Nghiên cứu tình trạng nhiễm norovirus ở trẻ khỏe mạnh dưới 3 tuổi tại một trường mầm non ở hà nam năm học 2014 2015

ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm dạ dày ruột cấp VDDRC hay còn gọi là tiêu chảy ở trẻ em là một vấn đề sức khỏe đang được quan tâm trên toàn thế giới, đặc biệt thu hút được rất nhiều chú ý của các n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

-*** -

Đ T V ệt H n NGHIÊN CỨU

- 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

-*** -

Đ T V ệt H n

- 2015

Chuyên ngành : Vi sinh v t học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

N ờ ớn dẫn k oa ọc:

PGS.TS N uyễn Vân Tran PGS.TS Bù T V ệt Hà

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vân Trang,

người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn PGS TS Bùi Thị Việt Hà cùng các

thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy và dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.s Vũ Thị Bích Hậu,CN.Nguyễn

Phương Anh, CN.Nguyễn Thanh Tâm làm việc tại Phòng Miễn dịch Vắc xin –

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt

quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ động viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học viên

Đỗ Thị Việt Hương

LRC Long Control Region Vùng kiểm soát dài của gen FUT Enzyme fucosyltransferase

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Probe - Đầu dò gắn huỳnh quang

Primer

ORF Open Reading Frame Khung đọc mở của gen

ORI Origin Vị trí khởi đầu tái bản

OD Optical density M t độ quang của mẫu ADN URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa của gen

Thermus aquaticus DNA

polymerase Enzyme phiên mã ngược WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

RV Rotavirus

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Giới thiệu chung về Viêm dạ dày ruột cấp ở trẻ em 3

1.1.1.Định nghĩa bệnh VDDRC 3

1.1.2.Phân loại 3

1.1.3.Tình hình bệnh VDDRC trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.4.Dịch tễ học bệnh VDDRC 4

1.1.5.Các tác nhân gây VDDRC 7

1.2.Giới thiệu chung về NoV 7

1.2.1.Bệnh VDDRC do nhiễm NoV 7

1.2.2.Phân loại, hình thái và tổ chức bộ gen của NoV 8

1.2.3.Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và sinh lý bệnh 12

1.2.4.Chẩn đoán 13

1.2.5.Phương pháp real time RT-PCR (Real time Reverse transcription polymerase chain reaction) 16

1.3.Tình hình nghiên cứu NoV trong và ngoài nước 16

1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

1.3.2.Tình hình nghiên cứu trong nước 17

1.4.Kiểu gen FUT-2 ở người và tính cảm nhiễm NoV 19

1.5 Kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) và khả năng cảm nhiễm của NoV 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1.Đối tượng nghiên cứu 23

2.2.Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

2.3.V t liệu 24

2.3.1 Máy móc, dụng cụ 24

2.3.2 Sinh phẩm 24

2.4.Phương pháp nghiên cứu 25

2.4.1 Thu th p bệnh phẩm 25

2.4.2 Kỹ thu t real time-RT PCR phát hiện ARN của NoV 26

2.4.3 Kỹ thu t RT PCR khuếch đại đoạn gen vùng C của NoV 28

2.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen FUT-2 31

2.4.5 Xác định kiểu hình HBGA (ABO và Lewis) trong mẫu nước bọt 33

2.5.Xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Tỷ lệ lưu hành của NoV ở trẻ không triệu chứng tại trường mầm non ở Hà Nam 36

3.2.Biến động genotype của NoV lưu hành ở trẻ không triệu chứng tại trường mầm non ở Hà Nam 39

3.3.Mối liên hệ giữa tính cảm nhiễm NoV với kiểu gen của FUT-2 47

3.3.1 Tần số SNP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên gen FUT-2 47

3.3.2 Mối quan hệ giữa alen đồng hợp lặn A385T và sự kháng nhiễm NoV 52 3.4 Mối tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức và khả năng cảm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non ở Hà Nam 53

3.4.1 Kiểu hình HBGA ở trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non Hà Nam 53

3.4.2 Mối liên quan giữa kiểu hình của kháng nguyên HBGA với khả năng cảm nhiễm NoV 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần kỹ thu t Realtime RT-PCR đơn cặp primer và probe phát hiện

NoV genotype G1 27

Bảng 2.2 Thành phần kỹ thu t Realtime RT-PCR đơn cặp primer và probe phát hiện NoV genotype G2 28

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-PCR đơn cặp primer đối với G1 29

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng RT-PCR đơn cặp primer đối với G2 29

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen FUT-2 32

Bảng 3.1 Đặc điểm chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam 37

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh 40

Bảng 3.3 Các genotypes NoV phát hiện ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam (T3/2014 - T5/2015) 41

Bảng 3.4 Đặc điểm genotypes NoV ở trẻ khỏe mạnh tại một số nhà trẻ ở Hà Nam vào một số tháng khác nhau 45

Bảng 3.5 Tần số các SNP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên gen FUT-2 ở trẻ tại 01 trường mẫu giáo tại Hà Nam 50

Bảng 3.6 Các tần số đột biết ở FUT-s ở các quần thể Châu Á láng giềngvà Việt Nam 51

Bảng 3.7 Phân bố kiểu gen 385 trong 85 người có mẫu phân được xét nghiệm lây nhiễm NoV 52

Bảng 3.8 Phân bố kiểu hình kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis a, b ở trẻ tại trường mầm non ở Hà Nam (n=119) 54

Bảng 3.9 Phân bố kiểu hình kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis x, y ở trẻ tai trường mầm non ở Hà Nam (n=119) 54

Bảng 3.10 Tổ hợp kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis ab và xy ở trẻ tại trường mầm non ở Hà Nam (n=119) 54

Bảng 3.11 Tỷ lệ kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức ABO (n=119) 56

Bảng 3.12 Tần suất kháng nguyên Lewis theo tình trong nhiễm NoV (n=119) 57 Bảng 3.13 Mối liên quan giữa kiểu hình ABO và tình trạng đơn nhiễm NoV (n=119) 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 NoV dưới kính hiển vi điện tử 8

Hình 1.2 Biến đổi chủng NoV ở miền Bắc nước ta từ 2010-2013 10

Hình 1.3 Phân bố genotype khác nhau của NoV ở miền Bắc và miền Nam nước ta trong năm 2010 10

Hình 1.4 Cấu trúc của NoV 11

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gen của NoV 11

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các loại mẫu thu th p sử dụng cho nghiên cứu 25

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu 35

Hình 3.2 Tỷ lệ lưu hành genotypes NoV ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam 42

Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loài dựa trên đoạn gen vùng capsid của các chủng NoV phát hiện trong nghiên cứu này 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm dạ dày ruột cấp (VDDRC) hay còn gọi là tiêu chảy ở trẻ em là một vấn đề sức khỏe đang được quan tâm trên toàn thế giới, đặc biệt thu hút được rất nhiều chú ý của các nhà khoa học, y học bởi đó là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh t t và tử vong cho trẻ em dưới 5 tuổi ở các nước đang phát triển Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) và nhiều công trình nghiên cứu điều tra ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ La Tinh cho thấy, ở các nước đang phát triển hàng năm có trên 750 triệu trường hợp VDDRC, trong đó 500 triệu là trẻ em dưới 5 tuổi Tử vong do VDDRC hàng năm lên tới 3-6 triệu trẻ em, có 80% trong số này là trẻ em dưới 2 tuổi Ở những nước đang phát triển như nước ta, đây là bệnh có tần suất mắc nhiều thứ 2 (sau các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp) Tử vong do VDDRC thường không dược đánh giá đúng và kịp thời, tuy nhiên ước tính hàng năm có 6000-8000 trường hợp tử vong ở nước ta do VDDRC Tác nhân gây VDDRC khá đa dạng, các báo cáo cho thấy có ít nhất 26 loại tác nhân khác nhau có thể gây ra bệnh VDDRC ở trẻ em, trong đó có 60-70% của các trường hợp nguyên nhân là do các virus 7 nhóm virus thường gây VDDRC là rotavirus, NoV, sapovirus, adenovirus, astrovirus, parechovirus và aichivirus được coi là các tác nhân thường gặp của bệnh viêm dạ dày ruột cấp ở người NoV là tác nhân quan trọng nhất gây ra các vụ dịch VDDRC không do vi khuẩn ở người lớn và trẻ em Theo các báo cáo hàng năm trên toàn thế giới, có đến hơn 267 triệu trường hợp nhiễm do NoV NoV còn có khả năng gây nhiễm nhưng không có triệu chứng

NoV thuộc họ Caliciviridae là virus ARN sợi đơn, dương có khả năng lây

nhiễm cho người và động v t NoV khá đa dạng về kiểu gen và tính kháng nguyên, bao gồm 5 nhóm gen (từ GI đến GV) và 35 typ gen đã được phát hiện dựa vào trình

tự đoạn gen mã hóa protein VP1 NoV ở người thuộc GI, GII và GIV nhưng hầu hết các chủng gây bệnh ở người đều thuộc nhóm gen GI và GII Các virus thuộc họ

