ẢNH HƯỞNG của FLORFENICOL lên SINH hóa HUYẾT học và tồn lưu TRÊN cá TRA NUÔI

Ảnh hưởng của kháng sinh florfenicol lên các chỉ tiêu sinh hóa, huyết học và sự tồn lưu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai đoạn giống có trọng lượng 1520 gcon được thực hiện tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ từ tháng 4102008. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3 lần trong hệ thống bể composite có sục khí liên tục, mật độ 70 conbể 500 L. Cá được cho ăn thức ăn có chứa florfenicol với liều lượng 0, 10, 30 và 100 mgkg khối lượng thânngày, liên tục trong 7 ngày. Các chỉ tiêu sinh hóa (enzyme ChE, LPO, GST và CAT ở cơ, gan, mang và não), huyết học (số lượng hồng cầu, bạch cầu, hematocrit, hemoglobin, MCV, MCH, MCHC và ion Na+, K+, Cl trong huyết tương) và tồn lưu được thu tại các thời điểm 0 ngày (chưa ăn kháng sinh); 1, 4, 7 ngày (ăn kháng sinh); 1, 5, 14, 28 ngày (ngưng ăn kháng sinh). Kết quả cho thấy florfenicol gây ức chế hoạt tính ChE ở não và gan, đồng thời làm tăng hoạt tính LPO, GST và CAT ở mô não, mang, gan và cơ. Sau khi cá ngưng ăn kháng sinh, hoạt tính các enzyme này có xu hướng phục hồi, mức độ và thời gian phục hồi phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh và loại mô. Số lượng hồng cầu, bạch cầu, hematocrit giảm và phục hồi sau khi cá ăn kháng sinh 15 ngày tùy lượng kháng sinh cá đã ăn

TÓM TẮT

Ảnh hưởng của kháng sinh florfenicol lên các chỉ tiêu sinh hóa, huyết học và sự

tồn lưu trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai đoạn giống có trọng

lượng 15-20 g/con được thực hiện tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

từ tháng 4-10/2008 Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và lặp lại 3lần trong hệ thống bể composite có sục khí liên tục, mật độ 70 con/bể 500 L Cáđược cho ăn thức ăn có chứa florfenicol với liều lượng 0, 10, 30 và 100 mg/kgkhối lượng thân/ngày, liên tục trong 7 ngày Các chỉ tiêu sinh hóa (enzyme ChE,LPO, GST và CAT ở cơ, gan, mang và não), huyết học (số lượng hồng cầu,bạch cầu, hematocrit, hemoglobin, MCV, MCH, MCHC và ion Na+, K+, Cl-

trong huyết tương) và tồn lưu được thu tại các thời điểm 0 ngày (chưa ăn khángsinh); 1, 4, 7 ngày (ăn kháng sinh); 1, 5, 14, 28 ngày (ngưng ăn kháng sinh) Kết quả cho thấy florfenicol gây ức chế hoạt tính ChE ở não và gan, đồng thờilàm tăng hoạt tính LPO, GST và CAT ở mô não, mang, gan và cơ Sau khi cángưng ăn kháng sinh, hoạt tính các enzyme này có xu hướng phục hồi, mức độ

và thời gian phục hồi phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh và loại mô Số lượnghồng cầu, bạch cầu, hematocrit giảm và phục hồi sau khi cá

ăn kháng sinh 1-5 ngày tùy lượng kháng sinh cá đã ăn Ngoài ra, các

chỉ tiêu MCV, MCH, hemoglobin, MCHC và ion Na+, K+ và Cl- trong huyếttương có sự biến động nhưng không đáng kể so với đối chứng Mức tồn lưuflorfenicol trong cơ cá chỉ phát hiện được ở duy nhất 1 nghiệm thức là NT-100tại thời điểm cá ăn kháng sinh 7 ngày với mức 336 ppb, sau khi cá ngưng ănkháng sinh không còn phát hiện florfenicol tồn lưu trong cơ cho đến khi kếtthúc thí nghiệm, kết quả này cho thấy thời gian đào thải florfenicol khỏi cơ thể

cá khá nhanh Hơn nữa, sử dụng florfenicol liên tục 7 ngày không ảnh hưởngđến tăng trưởng cá tra giống 20-30 g/con

ABSTRACT

The effect of florfenicol on biochemistry, hematology and residue on stripped

catfish (Pangasianodon hyppophthalmus) fingerlings (15-20 g/fish) was studied

in College of Aquaculture and Fisheries, Cantho University from April toOctober 2008 The experiment was randomly designed and triplicated incontinuously aerated composite tank system Fish were stocked at density of 70individuals per 500 liters tank They were fed with daily diets containing 0, 10,

30 and 100 mg florfenicol/kg body weight in consecutive 7 days Theparameters of biochemistry (enzyme ChE, LPO, GST and CAT in muscle, liver,gill and brain), hematology (quantity of red blood cell (RBC) and white bloodcell (WBC), hematoctit, hemoglobin, MCV, MCH, MCHC and ion Na+, K+, Cl-

in plasma) and residue of florfenicol in muscle were sampled at zero day(feeding without florfenicol); 1st, 4th, 7th day (feeding with florfenicol); and 1st,

5th, 14th, 28th day (after stopping feeding with florfenicol)

The result shows that florfenicol inhibits the ChE activity in brain and liver;and at the same time increases LPO, GST and CAT activities in brain, gill, liverand muscle These enzyme activities tend to recover after the feeding withflorfenicol has been stopped The degree and time of recovery depend on florfenicol concentration and type of tissue The quantity of RBC and WBC

and hematocrit value are decreased, but then it can be recovered in 1-5 daysafter non-feeding with florfenicol However, this completely depends on theamount of florfenicol that fishes have eaten In addition, the other ofhematological parameters such as MCV, MCH, hemoglobin, MCHC and ion

Na+, K+, Cl- in plasma are changed lightly, and non-significant with the control.The florfenicol residue in muscle is only detected in treatment 4 at 7th

contamination day with the residue concentration of 336 ppb Right after fisheshave been fed without florfenicol, the florfenicol is no longer found in muscleuntil the experiment ends The result indicates that the florfeniol residue wasdepleted from fish body rather fast Moreover, the using florfenicol in

consecutive 7 days cause no effect to the growth of Pangasianodon

hypophthalmus fingerlings (20-30 g/fish)

Chương 1 GIỚI THIỆU

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) phân bố tự nhiên ở một số nước

thuộc khu vực Đông Nam Châu Á như Campuchia, Thái Lan, Việt Nam… Đây

là loài cá nuôi quan trọng và mang lại giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam cá trađược nuôi rất phổ biến, đặc biệt là ở một số tỉnh vùng Đồng Bằng Sông CửuLong (ĐBSCL) như Cần Thơ, An Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Vĩnh

Long,

Mỗi năm diện tích nuôi cá tra ở ĐBSCL đều tăng, theo số liệu thống kêcủa Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến tháng 8/2009, toàn vùng cótổng diện tích nuôi cá tra là 5.154 ha So với năm 2000, diện tích này đã tăngkhoảng 10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới Tổng sảnlượng cá tra toàn vùng đến 14/8/2009 là 456.775 tấn với tốc độ tăng bình quântrong 8 tháng đầu năm 2009 là 13,5% (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nôngthôn, 2009)

Với xu hướng phát triển về diện tích và quy mô trong thời gian qua, mức

độ thâm canh hoá ngày càng cao và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng

trở nên nghiêm trọng, dịch bệnh xảy ra khắp nơi gây nhiều khó khăn và thiệt

hại không nhỏ cho người nuôi cá tra Đối phó với tình hình này người dân đã sửdụng hàng loạt các loại thuốc kháng sinh, hoá chất kể cả hoá chất, kháng sinhcấm hoặc hạn chế sử dụng để ngăn ngừa và điều trị bệnh cá Hơn nữa, đa phầnngười dân chưa hiểu rõ cách sử dụng cũng như chưa quan tâm đến sự ảnhhưởng của hoá chất, kháng sinh lên sinh trưởng và phát triển của cá, cũng nhưảnh hưởng đến môi trường sinh thái và đặc biệt là tác động đến chất lượng sảnphẩm khi thu hoạch Vấn đề lạm dụng hoá chất, kháng sinh đã và đang tạo ranguy cơ suy thoái môi trường, gây mất an toàn thực phẩm cho người tiêu dùngtrong nước và gây khó khăn cho xuất khẩu thuỷ sản

Để đáp ứng yêu cầu ngày càng nghiêm ngặt của một số thị trường xuấtkhẩu thuỷ sản về vấn đề dư lượng hoá chất, kháng sinh trong các sản phẩm thuỷsản xuất khẩu, Bộ Thuỷ sản (cũ), nay là Bộ Nông nghiệp & PTNT đã giao choViện Nghiên cứu NTTS II nghiên cứu tìm ra các chất thay thế những hoá chất,kháng sinh cấm sử dụng như Chloramphenicol (CAP), Nitrofuran, Malachitegreen, Trong số những hoá chất, kháng sinh được đề nghị thay thế cho nhómcấm sử dụng thì Florfenicol là một trong những chất được khuyến cáo sử dụngtrong điều bệnh nhiễm khuẩn trên cá tra, basa Đây là dẫn xuất củaThiamphenicol, có khả năng diệt khuẩn tương tự như CAP nhưng ít độc hơnCAP Kháng sinh này đã được EU cho phép sử dụng trên cá da trơn (catfish),mức giới hạn tối đa trong sản phẩm thuỷ sản xuất vào thị trường EU là 1.000ppb và Canada là 800 ppb Ở Việt Nam Florfenicol (FF) được khuyến cáo sửdụng trong điều trị bệnh mủ gan ở cá, tuy nhiên kháng sinh này thuộc danh mụckháng sinh hạn chế sử dụng trong sản xuất kinh doanh thủy sản, mức dư lượngtối đa cho phép là 1.000 ppb (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2009)

