Các hợp chất tritecpenoit từ cây bọt ếch (Glochidion obliquum Decne.)

Cây bọt ếch (Glochidion obliquum Decne.) là loài cây phổ biến ở các nước Việt Nam, Trung Quốc và được dùng làm thuốc chữa bệnh, đồ gỗ ….nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học. Đã tiến hành sử dụng các phương pháp phổ hiện đại: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EIMS), phổ khối lượng phun mù (ESI MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR, 13C NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY để xác định cấu trúc các hợp chất tách được. Các kết quả phổ đã cho phép khẳng định chất 85 là taraxerol, 86 là axit rotundic, 87 là pedunculoside.

Những đặc thù về môi trờng nh vậy đã tạo cho nớc tamột hệ thực vật phong phú và đa dạng Theo số liệu thống

kê gần đây hệ thực vật Việt Nam có trên 10.000 loài [7],trong đó có khoảng 3.200 loài cây đợc sử dụng trong y họcdân tộc và 600 loài cây cho tinh dầu [3] Đây là nguồn tàinguyên thiên nhiên rất quý báu của đất nớc

Tác dụng chữa bệnh của cây cỏ chính là do các hợp

chất tự nhiên có chứa trong chúng quyết định Nói đếnnguồn tài nguyên thực vật làm thuốc phong phú trên đất nớc

ta cũng nói đến khả năng sinh tổng hợp, chuyển hoá vàtích luỹ các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học củanguồn gen thực vật

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu cây bọt ếch

(Glochidion obliquum) là loài cây phổ biến ở các nớc Việt

Nam, Trung Quốc và đợc dùng làm thuốc chữa bệnh, đồgỗ… nhng cha đợc nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học

Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và xác

định cấu trúc một số hợp chất từ cây bọt ếch

(Glochidion obliquum) ở Nghệ An” từ đó góp phần xác

định thành phần hoá học của cây bọt ếch và tìm ranguồn nguyên liệu cho ngành dợc liệu, hơng liệu

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đợchỗn hợp các hợp chất của cây cây bọt ếch

- Sử dụng các phơng pháp sắc ký và kết tinh phân

đoạn để phân lập các hợp chất

- Sử dụng các phơng pháp phổ để xác định cấu trúccác hợp chất thu đợc

3 Đối tợng nghiên cứu

Đối tợng nghiên cứu là cây bọt ếch (Glochidion obliquum) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) ở Việt Nam.

Chơng 1 Tổng quan

1.1 Chi Glochidion

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân loại.

Glochidion là một chi tơng đối lớn thuộc họ Thầu dầu

(Euphorbiaceae), với gần 300 loài phân bố từ Madagascar

đến các đảo thuộc Thái Bình Dơng và phân bố chủ yếu ởvùng nhiệt đới châu á Hơn 20 loài thuộc chi này đợc tìmthấy ở Việt Nam và đợc dùng làm thuốc chữa bệnh cúm, lỵ,sốt rét, thấp khớp và khó tiêu [1], [2]

Bảng 1.1: Phân bố các loài thuộc chi Glochidion ở Việt Nam

Đà Nẵng, Khánh Hòa, NinhThuận

2 Glochidion

arnottianum

Muell.-Sóc mền Ninh Bình, ấn Độ, Trung

Quốc

3 Glochidion

assamicum

(Muell.-Arg.) Hook.f

Sóc assam Quảng Ninh, ấn Độ,

Mianma, Thái Lan

4 Glochidion

bachmaensis Thin

Bọt ếch cuống

Đồng, Đồng Nai ấn Độ,Himalaya, Mianma, Lào,Campuchia, Thái Lan

8 Glochidion

eriocarpun Champ

Bọt ếch lông

Lào Cai, Quảng Ninh,Tuyên Quang, Ninh Bình,Kon Tum Mianma, TháiLan, đông ấn Độ, TrungQuốc, Lào, Campuchia,Nhật Bản