Caliviridae có khả năng lây nhiễm người ở mọi lứa tuổi và thường liên quan đến

các trường hợp tiêu chảy cấp lẻ tẻ và vụ dich tiêu chảy cấp trên toàn thế giới Các

vụ dịch này thường xảy ra ở điều kiện bán trú (semi-enclosed) như trường học, bệnh

viện, nhà dưỡng lão, nhà trẻ Ở nước ta, nhiều nghiên cứu giám sát bệnh tiêu chảy ở trẻ em dưới 3 tuổi tại bệnh viện cho thấy RV và NoV là hai tác nhân quan trọng nhất NoV không những gây tiêu chảy cấp cho trẻ, mà còn có khả năng nhiễm không triệu chứng, là tác nhân tiềm ẩn gây ra các vụ dịch và là nguồn lây lan mạnh trong cộng đồng đặc biệt ở nhà trẻ, lớp học

Mức độ cảm ứng của cơ thể đối với NoV có liên quan đến các trạng thái của gen FUT-2, mã hóa cho enzym fucosyltransferase α(1,2) để điều hòa sự biểu hiện của kháng nguyên H Đã có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ giữa gen FUT- 2 và

sự nhiễm virus Nghiên cứu mới nhất trên gen tiết (secretor gene) ở các nhóm quần thể người khác nhau đã xác định được một vài đột biến của các gen này có thể làm mất hoặc giảm sự hoạt động của enzyme fucosyltransferase Trong khi đó, kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) là thụ thể trong quá trình nhiễm NoV Những kháng nguyên này được tổng hợp do kết quả hoạt động của một số

enzyme glycosyltransferase được mã hóa chủ yếu bởi các họ gen ABO (FUT-1), Lewis (FUT-3) và secretor (FUT-2)

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài ―Nghiên cứu tình

trạng nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh dưới 3 tuổi tại một trường mầm non ở Hà Nam năm học 2014 - 2015" với các mục tiêu như sau:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm NoV và kiểu gen của các chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh

2 Đánh giá mối liên quan giữa tính cảm nhiễm NoV và kiểu gen FUT-2

3 Đánh giá mối tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức và khả năng cảm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh

Đề tài được chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 G ớ t ệu c un về V êm dạ dày ruột cấp ở trẻ em

1.1.1 Định nghĩa bệnh VDDRC

Viêm dạ dày ruột cấp hay còn gọi là tiêu chảy là một bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa, phổ biến và thường gặp ở mọi lứa tuổi, đặc biệt là trẻ em Theo tổ chức Y tế Thế giới VDDRC được định nghĩa là ―đi ngoài phân lỏng hoặc tóe nước trên 3 lần trong 24 giờ, phân lỏng là phân không thành khuôn‖ [96] Độ rắn mềm của phân do thành phần nước trong phân quyết định: Phân có 85% nước gọi là nhão; phân có 88% nước gọi là lỏng: phân có 90% nước gọi là lỏng như nước [1] Số lượng phân được bài tiết ra ngoài bình thường mỗi ngày thay đổi tùy theo chế độ ăn, tuổi của từng cá thể Khi có tiêu chảy, phân chứa nhiều nước hơn bình thường gọi là phân nước hay phân lỏng Trong những trường hợp lỵ, trực khuẩn phân có thể chứa máu [2]

Mối nguy hiểm chính của VDDRC là tử vong và suy dinh dưỡng Tử vong

do VDDRC hầu hết thường gây ra bởi vì mất một lượng lớn muối và nước từ cơ thể [8] Những biến chứng do VDDRC thường gặp là kém ăn, đôi khi kèm nôn mửa [1] Trẻ ăn ít đi và khả năng hấp thu các chất dinh dưỡng bị giảm so với nhu cầu dinh dưỡng của trẻ, chính những yếu tố đó góp phần làm cho trẻ bị suy dinh dưỡng

và bệnh cảnh lâm sàng càng trở nên phức tạp hơn

1.1.2 Phân loại

VDDRC được phân loại tùy thuộc vào thời gian kéo dài các triệu chứng, trong đó một đợt VDDRC kéo dài ít hơn 2 tuần là VDDRC cấp tính Theo Chu Văn Tường, VDDRC cấp tính ở trẻ em thường xảy ra dưới 5 ngày, VDDRC kéo dài 2 tuần còn gọi là VDDRC kéo dài [7]

Ngày nay, người ta xác định 3 hội chứng lâm sàng khác nhau của VDDRC gồm:

- Tiêu chảy phân lỏng cấp tính: gồm các trường hợp khởi bệnh cấp tính, kéo dài dưới 14 ngày

- Hội chứng lỵ: gồm các trường hợp tiêu chảy phân có đàm máu

- Tiêu chảy kéo dài: gồm các trường hợp khởi đầu với tiêu chảy cấp tính rồi

Theo một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, tiêu chảy phân lỏng cấp tính chiếm 47,29%, hội chứng lỵ chiếm 51,25%, tiêu chảy kéo dài chiếm 1,48%

1.1.3 Tình hình bệnh VDDRC trên thế giới và Việt Nam

Các bệnh về VDDRC là nguyên nhân chính của dịch bệnh và tử vong ở trẻ

em tại các nước đã và đang phát triển [73] Bệnh thường lây qua đường tiêu hóa và thường gặp ở các khu dân cư có điều kiện sống không đảm bảo, trình độ dân trí thấp, kiến thức về phòng chống VDDRC bị hạn chế Trên thế giới, ước tính có 712.000 trường hợp tử vong do VDDRC, chiếm 9,9% trong tổng số 6,9 triệu trường hợp tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi (thống kê năm 2011) [56] Ở Châu Phi, Châu Á và Mỹ Latinh đã có 744 triệu đến 1 tỷ trường hợp viêm dạ dày cấp và 2,4 đến 3,3 triệu trường hợp tử vong hàng năm ở trẻ em dưới 5 tuổi [73] Tử vong do VDDRC hàng năm từ 3-6 triệu trẻ em, có 80% trong số này là trẻ em dưới 2 tuổi [6]

Tại Việt Nam, theo thống kê của Bệnh viên nhi Trung ương cho biết, trung bình mỗi trẻ bị VDDRC 3 lần/ năm, nhóm trẻ tại vùng nông thôn có tỷ lệ mắc cao hơn do ý thức vệ sinh kém, trẻ không được chăm sóc cẩn th n Do đó, bệnh VDDRC được đưa vào số 26 bệnh báo cáo thường xuyên Số ca bệnh VDDRC trong năm 2012 ở 28 tỉnh miền Bắc là 433.000, chỉ đứng sau số ca có triệu chứng cúm (870.000) [92], [91], [93], [94] Số ca tử vong ước tính (năm 2005) là 9600-12.400 ca tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi do VDDRC Trong năm 2005, ước tính chi phí điều trị trực tiếp cho những trường hợp VDDRC lên đến 3,1 triệu đô la Mỹ, 685.000 đô la cho chi phí trực tiếp khác và 1,5 triệu đô dành cho chi phí gián tiếp [33] Trong số trẻ dưới 5 tuổi 15% sẽ phải nh p viện

do VDDRC và 50% cần tới phòng khám [16] Những con số trên cho thấy gánh nặng của bệnh VDDRC cho bản thân trẻ, gia đình và nền y tế nước ta

1.1.4 Dịch tễ học bệnh VDDRC

a Các đường lây truyền

Hầu hết các nghiên cứu về bệnh sinh - dịch tễ cho rằng, các tác nhân gây tiêu chảy đều chủ yếu truyền qua đường phân, miệng thông qua thức ăn hoặc nước uống

bị ô nhiễm hay lây do tiếp xúc trực tiếp với phân người bị bệnh VDDRC, hoặc trung gian truyền bệnh như ruồi, dán…

b Một số hành vi làm gia tăng sự lan truyền tác nhân gây bệnh VDDRC

- Không nuôi con hoàn toàn bằng sữa mẹ trong 4-6 tháng đầu tiên sau khi

sinh: theo tổ chức Y tế Thế giới, những trẻ không được nuôi bằng sữa mẹ trong 4-6

tháng đầu tiên của cuộc đời có nguy cơ mắc VDDRC gấp nhiều lần so với những trẻ được nuôi bằng sữa mẹ hoàn toàn, nguy cơ tử vong do tiêu chảy của những trẻ này cũng lớn hơn một cách đáng kể Bởi sữa mẹ có chứa globulin miễn dịch chủ yếu là IgA (95%) IgM, IgG có tác dụng bảo vệ cơ thể chống các bệnh đường ruột và một

số bệnh khác do virus gây ra [14]

- Tập quán cai sữa sớm (trước 1 tuổi): Cho trẻ bú sữa mẹ kéo dài sẽ làm

giảm chỉ số mắc và sự trầm trọng của một số bệnh VDDRC như lỵ trực tràng và tả

- Cho trẻ bú sữa bình: Khi cho sữa vào một bình không sạch thì sẽ bị ô

nhiễm, nếu trẻ không bú hết sữa trong bình thì sự phát triển của vi khuẩn sẽ xảy ra

- Tập quán cho ăn dặm sớm (trước 4 tháng tuổi): Cho ăn dặm không đúng,

quá sớm hay quá muộn hoặc ăn dặm không đúng cách đều dễ dẫn đến VDDRC dẫn đến suy dinh dưỡng