Florfenicol hiện đang được sử dụng phổ biến ở Việt Nam, nhất là vùngĐBSCL bởi những hiệu quả mà nó mang lại trong điều trị bệnh gan thận mủ ở

cá tra Mặc dù được sử dụng rộng rãi nhưng các nghiên cứu kháng sinh nàytrong nuôi trồng thuỷ sản hiện nay chưa nhiều, một số nghiên cứu chủ yếu tậptrung xác định khả năng và hiệu quả điều trị các bệnh nhiễm khuẩn trên một sốloài cá như cá hồi, cá da trơn , cơ chế tiêu diệt vi khuẩn của florfenicol… Đếnnay vẫn chưa có nghiên cứu nào xác định ảnh hưởng của florfenicol đến các chỉtiêu sinh hoá và huyết học ở cá tra, cũng như việc xác định thời gian tồn lưu củathuốc trong cơ thể cá tra Chính vì vậy, đề tài “Ảnh hưởng của kháng sinhFlorfenicol lên các chỉ tiêu sinh hóa, huyết học và tồn lưu trên cá tra

(Pangasianodon hyphthalmus) nuôi trong bể” được thực hiện

Mục tiêu của đề tài

Nhằm cung cấp những thông tin về sự bài tiết và tích luỹ của Florfenicol trong cơ cá tra cũng như ảnh

hưởng của thuốc đến sức khoẻ của cá, xác định mối liên hệ giữa sự lưu tồn và đáp ứngsinh học của cơ thể cá khi cho ăn kháng sinh thông qua phân tích các chất đánh dấusinh học (biomarkers)

Kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở để khuyến cáo việc sử dụng kháng sinhFlorfenicol một cách an toàn và hiệu quả cho nghề nuôi cá tra, đồng thời đâycũng là dẫn liệu khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo

Nội dung nghiên cứu

- Xác định sự thay đổi hoạt tính của các enzyme ChE, LPO, GST vàCAT khi sử dụng florfenicol với các nồng độ khác nhau

- Xác định sự ảnh hưởng của florfenicol lên một số chỉ tiêu huyết họccủa cá tra

- Xác định thời gian tồn lưu của florfenicol trên cá tra

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số nghiên cứu sinh hoá trên cá 2.1.1 Sơ lược về vai trò của các enzyme

Các chất đánh dấu sinh học (enzyme ChE, LPO, GST,…) được dùng nhưnhững thông số liên quan đến những tiến trình sinh lý quan trọng trong cơ thểsinh vật như chức năng của hệ thần kinh, sự giải độc, hay hàng rào bảo vệ cơ

thể sinh vật khỏi tác động của những nhân tố gây stress,… (Varó et al., 2007)

2.1.1.1 Enzyme Acethylcholine (AChE)

Enzyme AChE là một chất hóa học thần kinh đóng vai trò như một tác nhân

dẫn truyền thông tin qua các thể tiếp hợp giữa hai tế bào thần kinh (Ellman et

al., 1961) AChE rất cần thiết cho các chức năng bình thường của thần kinh

trung ương và thần kinh ngoại biên AChE khi bị ức chế dẫn đến sự tích tụ củaacethylcholine tại các synap (các khoảng trống giữa hai tế bào thần

kinh), làm mất chức năng dẫn truyền của các xung thần kinh (Hart, 1993)

Trong nghiên cứu độc học, AChE được sử dụng nhiều và có vai trò như chấtđánh dấu sinh học (bio-marker) Theo O’Brien (1976) enzyme Cholinesterase(ChE) bao gồm cả acetylcholinesterase (AChE) và butyl cholinesterase (BChE)(trích dẫn bởi Nguyễn Văn Công và ctv, 2006a)

Theo Ludin (1962), Sturm et al (2000) và Varó et al (2003) thì enzyme AChE

và BChE là hai enzyme thường hiện diện trong cùng một loại mô (được trích

dẫn bởi Varó et al., 2007) Varó et al (2007) cho biết AChE là enzyme chủ yếu

hiện diện trong mô não và theo ông thì các nghiên cứu trước đây cũng đã chứngminh rằng AChE là ChE chính hiện diện trong não của nhiều loài cá như

Gumbusia yucatana (Rendonvon Osten et al., 2005), Limanda limanda, Platichthys flesus và Serranus cabrila (Sturm et al., 1999) và Dicentrarchus labrax (Varó et al., 2003)

2.1.1.2 Enzyme Catalase (CAT)

CAT là một trong những enzyme chống oxy hóa phân bố tại các perixosome cóvai trò quan trọng trong việc loại bỏ H2O2, chất được sinh ra trong quá trình β-oxy hóa chuỗi a-xit béo dài CAT được nghiên cứu để đánh giá sự tác động củachất độc cũng như khả năng của cơ thể chống lại các gốc oxy hóa (ROS-

Reactive Oxygen Species) do chất độc gây ra Chance et al (1979) cho biết

CAT là enzyme hiện diện ở hầu hết tế bào động vật và thực vật (trích dẫn bởi

Tort et al., 2005) CAT nhanh chóng kết hợp với H2O2 để phân cắt H2O2 thành

O2 và H2O (Tort et al., 2005)

2.1.1.3 Enzyme Glutathione S-transferase (GST)

GST là enzyme có chức năng xúc tác phản ứng giữa các hợp chất có ái lực điện

tử (thuốc trừ sâu và kim loại nặng) với glutathione (GSH); các hợp chất lạ từ đóchuyển hóa thành N-acetyl cystine S dạng kết hợp sau đó sẽ được thải qua nướctiểu và phân (Yawad, 1989) Ngoài ra, Storey (1996) cũng cho rằng GST có vaitrò quan trọng trong việc xúc tác phản ứng giữa GSH với các thành phần tổn

thương của tế bào bị tấn công bởi ROS Theo Zhang et al (2004) enzyme này

có liên quan đến việc giải độc đối với những chất ngoại sinh, đóng vai trò quantrọng trong việc bảo vệ các mô từ sự tác động của ROS George (1994) cũngcho rằng GST đóng vai trò như hàng rào bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân

oxy hóa và những sản phẩm lipid mang tính peroxyde (trích dẫn bởi Varó et al.,

2007) GST được xem như một enzyme quan trọng trong đánh giá tình trạngstress của động vật

2.1.1.4 Enzyme Lipid peroxidation (LPO)

Lipid peroxidation (LPO) là chất có liên quan đến các tác nhân oxy hoá trong

cơ thể, thường góp phần vào các tiến trình phát sinh bệnh Trong quá trình hôhấp hiếu khí tế bào đã sản sinh ra các gốc oxy hóa (Reactive Oxygen Species-ROS): superoxide anion (O2*), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl (*OH).ROS được tạo ra trong quá trình hô hấp hiếu khí này cần được phân hủy vàtrung hòa để tránh gây tổn thương cho sinh vật và thành phần nhạy cảm nhấtcủa tế bào đối với ROS là chuỗi a-xit béo chưa bảo hòa trên màng tế bào Hệquả của quá trình này là LPO được tạo thành (điều kiện bình thường LPO vẫnđược sinh ra) và đây là chất độc đối với tế bào Tuy nhiên, để chống lại ROS cơthể sinh vật thích ứng bằng cách sử dụng các nhân tố chống oxy hóa bao gồmcác chất không phải là enzyme (vitamin E, vitamin C, glutathione,…) và

enzyme CAT, Glutathione reductase, superoxyde dimutase (SOD) (Zhang et al.,

2004) Cũng theo tác giả này thì sự cân bằng giữa các nhân tố chống oxy hóa vàkhả năng tạo ROS là rất cần thiết để tránh các tổn thương cho các tế bào Songmột số hóa chất có thể trực tiếp hoặc gián tiếp làm đảo lộn sự cân bằng này dẫnđến cơ thể bị stress do các tác nhân oxy hóa gây ra Do đó, LPO được nghiêncứu nhiều để đánh giá sự ảnh hưởng của chất lên biến đổi sinh hóa, sức khỏecủa sinh vật

2.1.2 Một số nghiên cứu sinh hoá trên cá

Theo Đỗ Thị Thanh Hương (1997) thì hoạt tính của men AChE trong huyếttương của 3 loài cá chép, rô phi và mè vinh bị ức chế rất mạnh trong vòng 96giờ đầu khi tiếp xúc với Basudin 40EC Mức độ ức chế >80% ở nồng độ an toàn

và chỉ dẫn và >90% ở nồng độ LC50 96 giờ Khả năng phục hồi của men bắt đầusau ngày thứ 10 và rất chậm, ở những nghiệm thức nồng độ an toàn và chỉ dẫnđạt 70-90% và những nghiệm thức nồng độ LC50 96 giờ chỉ đạt 60-80% so vớiđối chứng sau 30 ngày Như vậy, dựa vào mức độ hoạt tính của men AChE cóthể dùng như một chất chỉ thị sinh học để đánh giá tình trạng sức khỏe cá vàmôi trường bị nhiễm thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ và gốc carbamate

Theo Fulton and Key (2001); Silva et al., (2004); Rendón-von Osten et al.