-10 Glochidion gamblei

Hook.f

Sóc gamblei

Cao Bằng, Lạng Sơn, HòaBình, Hà Tây, Ninh

B×nh, Thanh Hãa Ên §é,Th¸i Lan

11 Glochidion

glomerulatum

(Miq.) Boerl

Sãc chôm Kh¾p ViÖt Nam Ên §é,

Mianma, Th¸i Lan,Malayxia, Indonexia

13 Glochidion

hongkongensis

Muell.-Arg

Sãc hång k«ng

Th¸i Nguyªn, L©m §ång.Lµo, Campuchia, Th¸i Lan,

16 Glochidion Bät Õch lng L¹ng S¬n, B¾c C¹n, Th¸i

lutescens Blume bạc Nguyên, Phú Thọ, Vĩnh

Phúc, Hòa Bình, NinhBình, Thanh Hóa, ThừaThiên-Huế, Đà Nẵng,Khánh Hòa, Ninh Thuận.Thái Lan, Mianma, Trung

Đà Nẵng, Quảng Nam,Kon Tum, Gia Lai, KhánhHòa, Ninh Thuận

Sóc đỏ Khắp Việt Nam ấn Độ,

Mianma, Lào, Campuchia,Thái Lan, Malayxia,Indonexia, Philippin

23 Glochidion

talmyanum Beille

Bät Õch nam

26 Glochidion

zeylanicum A Juss.

Sãc tÝch lan

Cao B»ng, L¹ng S¬n, HµNam, Ninh B×nh, B×nh D-

¬ng Ên §é, Himalaya, XriLanka, Lµo, Malayxia

1.1.2 Thµnh phÇn ho¸ häc

Nh÷ng loµi nµy chøa c¸c lo¹i hîp chÊt bao gåmsesquiterpenoit [13], [14], triterpenoit, [15-19], steroit [20],flavanoit [21], alkaloidal glucosit [22] vµ lignan [23], [24]

O O

H

O H

O

O H

O

O

O

OGlc (1) Glochidiolide (2)

Phyllanthurinolactone

O

OGlc

O O

OGlc

O O

OGlc

(3) Glochidionolactone A (4) Glochidionolactone B (5)

Glochidionolactone C

O O

OGlc-O CO

OH OH

O H

O O

OH OH

O H

O O

OGlc

O N

H2

(10) Isoglochidiolide (11) Acumiaminoside

O Glc(OAc)4

O N

H2

O OH

O N

H2

(12) Acuminaminoside tetraacetate (13)Acuminaminoside

pentaacetate

O Glc(OAc)4

O AcHN

O

CH2COOH

H2C O

(16) 2-O-β -glucopyranoside, (17)

Glochidacuminoside B

2-hydroxyphenylacetic axit

O

OH

OH OH

OCOCH2

H2C O

(18) Glochidacuminoside C

O OH

O

H

OH OH

H

(22) Glochidone (23) lup-20(29)-en-3β ,23-diol

OH OCH

OAc OCH

OH OCH

OH OCH

OCH

OCH 3

3

OH

O H

OGlc OCH

OCH

OCH 3

3

3

(28) Glochiflavanoside B (29) Glochiflavanoside C

3

3

OH O

OH

CH2OH

OH O

(32) Glochidionionoside A (33) Glochidionionol A

OH

CH2OGlc

H O

OH

CH2OH

H O

(34) Glochidionionoside B (35)

