Nghiên cứu thu nhận dịch chiết chứa axid hydroxycitric từ vỏ quả tai chua (garcinia cowa roxb ) để tạo muối kép hydroxycitrat ứng dụng giảm béo phì

- Qui trình tổng hợp muối kép hydroxycitrat từ dịch chiết acid hydroxycitric của vỏ quả tai chua – Garcinia cowa Roxb.. Các dạng đồng phân và lacton của acid hydroxycitric Trong số các

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Sự phát triển kỳ diệu với tốc độ như vũ bão của khoa học và công nghệ, không ngoài mục tiêu lớn lao nhằm không ngừng cải tạo tự nhiên, đem đến những giá trị hoàn mỹ phục vụ đắc lực cho cuộc sống thiên đường như nhân loại mong muốn Ngày nay, thực tế cho thấy, đại bộ phận người dân sống thị thành có cuộc sống khá đầy đủ về vật chất, đặc biệt là khẩu phần ăn giàu dinh dưỡng nhưng sự thiếu hợp lý là nguyên nhân chính yếu của tình trạng thừa cân béo phì đang gia tăng nhanh chóng và phổ biến trong xã hội hiện đại của chúng ta Tình trạng này không chỉ gây hậu quả xấu về sức khoẻ, thẩm mỹ cho con người, mà còn là gánh nặng cho ngành y nói riêng và nền kinh tế nói chung

Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2014 có khoảng 1,9

tỷ người trưởng thành bị thừa cân (tương đương với 39% dân số), trong số đó có

600 triệu người mắc hội chứng béo phì Cũng theo số liệu của WHO, số người mắc hội chứng béo phì đã tăng hơn hai lần so với năm 1980 Chi phí cho công tác quản

lý và chữa trị hội chứng này dự toán có thể chiếm từ 2% - 7% so với tổng chi phí giành cho chăm sóc sức khỏe cộng đồng ở các quốc gia phát triển [128] Theo dẫn liệu từ Cục y tế dự phòng - Bộ Y tế năm 2014, Việt Nam – quốc gia thuộc Thế giới thứ 3 có tỷ lệ người trưởng thành bị thừa cân, béo phì chiếm khoảng 25% dân số Các nhà khoa học tiếp tục cảnh báo con số mắc phải hội chứng này sẽ tiếp tục gia tăng và đang có xu hướng nhân rộng vào lứa tuổi vị thành niên [129] Rõ ràng, thừa cân béo phì đã trở thành vấn nạn, tạo ra gánh nặng cho giải pháp vì sức khỏe cộng đồng của toàn xã hội, đó cũng là căn nguyên khơi nguồn cho việc tìm kiếm giải pháp hợp lý có hiệu quả cao chống lại căn bệnh thế kỷ này, một căn bệnh chỉ đứng sau đại dịch HIV và xung đột vũ trang

Một trong những giải pháp đang rất được quan tâm đến bởi triển vọng ứng dụng vừa đảm bảo tính hiệu quả, vừa an toàn đối với sức khỏe và đặc biệt sử dụng được nguồn nguyên liệu thực vật đa dạng giàu hoạt tính sinh học sẵn có trong nước [127] Trong số đó, dịch chiết chứa acid hydroxycitric từ vỏ quả bứa - một hợp chất

thiên nhiên có công năng giảm béo đã được sử dụng rộng rãi dưới dạng chế phẩm muối hydroxycitrat [133]

Từ những năm 50 của thế kỷ trước cho đến hiện nay rất nhiều tập hợp các công trình nghiên cứu đã công bố về hoạt chất acid hydroxycitric và muối

hydroxycitrat [15] thu nhận được chủ yếu từ quả của cây bứa (bứa tròn - Garcinia

Cambogia, bứa nhà - Garcinia cochinchinensis (Lour.) Choisy, Garcinia Atro Viridis, Garcinia Indica, …) [16] Đối với quả tai chua (Garcinia cowa Roxb.)