- Dùng nước uống đã bị nhiễm tác nhân đường ruột: Nước có thể bị nhiễm

bẩn ngay tại nguồn của nó hoặc trong suốt quá trình dự trữ tại nhà Sự ô nhiễm tại nhà là do bảo quản hoặc sử dụng không hợp vệ sinh

- Không rửa tay sau khi đi ngoài, sau khi xử lý phân, trước khi chuẩn bị thức ăn: Thói quen rửa tay là một hành vi tốt bảo vệ sức khỏe chung, đặc biệt có hiệu lực

đối với việc phòng VDDRC

- Không xử lý phân (đặc biệt là phân trẻ nhỏ) một cách hợp vệ sinh: Nhiều

b c cha mẹ thường cho rằng phân trẻ em là không nguy hiểm, nhưng thực ra, chúng chứa rất nhiều virus và vi khuẩn gây bệnh Phân súc v t cũng chứa nhiều vi sinh v t

có thể truyền bệnh cho người

c Các yếu tố vật chủ liên quan đến sự gia tăng chỉ số mắc, mức độ trầm trọng, thời gian bị bệnh VDDRC

- Suy dinh dưỡng: VDDRC và suy dinh dưỡng liên quan chặt chẽ với nhau

nhất là đối với những trẻ suy dinh dưỡng nặng, những trẻ đó sự hồi phục niêm mạc

ruột bị ch m trễ do thiếu vitamin A, giảm sức đề kháng của cơ thể Sự nghiêm trọng, kéo dài và nguy cơ dễ tử vong doVDDRC sẽ gia tăng đối với những trẻ bị suy dinh dưỡng Ngược lại điều này sẽ làm cho tình trạng suy dinh dưỡng trở nên trầm trọng hơn [8]

- Sởi: Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, tiêu chảy và lỵ thường gặp ở trẻ đang

bị sởi hoặc mới khỏi bệnh sởi trong vòng 4 tuần lễ, do trong thời gian này hệ thống miễn dịch bị suy giảm [1]

- Bệnh suy giảm miễn dịch hoặc ức chế miễn dịch: Tình trạng này có thể tạm

thời do một số bệnh nhiễm vi rus (như sởi), hoặc có thể kéo dài như ở những người

có hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HIV/AIDS) Nếu tình trạng ức chế miễn dịch nặng thì VDDRC có thể xảy ra do các tác nhân bất thường và bệnh cũng

có thể kéo dài

- Tuổi: Hầu hết tiêu chảy xảy ra trong hai năm đầu cuộc đời Chỉ số mắc bệnh

cao nhất là ở nhóm trẻ 6-11 tháng, khi mới t p ăn dặm [6] Theo tổ chức Y tế Thế giới cho biết, nhóm tuổi này dễ mắc bệnh VDDRC bởi vì thời kỳ này trẻ phải ăn thức ăn bổ sung, trong khi đó các yếu tố bảo vệ chống tiêu chảy trong sữa mẹ lại giảm

d Tính chất mùa

Người ta nh n thấy tình trạng VDDRC trẻ em có sự khác biệt theo mùa ở nhiều địa dư khác nhau Ở những vùng ôn đới, VDDRC do vi khuẩn thường xảy ra vào mùa nóng, ngược lại VDDRC do virus, đặc biệt là RV lại xảy ra cao điểm vào mùa đông Ở những vùng nhiệt đới,VDDRC do RV xảy ra quanh năm nhưng tăng vào các tháng khô và lạnh, ngược lại VDDRC do vi khuẩn lại xuất hiện cao điểm vào giao điểm giữa mùa mưa và nóng Tỷ lệ mắc VDDRC kéo dài cũng dao động theo mùa

e Các vụ dịch

Hai tác nhân gây bệnh có thể gây thành dịch lớn và tử vong cao là Vibro

cholerae 01 và Shigella dysenteriae týp 1 Những vụ dịch xảy ra gần đây là năm

1961, dịch xảy ra do Vibrio cholerae 01 ở Indonesia lan đến Châu Á, Trung C n Đông và Châu Phi, một số nước châu Âu và Bắc Mỹ Shigella dysenteria Týp 1 gây

dịch lỵ lớn ở Trung Mỹ và gần đây ở Châu Phi và vùng Nam Á Ngoài ra, còn có một số vụ dịch lỵ trực khuẩn ở Trung Mỹ, Trung Phi và Nam Phi

1.1.5 Các tác nhân gây VDDRC

Tác nhân gây VDDRC khá đa dạng, nhiều nghiên cứu miêu tả 26 các loại tác nhân khác nhau từ virus như: RV, NoV, adenovirus (Adv), astrovirus, đến vi khuẩn

như các chủng E.coli gây tiêu chảy (DEC) như: vi khuẩn thuộc họ Vibrio trong đó

có phảy khuẩn tả (V.cholera), Samonella, Shigella, ký sinh trùng như họ

Crytosporidium, Giardialamblia, Entamoeba histolytica… [55, 60] Tuy nhiên, dù

là 26 tác nhân trong một số ít nghiên cứu, hay 2-6 tác nhân trong đa số các nghiên cứu, tỷ lệ phát hiện ít nhất một tác nhân không vượt quá mức 80% Trong số đó, 60-

70% do vi rút gây ra, thường gặp là RV, NoV

Một số tác nhân gây tiêu chảy:

NoV được coi là nguyên nhân chính gây viêm dạ dày ruột cấp tính ở trẻ em

và người lớn Bệnh do NoV thường xảy ra và tìm thấy ở các nơi khác nhau: nhà hàng, trường học, các trung tâm chăm sóc sức khỏe, bệnh viện, nhà điều dưỡng và tàu du lịch Hằng năm có đến hơn 267 triệu trường hợp nhiễm do NoV trên toàn thế giới [68] Con đường truyền chính của virus này thường lan truyền qua đường thực phẩm, đường nước, không khí và lan truyền từ người sang người [35], [62]

NoV được phát hiện lần đầu tiên bởi Kapikian và cộng sự vào năm 1972

dưới kính hiển vi điện tử (EM) Trước đây, các virus được kí hiệu là ―Norwalk-like

viruses‖ Chủng nguyên thủy của NoV là virus Norwalk, chúng được phát hiện từ

một đợt bùng phát viêm dạ dày ruột cấp tính tại một trường tiểu học ở Norwalk,

Ohio năm 1968 [46] NoV là thành viên của chi NoV, cùng với chi Sapovirus trong

họ Caliciviridae [38] Các virus này thường nhỏ và không có màng bao quanh,

Hìn 1.1 NoV d ớ kín ển v đ ện tử [65]

1.2.2 Phân loại, hình thái và tổ chức bộ gen của NoV

Trước đây, việc phát hiện lây nhiễm NoV ở người bị hạn chế bởi vì NoV gây bệnh ở người nhưng khó nuôi cấy được trên tế bào và cũng không có động v t thí nghiệm nào thích hợp cho sự gây nhiễm NoV Tạo dòng của bộ gen virus Norwalk được thực hiện năm 1990 đã dẫn đến sự tiến bộ lớn trong sự hiểu biết về virus học phân tử và dịch tễ học của NoV [42] Gần đây, các phương pháp chẩn đoán phân tử

có độ nhạy dựa trên phản ứng RT-PCR và các kỹ thu t giải trình tự bộ gen để phát hiện, mô tả đặc điểm NoV đã góp phần nâng cao thêm sự hiểu biết của chúng ta về dịch tễ học của sự lây nhiễm NoV [98] Những kỹ thu t này đã chứng minh rằng các NoV có tính di truyền và đa dạng về kháng nguyên [99] Dựa vào trình tự giống nhau và phân tích cây phát sinh chủng loài, NoV có thể được phân loại theo nhóm gen (genogroup), kiểu gen (genotype) và cụm gen (genocluster) Hiện nay, NoV được phân loại thành năm nhóm gen khác nhau: từ GI đến GV [38],[80] NoV ở người thuộc GI, GII và GIV, nhưng hầu hết các chủng gây bệnh ở người đều thuộc nhóm gen GI và GII NoV GIII và GV cho đến nay đã được tìm thấy ở loài bò và các loài chuột Trong các nhóm gen (genogroups), NoV được chia tiếp thành các kiểu gen (genotypes), trong số đó có ít nhất 29 kiểu gen đã được báo cáo Hiện nay nhóm gen GI được chia thành tám kiểu gen (GI.1 đến GI.8), GII bao gồm ít nhất 17 kiểu gen (GII.1 đến GII.17), GIII có hai kiểu gen (GIII.1-GIII.2) và mỗi GIV và GV bao gồm một kiểu gen [99]

Các phân tích về trình tự toàn bộ chiều dài bộ gen của NoV đã chỉ ra rằng

các chủng virus trong một nhóm gen thường có nhiều hơn 69% tương đồng về nucleotide, trong khi các chủng trong các nhóm gen khác chỉ chiếm 51-56% sự tương đồng Ngoài ra, sự phân loại dựa trên trình tự nucleotide của gen cho protein

vỏ capsid cho thấy rằng các trình tự chênh lệch nhau bởi 60% giữa các genogroups

và 20- 30% giữa các genotypes Trong cùng genocluster, trình tự vỏ capsid của virus thường rất giống nhau [29]