(2005) thì trong ngành khoa học nghiên cứu về các loại độc chất thì hoạt tínhcủa AChE ở sinh vật được xem như là một chỉ tiêu để phát hiện những hóa chấtnhư lân hữu cơ, carbamate và một số loại thuốc trừ sâu khác (trích dẫn bởi

Huixian Li et al., 2008) Chính vì vậy, enzyme ChE được dùng như chất đánh

dấu sinh học cho môi trường bị ô nhiễm bởi các loại hoá chất bảo vệ thực vật

gốc lân hữu cơ và carbamate (Coppage et al., 1975; Peakall, 1992;

Kirby et al., 2000 trích dẫn bởi Nguyễn Văn Công và ctv, 2006a)

Không những thế, Boone and Chamber (1997), Bocquené et al (1990), Sturm

et al (1999, 2000), Varó et al (2003) còn cho rằng hoạt tính của ChE còn được

dùng để đánh giá ảnh hưởng của độc chất lên thần kinh của cá sống trong môi

trường ô nhiễm nông dược (trích dẫn bởi Varó et al., 2007)

Nguyễn Văn Công và ctv (2006a) chỉ ra rằng, ở cá lóc hoạt tính ChE khác nhautheo cơ quan, cụ thể là hoạt tính ChE cao nhất trong não, kế đến là trong thịt vàthấp nhất là trong gan Trong điều kiện môi trường nước có basudin 50EC (chứa50% hoạt chất diazinon) thì hàm lượng DO không ảnh hưởng đến mức độ ứcchế ChE, chỉ có nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến sự ức chế này, nhiệt độ càng caothì khả năng ức chế ChE càng tăng (ngoại trừ ở gan)

Basudin 50EC (Diazinon) rất độc, làm giảm đáng kể hoạt tính ChE ở nồng độ0,016 mg/L, sự ức chế này gia tăng theo sự gia tăng nồng độ Ngoài ra, diazinoncòn làm giảm sinh trưởng của cá lóc trong điều kiện phòng thí nghiệm.Diazinon ở nồng độ 0,35 mg/L ức chế 50% tốc độ tăng trưởng tương đối(%/ngày) ở 40 ngày so với đối chứng và giảm còn khoảng 30% ở thời điểm kếtthúc thí nghiệm (60 ngày) (Nguyễn Văn Công và ctv., 2006b)

De Mel and Pathiratne (2005) khi nghiên cứu trên đối tượng cá chép (Cyprinus

carpio) cho thấy hoạt tính AChE bị ức chế mạnh nhất (29-81%) bởi

Chlorpyrifos, tiếp đó là Dimethoate (ức chế 25-63%), Carbaryl (ức chế 1934%)

và cuối cùng là Carbosulfan (ức chế 3-37%) Mức độ ức chế tùy thuộc vào nồng

độ thuốc, hoạt tính AChE bị ức chế mạnh nhất là ở mô não Khả năng phục hồi(mức độ và thời gian) của enzyme AChE cũng tùy thuộc vào loại thuốc, nồng

độ và thời gian tiếp xúc Ở nồng độ 0,5% LC50, hoạt tính AChE ở não phục hồihoàn toàn sau 7 ngày đối với Carbosulfan và 14 ngày đối với Carbaryl; ở nồng

độ 1% LC50 thì hoạt tính AChE phục hồi hoàn toàn sau 14 ngày đối vớiCarbosulfan và 21 ngày đối với Carbaryl Trong khi đó, ngay cả ở nồng độ thấp(0,5% LC50) thì hoạt tính AChE cũng không thể phục hồi hoàn toàn sau 21 ngàyđối với Chlorpyrifos (chỉ phục hồi 36-78% so với bình thường) và Dimethoate(chỉ phục hồi 56-84% so với bình thường) Như vậy, thời gian phục hồi hoạttính AChE sau khi ngưng tiếp xúc với Carbamate (Carbosulfan và Carbaryl)nhanh hơn so với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ (Chlorpyrifos và Dimethoate) Vần đề phục hồi hoạt tính AChE sau khi tiếp xúc với các loại thuốc trừ sâu gốclân hữu cơ hay carbamate được Post (1985) giải thích rằng, AChE rất khó phụchồi khi tiếp xúc với thuốc trừ sâu gốc lân hữu cơ là vì liên kết giữa

lân hữu cơ và AChE rất khó bị phá vỡ, hoạt tính bình thường của AChE chỉ có

thể được phục hồi bằng cách tổng hợp AChE mới (không bị ảnh hưởng bởithuốc) Trong cơ thể cá quá trình tổng hợp AChE luôn được thực hiện ở tốc độbình thường, vì vậy để phục hồi hoàn toàn hoạt tính AChE đòi hỏi phải có thờigian nhất định Ngược lại, Carbamate có phản ứng với AChE khác với lân hữu

cơ, liên kết giữa Carbamate và AChE là một liên kết yếu, những cá bị ảnhhưởng bởi loại thuốc này không cần phải tổng hợp đầy đủ AChE mới vì AChE

có thể được giải phóng từ liên kết giữa Carbamate và AChE (trích dẫn bởi DeMel and Pathiratne, 2005)

Theo Zhang et al., (2004) nghiên cứu sự ảnh hưởng 2,4-dichorophenol trên gan

cá vàng (Carassius aurtus) sau 40 ngày thì thấy CAT tăng nhưng không tỉ lệ

thuận với nồng độ thí nghiệm (0,005-1,0 ppm) Mặt khác, nghiên cứu của

Cazenave et al (2006) cho thấy hoạt tính của CAT trên gan, mang, não cá

Corydoras Paleatus khi tiếp xúc với Microsystin-RR ở các nồng độ 0,5; 2,5 và

10ppb sau 24 giờ Kết quả cho thấy ở nồng độ microsystin-RR lớn hơn hoặcbằng 2 ppb thì hoạt tính LPO trong não có sự thay đổi trong khi đó ở gan, mangvẫn bình thường Đối với gan và não thì hoạt tính GST giảm ở nồng độ 0,5 µg/l

và CAT tăng ở gan đối với các nồng độ thí nghiệm

Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Hiền (2007) cho thấy, hoạt tính của các enzymeAChE, CAT, GST và LPO ở cơ, mang, gan và não của cá tra giống có sự biếnđộng khi cho ăn kháng sinh enrofloxacine Kháng sinh này làm giảm hoạt tínhcủa men AChE, sau 24 giờ ngưng cho ăn kháng sinh thì hoạt tính của menAChE có xu hướng giảm chậm và bắt đầu tăng dần trở lại sau 171 giờ tiếp theo.Ngược lại, kháng sinh làm tăng hoạt tính của các men CAT, GST và LPO ở cơ,gan và mang Mật độ ương nuôi càng cao trong thời gian dài thì hoạt tính củacác men CAT, GST và LPO ở cơ, gan và mang cá càng tăng cao, trong khi đóhoạt tính của men AChE càng giảm, mức độ stress càng cao Hoạt tính củaAChE, CAT và LPO được tìm thấy cao nhất ở não; GST thì cao nhất ở gan

Varó et al (2007) cho thấy rằng khi cho cá vền biển (Sparus aurata) vào môi

trường có Dichlorvos với nồng độ dưới mức gây chết sẽ gây ra sự ức chếkhoảng 75% hoạt tính của ChE ở não, tăng hoạt tính của LPO và sự gia tăng

hoạt tính LPO ở đầu cá vền biển (Sparus aurata) có tương quan với sự ức chế

hoạt tính AChE ở não cá Theo tác giả thì nghiên cứu về sự ảnh hưởng của

Diazinon trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) của Üner et al (2006) cũng cho

kết quả tương tự Đối với GST thì hoạt tính của enzyme này không khác biệtsau khi thả vào môi trường có Dichlorvos 24 giờ, kết quả này tương tự

như kết quả nghiên cứu của Osten et al (2005), không có sự ảnh hưởng đến

hoạt tính của GST ở mang cá Gambusia yucatana trong môi trường có lân hữu

cơ

Huixian Li et al (2008) khi nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc trừ sâu methomyl trên cá Pseudorasbora parva cho thấy sau 96 giờ tiếp xúc thì hoạt tính AChE ở

não giảm 48% ở nồng độ 0,043 mg/L và 0,213 mg/L; hoạt tính GST ở gan cũnggiảm 40% ở nồng độ 0,085 mg/L và 0,123 mg/L

Hoạt tính AChE ở não cá Seriola dumerilli sẽ giảm dần khi nồng độ Malathion

tăng (4 mg/kg, 6 mg/kg) sau khi tiếp xúc 2 ngày và 7 ngày Cũng trong nghiên

cứu này Jebali et al (2006) cho thấy rằng sau 2 ngày cá Seriola dumerilli sống

trong môi trường có Cadmium thì hoạt tính AChE tăng ở nồng độ thấp (50µg/kg) nhưng lại bị ức chế mạnh ở nồng độ cao (100 µg/kg và 250 µg/kg).Ngoài ra, khi môi trường bị ô nhiễm Malathion, đồng thời có sự hiện diện củaCadmium thì nồng độ Malathion sẽ tăng nhanh trong gan cá

Các enzyme chống oxy hóa là chỉ thị tốt nhất phản ảnh sự ô nhiễm kim loạinặng Trong môi trường có sự hiện diện của Pb2+ và Cu2+ sẽ làm giảm hoạt tínhcủa các enzyme GSH-Px và SOD trong các mô gan, lách, não và tim của cá hồi

(Oncorhynchus mykiss), trong khi đó hoạt tính của LPO ở các mô này lại tăng hơn so với đối chứng Trong nghiên cứu trên Ates et al (2007) còn chứng minh

