gây độc đối với các dòng tế bào u ác tính,

tế bào Hela, chứng tăng bạch cầu [47] Dịch chiết từ vỏ thân cây bình bát cho thấy có khả năng giảm đau, chống viêm [46], dịch chiết từ rễ có khả năng chống lại các tế bào u ác tính [48]

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Nguyên liệu, phương pháp và thiết bị

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C Mẫu được xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp

để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm

2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất từ các cặn dịch chiết, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký cột (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích, các phương pháp kết tinh phân đoạn

- Sắc ký bản mỏng phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F245 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm Hiện màu: hơi iot và đèn

UV 254 nm

- Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230-400/mesh

2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp của các phương pháp phổ:

- Phổ DEPT

2.2 Phân lập các hợp chất

Mẫu lá cây bình bát thu hái ở Tiền Giang vào tháng 3/2010 được TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật định danh, tiêu bản được lưu giữ tại khoa Sinh, Trường Đại học Vinh Lá (5,0 kg), được phơi khô, xay nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng (7 ngày), 3 lần Dịch chiết được cất loại dung môi thu được cặn metanol (316 g) Phân bố cặn metanol trong nước, sau đó chiết lần lượt với hexan, etyl axetat, butanol rồi cất loại dung môi thu được các cặn dịch chiết tương ứng là 31, 82 g và 47 g

Sơ đồ 2.1: Phân lập hợp chất trong lá cây bình bát

Cặn hexan (31g) được tách trên sắc kí cột silica gel với hệ dung môi giải hấp là hexan:axeton (25:1; 19:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1) thu được 14 phân đoạn

- Sắc kí cột cloroform : metanol

- Ngâm với metanol

- Cất thu hồi metanol

- Phân bố trong nước

- Chiết lần lượt với etylaxetat, butanol

Chất 1-4

chính Phân đoạn 3 tiếp tục phân tách bằng sắc kí cột trên silica gel với hệ dung môi rửa giải là hexan:axeton (15:1) thu được hợp chất 1 (302 mg) và hợp chất 2 (135 mg) Phân đoạn 6 sắc kí lại nhiều lần thu với hệ dung môi hexan:axeton (9:1) được hợp chất 4 (31 mg)

Cặn butanol (47g) được tách trên sắc kí cột silica gel với hệ dung môi giải hấp là clorofoc:metanol:nước (40:1:0,05; 30:1:0,05; 20:1:0,05; 10:1:0,05; 4:1:0,05) thu được 10 phân đoạn chính Phân đoạn 5 tiếp tục phân tách bằng sắc kí cột trên silica gel với hệ dung môi rửa giải là clorofoc:metanol: nước (9:1:0,05) thu được hợp chất 3 (235 mg)

2.3 Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất đã phân lập

Hợp chất 1: Tinh thể hình kim, đ.n.c.: 135-136oC IR (KBr) max (cm-1):

3400, 3025, 1410, 1250, 820, 690 EI-MS m/z: 414 [M]+ (20), 413 (41), 398 (28), 397(100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11) Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) ( ppm): 5,31(1H, m, H-6); 3,51 (1H,

m, H-3); 1,01 (3H, s, 19-CH3); 0,92 (3H, d, J= 6,2 Hz, 21-CH3); 0,84 (3H, d,

J = 7,0 Hz, 29-CH3); 0,83 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-26); 0,81 (3H, d, J =6,5 Hz, 27-CH3); 0,68 (3H, s, 18-CH3) Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): 140,8 (C-5); 121,7 (C-6); 71,8 (C-3); 56,8 (C-14); 56,1 (C-17); 50,2 (C-9); 45,9 (C-24); 42,3 (C-4, C-13); 39,8 (C-12); 37,3 (C-1); 36,5 (C-10); 36,2 (C-20); 33,9 (C-22); 31,9 (C-7); 31,7 (C-8); 29,7 (C-2); 29,2 (C-25); 28,3 (C-16); 26,1 (C-23); 24,3 (C-15); 23,1 (C-28); 21,1 (C-11); 19,8 (C-19); 19,4 (C-27); 19,1 (C-26); 18,8 (C-21); 11,9 (C-18, C-29)

Hợp chất 2: Tinh thể hình kim, đ.n.c: 155o-157oC IR (KBr) max (cm-1):