Glochidionionol B

CH2OGlc

H O

OH

CH2OH

H O

OH

(36) Glochidionionoside C (37) Glochidionionol C

OH GlcO

O H

OH O

H

O H

(38) Glochidionionoside D (39) Aglycol

glochidionionoside D

OH O

O H

O H

OGlc O

C

H

O H

(46) Glochinin A

O H O H O H

O

CH2O

O H O

O

O C

OH

OH

(47) Glochiin M1

O H O H O H

O

CH2O

O H

O

O C

O H O

O

O C

OH

O

OH

OH OH O

O

OH

OH OH OH

C O O

OH OH

O H

C

(49) Glochiin C1

O OH O

H

O

H

O O

H

O O

OH

O

H

O O

O

OH

(50) Glochicoccinoside A

O OH O

H

O

H

O O

O

O O H

OH OH

O O

O

OH

(51) Glochicoccinoside B

(56) Glochidiol (57) Glochidonol

O

H OH

O

O

(58) 22α-hydroxystictan-3-one (59)

stictane-3,22-dione

OH

(62) Megastigmane glucoside B (63) Kiwiionoside

OH OGlc

O C

(66) Aglycon tetraaxetat

O C

AcO

CH2OAc

OAc

CH2OAc OAc

(67)Aglycone (68) Pentaaxetat aglycone

O

CH2Me OMe OMe

H

HOCH2

OH O

OOH

(70)

O O

H

HOCH2

O H

O H

OH

CH2OH OC O

O H

O O

H HOCH2

O

O GlcOH

OCHOCH

1 2 3 4

5

6 7 8

9

1' 2' 3' 4'

5' 6' 7'

8' 9'

3 3

OXyl

O H

O

OH

OCH OCH

3 3

O

O

O H

H

H

O H

B

C

1 2 3 4 6

7 8 9

O H

O O

H

H O

H O

COOCH3

1 3

5'

O

O O

O H

O O

H

H O

H O

COOCH3

1 3

5'

7

11 1'

2' 3' 7'

(77) Glochicoccin B (78) Glochicoccin C

O O

O

H

O O

H

H O

H O

COOH

1 3 5'

O

O O

O O

H

H O

H O

COOH

1 3

(79) Glochicoccin D (80)

Phyllaemblic acid

1.1.3 Sử dụng

Hơn 20 loài thuộc chi này đợc tìm thấy ở Việt Nam và

đợc dùng làm thuốc chữa bệnh cúm, lỵ, sốt rét, thấp khớp vàkhó tiêu [1], [2]

1.2 Cây bọt ếch (Glochidion obliquum)

ít đồng trởng Quả tháng 12

H×nh 1.1: ¶nh c©y bät Õch

N¬i sèng vµ thu h¸i: C©y mäc ë b¾c ViÖt Nam (VÜnhPhó, L¹ng S¬n) vµ ë Nam ViÖt Nam Cßn ph©n bèCampuchia, Ên §é, Malaixia, Indonexia [1,3]

1.2.2 Thµnh phÇn ho¸ häc

Cha cã c«ng tr×nh nµo nghiªn cøu vÒ thµnh phÇn ho¸

häc cña c©y nµy.

1.2.3 Sö dông

Lá, vò ra ngâm vào nước dùng trị ghẻ

để thu đợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đợc nêu

ở phần thực nghiệm

2.2 Phơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các chất

Để phân tích và phân tách cũng nh phân lập các hợpchất, sẽ sử dụng các phơng pháp sắc ký nh:

- Sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Sắc ký cột thờng (CC)

- Sắc ký cột nhanh (FC)

- Các phơng pháp kết tinh phân đoạn

2.3 Phơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc các hợp chất đợc khảo sát nhờ sự kết hợp cácphơng pháp phổ:

3.1.2 Các phơng pháp sắc ký

- Sắc ký cột thờng, sử dụng silicagel cỡ hạt 400/mesh

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích đợc tiến hành trênbản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày0,2 mm

Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm

- Các phơng pháp kết tinh phân đoạn

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boetius

- Phổ tử ngoại UV đợc ghi trên máy Aigilent

- Phổ hồng ngoại IR đợc ghi trên máy Bruker, dạng viênnén KBr

- Phổ khối lợng EI-MS đợc ghi trên máy

MS-Engine-5989-HP - Phổ 1H-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz Phổ 13NMR, DEPT và phổ 2 chiều HMBC, HSQC ghi trên máy Bruker125MHz (Viện Hoá học-Viện Khoa học và Công nghệ ViệtNam)