được rằng khi môi trường nhiễm kim loại nặng (Pb2+ và Cu2+) và có sự hiện diệncủa Selenium (Se4+) thì hoạt tính của các enzyme GSH-Px, SOD tăng và LPOgiảm hơn so với không có sự hiện diện của Se4+ Điều này có nghĩa là sự hiệndiện của Selenium trong môi trường sẽ làm giảm sự tác động của Pb2+, Cu2+ lêncác enzyme (GSH-Px, SOD, LPO), hay nói cách khác Selenium làm giảm sựảnh hưởng của các kim loại nặng này lên sức khỏe của cá

Khi nghiên cứu sự ảnh hưởng của Cadmium lên các emzyme SOD, CAT và

LPO ở mô cơ, gan, mang, não và thận của cá trê phi (Clarias gariepinus) Asagba et al (2008) cho thấy rằng sau 7 ngày nuôi trong môi trường có

Cadmium hoạt tính của LPO và CAT ở mô không có sự khác biệt so với đốichứng, trong khi hoạt tính của SOD giảm ở mang nhưng lại tăng ở thận và khácbiệt có ý nghĩa (p<0,05) so với đối chứng Sau 21 ngày, hoạt tính CAT vẫnkhông có sự khác biệt giữa các nghiệm thức thí nghiệm; hoạt tính của LPO ởthận tăng có ý nghĩa so đối chứng; tương ứng với sự gia tăng LPO ở thận thìhoạt tính SOD ở mô này giảm có ý nghĩa so với đối chứng, tuy nhiên đối với

mô gan thì hoạt tính SOD lại tăng có ý nghĩa so với đối chứng

Như vậy, có thể nói rằng ảnh hưởng của Cadmium đến hoạt tính của enzyme

LPO và SOD tùy thuộc vào nồng độ, loại mô và thời gian cá tiếp xúc với

Cadmium

Khi thả cá Esomus danricus vào môi trường có Cu2+ thì hoạt tính của enzymeCAT giảm có ý nghĩa ở nồng độ dưới mức gây chết (0,55 mg/L) và nồng độ gâychết (LC50 96h = 5,5 mg/L) ở thời điểm 48, 72 và 96 giờ; hoạt tính LPO thì chỉtăng có ý nghĩa ở nồng độ gây chết ở thời điểm 24 và 96 giờ, với nồng độ dướimức gây chết không ảnh hưởng đến hoạt tính của LPO Với kết quả này

Vutukuru et al (2006) kết luận Cu2+ là chất có độc tính cao đối với cá và hoạt

tính các enzyme CAT, LPO có tương quan tuyến tính thuận với nồng độ và thờigian cá tiếp xúc với Cu2+

Cá sống trong điều kiện mực nước thấp hay mức oxy hòa tan trong nước khácnhau cũng ảnh hưởng đến hoạt tính các enzyme LPO, CAT, GST Cá hồi

(Oncorhynchus tshawytscha) bị gây stress bằng cách cho cá sống ở mực nước

thấp (6,5-7,5 cm, vây cá ở trên mực nước này), kết quả cho thấy sau 6 giờ hoạttính LPO ở thận, gan và não đều giảm, trong đó hoạt tính LPO ở thận là giảm có

ý nghĩa (Welker et al., 2004) Hoạt tính LPO ở gan và máu cá Leporinus

elongatus trong điều kiện oxy bình thường (6,94±0,08 mg/L trong 7 ngày) và

oxy vừa (3,91±0,09 mg/L trong 7 ngày) cao hơn ở cá sống trong điều kiện oxythấp (1,92±0,09 mg/L trong 14 ngày); hoạt tính GST ở gan giảm khi oxy tăng,ngược lại GST trong máu không thay đổi với các mức oxy khác nhau; hoạt tính

của CAT ở gan và máu cá cũng không có sự khác biệt giữa các nhóm (Filho et

al., 2005)

Qua các nghiên cứu trên cho thấy, các loài cá rất dễ bị tác động bởi những nhân

tố bên ngoài cũng như sự thay đổi của môi trường Thông qua việc đo hoạt tínhcác enzyme, hay nói cách khác sự biến đổi một số chỉ tiêu sinh hóa ở cá có thểđánh giá được mức độ ảnh hưởng của các nhân tố bên ngoài đến sức khỏe cá

2.2 Một số nghiên cứu về huyết học trên các đối tượng thủy sản nuôi 2.2.1 Thành phần cấu tạo và vai trò của máu

Số lượng máu trong cơ thể cá ít hơn so với máu ở động vật bậc cao vì nănglượng tiêu hao cho quá trình trao đổi chất của cá ít hơn Cá nước ngọt có sốlượng máu tổng cộng chiếm 2,7% khối lượng cơ thể và biến động trong khoảng1,8-4,1% Đối với cá biển lượng máu chiếm 4,1% và dao động từ 1,97,3% Cónhiều yếu tố ảnh hưởng đến số lượng máu trong cơ thể cá như phương thứcsống và trạng thái sinh lý của cá: cá hoạt động nhanh nhẹn có số lượng máunhiều hơn cá ít hoạt động (http://agriviet.com)

Thể tích máu gia tăng theo tuổi và giai đoạn thành thục sinh dục Thể tích máu

cá đực cao hơn cá cái trưởng thành Điều kiện sống cũng ảnh hưởng đến lượng

máu của cá: cá tầm Acipenser ruthenus sống ở sông hoặc hồ có điều kiện sống

tốt (dinh dưỡng tốt) thì lượng máu nhiều hơn so với những cá thể cùng loài sống

ở ao hồ có điều kiện sống kém (dinh dưỡng kém)

(http://agriviet.com)

Khi đem máu ly tâm hoặc để máu lắng tự nhiên trong môi trường lạnh sẽ diễn

ra quá trình phân chia thành phần dịch lỏng gọi là huyết tương (chất dịch cómàu vàng nhạt hoặc không màu) và phần lắng đọng (có màu đỏ) được hìnhthành từ các thành phần hữu hình của máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) Huyếtthanh là huyết tương đã bị loại fibrinogen.(http://agriviet.com) Theo Đỗ ThịThanh Hương (2000) thì huyết tương là bộ phận chủ yếu tiếp nhận và vậnchuyển các chất thải từ các tổ chức trong cơ thể cá đến cơ quan bài tiết để thải

ra ngoài Thành phần huyết tương gồm có 90% nước, phần còn lại bao gồm cácchất hoà tan (albumin, globulin, fibrinogen, khoáng ), chất dinh dưỡng (a-xitamin, glucid, ), chất bài tiết (urê, a-xit uric )

Tỉ lệ giữa thể tích huyết cầu và huyết tương thay đổi theo giống loài và phươngthức sinh sống của cá Thông thường huyết cầu chiếm khoảng 27%, cao nhất là

36% như ở cá chép, thấp nhất là 16% như ở cá hàm ếch Lophius piscatorius

(http://agriviet.com)

Chức năng chính của máu là cung cấp các chất nuôi dưỡng và cấu tạo các tổchức cũng như loại bỏ các chất thải trong quá trình chuyển hóa của cơ thể nhưkhí carbonic và a-xit lactic Máu cũng là phương tiện vận chuyển của các tế bào(cả tế bào có chức năng bảo vệ cơ thể lẫn tế bào bệnh lý) và các chất khác nhau(các amino a-xit, lipid, hormone) giữa các tổ chức và cơ quan trong cơ thể Cácrối loạn về thành phần cấu tạo của máu hay ảnh hưởng đến sự tuần hoàn bìnhthường của nó có thể dẫn đến rối loạn chức năng của nhiều cơ quan khác nhau(Đỗ Thị Thanh Hương, 2000)

Theo Đỗ Thị Thanh Hương (2000) thì hồng cầu là những tế bào có nhân, cótính đàn hồi, có thể co dãn và biến đổi hình dạng tế bào để chui qua các maomạch Chức năng chính của hồng cầu là vận chuyển oxy từ cơ quan hô hấp đếncác cơ quan khác của cơ thể, đồng thời chuyển Carbonic từ các cơ quan về cơquan hô hấp để thải ra ngoài

Có 2 loại hồng cầu là hồng cầu trưởng thành và hồng cầu chưa trưởng thành

(Hrubec et al., 2000; Zexia et al., 2007)

Số lượng hồng cầu trong máu cá thay đổi rất lớn Ở cá nước ngọt số

lượng hồng cầu dao động trong khoảng 1-3,5 triệu tb/mm3, ở cá biển số lượng

này dao động từ 0,9-4 triệu tb/mm3 (http://www.agriviet.com)

Bạch cầu: là tế bào có nhân, kích thước lớn hơn hồng cầu Dựa vào đặc tính bắtmàu với thuốc nhuộm mà người ta chia bạch cầu làm 2 loại: bạch cầu có hạtgồm tế bào ưa a-xit - eosinophil, tế bào ưa kiềm - basinophyl, tế bào trung tính– neutrophyl và bạch cầu không hạt gồm tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân -monocyte Chức năng chính của bạch cầu là giúp cho cơ thể chống lại các bệnhtruyền nhiễm và các vật thể lạ trong máu Số lượng bạch cầu biến đổi lớn theoloài, tình trạng sinh lí, tuổi, dinh dưỡng, nhiệt độ và thành thục sinh dục (Đỗ ThịThanh Hương, 2000) Trong đó:

- Tế bào Lympho (Lymphocyte): phổ biến trong máu, chiếm 20-40%,

tế bào chất trong suốt, nhân lớn chiếm gần hết tế bào Nhân bắt màuxanh đậm với thuốc nhuộm Giemsa

- Bạch cầu đơn nhân (monocyte): chiếm 3-8%, nhân hình móng ngựa,nhân bắt màu xanh đậm