Thông qua việc giám sát dịch tễ của NoV trên thế giới đã cho thấy vai trò chủ yếu của những chủng có nhóm gen GII, đặc biệt là những chủng có kiểu gen GII/4 chiếm ưu thế là nguyên nhân của các vụ dịch (hiện tại ước tính khoảng gần 80% của tất cả các trường hợp lây nhiễm, nó cũng là nguyên nhân của cả 5 vụ dịch trong hơn

th p kỷ qua) và có các biến thể GII.4 mới xuất hiện từ 1-2 năm gần đây Dường như

sự tăng lên thường xuyên của biến thể GII.4 mới đã tiếp diễn trong những năm gần đây và đã trở thành một hiện tượng toàn cầu [76], [77] Các nghiên cứu về dịch tiêu chảy cấp ở quân đội Israel chủng phân l p là GII.6 nhưng nhanh chóng chuyển thành chủng GII.4 [30] Điều tra ở Mỹ do CDC tiến hành vào năm 2006 tỷ lệ các ca do GII.4 tăng lên rõ rệt trong toàn nước Mỹ [43] Một nghiên cứu của Nh t vào năm 2004-2005 cho thấy GII chiếm 98,6% trong đó GII.4 chiếm tới 77,4% [37] Tại Brazil trẻ tiêu chảy cấp nhiễm NoV genogroup GI chiếm 6,1%, genogroup GII chiếm 78,7%, còn lại

là bộ nhiễm của 2 genogroup này [19] Mặc dù dịch bệnh NoV được báo cáo quanh năm, nhưng đỉnh điểm của việc bùng phát dịch là trong mùa đông [21]

Ở Việt Nam, từ năm 2007-2013, kiểu gen NoV GII.4 luôn luôn là kiểu gen lưu hành chiếm ưu thế Sự xuất hiện của các dòng GII.4 ở Việt Nam cùng thời điểm trên thế giới xuất hiện dòng GII.4 mới tương ứng: sự chiếm ưu thế của dòng US95/96 ở nước ta trong những năm 1998-1999, sự tồn tại của chủng 2006b ở nước

ta từ 2007-2013, sự xuất hiện của chủng New Orleans-2010 trong giai đoạn

2009-2011 và sự nổi trội của chủng Sydney 2012 trong năm 2013 Song song tồn tại với các đa dạng chủng GII.4 là genotype GII.3, chiếm tỷ lệ không dưới 20% (hình 1.2) Như v y, sự xuất hiện của các đa dạng chủng GII.4 ở nước ta đồng thời với sự lưu

hành toàn cầu của các chủng này trên thế giới [22] Các chủng NoV phổ biến ở miền Bắc bao gồm GI.8, GII.3, GII.4, GII.13, trong khi đó các genotype NoV lưu hành ở miền Nam đa dạng hơn với việc thêm nhiều type thuộc nhóm gen GI và GII như GI.3 GI.4, GI.5, GII.6, GII.9 và GII.12 (Hình 1.3)

Hìn 1.2 B ến đổ c ủn NoV ở m ền Bắc n ớc ta từ 2010-2013

Hìn 1.3 P ân bố enotype k ác n au của NoV ở m ền Bắc và m ền Nam

n ớc ta tron năm 2010 [69]

NoV là thành viên của chi Norovirus, trong họ Caliciviridae Hạt NoV được tạo

thành bởi 3 cấu trúc đơn của vỏ capsid, với khối 20 mặt đối xứng, kích thước 27-40

nm Bề mặt điển hình của hạt virus có hình dáng lõm của cái tách Vỏ capsid gồm có

90 dimer của một protein vỏ đơn, có trọng lượng phân tử là 58 Kd (hình 1.4)

Hìn 1.4 Cấu trúc của NoV [65]

Bộ gen của NoV bao gồm mạch dương (positive-sense), 7.400-7.700 nucleotide của sRNA Bộ gen được polyadenyl hóa và chia thành 3 khung đọc mở (ORF1, ORF2 và ORF3) ORF1 mã hóa cho một polyprotein được tách ra từ enzym thủy phân protein, tạo thành NTPase, protease, và RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1 tạo thành lớp capsid và mang tính kháng nguyên của virus Gen VP1 là gen biến đổi lớn nhất trong hệ gen của NoV và được chia thành ba miền, miền vỏ (S) được liên kết với miền nhô ra ngoài (miền P2) nhờ khớp nối lỏng lẻo (miền P1) Miền S có tính bảo thủ rất cao, hình thành bộ xương của cấu trúc capsid, miền P2 có chứa vùng liên kết với tế bào v t chủ, do v y miền này mang tính kháng nguyên của virus Còn ORF3 mã hóa cho protein VP2 có chức năng trong quá trình lắp ráp và ổn định hạt virus (hình 1.5) [38] NoV được phân nhóm dựa vào trình tự axit amin của protein VP1- các virus

có sự khác biệt nhỏ hơn 14,3% thuộc cùng một chủng, khác biệt từ 14,3-43,8% thuộc cùng một kiểu gen, khác biệt từ 45-61% thuộc cùng một nhóm gen

Hìn 1.5 Cấu trúc bộ en của NoV

1.2.3 Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và sinh lý bệnh

 Đường lây truyền của Novovirus

Sự lan truyền phổ biến của NoV là thông qua thức ăn, nước và môi trường bị

ô nhiễm, sự tiếp xúc giữa người với người, trong không khí Ví dụ, NoV lan truyền qua việc thay tã, chia sẻ đồ dùng ăn uống, ăn thực phẩm hoặc uống chất lỏng

bị nhiễm virus, hoặc đụng chạm vào các bề mặt hoặc đồ v t nhiễm virus và sau đó cho tay vào hoặc đặt gần miệng

Các NoV được tìm thấy trong mẫu phân và mẫu nôn của một người bị nhiễm bệnh Có ít nhất 2 nhân tố góp phần vào khả năng bùng phát dịch bệnh của virus Thứ nhất, virus lây nhiễm rất cao và chỉ một lượng nhỏ, khoảng 10-100 hạt virion đủ để gây bệnh Thứ hai, virus tương đối bền trong môi trường, ví dụ khả năng lạnh khi đóng băng, nhiệt độ đến 60oC, khử khuẩn với chlo, điều kiện axít, giấm, rượu, các dung dịch khử trùng tay và nồng độ đường cao [89] Giai đoạn ủ bệnh trung bình của vius ngắn (12-48h) nhưng sự phát tán của virus được phát hiện

ba tuần sau khi xuất hiện các triệu chứng, tạo cơ hội để mở rộng phạm vi phát tán của virus sang các v t chủ khác [83] Hiện nay việc phòng ngừa và khống chế các

vụ dịch của NoV đều dựa vào việc xác định các phương thức truyền nhiễm Sự lan

truyền bệnh được cắt đứt bằng việc kiểm soát sự ô nhiễm của thực phẩm và nguồn nước, duy trì vệ sinh cá nhân và làm giảm sự truyền bệnh từ người sang người

 Đặc điểm lâm sàng

Triệu chứng nhiễm NoV thông thường nhất là nôn mửa hoặc tiêu chảy, đau quặn bụng và đôi khi có sốt Phân tiêu chảy thường không có máu, ít chất nhờn, thể lỏng và có nước Các triệu chứng thường kéo dài khoảng 24-60h [47] Các nghiên cứu trên người tình nguyện cho thấy rằng có đến 30% các trường hợp nhiễm trùng

mà không có triệu chứng nào Hiện nay chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu VDDRC do NoV, cũng như không có vacxin để phòng ngừa bệnh [38] Điều trị chỉ

t p trung vào chăm sóc hỗ trợ, bổ sung dinh dưỡng, đặc biệt là hồi phục nước và điện giải Các biến chứng từ nhiễm NoV có thể thường thấy ở trẻ sơ sinh và người cao tuổi Người già và trẻ em mất nước gây rối loạn điện giải có thể dẫn đến tử

vong nhanh chóng nếu không được cấp cứu kịp thời Tuy nhiên, dữ liệu mới cho thấy rằng các dấu hiệu và các biến chứng lâm sàng bất thường từ sự lây nhiễm NoV

có thể xảy ra ở những người suy giảm miễn dịch và căng thẳng tinh thần [48]

Nghiên cứu ban đầu trong các nhóm tình nguyện đã chứng minh rằng khoảng 30% trường hợp nhiễm bệnh mà không có triệu chứng đi kèm [75] Gần đây, nghiên cứu cho thấy rằng những người nhiễm bệnh NoV phụ thuộc vào sự hiện diện của các thụ thể kháng nguyên nhóm máu histo đặc hiệu ở người (HBGA) trong đường tiêu hóa [59] HBGAs ở người là phức hợp các carbohydrate bao gồm một oligosaccharide liên kết với protein hoặc lipid trên niêm mạc biểu mô của hệ hô hấp, sinh dục và ống tiêu hóa, hoặc như các oligosaccharide tự do trong các dịch sinh học như nước bọt [66] Cả 3 họ HBGA chính (họ ABO, Lewis và họ secretor)