thuộc họ Bứa theo tài liệu được công bố [17] hàm lượng acid hydroxycitric chiếm

tỷ lệ 27,1% nên trong tương lai gần, quả tai chua sẽ được sử dụng làm nguồn nguyên liệu chính thống cho mục đích khai thác hoạt chất acid hydroxycitric

Tuy vậy, acid hydroxycitric (HCA) dễ bị lacton hóa trong quá trình hóa hơi

và cô đặc ở dạng lỏng, không thuận lợi cho quá trình thương mại hóa, cho nên thường được chuyển hóa qua các dạng muối rắn Bên cạnh đó, các muối hydroxycitrat của kim loại hóa trị hai (II) lại dễ bị hấp thụ hơi nước, khó bảo quản

Vì vậy giải pháp muối kép của HCA tạo ra các sản phẩm rắn vừa thuận lợi cho thương mại hóa, vừa hạn chế khả năng hút ẩm và cùng một lúc đưa được nhiều nguyên tố vi lượng kim loại vào cơ thể, là một xu hướng đang rất được quan tâm

Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu được công bố có liên quan đến hoạt chất acid hydroxycitric cũng như công nghệ tạo muối hydroxycitrat Tuy nhiên, hầu như chưa có công trình nào đề cập hoàn thiện đến thành phần hoá học, đặc biệt liên quan đến công nghệ chiết tách và tạo muối từ nguồn nguyên liệu quả tai chua

Quả tai chua (Garcinia cowa Roxb.) được trồng tập trung tại hầu hết các tỉnh

miền núi và trung du Bắc bộ (Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Lào Cai, Tuyên Quang, Bắc Giang, Yên Bái, ) [4], trồng nhiều trong vườn nhà và nương rẫy, với sản lượng dự kiến hàng triệu tấn quả/năm [131]

Được kế thừa các công trình nghiên cứu khoa học đã công bố có liên quan cùng với vùng nguyên liệu có sản lượng đủ lớn để thực thi ứng dụng, chúng tôi

chọn đề tài “Nghiên cứu thu nhận dịch chiết chứa acid hydroxycitric từ vỏ quả

tai chua (Garcinia cowa Roxb.) để tạo muối kép hydroxycitrat ứng dụng giảm

béo phì” để thực hiện nội dung luận án tiến sĩ

Hy vọng nội dung luận án sẽ góp phần hoàn thiện thêm tư liệu về loài thực

vật Garcinia cowa Roxb và mở ra triển vọng khả quan trên quy mô phát triển cây

dược liệu sẵn có trong nước cũng như phương án công nghệ ứng dụng phù hợp, hiệu quả, góp phần nâng cao đời sống nhân dân vùng dược liệu

2 Mục đích nghiên cứu

- Xác định hàm lượng acid hydroxycitric (HCA) trong dịch chiết vỏ quả tai

chua – Garcinia cowa Roxb

- Qui trình tổng hợp muối kép hydroxycitrat từ dịch chiết acid hydroxycitric

của vỏ quả tai chua – Garcinia cowa Roxb

- Sử dụng chế phẩm muối kép hydroxycitrat để đánh giá khả năng giảm béo

- Góp phần làm phong phú thêm tư liệu về loài tai chua – Garcinia cowa

Roxb

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng: Vỏ quả tai chua - Garcinia cowa Roxb., được thu hái vào tháng

7, tháng 8 tại tỉnh Vĩnh Phúc

* Phạm vi nghiên cứu:

- Chiết xuất vỏ quả tai chua - Garcinia cowa Roxb., bằng dung môi nước

- Xác định hàm lượng acid hydroxycitric (HCA) từ dịch chiết vỏ quả tai chua

- Garcinia cowa Roxb

- Tổng hợp muối kép hydroxycitrat từ dịch chiết acid hydroxycitric của vỏ

quả tai chua - Garcinia cowa Roxb

- Tác dụng hoạt tính sinh học của chế phẩm muối kép hydroxycitrat từ dịch

chiết acid hydroxycitric của vỏ quả tai chua - Garcinia cowa Roxb

4 Phương pháp nghiên cứu

* Phương pháp lý thuyết: Tổng hợp tài liệu về phương pháp nghiên cứu loài

Bứa, đặc biệt là tai chua Garcinia cowa Roxb Các phương pháp chiết xuất đạt hiệu

suất cao nhất đối với loài tai chua Các phương pháp tổng hợp muối kép, xác định hàm lượng các ion kim loại và xác định cấu trúc của muối kép hydroxycitrat

* Phương pháp thực nghiệm: Phương pháp lấy mẫu, xử lý và bảo quản mẫu nhằm sử dụng trong thời gian dài Chiết xuất acid hydroxycitric (HCA) bằng phương pháp chưng ninh với dung môi là nước Xác định hàm lượng acid bằng phương pháp chuẩn độ acid – base, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC, xác định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp bằng phương pháp phổ hồng ngoại - IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân - NMR, phổ khối - MS, phương pháp khối phổ phân giải cao - HRMS, xác định hàm lượng ion kim loại trong sản phẩm muối kép bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử - AAS, sắc ký trao đổi ion -

IC, phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử ghép khối phổ - ICP/MS, phương pháp đánh giá tính an toàn và giảm béo của muối kép hydroxycitrat

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

- Xác định cây tai chua - Garcinia cowa Roxb., tại vùng nguyên liệu, hàm

lượng acid hữu cơ và acid hydroxycitric trong nguyên liệu

- Tổng hợp thành công muối kép hydroxycitrat từ dịch chiết acid của vỏ quả tai chua, đánh giá tác động an toàn và tác dụng giảm béo phì của muối kép hydroxycitrat

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Xây dựng quy trình tổng hợp muối kép hydroxycitrat dưới dạng quy mô công nghiệp, tạo nên các chế phẩm sinh học vừa hỗ trợ sức khỏe, vừa góp phần làm tăng tính thẩm mỹ và nhu cầu làm đẹp đang ngày một “bùng nổ” trong thời đại hiện nay Từ đó quy hoạch vùng nguyên liệu, chuyển đổi cây trồng, phát triển kinh tế cây dược liệu, nâng cao thu nhập, nhằm cải thiện điều kiện sống cho người dân vùng khó khăn, vùng dược liệu trong nước

6 Cấu trúc của luận án

Luận án gồm 139 trang, trong đó có 36 Bảng và 83 Hình Phần mở đầu 05 trang, kết luận, những đóng góp mới và kiến nghị 03 trang, danh mục các công trình khoa học đã công bố 02 trang, tài liệu tham khảo 15 trang Nội dung của luận án chia làm 03 chương:

Chương 1 Tổng quan, 37 trang

Chương 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu, 14 trang

Chương 3 Kết quả và thảo luận, 63 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương chi bứa - Garcinia

Họ Bứa (Măng cụt, Clusiaceae hay Guttiferae do Antoine Laurent de Jussieu đưa ra năm 1789), là một họ thực vật có hoa, bao gồm khoảng 27 - 28 chi và 1.050 loài hay chỉ chứa 14 chi với 595 loài, tùy theo quan điểm phân loại Các cây thân gỗ hay cây bụi, thông thường có nhựa mủ vàng và quả hay quả nang để lấy hạt [22]

Họ này là những cây gỗ sống lâu năm, đa số chúng đều hoang dại có vị chát, đắng không ăn được Tuy nhiên, vẫn còn một số bộ lá và có nhiều loài quả ngon ngọt như

măng cụt (Garcinia mangostana), măng cụt rừng (Garcinia indica) [23]; nhiều loài

lá, quả có vị chua được dùng làm rau, gia vị như loài bứa (Garcinia oblongifolia), tai chua (Garcinia cowa Roxb.)[50]