- Bạch cầu trung tính (neutrophyl): chiếm 50-70%, nhân là 1 dãy hayhình móng ngựa Nhân bắt màu xanh nhạt hoặc hơi hồng

Ngoài ra, Goel et al (1981) cho biết máu là thành phần quan trọng để nghiên

cứu ảnh hưởng của độc chất lên sinh vật (được trích dẫn bởi John, 2006) Cácchỉ tiêu huyết học là những chỉ thị tốt nhất cho tình trạng sức khỏe, stress hay

tình trạng bệnh của cá (Valenzuela et al., 2006; Zexia et al., 2007) Theo Silveira-Goffigny et al (2004), các chỉ thị huyết học thay đổi theo tuổi tác, dinh dưỡng Ngoài ra, theo Person-Le Ruyet et al (2004) và Affonso et al (2002)

các chỉ thị này còn thay đổi theo điều kiện môi trường như nhiệt độ, oxy hòa

tan, các yếu tố gây ô nhiễm (được trích dẫn bởi Valenzuela et al.,

2006)

2.2.2 Một số nghiên cứu về huyết học trên cá

Số lượng hồng cầu của cá chép, rô phi và mè vinh gia tăng trong khoảng 24 giờđầu khi tiếp xúc với thuốc trừ sâu Basudin 40EC ở nồng độ LC50 96 giờ Ở thờiđiểm 12 giờ sau khi tiếp xúc với thuốc số lượng hồng cầu tăng 1,3 – 1,6 lần ở 3loài cá trên Ở nồng độ LC50 96 giờ hàm lượng hemoglobin và tỉ lệ huyết cầu(hematocrit) của 3 loài cá này đều tăng ở thời điểm 12 giờ (Đỗ Thị ThanhHương, 1997)

Ajani (2005) cho rằng mức độ đầu tư và biện pháp kỹ thuật áp dụng trong hệ thống nuôi (quảng canh, bán thâm canh và thâm canh) có ảnh hưởng đến các chỉ tiêu huyết

học ở cá trê phi (Clarias gariepinus) Một số chỉ tiêu huyết học của cá nuôi trong hệ

thống bán thâm canh có giá trị cao nhất (tỷ lệ huyết sắc tố 37,1%, số lượng hồng cầu2,83 triệu tb/mm3, số lượng bạch cầu 3,4.103 tb/mm3, nồng độ các ion Na+ 134,6mg/dL và Cl- 104,7 mg/dL) so với các giá trị này của cá nuôi ở hệ thống nuôi quảngcanh và thâm canh

Cá tầm Trung Quốc (Acipenser sinensis) có số lượng hồng cầu 84,86x104 tếbào/mm3 và số lượng bạch cầu 2,24x104 tế bào/mm3; bạch cầu của cá gồm 4loại chính, trong đó tiểu cầu (thrombocytes) chiếm tỷ lệ cao nhất (60,78%),lymphocytes và monocytes có tỷ lệ tương đương nhau (12,1% và 12,47%),bạch cầu có hạt gồm neutrophil chiếm 10,43% và eosinophils chiếm 4,22%

(Zexia et al., 2007)

Theo John (2007) khi cho cá Mystus vittatus tiếp xúc với Metasystox (một dạng

thuốc trừ sâu có gốc lân hữu cơ) hay Sevin (carbamate) trong thời gian 30 ngàythì số lượng hồng cầu (1,53 triệu tb/mm3 và 1,47 triệu tb/mm3), hematocrit(15,25% và 14,3%), hemoglobin (8,3 g/dL và 8,2 g/dL) và MCV (99,92 µm3 và97,35 µm3) giảm so với đối chứng (tương ứng 2,04 triệu tb/mm3, 20,45%, 10,8g/dL và 100,19 µm3); trong khi đó, số lượng bạch cầu (35,35x103 tb/mm3 và36,93x103 tb/mm3), MCH (54,48 pg và 55,82 pg) và MCHC (54,43 dL và 57,34dL) lại tăng so với đối chứng (tương ứng 27,5x103 tb/mm3, 52,91 pg và 52,81pg)

Cá rô phi lai có 3 loại tế bào máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu Trong đóbạch cầu được chia làm 6 loại, bao gồm lymphocyte nhỏ, lymphocyte lớn,neutrophils, monocytes, eosinophils và một dạng tế bào giống như tiểu cầu(thrombocyte-like cells) Khi được nuôi ở mật độ cao (120 g/L), số lượng hồngcầu dao động trong khoảng 1,91-2,83 triệu tb/mm3, số lượng bạch cầu 21,6-154,7.103 tb/mm3, các giá trị PCV, Hb, MCV, MCH và MCHC lần lượt là 27-

37%, 7,0-9,8 g/dL, 115-183 fL, 28,3-42,3 pg và 22-29 g/dL (Hrubec et al.,

2000)

Borge et al (2004), khi nghiên cứu quần thể cá Jundiá (Rhamdia quelen) vùng

nước ngọt Nam Mỹ cho thấy loài cá này có số lượng hồng cầu (2,2-4,2 triệutb/mm3), số lượng bạch cầu (70,1-111,8.103 tế bào/mm3) và hematocrit (37-

51%) cao hơn so với ở con lai của cá rô phi trong nghiên cứu của Hrubec et al.

(2000) Tuy nhiên, các chỉ số hemoglobin (7,5-9,1g/dL), MCV (104,3-156,8fL), MCH (22,6-33,5 pg) và MCHC (16,9-23,6 gd/L) tương tự như ở cá rô philai

Theo Das et al (2004) thì hàm lượng NO2- trong hệ thống ương nuôi

làm thay đổi hầu hết các chỉ tiêu huyết học ở cá Catla (Catla catla) giai đoạn

giống, mức độ thay đổi tùy thuộc vào nồng độ nitrite và thời gian cá sống trongmôi trường có nitrite Ở nồng độ nitrite < 2 mg/L sau 96h không gây ra nhiềubiến đổi đối với các chỉ tiêu huyết học Tuy nhiên, ở nồng độ nitrite cao từ 4-10,4 mg/L làm giảm số lượng hồng cầu, bạch cầu, hemoglobin và protein tronghuyết tương, đồng thời làm tăng lượng đường glucose trong máu

Một số kim loại nặng như chì (Pb2+), đồng (Cu2+) tồn tại (đơn lẻ) trong môi

trường sẽ làm thay đổi các chỉ tiêu huyết học ở cá hồi (Oncorhynchus mykiss)

sau 72 giờ tiếp xúc Các kim loại nặng này (nồng độ 2 ppm cho từng kim loại)tác động làm tăng số lượng bạch cầu, MCV và MCH; giảm số lượng hồng cầu,hematocrit và hemoglobin so với các chỉ tiêu này ở những cá hồi không tiếp xúc

Pb2+ và Cu2+ Đồng thời, nghiên cứu cũng cho thấy Selenium (Se4+) là một chất

có khả năng hạn chế sự ảnh hưởng Pb2+, Cu2+ đến các chỉ tiêu huyết học của cá

hồi (Ates et al., 2007)

Theo Celik et al (2006) thì cá “Black scorpion fish” (Scorpaena porcus) khi bị nhiễm ký sinh trùng Trachelobdella lubrica sẽ giảm có ý nghĩa về số lượng

bạch cầu (20.830±3.360 tb/mm3) và hematocrit (19,83±1,17%) so với ở cá khỏe(32.000±1.800 tb/mm3 và 23,42±0,69%) Các chỉ số huyết học khác ở cá bệnhthấp hơn nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với ở cá khỏe, số lượnghồng cầu (366.583±14.310 tb/mm3 so với 411.000±15.380 tb/mm3), các ion Na+

(176,5±1,98 mM/L so với 181,42±2,17 mM/L), K+ (3,23±0,23 mM/L so với4,04±0,25 mM/L), Cl- (150,83±3,1 mM/L so với 159,75±3,89 mM/L)

Theo Lumlertdacha et al (1995) thì cá nheo (Ictalurus punctatus) ăn thức ăn có nấm Fusarium moniliforme (FB1) sẽ làm thay đổi một số chỉ tiêu huyết học, các

chỉ tiêu này có xu hướng giảm khi nồng độ FB1 trong thức ăn tăng (20, 80, 320,

720 mg/kg) Cá nheo 1 năm tuổi ăn thức ăn có chứa 80 mg FB1/kg thì số lượnghồng cầu (2,13 triệu tb/mm3), bạch cầu (9,8x103 tb/mm3) và hematocrit (30,7%)giảm có ý nghĩa (p<0,05) so với nghiệm thức đối chứng 0,3 mg FB1/kg (các giátrị huyết học lần lượt là 2,61 triệu tb/mm3, 12,9x103 tb/mm3 và 36,6%) Cá nheo

2 năm tuổi thì số lượng hồng cầu và hematocrit giảm có ý nghĩa (p<0,05) khinồng độ FB1 trong thức ăn ở mức 320 mg/kg và 720 mg/kg; số lượng bạch cầugiảm khi cá ăn thức ăn có nồng độ FB1 20 mg/kg và 80 mg/kg nhưng không có

sự khác biệt (p>0,05) so với đối chứng (13,2x103 tb/mm3), ngược lại ở nồng độ

320 mg/kg và 720 mg/kg FB1 trong khẩu phần ăn đã làm tăng số lượng bạchcầu ở cá (14,1x103 tb/mm3 và 15,4x103 tb/mm3) và sự gia tăng này là có ý nghĩa(p<0,05)