đã cho thấy có sự liên quan đến việc nh n diện NoV Sự phối hợp của liên kết đặc hiệu chủng và biểu hiện biến đổi trên thụ thể HBGA có thể giải thích sự mẫn cảm của người nhiễm khác nhau được theo dõi trong các vụ dịch NoV và trong các nghiên cứu ở người tình nguyện [88]

1.2.4 Chẩn đoán

Có nhiều phương pháp thích hợp để chẩn đoán nhiễm NoV Những phương pháp này bao gồm: quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi điện tử (EM), quan sát bằng kính hiển vi điện tử miễn dịch (IEM), thử nghiệm ngưng kết hồng cầu miễn dịch

(IAHA), thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm miễn dịch enzym (EIA), thử nghiệm sắc ký miễn dịch (IC), RT-PCR, real-time PCRvà giải trình tự nucleic acid Trong số những phương pháp này thì RT-PCR, real-time PCR và giải trình tự nucleic acid được sử dụng rộng rãi để phát hiện và xác định kiểu gen của NoV [50], [71], [81], [98] Các kỹ thu t sinh học phân tử này đã thay thế các thử nghiệm miễn dịch truyền thống và trở thành tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán nhiễm trùng NoV trong th p kỷ qua

 Các kỹ thuật chẩn đoán thông thường

- Quan sát trực t ếp bằn sử dụn EM: kỹ thu t này cho phép phát hiện

một lượng virus > 106/ml trong dịch huyền phù phân, nó chỉ có thể thành công khi

áp dụng trong giai đoạn sớm của bệnh [89]

- Kỹ t uật IEM: trong kỹ thu t này, huyết thanh miễn dịch được sử dụng để

nâng cao sự phát hiện virus bởi sự ngưng kết của các hạt virus trong dịch huyền phù phân Sự kết cụm virus xảy ra trong sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu có thể phát hiện và cải thiện khả năng chẩn đoán đặc hiệu Tuy nhiên, kỹ thu t này chỉ được sử dụng cho các mẫu phân thu nh n trong giai đoạn đầu của bệnh [58]

- T ử n ệm n n kết ồn cầu m ễn d c (IAHA) và m ễn d c p ón

xạ (RIA): IAHA là thử nghiệm để đánh giá nồng độ kháng thể NoV trong một lượng

lớn huyết thanh vì thế các nghiên cứu dịch tễ học về huyết thanh có thể được thực hiện bằng thử nghiệm này [45] Những hạt virus được làm sạch từ mẫu phân có thể được dùng như một kháng nguyên và tương tác của phức hợp giữa kháng nguyên/kháng thể được phát hiện bởi sự ngưng kết hồng cầu nhóm máu O ở người Mặc dù thử nghiệm

có lợi thế là đòi hỏi kháng nguyên ít hơn, nó nhanh chóng được thay thế bằng RIA RIA đã được phát triển như là một phương pháp thay thế cho IEM để phát hiện kháng nguyên NoV trong các mẫu phân [39] Hiện nay, 2 phương pháp này đang được nghiên cứu để phát triển thêm

 Các kỹ thuật phân tử

Sau thành công về tạo dòng và giải trình tự bộ gen virus Norwalk (NoV), thử nghiệm RT-PCR được phát triển để phát hiện NoV trong cả mẫu bệnh phẩm và mẫu môi

trường trong hai th p kỷ qua Ứng dụng RT-PCR và các kỹ thu t giải trình tự cDNA để phát hiện và mô tả đặc điểm di truyền NoV đã tăng cường đáng kể sự hiểu biết của chúng ta về dịch tễ học của bệnh nhiễm NoV [88], [98] Gần đây, RT-PCR được sử dụng rộng rãi như một công cụ để chẩn đoán bệnh nhiễm NoV Một bước ngoặt đáng tin c y nhất cho chẩn đoán nhiễm NoV là sự hiện diện RNA của NoV trong các mẫu phân Để tạo điều kiện cho việc phân tích phân tử RNA của NoV, khuếch đại bộ gen RNA của chúng và trình tự của sản phẩm khuếch đại phải được thực hiện Thêm vào đó, các kỹ thu t phân tử khác như: PCR miễn dịch, RT-LAMP và realtime PCR, những kỹ thu t đó nhanh và nhạy hơn phương pháp RT-PCR chuẩn, gần đây các phương pháp realtime RT PCR đã được phát triển để phát hiện nhanh NoV trong một số lượng lớn các mẫu phân

và mẫu hải sản trong suốt mùa dịch bệnh và các vụ dịch của NoV [44], [90]

Trong những năm gần đây, protein vỏ NoV biểu hiện bởi baculovirus trên dòng

tế bào côn trùng để tạo hạt giống virus-like particles (VLPs) Những VLPs này có hình thái và kháng nguyên giống với các hạt virus nguyên thể Các VLPs rất hữu ích cho việc tạo miễn dịch của nhiều loài động v t khác nhau (chuột, chuột lang và thỏ) để sản xuất sản phẩm huyết thanh miễn dịch đa và đơn dòng và sau đó có thể được sử dụng để thiết l p các thử nghiệm chẩn đoán cơ bản EIA như thử nghiệm ELISA và thử nghiệm

IC [84] Một số bộ kít ELISA dùng để phát hiện NoV trong các mẫu phân đã được phát triển và thương mại hóa Mặc dù các mẫu phân có thể được thử nghiệm trực tiếp bằng những bộ kít ELISA mà không cần bước tinh chế và cô đặc quá phức tạp, độ nhạy của phương pháp ELISA thì thấp hơn nhiều so với phương pháp RT-PCR [28], [51] Độ nhạy thấp là hạn chế của phương pháp ELISA, điều đó làm cho nó không phù hợp cho việc phát hiện trực tiếp NoV trong các mẫu phân, mẫu hải sản mà không có sự cải thiện

độ nhạy Gần đây, thử nghiệm phát hiện nhanh bằng bộ kít IC cũng đã trở thành thương mại hóa, có sẵn để phát hiện NoV Bộ kít IC này đã chứng minh có độ nhạy cao hơn so với các thử nghiệm bằng ELISA Tuy nhiên, hạn chế của các thử nghiệm chẩn đoán EIA cơ bản để phát hiện NoV là chỉ có một số kiểu gen NoV mà các kháng thể đơn dòng đặc hiệu có thể được phát hiện

1.2.5 Phương pháp realtime RT-PCR (Realtime Reverse transcription polymerase

- Phản ứng Realtime PCR: là kỹ thu t PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA Realtime PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra Khả năng này được phát hiện nhờ

bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Probe Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA Khi sử dụng máy BIO-RAD, máy có bộ camera có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được Chu

kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle of threshold) Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng

1.3 Tìn ìn n ên cứu NoV tron và n oà n ớc

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

NoV thuộc họ Caliciviridae là nguyên nhân đứng thứ hai (sau RV) gây nên

các vụ dịch tiêu chảy ở các nhóm tuổi, trong đó gặp chủ yếu là ở trẻ em dưới 5 tuổi

[15] Theo nghiên cứu trên toàn thế giới, tỷ lệ ca tiêu chảy do nhiễm NoV thường

khá cáo (Brazil 33%, Nh t 29%, Ý 48,4%, Đài Loan 29,5%, Ấn Độ và Thái Lan: 12-44%) Từ năm 1995 đến nay, trên thế giới đã xảy ra 5 đại dịch tiêu chảy cấp do

NoV Những vụ dịch này lan rộng ra toàn thế giới trong vòng vài tháng Khoảng

thời gian giữa các lần xuất hiện đại dịch ngày càng ngắn hơn NoV là một trong những virus có mức độ đa dạng di truyền cao taọ điều kiện để chúng lưu hành phổ biến và khả năng thích ứng rộng trong cộng đồng

Trong nghiên cứu của Castilho và cộng sự (2006) đã tiến hành kiểm tra 234 mẫu phân từ trẻ em có hoặc không có viêm dạ dày ruột trong một khoảng thời gian

5 năm (1995-1999) ở bang São Paulo, Brazil NoV được phát hiện bằng kỹ thu t RT-PCR với việc sử dụng hai cặp mồi oligonucleotide khác nhau nhắm vào 3’ của gen RNA polymerase (vùng B), cũng như một khu vực capsid một phần ở đầu 3' của gen VP1 (vùng D) Tổng cộng có 78 (33%) các mẫu xét nghiệm dương tính cho NoV, trong đó chủng GI chiếm 6,1% và GII chiếm 78,7%, còn lại là bội nhiễm của