Chi bứa (danh pháp khoa học: Garcinia) là một chi rất rộng trong họ Bứa, là

loài thực vật tạp tính (đủ giống hoa như hoa đực, hoa cái, hoa lưỡng tính) hoặc dạng cây bụi, được phân bố rộng rãi tại khu vực miền Nam Châu Phi, vùng nhiệt đới

Châu Á, Australia và Polynesia [39] Tên gọi Garcinia lấy theo tên của nhà thực vật

học Laurence Garcia, người đã sưu tập các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn Độ vào thế

kỷ 18 [45] Tại Việt Nam, loài thực vật này phân bố rộng khắp từ các tỉnh miền Bắc như Tuyên Quang, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, đến các tỉnh miền Trung như Hà Tĩnh, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam - Đà Nẵng [125] Riêng loài tai chua chủ yếu tập trung ở các tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ [126]

1.2 Mô tả và phân bố loài tai chua

1.2.1 Mô tả thực vật

Loài tai chua tên khoa học là Garcinia cowa Roxb., là một loài cây mộc

thuộc họ Măng cụt (Clusiaceae) [20]

Thân cây cỡ trung bình, cao khoảng 16 - 18m, vỏ xám đen, cành nhiều, thẳng, thường đâm ngang, đầu hơi rủ xuống

Lá: lá đơn, sắc xanh lục, mọc đối, dài 7 - 17cm, rộng 2,5 - 7cm, hình trứng ngược, đầu tù có mũi lồi ngắn, đôi khi nhọn, gốc hình nêm, phiến cứng Gân lông

chim nổi rõ cả 2 mặt, gân bên nhỏ 15, xếp song song và nối với nhau ở sát mép lá Cuống lá dài chừng 2cm

Hoa: cây tạp tính nên cụm hoa đực gồm 3 - 8 hoa, xếp thành tán cuống dài 1cm Hoa đực mọc thành cụm 3 - 5 hoa ở nách lá, 4 lá đài và 5 cánh hoa, 20 nhị có chỉ, nhị ngắn [4]

Quả: Quả hình cầu bẹp có 4 - 8 múi; vỏ quả dày ngoài vàng xanh, trong hồng hoặc đỏ có 6 - 10 hạt Hạt có áo Mùa hoa tháng 3 - 6, mùa quả tháng 8 - 9 Hình ảnh về cây, lá và vỏ quả khô tai chua (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cây, lá và vỏ quả khô của tai chua

1.2.2 Phân bố

Tai chua là một loại cây nhiệt đới cho quả ăn được, mọc hoang ở ven rừng Đông Nam Á như Nam Thái Lan, Mianma, Indonexia, và phân bố ở miền Đông bắc Ấn Độ Tại Việt Nam, cây mọc trong rừng núi vùng trung du các tỉnh Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ như: Cao Bằng, Lạng Sơn, Hà Tây, Hoà Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thị, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh , trong các rừng thứ sinh [25] Chúng thường được trồng để lấy vỏ quả Quả sau khi được thu hái, bỏ hạt, thái vỏ ra thành miếng mỏng phơi khô hay sấy khô, làm vỏ quả có màu đen hoặc nâu nhạt [27]

1.3 Thành phần hóa học

Trong quả tai chua có chứa phần lớn là acid hydroxycitric (HCA), cùng với hàm lượng nhỏ không đáng kể là các hợp chất như lacton của acid hydroxycitric, acid oxalic, acid citric, acid tartaric, acid malic, flavonoid (trong vỏ), vitamin C (100g có 61mg vitamin C), hợp chất xanthon (isoxanthochymol và xanthochymol), hợp chất gluxit Đặc biệt, hàm lượng của acid hydroxycitric (HCA) chiếm khoảng 23% - 25% trong vỏ quả khô [40]

* Như vậy: Ở Việt nam, chi Garcinia được phân bố rộng rãi từ Bắc tới Nam, nhưng chỉ có loài tai chua - Garcinia cowa Roxb., tập trung chủ yếu các tỉnh phía