C-3.2 Nghiên cứu các hợp chất từ cây bọt ếch

3.2.1 Phân lập các hợp chất

Mẫu lá cây bọt ếch (Gochidion obliquum) đợc thu hái ở

Nghệ An vào tháng 5/2008 đợc TS Trần Huy Thái, Viện Sinhthaí và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệViệt Nam định danh, tiêu bản đợc lu giữ tại khoa Sinh, Tr-ờng Đại học Vinh.Mẫu lá cây bọt ếch phơi khô (6,3 kg) đợcxay nhỏ và chiết với metanol (20 L x 3) ở nhiệt độ phòng,cất thu hồi dung môi dới áp suất giảm thu đợc cao màu nâu

(375 g) Dịch chiết đợc chiết lần lợt với n-hexan, etyl axetat,

và n-butanol, thu đợc các cao n-hexan (11g), etyl axetat (129

g), n-butanol (143g), và phần tan trong nớc (21g)

Cao etyl axetat đợc tách bằng sắc ký cột trên silicagel

với dung môi rửa giải n-hexan và tăng nồng độ của axeton

thu đợc 8 phân đoạn chính Phân đoạn 2 đợc sắc ký lại

cột trên silicagel với hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton

(19:1) thu đợc chất 84 (783 mg)

Cao metanol(375g)

- Ngõm với metanol -Cất thu hồi metanol

- Phõn bố trong nước

- Chiết lần lượt với n- hexan, etylaxetat, butanol

Lá bọt ếch(6,3kg)

Sơ đồ 3.1: Phõn lập hợp chất trong lỏ cõy bọt ếch

3.2.2 Dữ kiện vật lý của các hợp chất

Hợp chất 81: Chất bột màu trắng, đ.n.c 193-194oC;

UVλmaxEtOHnm (logε): 256 (4,14), 267 (4,11), 293 (4,02), 346

(3,83); EI-MS m/z: 372 [M]+; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD)

δ(ppm): 6,72 (2H, s, H-3, 5), 6,48 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7), 6,35 (1H, dt, J = 11,5, 5,0 Hz, H-8), 4,91 (1H, d, J = 7,5 Hz, H- 1’), 4,30 (2H, dd, J =11,5, 5,5 Hz, H-9), 3,76 (6H, s, 2xCH3O),

3,01-3,73 (6H, H-2’, 3’, 4’, 5’, 6’); 13C-NMR (125 MHz, CD3OD)

δ(ppm): 152,7 (C-2, 6), 133,9 (C-1), 132,7 (C-4), 130,2 (C-7),128,5 (C-8), 104,5 (C-1’), 102,6 (C-3, 5), 77,2 (C-3’), 76,6 (C-5’), 74,2 (C-2’), 70,0 (C-4’), 61,5 (C-9), 62,8 (C-6’), 57,1(2xCH3O)

Cao butanol(143g)

Dung dịchnước

Cao

n-hexan

(11g)

- Sắc ký cột cloroform : metanol

Cao etyl axetat(129g)

Chất 84

- Sắc ký cột cloroform : metanol Chất 81

Chất 82Chất 83, 85

Hợp chất 82: Tinh thể hình kim không màu, đ.n.c.

190-192oC; UVλmaxEtOHnm (logε): 275, 219; IRνmaxKBrcm-1: 3396,

1610; EI-MS m/z: 328 [M]+; 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6)

δ(ppm): 6,98 (1H, s, H-6), 4,97 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-1’), 3,16-4,00 (6H, m, H-2’, 3’, 4’, 5’, 6’), 3,76 (3H, s); 13C-NMR

(DMSO-d6, 125MHz) δ (ppm): 163,4 (C-7), 150,9 (C-3), 148,1(C-5), 140,6 (C-4), 118,1 (C-1), 116,0 (C-2), 109,5 (C-6), 81,7(C-5’), 79,8 (C-3’), 73,7 (C-2’), 70,7 (C-4’), 72,1 (C-1’), 59,8(OCH3)

Hợp chất 83: Chất rắn vô định hình màu vàng, đ.n.c.