2 genogroup này [24] Năm 2009, Carlsson B và cộng sự, đã phát hiện ra có 54,2% trong tổng số 116 người ở một nhà dưỡng lão già ở El Grao de Castellón, Tây Ban Nha đã nhiễm NoV (GII.4) [23] Đến năm 2013, Najafi A và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu trên 375 mẫu phân của trẻ em dưới 7 tuổi bị bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính ở bệnh viện Nhi khoa Shahrivar, thành phố Borazjan, Iran Trong tổng số mẫu

thu được, NoV được phát hiện ở 47 trong tổng số 375 (12,53%) Tỷ lệ nhiễm cao

nhất là ở trẻ em dưới hai tuổi (76,6%) Đặc biệt, virus này đạt tỷ lệ cao nhất trong

mùa thu (63,83%) và thấp nhất ở mùa hè (6,38%) [70]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Tiêu chảy là một trong những bệnh có tỉ lệ mắc cao, đứng thứ hai chỉ sau các bệnh về đường hô hấp ở trẻ dưới 5 tuổi, đặc biệt ở các nước đang phát triển Nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy bao gồm virus, vi khuẩn và ký sinh trùng Nhờ có những nỗ lực đưa giám sát tiêu chảy kèm chẩn đoán tác nhân vi rút, do Tổ chức Y

tế thế giới tài trợ từ những năm 1998 đến nay, nghiên cứu về các bệnh tiêu chảy do virus ở Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu, tiêu điểm nhất là việc sản xuất và

lưu hành vắc xin phòng tiêu chảy do RV NoV cũng là tác nhân phổ biến đứng thứ 2 sau RV gây các vụ dịch tiêu chảy không do vi khuẩn ở người lớn và trẻ em Qua

nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ phát hiện NoV dao động trong khoảng lớn từ 5,5% đến 36% giữa các nghiên cứu, do nhiều nguyên nhân bao gồm sự khác nhau về địa điểm nghiên cứu, các kỹ thu t sử dụng, phương pháp chọn lựa đối tượng và thời gian tiến hành nghiên cứu Trước đây, các nghiên cứu trong những năm 2000 đã chỉ

ra rằng, tỷ lệ phát hiện NoV trong mẫu phân tiêu chảy không vượt quá 6% trong những nghiên cứu trong giai đoạn này, phần nào đánh giá thấp tầm quan trọng của virus này trong bệnh tiêu chảy Với việc các xét nghiệm phân tử có độ nhạy cao hơn như realtime RT-PCR ngày càng trở nên phổ c p, tỷ lệ phát hiện vi rút này ở nước

ta khoảng 30% như nghiên cứu đầu tiên ở miền Bắc Tỷ lệ này được tiếp tục khẳng định trong các nghiên cứu khác ở miền Nam, cho thấy tầm quan trọng của vi rút này, chỉ sau RV [11] NoV còn có khả năng gây nhiễm nhưng không có triệu chứng Tuy nhiên, ở nước ta các nghiên cứu dịch tễ học phân tử về virus này ở trẻ nhiễm bệnh cũng như khỏe mạnh tại các trường mầm non càng hạn chế

Năm 2012, Nguyễn Đỗ Phúc và cộng sự đã xây dựng thành công quy trình phát hiện NoV bằng kỹ thu t Realtime PCR Kết quả ứng dụng quy trình Real time PCR ban đầu cho thấy có 12/40 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ phát hiện NoV nhóm GI

và GII [9] Nhóm nghiên cứu Phạm Thị Hà Giang và cộng sự (2013) đã xác định được 7 tác nhân vi khuẩn và virus gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi trong tổng số

410 mẫu phân tiêu chảy thu th p ở Bệnh viện Nhi Thái Bình từ tháng 9/2011 đến tháng 9/2012 sử dụng bộ sinh phẩm Allscreen-Interlabservice do Cộng hòa Liên bang Nga tài trợ Bộ sinh phẩm này có khả năng xác định được tới 73,6% nguyên

nhân gây tiêu chảy trong đó tỉ lệ NoV là 31% Đồng nhiễm giữa RV và NoV diễn ra

phổ biến nhất (chiếm 6,6%) [3]

Tại viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Vũ Thị Bích H u và cộng sự (2013), đã tiến hành nghiên cứu sự biến động genotype của NoV lưu hành tại miền Bắc Việt Nam từ 2007 – 2013 Kết quả cho thấy, trong hơn 1800 mẫu phân tiêu chảy tại bệnh viện ở một số tỉnh miền Bắc nước ta từ 2007-2013, NoV GII.4 là genotype lưu

hành phổ biến nhất (74,5%), kế tiếp là genotype GII.3 (20%) Sự biến động đáng kể

và nhanh chóng của chủng NoV GII.4 trong thời gian ngắn với các đa dạng chủng

khác nhau bao gồm: Nhóm 2006b chiếm ưu thế trong những năm 2007-2008 đã dần thay thế bởi nhóm Sydney-2012 trong năm 2013 Genotype GII.4 nhóm New Orleans-2009 tồn tại trong giai đoạn 2010-2012 và không xuất hiện trong năm

2013 Tương tự với NoV GII.4, vị trí tương tác với kháng nguyên nhóm máu của các chủng GII.3 ở nước ta từ 2007-2013 có sự ổn định với sự khác biệt trong trình

tự axit amin là 3-5% giữa các chủng Như v y, cùng một lúc tồn tại sự đa dạng di

truyền của 2 genotype NoV này nhưng bền vững trong tương tác với tế bào v t chủ

Điều này giải thích khả năng lưu hành trong thời gian dài của 2 genotype này ở nước ta, tương tự với đặc điểm chủng NoV lưu hành trên thế giới [4] Cũng trong năm 2013, tác giả Nguyễn Vân Trang cũng đã tiến hành đánh giá vai trò của kháng nguyên nhóm máu (HBGA) trong tính cảm nhiễm với 2 loại virus là RV và NoV ở trẻ nh p viện do tiêu chảy tại Thái Bình Kết quả cho thấy, trong số 260 trẻ nh p viện có đồng thời mẫu phân và nước bọt, 158 trẻ (61%) có kiểu hình tiết kháng nguyên HBGA (Lea-b+), 31 trẻ (12%) có kiểu hình không tiết kháng nguyên (Lea+b-),

và 71 trẻ (27%) có kiểu hình tiết kháng nguyên không hoàn toàn (Lea+b+) NoV

được phát hiện ở 50 trong số 260 trẻ này với GII.3 và GII.4 là những kiểu gen phổ biến nhất Toàn bộ trẻ nhiễm GII.4 có kiểu hình tiết HBGA Trong số trẻ nhiễm GII.3, có 5 trong số 28 trường hợp trẻ không tiết kháng nguyên [10]

1.4 K ểu en FUT-2 ở n ờ và tín cảm n ễm NoV

Mức độ cảm ứng của cơ thể đối với NoV có liên quan đến các trạng thái của gen FUT-2 Gen FUT-2 mã hóa cho enzym fucosyltransferase α(1,2) để điều hòa sự

biểu hiện của kháng nguyên H (tiền chất cần thiết của các kháng nguyên A và B) trên bề mặt của cơ và dịch cơ thể, từ đó xác định tình trạng tiết trong các nhóm máu của các kháng nguyên ABH Trạng thái tiết trong các nhóm máu của mỗi cá thể rất quan trọng cho các nghiên cứu mối liên quan của bệnh và các đột biến nucleotit được tìm thấy trong gen FUT-2 đặc trưng cao của mỗi dân tộc

Chiều dài của FUT-2 khoảng 9980 bp, bao gồm 2 exon (118 và 2995 bp) bị tách

ra bởi một intron có kích thước 6865 bp Exon đầu tiên tạo thành vùng mã hóa không được dịch mã, exon thứ 2 mã hóa cho 343 amino axit của protein đã được nghiên cứu

rộng rãi [32] Sự đa hình được tìm thấy trong gen FUT-2 cho thấy tính đặc trưng dân

tộc cao với đột biến vô nghĩa ở vị trí G428A có liên quan đến quần thể người da trắng

và đột biến vô nghĩa alen C571T được tìm thấy phần lớn của người ở các đảo thuộc Thái Bình Dương [41] Đột biến ở vị trí A385T làm giảm hoạt động của enzyme fucosyltransferaseα(1,2) do đột biến mất ở vị trí 129 (Ile–Phe) là nguyên nhân chủ yếu nhất dẫn đến kiểu hình không tiết (nonsecretor) của người phía Đông và Đông Nam châu Á Đã có một số nghiên cứu về mối quan hệ giữa gen FUT-2 và tình trạng nhiễm NoV Nghiên cứu mới nhất trên gen secretor (gen tiết) ở các nhóm quần thể người khác nhau đã xác định được một vài đột biến của các gen này mà có thể làm mất hoặc giảm

sự hoạt động của enzyme fucosyltransferase Đó là đột biến G428A, C571T, C628T và G849A; tất cả chúng tạo thành bộ ba kết thúc, trong khi đó mất 3 nucletit ở vị trí 685 tạo thành protein không hoạt động và đột biến A385T tạo nên một enzyme không ổn định [86] Đột biến C357T không làm thay đổi aminoaxit trong enzym fucosyltransferase nhưng nó được tìm thấy trong nhiều quần thể [53]

Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng, tình trạng nhiễm NoV hiếm khi vượt quá 70% bởi một số yếu tố di truyền đóng vai trò lớn trong việc ngăn chặn một

số người không bị nhiễm NoV Người ta cho rằng tình trạng secretor, khả năng biểu hiện HBGA (histo-blood group antigen) trên niêm mạc và trong dịch tiết có thể có nguy cơ bị nhiễm NoV Những người non-secretors (những người không biểu hiện Fuc-TII a1,2-fucosyltransferase và do đó không thể hiện H type 1 hay Lewis b (Leb) kháng nguyên) cho thấy rằng giảm bị nhiễm hoặc th m chí đề kháng với sự nhiễm NoV Ngoài ra, các nghiên cứu huyết thanh dịch tễ học đã cho thấy rằng những người secretor có dấu hiệu kháng thể cao hơn đáng kể và xuất hiện lại NoV nhiều hơn những người non-secretor [20]