Gaikowski et al (2003) cho biết amphenicol (chloramphenicol, thiamphenicol và florfenicol) có thể

làm suy yếu chức năng tủy dẫn đến giảm số lượng bạch cầu, đặc biệt là neutrophil,ngăn chặn quá trình thành thục, ở một số loài động vật như chuột, chó Tuy nhiên,nghiên cứu của nhóm tác giả này chưa chứng minh được những ảnh hưởng tương tựđối với cá

2.3 Tình hình sử dụng hoá chất, kháng sinh và một số nghiên cứu về kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều loại hoá chất, kháng sinh dùng trong nuôitrồng thuỷ sản với tên thương mại rất khác nhau Mặc dù, Bộ Thuỷ sản (cũ), nay

là Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ra Quyết định ban hành danhmục hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản và các quyđịnh về việc cấm mua bán và sử dụng thuốc, hoá chất không rõ nguồn gốc chonuôi trồng thủy sản nhưng trong thực tế tình trạng mua bán và sử dụng các loạihoá chất, kháng sinh cấm sử dụng hoặc không rõ nguồn gốc vẫn diễn ra thườngxuyên và phổ biến Ngoài ra, việc sử dụng thuốc, hoá chất không đúng cách,dùng quá liều cũng xảy ra khá phổ biến, hậu quả là dẫn đến tình trạng lờnthuốc, gây mất an toàn vệ sinh thực phẩm, nguy cơ gây suy thoái môi trường, Qua phân tích tình hình phân phối và sử dụng thuốc trong nuôi trồng thuỷ sảntại các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau, Nguyễn Thị Phương Nga (2004)thì có đến 136 loại kháng sinh đang được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản,trong đó có 40 loại thuốc có chứa kháng sinh thuộc danh mục hạn chế sử dụng

Kết quả điều tra các hộ nuôi tôm và các cửa hàng, đại lý phân phối thuốc, hoáchất tại 2 tỉnh Sóc Trăng và Bạc Liêu của Huỳnh Thị Tú và ctv (2006) thì có 74loại thuốc và hoá chất, trong đó có 19 loại kháng sinh đang được dùng trong

nghề nuôi tôm Kháng sinh được sử dụng nhiều nhất thuộc nhómFluoroquinolones (enrofloxacin, norfloxacin và oxolinic a-xit) Ngoài ra, nghiêncứu này còn xác định mức tồn lưu của 2 loại kháng sinh là enrofloxacin vàfurazolidone (AOZ) Kết quả cho thấy mức tồn lưu của AOZ trong tôm khá lâu,sau khi dừng cho ăn kháng sinh 28 ngày mức tồn lưu là 115 ppb trong bể thínghiệm, trong khi quy định không cho phép AOZ tồn lưu trong sản phẩm thuỷsản Ngược lại, tốc độ đào thải enrofloxacin trong tôm rất nhanh, trong bể nuôisau 28 ngày độ tồn lưu chỉ còn 10 ppb, thấp hơn 10 lần so với dư lượngenrofloxacin tối đa cho phép trong sản phẩm thuỷ sản (100 ppb); trong mô hìnhnuôi thâm canh không phát hiện độ tồn lưu enrofloxacin trong cơ tôm sau khingừng cho ăn kháng sinh 7 ngày

2.4 Florfenicol và một số nghiên cứu sử dụng Florfenicol trong điều trị bệnh

khí (Clostridium spp, Bacteroides spp) Theo Syriopoulou et al (1981) và Graham et al (1988) phổ kháng khuẩn của florfenicol tương tự như

Chloramphenicol và hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn thiamphenicol (trích dẫn

bởi Park et al., 2006)

Một số nghiên cứu cho thấy chloramphenicol gây rối loạn tuỷ xương với triệuchứng suy tuỷ không phục hồi (thiếu máu bất sản) do ái lực của kháng sinh nàytrên ribosome của các tế bào đang biệt hoá (tuỷ xương) và tỉ lệ tử vong trênngười là 1/25.000-1/60.000 trường hợp Chloramphenicol không được phép tồnlưu trong thực phẩm (MRL=0) Tuy nhiên, florfenicol ít độc hơnChloramphenicol do trong cấu tạo hoá học mất đi nhóm p-NO2 và cho đến nayvẫn chưa có ghi nhận nào về thiếu máu trên người sử dụng kháng sinh này (VõThị Trà An, 2007)

Hiện nay, florfenicol được dùng khá phổ biến trong điều trị bệnh cho gia súc,gia cầm và thuỷ sản Trong số các vi khuẩn nhạy cảm, nồng độ ức chế tối thiểu(MIC) với florfenicol khác nhau và thay đổi từ 1-8 μg/ml (Võ Thị Trà

An, 2007) Theo Gaunt et al (2006) nồng độ ức chế tối thiểu của florfenicol đối với vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri là 0,25 μg/mL Đối với vi khuẩn Vibrio anguillarum dòng

HI-610, MIC là 0,5 mg/L (Samuelsen et al., 2003) Theo Fukui et al (1987) và Inglis et

al (1991) thì MIC của florfenicol ở hầu hết các vi khuẩn gây bệnh ở cá là 0,5 – 2

μg/mL và theo Stamm (1989) khi cho cá ăn liều 20 mg/kg thì MIC trong huyết tương

được duy trì khoảng 0,5 μg/mL trong thời gian 3,5 ngày (trích dẫn bởi Park et al.,

2006)

Khi nghiên cứu dược động học của florfenicol trên cá da trơn Hàn Quốc

(Silurus asotus), Park et al (2006) cho thấy sau khi cho cá ăn kháng sinh

florfenicol với liều 20 mg/kg thể trọng, thời gian đạt nồng độ cao nhất tronghuyết tương (tmax) là 8 giờ, nồng độ cao nhất trong huyết tương (Cmax) là9,59±0,36 µg/mL, thời gian bán thải (t1/2) là 15,69±2,59 giờ và sinh khả dụng(F) là 92,61±10,1% Điều này cho thấy florfenicol được cá hấp thu nhanh vàgần như hoàn toàn Ngoài ra, kết quả nghiên cứu còn chỉ ra rằng chất chuyểnhóa chính của florfenicol là florfenicol amine, quá trình chuyển hóa florfenicolcũng rất nhanh, đạt giá trị tmax sau 7,33 giờ và Cmax là 3,57±0,65 mg/L, tỉ lệchuyển hóa 28,08%

Các kháng sinh nhóm phenicol được hấp thu tốt qua đường tiêu hoá và phân bốđều khắp dịch nội ngoại bào Cá rô phi khi cho ăn kháng sinh florfenicol vớiliều 10 mg/kg thể trọng thì nồng độ kháng sinh này ở cơ đạt cao nhất 4,59 µg/gsau 12 giờ và sau 24 giờ thì nồng độ florfenicol cao nhất ở cơ là 1,6 µg/g Conđường bài tiết florfenicol ở cá rô phi nuôi trong môi trường nước ngọt chủ yếu

là qua gan thận; trong khi đó ở cá nuôi trong môi trường nước mặn thì bài tiết

chủ yếu qua mang (Feng et al., 2008)

Samuelsen et al (2003) nghiên cứu trên cá tuyết thì nhận thấy khi cho cá ăn

kháng sinh florfenicol trong 10 ngày liên tiếp với liều 10 mg/kg thể trọng/ngàythì sau khi ngưng dùng thuốc 24 giờ, nồng độ trung bình trong huyết tương là5,0±1,6 mg/L và ở cơ là 4,6±0,9 mg/kg; với liều 20 mg/kg thể trọng/ngày thìnồng độ trung bình trong huyết tương là 6,5±1,3 mg/L và ở cơ là 7,0±2,7mg/kg

Theo Võ Thị Trà An (2007) khuyến cáo liều dùng florfenicol cho cá là 10mg/kg thể trọng Thời gian tồn lưu là 28 ngày khi sử dụng florfenicol trên bòvới liều tiêm bắp 20 mg/kg và tiêm trên da (dùng 1 liều duy nhất) với nồng độ

40 mg/kg

Một tư liệu khác cho thấy có thể dùng florfenicol để điều trị bệnh nhiễmtrùng máu ở cá da trơn và bệnh “furunculosis” ở cá hồi với liều 10 mg/kg thểtrọng/ngày, dùng cho 10 ngày và thời gian đào thải khỏi thịt là 12

và

http://www.usp.org/pdf/EN/veterinary/florfenicolfenicol.pdf) nghiên cứu

Theo danh mục thuốc thú y thuỷ sản được phép lưu hành tại Việt nam (banhành kèm theo Quyết định số 06/2008/QĐ-BNN ngày 18/01/2008 của Bộtrưởng Bộ Nông Nghiệp & Phát triển Nông thôn) thì florfenicol được các nhàsản xuất thuốc thú y thuỷ sản khuyến cáo dùng trong điều trị bệnh ở cá tra và cá

ba sa do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và thời gian ngưng sử dụng thuốc trước

khi thu hoạch là 12-15 ngày

Nordmo et al (1994) nghiên cứu hiệu quả điều trị bệnh “furunculosis” của

florfenicol trên cá hồi đại dương Kết quả cho thấy tỉ lệ chết của những cá bị

nhiễm Aeromonas salmonicida giảm khi sử dụng florfenicol để trị với liều 10

mg/kg thể trọng trong 10 ngày liên tiếp, và giảm nhanh hơn so với khi sử dụngoxolinic a-xit, flumequine hay trimethoprim kết hợp với sulphadiazine

Gaunt et al (2004) nghiên cứu xác định liều lượng florfenicol trộn vào thức ăn

để điều trị bệnh nhiễm trùng máu do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá nheo