3400, 3025, 1410, 1250, 820, 690 Phổ EI-MS m/z: 412 [M+] (7), 300 (7), 255 (11), 231 (4), 213 (8), 173 (7), 145 (20), 133 (20), 83 (49,3), 55 (100), 43 (90) Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) ( ppm): 5,35 (1H, m, H-6), 5,14 (1H,

m, J=12,0, 3,0 Hz, H-22), 5,03 (1H, dd, J =12,0, 3,0Hz, H-23), 3,28 (1H, m, H-3), 0,90 (3H, d, J=6,5 Hz, 21-CH3), 0,82 (3H, d, J=6,6 Hz, 26-CH3), 0,83 (3H, t, J = 7,0 Hz, 29-CH3), 0,80 (3H, d, J=6,5 Hz, 27-CH3), 0,79 (3H, s, 19-

CH3) và 0,64 (3H, s, 18-CH3) Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): 140,8 (C-5); 138,3 (C-22); 129,3 (C-23); 121,7 (C-6); 71,8 (C-3); 56,9 (C-14); 56,0 (C-17); 51,3 (C-9); 50,2 (C-24); 42,3 (C-4, C-13); 40,5 (C-20); 39,7 (C-12); 36,5 (C-10); 37,3 (C-1); 31,9 (C-7, C-8); 31,7 (C-2, C-25); 28,9 (C-16); 25,4 (C-28); 24,4 (C-15); 21,2 (C-27); 21,1 (C-11); 19,4 ( C-19); 19,0 (C-26); 12,2 (C-21); 12,0 (C-29); 11,9 (C-18)

Hợp chất 3: Chất rắn vô định hình, đ.n.c: 283-285°C IR (KBr) max (cm

-1): 3400, 3050, 1650 và 815 EI-MS m/z 396 [M-glc]+ 1H-NMR (500Hz DMSO-d6) ( ppm): 5,32 (1H, d, J=3,0, H-6); 2,40 (1H, s, H-4b); 2,20 (1H, q, J= 2,5, 13,5Hz, H-4a); 0,98 (3H, s, 21-CH3); 0,91 (3H, d, J=6,5Hz, 27-CH3); 0,67 (3H, s, 18-CH3) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6) (ppm): 140,4 (C-5), 121,1 (C-6); 100,8 (C-1’); 77,0 (C-3); 76,7 (C-5’); 76,6 (C-3’); 73,4 (C-2’); 70,1 (C-4’); 61,1 (C-6’); 56,2 (C-14); 55,4 (C-17); 49,6 (C-9); 45,1 (C-24); 41,8 (C-13); 40,1 (C-4); 40,0 (C-12); 38,2 (C-1); 36,8 (C-20); 36,2 (C-10); 35,4 (C-22); 33,3 (C-7); 31,4 (C-8); 31,3 (C-2); 29,2 (C-23); 28,7 (C-16); 27,7 (C-25); 25,5 (C-15); 23,8 (C-28); 22,6 (C-11); 20,6 (C-27); 19,7 (C-19); 19,0 (C-21); 18,9 (C-26); 11,7 (C-18, C-29)

Hợp chất 4: Tinh thể hình kim, đ.n.c: 167-168oC EI-MS m/z 428 [M]+ Phổ 1H-NMR (500Hz CDCl3) ( ppm): 5,80 (1H, br s, H-4); 4,34 (1H, br s, H-6b); 1,38 (3H, s, 21-CH3); 0,92 (3H, d, J=6,5 Hz, 26-CH3); 0,85 (3H, d, J=2,0 Hz, 19-CH3); 0,82 (3H, d, J= 3,5 Hz, 29-CH3); 0,81 (3H, s, 61-CH3); 0,74 (3H, s, 18-CH3); Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): 200,4 (C-3); 168,5 (C-5); 126,3 (C-4); 73,3 (C-6b); 56,1 (C-17); 55,9 (C-14); 53,7 (C-9); 45,9 (C-24); 42,6 (C-13); 39,7 (C-12); 38,6 (C-7); 38,0 (C-10); 37,1 (C-1);

36,1 (C-20); 34,3 (C-2); 34,0 (C-22); 29,8 (C-8); 29,2 (C-25); 28,2 (C-16); 26,2 (C- 23); 24,2 (C-15); 23,1 (C-28); 21,0 (C-11); 19,8 (C-26); 19,5 (C-19); 19,1 (C-27); 18,8 (C-21); 12,0 (C-18, C-29)