Bắc và Bắc Trung Bộ, thuận tiện cho quá trình thu gom, tập trung nguồn nguyên liệu trong quá trình nghiên cứu Dựa trên những thông tin về acid hydroxycitric mà loài tai chua mang lại, chúng tôi tiếp tục tìm hiểu về loài thực vật này nhằm cung cấp thêm những tư liệu, cũng như so sánh các đặc tính của nó trên thế giới và tại Việt Nam

1.4 Tình hình nghiên cứu acid hydroxycitric (HCA) của loài tai chua

1.4.1 Trên thế giới

a Nghiên cứu về cấu trúc của acid hydroxycitric (HCA)

Acid hydroxycitric (acid 1,2 dihydroxypropan-1,2,3-tricacboxylic) được tìm thấy lần đầu tiên trong tự nhiên như là thành phần chính trong loại quả có tính acid

cao Garcinia cambogia [66] Xa hơn nữa, acid hydroxycitric (HCA) đã được tìm thấy trong quả của loài Garcinia như Garcinia cambogia, Garcinia indica và

Garcinia atroviridis theo một báo cáo của Lewis, Neelakantan (1954) [68], các tác

giả đã tìm thấy 31% chất béo có thể ăn được trong hạt của quả Garcinia cambogia

và hàm lượng acid HCA được chiết xuất bằng phương pháp chưng ninh chiếm khoảng 20 - 30% [72]

Gần đây, tính chất và hoạt tính sinh học của HCA lại được thảo luận bởi Lewis và Neelakantan (2001) [24], bởi các tác giả đã nhận thấy đồng phân cấu trúc của acid hydroxycitric không bền vững, dễ bị chuyển hóa sang dạng lacton (Hình 1.2) trong quá trình chiết xuất và bảo quản [70]; vì thế đã chuyển hóa acid sang các dạng muối kali, canxi hydroxycitrat bền vững hơn [69]

Hình 1.2 Cấu trúc của HCA và dạng lacton

Những sản phẩm này thường được bán tại Mỹ như là một xu hướng mới, bổ trong chế độ ăn uống và các thực phẩm giảm béo trên thị trường [132]

Bên cạnh đó, Martius và Maue đã phát hiện ra cấu trúc của acid HCA và lacton của nó tồn tại các dạng đồng phân lập thể khác nhau [26] Cụ thể, acid hydroxycitric (acid 1,2-dihydroxypropan-1,2,3-tricarboxylic) có hai trung tâm đối xứng nhau, làm xuất hiện hai cặp chất đồng phân lập thể, hoặc bốn đồng phân quang học, cùng với đồng phân lacton của nó (Hình 1.3) [18]

C C

(+)-allo-Lacton acid hydroxycitric (6)

Hình 1.3 Các dạng đồng phân và lacton của acid hydroxycitric

Trong số các đồng phân của acid hydroxycitric được các nhà khoa học tổng hợp về dạng hydroxycitrat [83], thì đồng phân (1) là thành phần chính và có nhiều

trong loài Garcinia [77]; đây là đồng phân dễ dàng tạo ra các dẫn xuất dạng muối

hydroxycitrat của kim loại natri, canxi nhằm bảo vệ cấu trúc acid hydroxycitric HCA; còn đồng phân (2), (3) và (4) chiếm tỷ lệ thứ yếu trong quá trình tổng hợp, cùng với các đồng phân (5) và (6), các đồng phân này cũng được tìm thấy trong loài

(-)-Hibiscus (loài cây dâm bụt hay râm bụt) [49]

b Về hàm lượng acid hydroxycitric (HCA)