Ictalurus punctatus Kết quả cho thấy sử dụng 10 mg/kg thể trọng trong 10 ngày

liên tiếp thì tỉ lệ cá bệnh chết thấp nhất (0,8%), trong khi sử dụng liều 5 mg/kgthể trọng và 15 mg/kg thể trọng thì tỉ lệ cá chết là 2,5% và không điều trị thì tỉ

lệ cá chết là 60%

Seljetokken et al (2006) thí nghiệm sử dụng florfenicol điều trị bệnh do

Listonella anguillarum gây ra trên cá tuyết (Gadus morhua) thì kết quả cho thấy

tỉ lệ chết của những cá bị nhiễm bệnh nhưng không được điều trị là 77%; khi sửdụng liều 10 mg/kg thể trọng/ngày trong 10 ngày liên tiếp, tỉ lệ chết là 31% khidùng thức ăn “marine pellets” và 52% khi dùng thức ăn “salmonid pellets” Khi

sử dụng liều 10 mg/kg thể trọng/ngày với thức ăn “marine pellets” thì tỉ lệ chết

là 52% khi cho cá ăn trong 5 ngày liên tiếp và 38% khi cho cá ăn vào các ngày

1, 2, 4, 6 và 8 sau khi điều trị lần đầu Nồng độ thuốc trung bình trong huyết

tương của cá sau khi ngưng thuốc 24 giờ là 3,3±1,7 μg/mL và 3,5±2,8 μg/mL

tương ứng với cá cho ăn 10 ngày liên tiếp bằng thức ăn “marine và salmonidpellets”; và ở những cá cho ăn 5 ngày liên tiếp là 2,2±2,3 μg/mL, và 1,7±0,7μg/mL ở những cá cho ăn vào ngày 1, 2, 4, 6 và 8 sau khi điều trị lần đầu Hiện nay trên thị trường rất nhiều sản phẩm thuốc thú y thủy sản có chứakháng sinh florfenicol được các nhà sản xuất khuyến cáo dùng trong điều trịbệnh động vật thủy sản như:

- Sản phẩm Florted 20 Powder® (sản phẩm chứa 20 g florfenicol/1kgthuốc) của Công ty Golden Vet (Cty TNHH TM thuốc thú y Hoàng Kim-

TP.HCM) được khuyến cáo sử dụng trong điều trị bệnh mủ gan, phù mắt, xuất huyết trên cá với liều 1

kg/2 tấn cá dưới 2 tháng tuổi (hay 1kg/200kg thức ăn) và đối với cá trên 2 tháng tuổidùng 1kg/10 tấn cá (hay 1kg/200 kg thức ăn) Trộn thuốc vào thức ăn, cho cá ăn liêntục 5-7 ngày Ngưng sử dụng 2 tuần trước khi thu hoạch

- Sản phẩm Vime®-fenfish suspension (sản phẩm chứa 400g florfenicol/L)của Cty Vemedim đặc trị bệnh gan thận có mủ, đốm đỏ trên cá Công ty khuyếncáo trộn vào thức ăn cho cá, dùng liên tục 5-7 ngày với liều lượng 1 lit/ 35-40tấn cá dưới 2 tháng tuổi (hay 1 lit/2,4-2,8 tấn thức ăn), và đối với cá lớn hơn 2tháng tuổi dùng 1 lit/40 tấn cá (hay 1lit/1,5-2 tấn thức ăn) Ngưng sử dụng thuốc

2 tuần trước khi thu hoạch

Theo Wrzesinski et al (2006), khi cho cá nheo (Ictalurus punctatus) ăn

kháng sinh florfenicol 10 mg/kg thể trọng/ngày trong 12 ngày liên tiếp (nồng độthực tế cá ăn vào là 9,3 mg/kg thể trọng/ngày) thì mức tồn lưu florfenicol trong

cơ cá sau khi ngưng ăn kháng sinh 4 ngày là 876 ppb, thấp hơn mức giới hạntồn lưu cho phép trong thịt cá (1.000 ppb)

Gaikowski et al (2003) đã chứng minh rằng liều lượng kháng sinh

florfenicol (10, 30 và 50 mg/kg thể trọng/ngày) được phối trộn trong thức ănkhông ảnh hưởng đến tăng trưởng cũng như khả năng bắt mồi của cá nheo

(Ictalurus punctatus) Tuy nhiên, tăng trưởng của cá bị ảnh hưởng bởi vị trí đặt

các bể thí nghiệm, những cá trong các bể gần cửa ra vào có tăng trưởng thấphơn cá trong các bể ở xa cửa ra vào

Mặc dù hiện nay florfenicol là loại kháng sinh được dùng khá phổ biếntrong nuôi trồng thủy sản nói chung và nuôi cá tra nói riêng, nhưng có rất ítnghiên cứu về kháng sinh này trên cá tra được công bố

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4-10/2008 tại Khoa Thuỷ Sản – TrườngĐại học Cần Thơ

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện trên cá tra Pangasianodon

hypophthalmus

3.3 Cá thí nghiệm

Cá tra cỡ 15-20 g/con được mua từ trại giống ở Thành phố Cần Thơ Chọn cákhoẻ, không bị xây xát, không dị hình, màu sắc sáng tự nhiên và không có dấuhiệu bệnh để làm thí nghiệm

Cá trước khi đưa vào hệ thống thí nghiệm được nuôi dưỡng cho khoẻ

và cho ăn để cá quen với thức ăn thí nghiệm Thời gian nuôi dưỡng 3 tuần

Sau đó bố trí cá vào hệ thống bể thí nghiệm với mật độ 70 con/bể Để cá ổnđịnh trên bể 2 tuần trước khi chính thức tiến hành thí nghiệm

3.4 Thức ăn

Thức ăn Cargill 30% đạm được chọn cho cá ăn trong quá trình thí nghiệm.Thức ăn được trộn kháng sinh Florfenicol (FF) với liều lượng đã định (10mg/kg cá/ngày, 30 mg/kg cá/ngày và 100 mg/kg cá/ngày) Thức ăn sau khi trộn

FF được áo dầu bên ngoài, để khô tự nhiên và bảo quản ở tủ âm có nhiệt độ-200C

Mỗi ngày cho cá ăn 2 lần vào 8 giờ và 16 giờ Khẩu phần ăn 3-5% khối lượngthân/ngày Lượng thừa sẽ được loại bỏ sau 2-3 giờ cho ăn Riêng trong thời giancho cá ăn kháng sinh (7 ngày), cho cá ăn 70% khẩu phần hàng ngày của cánhằm đảm bảo cá ăn đủ lượng kháng sinh theo dự kiến

3.5 Bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên trong các bểcomposite 0,5 m3 với 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại:

- Nghiệm thức 1: không cho ăn kháng sinh (NT-ĐC);

- Nghiệm thức 2: cho cá ăn 10 mg FF/kg khối lượng/ngày (NT-10);

- Nghiệm thức 3: cho cá ăn 30 mg FF/kg khối lượng/ngày (NT-30);

- Nghiệm thức 4: cho cá ăn 100 mg FF/kg khối lượng/ngày (NT-100)

Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm

- Thời gian cho cá ăn kháng sinh: 7 ngày liên tiếp

- Các bể thí nghiệm được sục khí liên tục

- Định kỳ thay 20% nước bể thí nghiệm mỗi 2 ngày, kết hợp với chonước chảy tràn

- Các chỉ tiêu theo dõi và phân tích:

- Môi trường: nhiệt độ (0C), pH, DO, NO3-, NO2-, TAN

- Sinh hoá: phân tích các enzyme ChE, CAT, GST và LPO ở cơ, gan,mang và não

- Huyết học: định lượng hồng cầu, bạch cầu, thể tích hồng cầu, tỉ lệ và

số lượng huyết sắc tố, trọng lượng trung bình và nồng độ huyết sắc

tố trong hồng cầu, đo hàm lượng ion Na+, K+, Cl- trong huyết tương

- Dư lượng kháng sinh florfenicol trong cơ cá

- Tăng trưởng: cân đo trọng lượng và chiều dài cá qua các lần thumẫu

3.6 Phương pháp thu và phân tích mẫu 3.6.1 Phương pháp thu mẫu

- Môi trường:

- Nhiệt độ, pH được đo bằng máy Hanna và oxy được đo bằng máy HannaHI9145 Mỗi ngày đo 2 lần vào 7 giờ sáng và 2 giờ chiều

- Các chỉ tiêu NO3-, NO2- và TAN được thu vào chai nhựa 1 L và được bảoquản lạnh đến khi phân tích xong

- Mẫu phân tích huyết học: thu mẫu máu ở động mạch đuôi và phân tích

các chỉ tiêu huyết học Sử dụng ống tiêm nhựa 1 mL để thu máu cá, mỗi

cá thu khoảng 0,4–0,6 mL máu và cho vào ependorf và được giữ lạnhtrong nước đá suốt thời gian thu mẫu

- Mẫu phân tích sinh hóa: tất cả dụng cụ thu mẫu và mẫu đều được đặt trên

nước đá để giữ lạnh trong quá trình thu mẫu

- Cơ: cắt nhuyễn cơ cá (không lấy da), trộn đều cơ của tất cả cá trong cùng

1 bể (3-5 con) cho vào ependorf, mẫu được làm đông trong nitơ lỏng vàgiữ ở tủ âm có nhiệt độ -800C cho đến khi phân tích

- Gan: các bước thực hiện tương tự như mẫu cơ

- Mang: rữa qua nước cất (lạnh), cắt rời các tia mang khỏi xương cung

mang và thực hiện các bước tương tự như mẫu cơ và gan

- Não: gỡ bỏ các chỉ máu bao quanh và tiếp tục thực hiện các bước tương

tự như mẫu cơ và gan

- Mẫu phân tích tồn lưu: cơ cá bao gồm cả da được cắt nhuyễn, trộn đều cơ

của tất cả cá trong cùng một bể (3-5 con) cho vào ống falcon Mẫu đượcgiữ lạnh trong suốt thời gian thu mẫu và được bảo quản ở tủ âm có nhiệt