Có thể có mối quan hệ giữa alen FUT-2 và sự nhạy cảm hình thành bệnh

cũng đã được nghiên cứu rộng rãi Alen vô nghĩa 428A cho thấy có sự bảo vệ cho

sự nhiễm NoV GII, đó là nguyên nhân chính của bệnh viêm dạ dày cấp tính [23]

Alen vô nghĩa 428A cũng có mối liên hệ chặt chẽ với quá trình làm ch m sự nhiễm virut HIV- 1 [52]

1.5 Khán n uyên n óm máu t n dun tổ c ức (HBGA) và k ả năn cảm

n ễm của NoV

Khoảng một thế kỷ trước, Karl Landsteiner đã phát hiện ra kháng nguyên nhóm máu ABO ở trong kháng thể và tế bào hồng cầu ở người Gần đây đổi tên thành kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) vì sự hiện diện của nó trong nước bọt, một số mô tế bào và ruột [66] Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, NoV và RV là hai tác nhân nh n biết kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) là thụ thể trong quá trình nhiễm Kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) là một phức hợp carboohydrate liên kết với glycoprotein hoặc glycolipid có mặt trên bề mặt tế bào hồng cầu hoặc các tế bào nội biểu mô và các dịch cơ thể như nước bọt, dịch ruột, sữa [78] Những kháng nguyên này được tổng hợp do kết quả hoạt động của một số enzyme glycosyltransferase được mã hóa

chủ yếu bởi các họ gen ABO (FUT-1), Lewis (FUT-3) và secretor (FUT-2) Gen

FUT-2 và FUT-3 xác định kiểu hình của kháng nguyên Lewis Khi gen FUT-2 hoạt

động, kiểu hình của kháng nguyên Lewis là Lea-b+

và Lex-y+ (trạng thái tiết hoàn

toàn) nhưng khi gen FUT-2 không hoạt động, kiểu hình của kháng nguyên Lewis là

Lea+b- và/hoặc Lex+y-(trạng thái không tiết) Kiểu hình Lea+b+

và/hoặcLex-b+(trạng

thái tiết không hoàn toàn) xuất hiện khi gen FUT-2 bị đột biến làm giảm mức độ

biểu hiện yếu tố H hoặc do quá trình fucosylation không hoàn toàn của tiền chất H

Sự không hoạt động của gen FUT-3 dẫn đến kiểu hình Lea-b-

và Lex-y- (không xác định) Những tiến bộ trong các nghiên cứu gần đây về sự tương tác giữa NoV với

v t chủ và các thụ thể của virus đã mở ra hướng mới trong nghiên cứu phổ v t chủ đặc hiệu và quá trình phát sinh bệnh của virus này Larsson đã chứng minh rằng

hiệu giá kháng thể kháng NoV nhóm GII ở những người thuộc trạng thái không tiết

thấp hơn đáng kể so với những người ở trạng thái tiết Tuy nhiên, có NoV có rất nhiều kiểu gen khác nhau và một số chủng có khả năng liên kết với kháng nguyên

Lea ở những cá thể không tiết và gây ra hiện tượng nhiễm không triệu chứng Các nghiên cứu trên mẫu nước bọt cho thấy các chủng NoV khác nhau nh n biết các HBGA khác nhau, trong đó NoV nhóm GI liên kết với các HBGA ở những cá thể tiết và thuộc nhóm máu A hoặc O mà không liên kết hoặc liên kết ở mức độ thấp với HBGA của các cá thể không tiết hoặc mang nhóm máu B Hạt VLP của các chủng GII.4 liên kết chủ yếu với HBGA của cá thể tiết mà không phân biệt cá thể thuộc nhóm máu nào [87]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ở mục tiêu 1, chúng tôi sử dụng mẫu phân của trẻ khỏe mạnh không có biểu hiện tiêu chảy để phát hiện NoV trong mẫu phân bằng phương pháp Real time RT-PCR

Ở mục tiêu 2, chúng tôi sử dụng mẫu quệt niêm mạc miệng của trẻ để khuếch

đại gen FUT-2, giải trình tự phát hiện SNP trên gen FUT-2 để đánh giá liên quan giữa tính cảm nhiễm NoV và kiểu gen FUT-2

Ở mục tiêu 3, chúng tôi sử dụng mẫu nước bọt của những trẻ này để phát hiện kháng nguyên A, B, H, Lea

, Leb, Lex, Ley bằng kỹ thu t ELISA để đánh giá mối tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức và khả năng

b Thời gian

- Thu th p mẫu trong 15 tháng (từ tháng 3/2014 đến tháng 5/2015)

- Xét nghiệm (xét nghiệm và định type NoV): Tháng 4 - tháng 7 năm 2015

2.3 Vật l ệu

2.3.1 Máy móc, dụng cụ

- Máy real time PCR Rotogene (Qiagen, Đức)

- Máy luân nhiệt (Eppendorf, Hoa Kỳ)

- Máy điện di (BioRad, Hoa Kỳ)

- Máy chụp ảnh gel VersaDoc (BioRad, Hoa Kỳ)

- Tủ lạnh thường -200C

- Tủ lạnh âm sâu -800C

- Máy ly tâm (Hettick, Đức),

- Đĩa 96 giếng Maxisorp (Nunc, Hoa Kỳ)

qRT-+ Chứng dương NoV chủng GI.1 và GII.4 (Phòng Miễn dịch Vắc xin, Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương)

+ Cặp mồi và đầu dò đặc hiệu NoV trong phản ứng Realtime RT-PCR

+ Bộ sinh phẩm One-step RT-PCR (Qiagen, Đức)

+ Bộ Kit Wizard SV gel and PCR Clean-up System (Promega, Hoa Kỳ)

- Sinh phẩm cho xác định kiểu gen FUT-2:

+ Kit tách chiết Gentra Puregene Buccal Cell Kit (Qiagen, Đức)

+ Mồi amplify đoạn 1033 bp của gen FUT 2 (IDT, Hoa Kỳ)

+ Bộ Kit Wizard SV gel and PCR Clean-up System (Promega, Hoa Kỳ)

- Sinh phẩm cho xác định kiểu hình HBGA (ABH và Lewis)

+ Các loại kháng thể đơn dòng A, B, H, Lewis x, Lewis y, Lewis a, Lewis b (Covance, Hoa kỳ)

+ Các loại kháng thể cộng hợp đề kháng chuột (KPL, Hoa Kỳ)

2.4 P n p áp n ên cứu

2.4.1 Thu thập bệnh phẩm

- Thu th p mẫu phân: Dùng thìa sạch lấy khoảng 5 g phân từ bô của trẻ không

có biểu hiện tiêu chảy cho vào ống vô trùng, không có chất bảo quản Bảo quản ống ở

-200C rồi v n chuyển đến viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương định kỳ 1 tháng/1 lần Tại phòng thí nghiệm mẫu được bảo quản ở -700C đến khi làm xét nghiệm

- Thu th p mẫu niêm mạc: Lấy mẫu niêm mạc ít nhất 30 phút sau khi trẻ ăn Dùng chổi lấy mẫu quệt vào 2 má trong của trẻ, mỗi bên 10 lần Cắt phần lông chổi cho vào ống có chứa 1 ml đệm bảo quản Bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 tháng trước khi tách chiết mẫu ADN

- Thu th p mẫu nước bọt: Lấy nước bọt bằng ống hút Mỗi trẻ lấy khoảng 100-200µl nước bọt, bảo quản mẫu ở 4oC rồi v n chuyển đến viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

Số lượng mẫu và mục đích nghiên cứu được thể hiện ở sơ đồ sau:

Hìn 2.1 S đồ tóm tắt các loạ mẫu t u t ập sử dụn c o n ên cứu

2.4.2 Kỹ thuật real time-RT PCR phát hiện ARN của NoV

a Phương pháp tách chiết ARN từ mẫu phân

Xử lý mẫu:

Bước 1: Mẫu phân được lấy từ -80oC Sau khi tan băng, pha loãng 4 lần bằng nước DEPC-H2O (100 µl mẫu: 300 µl nước DEPC-H2O)

Bước 2: Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC, thu dịch nổi

ARN đ ợc tách chiết t eo ớng dẫn của bộ kít H pure v ral ARN của

n à sản xuất Roc e, Đức Cụ thể:

Bước 1: Cho 200 µl dịch nổi mẫu pha loãng vào ống eppendorf 1,5 ml chứa hỗn hợp poly (A) carrier ARN: Binding Buffer, trộn đều trong 15 giây

Bước 2: Ủ ở nhiệt độ thường (15-25oC) trong 10 phút sau đó spindown

Bước 3: Đặt cột vào tuýp hứng 2 ml mới Đưa toàn bộ dung dịch mẫu và poly (A) carrier ARN: Binding Buffer lên cột (tránh không làm ướt mép cột) Đóng nắp lại và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 15 giây Chuyển cột sang tuýp 2 ml mới