269-270oC; UVλmaxMeOHnm (logε): 270 (3,89), 334 (3,84);

IRνmaxKBrcm-1: 3390, 1612, 1529, 1092, 990; EI-MS m/z: 432

[M]+; 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 13,16 (1H, s, OH), 10,82 (1H, s, 7-OH), 10,34 (1H, s, 4’-OH), 8,02 (2H, d, J

5-= 9,0 Hz, H-2’, 6’), 6,90 (2H, J 5-= 8,1 Hz, H-3’, 5’), 6,77 (1H, s, H-3), 6,27 (1H, s, H-6), 4,95 (1H, d, J=7,2 Hz, H-1”) và 3,23- 4,95 (6H, m, H-2”-6”); 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6) δ(ppm):182,1 (C-4), 163,9 (C-2), 162,5 (C-7), 161,1 (C-5), 160,4 (C-4’), 160,0 (C-9), 128,9 (C-2’, 6’), 121,6 (C-1’), 115,8 (C-3’,5’), 104,6 (C-8), 104,0 (C-10), 102,4 (C-2), 98,1 (C-6), 81,8(C-5”), 78,7 (C-3”), 73,4 (C-1”), 70,8 (C-2”), 70,5 (C-4”), 61,3(C-6”)

Hợp chất 84: Tinh thể hình kim, đ.n.c.136-138oC;

IRνmaxKBrcm-1: 3400, 3025, 1410, 1250, 690 và 820; EI-MS m/z

(%): 414 (M+, C29H50O, 20), 413(41), 398 (28), 397(100),395(32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6),

139 (11); 1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ(ppm): 5,31(1H, m, H-6), 3,51 (1H, m, H-3), 1,01 (3H, s, 19-CH3), 0,92 (3H, d, J = 6,2

Hz, 21-CH3), 0,84 (3H, d, J = 7,0 Hz, 29-CH3), 0,83 (3H, d, J =

6,5 Hz, H-26), 0,81 (3H, d, J =6,5 Hz, 27-CH3), 0,68 (3H, s,

18-CH3); 13C-NMR (125MHz, CDCl3) δ(ppm): 140,8 (C-5), 121,7(C-6), 71,8 (C-3), 56,8 (C-14), 56,1 (C-17), 50,2 (C-9), 45,9(C-24), 42,3 (C-4), 42,3 (C-13), 42,3 (C-4), 39,8 (C-12), 37,3(C-1), 36,5 (C-10), 36,2 (C- 20), 34,0 (C-8), 32,0 (C-7), 31,7(C-2), 29,2 (C-25), 28,3 (C-16), 26,1 (C-23), 24,3 (C-15), 23,1(C-28), 21,1 (C-11), 19, 8 (C-26), 19,4 (C-19), 19,1 (C-27),

18,8 (C-21), 12,0 (C-29) và 11,9 (C-18).

Hợp chất 85: Chất rắn vô định hình, đ.n.c

273-275oC; IRνmaxKBrcm-1:3400, 3050, 1650 và 815; EI-MS m/z (%):

396 [M+-C6H12O6] (9), 273 (2), 255 (9), 185 (5), 161(15), 145(25), 133 (21), 105 (42), 91 (46), 81 (51), 69 (100); 1H-NMR

(500MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 5,38 (1H, m, H-6), 5,03 (1H, d, J

= 7,0 Hz, 1’), 4,05-4,60 (6H, m, 2’- 6’), 3,99 (1H, m, 3), 3,98 (1H, m, H-5’), 1,00 (3H, d, J = 6,5 Hz, 21-CH3), 0,94 (3H, s, 19-CH3), 0,90 (3H, t, J = 7,0 Hz, 29-CH3), 0,89 (3H, s,