độ -800C cho đến khi phân tích

3.6.2 Thời gian thu mẫu

- Môi trường: nhiệt độ, pH và oxy được đo mỗi ngày 2 lần vào 7 giờ sáng

và 2 giờ chiều Các chỉ tiêu NO3-, NO2- và TAN được thu mẫu theo nhịpthu mẫu sinh hoá

- Thời gian thu mẫu huyết học, sinh hoá và tồn lưu: trước khi cho ăn kháng

sinh (ngày 0); trong thời gian cho ăn kháng sinh thu mẫu vào các

ngày 1, 4 và 7; sau khi ngưng cho ăn kháng sinh thu mẫu vào các ngày 1,

5, 14 và 28 Mỗi bể thu 5 cá/1lần, riêng ở ngày 0 chỉ thu 3 cá/bể

3.6.3 Phương pháp phân tích mẫu

3.6.3.1 Phân tích mẫu môi trường

- NO3-: phân tích bằng phương pháp Salycilate;

- NO2-: phân tích bằng phương pháp Giess llosway;

- TAN:phân tích bằng phương pháp Indophenol blue

3.6.3.2 Chuẩn bị mẫu cho phân tích enzyme

Mẫu phân tích enzyme được chuẩn bị theo các bước sau:

- Mẫu cơ, gan, mang, não được giải đông và giữ lạnh trong nước đá;

- Cân trọng lượng mẫu (từ 0,1-0,3 g) cho vào ống nghiệm nhựa và đemnghiền trong dung dịch đệm phosphate 50 mM (KH2PO4/K2HPO4 50mM; pH=7,5) bằng máy nghiền, thể tích dung dịch đệm dùng cho mỗimẫu nghiền là 3 mL;

- Cân lại hỗn hợp vừa nghiền;

- Rút lấy 1 mL mẫu cho phân tích LPO, phần còn lại đem ly tâm 10.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 40C;

- Lấy phần nước trong nổi ở trên để phân tích ChE, CAT, GST;

- Tất cả các mẫu dùng cho phân tích enzyme được trữ lạnh ở tủ âm cónhiệt độ -800C đến khi phân tích

3.6.3.3 Phương pháp phân tích các enzyme a) Cholynesterase (ChE)

Phân tích theo phương pháp của Ellman et al (1961) có bổ sung Trong quá

trình phân tích sử dụng acetylthiocholine iodide (ATChI) như là cơ chất củaAChE ATChI bị phân hủy tạo thành thiocholine và acetat bởi sự xúc tác củaAChE; những phân tử thiocholine được tạo ra sẽ phản ứng vớidithiobisnotrobenzoate (DTNB) tạo ra sản phẩm có màu vàng, cường độ màuđậm dần theo thời gian Hoạt tính ChE được đo bằng máy so màu quang phổ

Phương trình phản ứng minh họa:

AChE Acetylthiocholine iodide ========> thiocholine + acetate Thiocholine + dithiobisnotrobenzoate ====> sản phẩm có màu vàng

- DTNB (5,5 dithiobis 2nitrobenzoic a-xit) 167 µM, M = 396,3g

DTNB 167mM: 66,1 mg/ml Sodium phosphate 50 mM, pH=7,4

Pha loãng 1.000 lần

DTNB 167mM ============> DTNB 167 µM => 10µL DTNB 167mM + 9.990µL sodium phosphates => DTNB 167

µM

- Cơ chất Acetylthiocholine iodine (ATChI, Sigma) 30 mM

8,67 mg/1ml Sodium phosphate, pH=7,5

Bảng 3.1: Qui trình phân tích ChE

Phân tích theo phương pháp của Baudhuin et al (1964) có bổ sung Catalase là

enzyme hiện diện trong peroxisom của hầu hết các tế bào hiếu khí và có chứcnăng bảo vệ tế bào chống lại độc chất hydrogen peroxide bằng việc phân hủy

H2O2

Catalase 2H2O2 ========> 2H2O + O2

Nguyên lý: Phương pháp thông thường xác định CAT dựa trên sự thay đổi của

dung dịch đo ở bước sóng 240nm Phương pháp yêu cầu trong đo quang phổphải sử dụng curvet thạch anh để tránh sự nhiễu Titanium oxisulfate (TiOSO4)phản ứng với H2O2 mà không bị khử bởi CAT sau 6 phút Qui trình phân tích:

Trước tiên, dung dịch đầu BC được chuẩn bị gồm 1g Albumin bovine (BSA,sigma); 100mL Imidazol buffer 0,02M (1,3616g/l), pH 7,0

Chuẩn bị dung dịch TiOSO4: 1,7 g TiOSO4 pha trong 500mL H2SO4

2N Đun sôi trong 10 phút và để nguội dung dịch đến ngày hôm sau Pha loãng1,5 lần với H2SO4 2N

Sau đó cho 50µL H2O2 30% vào 250mL BC ===> dung dịch SC Tiếp đến, thêm 0,75mL TiOSO4 vào 1,25mL SC và đọc ở bước sóng 420 nm

Độ hấp thụ phải nằm trong khoảng 0,75 – 0,95 và là độ hấp thụ cao nhất (H2O2

không bị khử bởi CAT) nếu không thay đổi thể tích H2O2

Kế đến qui trình tiến hành tiếp tục theo bảng sau:

Bảng 3.2:Qui trình phân tích CAT

Chú ý: Một đơn vị hoạt tính được định nghĩa là lượng enzyme tạo ra sự phân

huỷ 90% cơ chất trong 1 phút trong thể tích 50mL theo quy trình

Độ hấp thụ mẫu trắng 1 (không H2O2_được hiệu chỉnh về 0) Độ hấp thụ mẫutrắng 2 được làm nền từ mẫu, nó tương đương phản ứng của mẫu với TiOSO4

Phân tích hoạt tính GST theo phương pháp của Habig et al (1974) có bổ sung.

Để đo hoạt tính của GST, chất được sử dụng là 1-chlor-2,4dinitrobenzen(CDNB), một hợp chất có tính kỵ nước CDNB có ái lực với enzyme phân tíchhơn các cơ chất khác và nó cũng là cơ chất trong quá trình chuyển hoá của

nhiều enzyme đồng đẳng với GST Ngoài ra, glutathione (GSH, Sigma) cũng làđồng cơ chất trong phản ứng

CDNB + GSH ======> CDNB – GSH + HCl Hoạt tính của GST được đo bằng máy so màu quang phổ thông qua độ hấp phụcủa cơ chất CDNB-GSH ở bước sóng 340 nm trong 3 phút ở nhiệt độ 250C

H2O GSH (nồng độ cuối 6,25 mM) Mẫu

700 30

240

30 /

- Đơn vị đo hoạt tính GST là nmol CDNB/mg protein/phút

d) Lipid Peroxidation (LPO)

Phân tích theo phương pháp của Fatima et al (2000) có bổ sung Oxy

hoá chuỗi a-xit béo chưa bão hoà bằng cách tách 1 hydrogen trong nhóm alkyl

và chèn một nguyên tử oxy dẫn đến việc tạo thành gốc hydroperoxyl hình thành

nên lipid hydroperoxides (LOOHs) LOOHs phân ly tạo ra malondialdehyde(MDA) và 4-hydroxyalkenals (HAE)

Phân tích LOOHs như là một phương pháp xác định phản ứng LPO.Thiobarbituric A-xit Reactive Substance (TBARS) được áp dụng phổ biến nhất.TBARS phản ứng với MDA, sản phẩm được xác định thông qua máy so màuquang phổ ở bước sóng 535nm Chuẩn bị đường chuẩn với nồng độ MDA tăngdần Trị số đọc được trên máy so màu quang phổ cho phép tính LPO (nmol

MDA/g mẫu) Qui trình thực hiện Chuẩn bị hoá chất:

- Trichloroacetic a-xit 5% (TCA 5%) C2HCl3O2, M: 163,39g/mol 5g TCA/100mL H2O (Trữ lạnh, sử dụng được lâu)

- Dimethyl sulfoxide (DMSO) C2H6OS, M: 78,13

- 2 Thiobarbituric a-xit (TBA) 0,67%, C4H4N2O2S, M:144,15g/mol 67mg TBA + 1mL DMSO trộn đều, sau đó thêm 9 mL nước

Bảo quản tránh ánh sáng (dùng chai nâu hay giấy bạc), sử dụng 1-2 ngày

đó thêm 49 mL H2O Bảng 3.4: Qui trình lập đường chuẩn và phân tích LPO

Chỉ tiêu Nồng độ MDA Thể tích pha loãng Dung dịch chuẩn

50 µM 1mL

100 µM 1mL

Nguyên tắc: Lượng Protein được xác định theo phương pháp Lowry et al.

(1951), sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn, Trong môitrường kiềm Cu sẽ tạo phức với protein, Khi Folin được đưa vào, Folin sẽ kếtdính với protein Phản ứng khử sẽ chuyển màu từ màu vàng sang màu xanh

Chuẩn bị hoá chất:

- BSA: 10mg/mL H2O

- Hỗn hợp A: 150 mL Na2CO3 2% + 1,5 mLCuSO4 1% + 1,5 mL NaKTartrate 2%

- Folin: 10mL Folin + 10 mL H2O Bảng 3.5: Qui trình phân tích Protein