Bước 4: Cẩn th n mở nắp cột, tránh không làm bắn giọt và nhiễm chéo Thêm

500 µ l Inhibitor Removal Buffer vào cột.Đóng nắp và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột sang tuýp 2 ml mới

Bước 5: Cẩn th n mở nắp cột và cho 450 ml Wash Buffer vào ống lọc Đóng nắp và ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút Chuyển cột sang tube 2 ml mới Bước 6: Cẩn th n mở nắp cột và cho 450 ml Wash Buffer (lần 2) vào ống lọc Đóng nắp và ly tâm 8000 vòng/ phút trong 1 phút Bỏ dịch trong tube 2 ml Ly tâm 13.000 vòng/phút trong khoảng 10 giây

Bước 7: Chuyển cột sang tuýp 1,5 ml mới và cho 50 µl dung dịch Elution Buffer vào giữa cột và ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 8: Bỏ cột, thu dịch, bảo quản ARN của virus ở -80°C

b Kỹ thuật realtime- RT PCR phát hiện ARN của NoV

Phát hiện ARN của NoV trong bệnh phẩm với cặp mồi và đầu dò đặc hiệu có

độ nhạy và đặc hiệu cao Sử dụng đầu dò đặc hiệu cho phép phát hiện và khẳng định sự có mặt ARN của NoV Cặp mồi nhằm vào đoạn gen tiếp nối giữa gen mã

hoá protein polymerase và gen mã hoá vỏ (capsid) của virus (vùng C), đây là đoạn

ít thay đổi nhất của NoV Một đoạn ngắn có kích thước ~100 bp sẽ được nhân lên

và nh n biết bởi đầu dò đặc hiệu trong vùng gen này Dựa vào tín hiệu huỳnh quang

để nh n biết sự có mặt của ARN của virus Trình tự mồi, đầu dò và quy trình kỹ thu t đã được Kageyama và cộng sự (2003) [44] sử dụng Ngưỡng dương tính thông thường của kỹ thu t real time RT-PCR phát hiện NoV này là 40 [44] Các mẫu dương tính có Ct<30 được giải trình tự gen để xác định kiểu gen NoV dựa trên việc phân tích vùng gen capsid

Bản 2.1 T àn p ần kỹ t uật Realt me RT-PCR đ n cặp pr mer và probe

p át ện NoV enotype GI

TT T àn p ần V (µl)/1 p ản ứn Nồn độ cuố cùn

3 Primer G1F-Pri.3007 (20 uM) 1,5 µl 2 uM

4 Primer G1R-Pri.3010 (20 uM) 1,125 µl 1,5 uM

5 Probe JJV1P-Pro.3015 (3 uM) 1,5 µl 0,3 uM

6 Enzyme SuperScript/Platinium 0,3 µl -

Bản 2.2 T àn p ần kỹ t uật Realt me RT-PCR đ n cặp pr mer và probe

p át ện NoV enotype GII

TT T àn p ần V (µl)/1 p ản ứn Nồn độ cuố cùn

3 Primer COG2F-Pri.3001 (20 uM) 1,125 µl 1,5 uM

4 Primer COG2R-Pri.3002 (20 uM) 1,125 µl 1,5 uM

5 Probe RING 2 TP-Pro.3003 (3 uM) 1,5 µl 0,2 uM

C trong 30 phút, 95oC trong 10 phút, 45 chu kỳ bao gồm:

94oC trong 20 giây, 55oC trong 30 giây và chọn kênh đọc Green

2.4.3 Kỹ thuật RT PCR khuếch đại đoạn gen vùng C của NoV

Các mẫu dương tính NoV tiếp tục được khuếch đại đoạn gen vùng C bằng cặp mồi đặc hiệu NoV, sử dụng bộ sinh phẩm One-step RT-PCR (Qiagen, Đức) Cặp mồi đặc hiệu NoV có trình tự là:

G1SKF: 5’- CTG CCC GAA TTY CTA AAT GA- 3’

G1SKR: 5’- CCA ACC CAR CCA TTR TAC A- 5’

Và G2SKF: 5’- CNT GGG AGG GCG ATC GCA A- 3’

G2SKR: 5’- CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT- 3’ [54]

Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 330 bp (đối với GI) và 368 bp (đối với GII).Sản phẩm PCR được tinh sạch theo quy trình hướng dẫn của bộ kit Winzard

SV gel and PCR Clean-up System (Hãng Promega-Hoa Kỳ) Cụ thể:

Bước 1: Gel sau khi chạy điện di dùng dao sạch và sắc để cắt gel có chứa sản phẩm mong muốn dưới tia cực tím Tránh để gel tiếp xúc với tia cực tím trong thời gian dài

Bước 2: Đặt gel đó vào trong tuýp 1,5ml, cân tuýp chứa gel Tính khối lượng gel thu được Nhỏ dung dịch Membrane Binding Solution vào tuýp chứa gel theo tỷ

lệ 100µl dung dịch Membrane Binding Solution tương ứng với 100mg gel Bước 3: Trộn và ủ tuýp trong bể ổn nhiệt ở 50oC-65oC trong 10 phút hoặc hơn

để gel tan hoàn toàn, cứ 2-3 phút trộn đều hỗn dịch 1 lần Nếu gel >2% thì tăng thời gian ủ

Bước 4: Sau khi gel tan hoàn toàn, đưa 350µl vào cột SV Minicolumn Ủ cột 1 phút tại nhiệt độ phòng Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 5: Nếu lượng hỗn dịch >350µl, lặp lại bước trên

Bước 6: Loại bỏ dịch Nhỏ 0,75ml dung dịch Membrane wash solution vào cột Bước 7: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch

Bước 8: Thêm 0,5ml Membrane wash solution vào cột, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 9: Loại bỏ dịch và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 10: Chuyển cột sang tuýp 1.5ml mới Nhỏ 50µl H2O-DEPC vào chính giữa màng, ủ ở nhiệt độ thường trong 1 phút sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Nếu cần tăng nồng độ sản phẩm mong muốn thì có thể giảm lượng

Kết quả giải trình tự gen được phân tích bằng phần mềm Mega5 Cây phân loại được xây dựng dựa vào các trình tự trên Genbank và các trình tự gen của các chủng NoV được tìm thấy trong nghiên cứu này

2.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen FUT-2

ADN được tách chiết từ mẫu niêm mạc miệng của trẻ theo hướng dẫn của bộ

kít Gentra Puregene Buccal Cell của nhà sản xuất Qiagen, Đức Cụ thể:

Bước 1: Mẫu tế bào niêm mạc miệng được thu th p bằng cách: Dùng chổi lấy mẫu quệt vào 2 má trong của trẻ, mỗi bên 10 lần để thu các tế bào miệng Để thu đc nhiều tế bào tốt nhất là lấy lúc sau ăn hay uống 1 giờ Cắt phần lông chổi vào ống 1,5ml Bảo quản ở nhiệt độ phòng tối đa 1 tháng trước khi tách chiết mẫu ADN ADN có thể được tách chiết ngay l p tức hoặc lưu trữ mẫu trong ống thu mẫu niêm mạc miệng tối đa 1 tháng ở nhiệt độ phòng (15-25°C)

Bước 2: Bổ sung 300 µl đệm Lysis Solution vào ống eppendorf 1,5 ml Dùng kéo sạch vô trùng cắt đầu phần lông chổi vào ống 1,5ml Các mẫu có thể được bảo quản trong đệm Lysis Solution ít nhất trong 2 năm ở nhiệt độ phòng

Bước 3: Phá vỡ tế bào làm theo bước 3a hoặc 3b dưới đây:

3a Ủ mẫu ở 65 °C trong vòng ít nhất 15 phút (để đạt hiệu quả cao có thể ủ mẫu trong vòng 60 phút)

3b Để đạt hiệu quả tách, thêm 1,5 µl Puregene proteinase K (cat no 158918), đảo trộn 25 lần và ủ ở 55°C trong vòng ít nhất 1 h (hoặc qua đêm để đạt hiệu quả cao nhất)

Bước 4: Lấy đầu dụng cụ ra bằng cách quẹt lên thành ống làm sao cho giữ được dịch nhiều nhất

Bước 5: Thêm 1,5 µl RNase và đảo trộn 25 lần Ủ mẫu ở 37°C trong 15 phút (hoặc 1 giờ) Sau đó, làm lạnh nhanh bằng cách thả vào đá trong vòng 1 phút Bước 6: Thêm 100 µl Protein Precipitation Solution và vortex mạnh trong khoảng 20s

Bước 7: Ủ trong đá trong khoảng 5 phút

Bước 8: Ly tâm mẫu ở 13000-16000 vòng/phút trong vòng 3 phút Các protein tủa thành hạt cứng Nếu protein không tủa thành viên cứng thì tiếp tục ủ mẫu trong đá 5 phút và ly ở 13000-16000 vòng/phút trong vòng 3 phút

Bước 9: Hút toàn bộ dịch nổi sang một eppendorf 1,5 ml sạch Bổ sung 300 µl