H-26-CH3), 0,89 (3H, s, 27-CH3), 0,67 (3H, s, 18-CH3); 13C-NMR

(125MHz, DMSO-d6) δ(ppm): 140,6 (C-5), 121,3 (C-6), 100,9(C-1’), 77,1 (C-3), 76,8 (C-5’), 76,8 (C-3), 73,6 (C-2), 70,2 (C-4), 61,2 (C-6’), 56,3 (C-14), 55,5 (C-17), 50,7 (C-9), 49,7 (C-24), 45,2 (C-13), 38,4 (C-4), 36,9 (C-12), 36,3 (C-1), 35,6 (C-10), 33,4 (C-20), 31,5 (C-22), 31,5 (C-8), 29,4 (C-16), 28,8 (C-23), 27,9 (C-2), 25,5 (C-25), 24,0 (C-15), 22,7 (C-28), 21,0 (C-

11), 20,7 (C- 27), 19,8 (C-19), 19,0 (C-26), 12,2 (C-29) và11,9 (C-18).

Chơng 4 Kết quả và thảo luận

4.1 Phân lập một số hợp chất từ cây bọt ếch

(Glochidion obliquum)

Mẫu lá cây bọt ếch (Glochidion obliquum) đợc chiết

bằng metanol Dịch chiết đợc cất thu hồi dung môi, rồi sau

đó chiết lần lợt với hexan, cloroform, n-butanol thu đợc cácdịch chiết tơng ứng Dùng sắc ký cột và sắc ký nhanh thu

đợc các chất tinh khiết Xác định cấu trúc các hợp chất nàybằng các phơng pháp phổ

Từ dịch chiết metanol của lá cây bọt ếch (Glochidion obliquum), bằng các phơng pháp sắc ký cột trên silicagel đã

phân lập đợc 5 hợp chất 81, 82, 83 và xác định các hợp

chất này bằng các phơng pháp phổ

4.2 Xác định cấu trúc

4.2.1 Hợp chất 81

Tinh thể hỡnh kim màu trắng, đ.n.c 281-283OC

Phổ tử ngoại (UV) của hợp chất 156 cho hấp thụ cực đại tại 240, 258,

319, 366 nm, chứng tỏ hợp chất 156 cú vũng thơm.

Phổ khối lượng phun mự electron (ESI-MS) negtive [M+H]+ cho pic

427, positive cho pic [M-H]+ 425, hợp chất 156 cú khối lượng phõn tử 426,

ứng với cụng thức C30H50O

Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H-NMR cho thấy một tớn hiệu singletsắc nột của một proton của nhúm hydroxy hỡnh thành liờn kết cầu hydro nộiphõn tử với nhúm cacbonyl ở δ 13,74ppm

Từ các số liệu phổ UV, MS, NMR và so sánh với tài liệu [19], hợp

chất 156 được xác định là taraxerol Hợp chất này được phân lập từ cây

Taraxacum officinale và cũng tìm thấy ở các loài Alnus spp., Skimmia japonica, Rhododendron spp., Euphorbia spp Hợp chất taraxerol có hoạt

tính kháng vi sinh vật, chống viêm và chống khối u [11]

27 12 11 9 10

25 26

28 2

29 30

24 23

Hình 3.2: Phổ IR của hợp chất 156

Hình 3.3: Phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS) positive

Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của hợp chất 156

Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của hợp chất 156

Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của hợp chất 156

Hình 3.7: Phổ 13C-NMR của hợp chất 156

Hình 3.8: Phổ DEPT của hợp chất 156

Hình 3.9: Phổ DEPT của hợp chất 156

Hình 3.10: Phổ HMBC của hợp chất 156

Hình 3.11: Phổ HMBC của hợp chất 156

Hình 3.12: Phổ HMBC của hợp chất 156

Hình 3.13: Phổ HMBC của hợp chất 156

Hình 3.14: Phổ HMBC của hợp chất 156

Hình 3.15: Phổ HSQC của hợp chất 156

Hình 3.16: Phổ HSQC của hợp chất 156