Trong quá trình nghiên cứu rộng rãi trên động vật, HCA đã chứng minh khả năng kìm hãm cảm giác ngon miệng khi ăn, làm tăng tốc độ tổng hợp glycogen của gan, làm giảm tổng hợp acid béo và lipid, dẫn đến giảm sự tăng trọng của cơ thể [53] Allison et al (2001), trong một bài báo về sử dụng HCA trong xử lý giảm cân, theo đó, dẫn xuất của HCA đã kết hợp cùng nhiều thành phần dược phẩm khác với mục đích làm tăng việc giảm cân, bảo vệ tim mạch, khắc phục tình trạng không bình thường của các lipid bị kéo dài khi hoạt động [52] Điều này đã làm tăng hơn nữa nhu cầu sử dụng HCA, dẫn đến nguồn cung cấp HCA trong quá trình sử dụng

quả các loài Garcinia cambogia, Garcinia indica đã gặp nhiều khó khăn, vì thế cần

tìm nguồn HCA mới để thay thế chúng [54]

Các tác giả Bhabani S Jena, Guddadarangavvanahally K Jayaprakasha và Kunnumpurath K Sakariah (2002), đã nghiên cứu và đưa ra các kết quả về quá

trình chiết xuất acid hydroxycitric (HCA) từ lá, quả và vỏ của loài Garcinia cowa

Roxb., được tìm thấy tại một phần phía Đông bắc Ấn Độ và bán đảo Andama [65]

Đồng thời, theo thông tin tham khảo hiện có, thì đây là báo cáo đầu tiên về acid

hydroxycitric (HCA) từ lá, quả và vỏ của Garcinia cowa Roxb., được chiết xuất

bằng phương pháp chưng ninh và hàm lượng của chúng được xác định bằng phương pháp chuẩn độ acid - base, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC [20]

Tại vùng cao Assam, loài Garcinia cowa Roxb., thường được trồng trong vườn của

người dân để lấy quả [63] Theo đó, hoa của loài này kéo dài từ tháng giêng đến tháng ba và quả của nó bắt đầu chín từ tháng năm đến tháng sáu Loại quả này rất phổ biến với tên gọi “kujithekera” hoặc “kauthekera”, chúng có thể được làm mứt mặc dù quả của chúng không được ngon bởi “nặng” mùi acid hoặc được cắt lát phơi khô đem bảo quản trong thời gian dài, sử dụng trong điều trị bệnh kiết lỵ [81] Tại Burma, lá tươi được nấu và ăn như là một loại rau sống

* Chiết xuất acid hydroxycitric (HCA) vỏ tai chua - Garcinia cowa Roxb.

Lá tươi và quả tai chua được cắt nhỏ, đem chưng ninh từng phần với 100mL nước cất trong nồi áp suất, thời gian 20 phút, sau đó được lọc bằng vải muslin Dịch chiết thu được đem xử lý với khoảng 4g than hoạt tính trong nước nóng với thời gian khoảng 30 phút Sau đó dịch chiết được xử lý lọc bằng giấy lọc Whatman 41, tẩy màu bằng than hoạt tính, thu được dịch cuối cùng Dịch cuối này, đem cô quay chân không còn lại khoảng 1/5, tiến hành xử lý với 100mL etanol và cô quay; tiến hành ly tâm các chất rắn đã lọc được, thu lấy phần rắn nổi trên bề mặt và rửa hai lần với 20mL etanol để thu hết các acid hữu cơ bám chặt trên đó khi ly tâm Sau đó cô đuổi dung môi, còn lại khoảng 25mL và bảo quản ở nhiệt độ 40C để sử dụng về sau Kết quả, hàm lượng acid thu được lần lượt từ lá và quả tươi chiếm khoảng 4,46% và 5,92% theo phương pháp chuẩn độ acid - base với dung dịch NaOH 0,1N và chất chỉ thị là phenolphtalein

Đối với vỏ quả khô của Garcinia cowa Roxb.: có hai phương pháp tiến hành

chiết xuất acid hữu cơ [20]

* Phương pháp 1: vỏ của quả Garcinia cowa Roxb., được chiết trong nồi áp

suất với nước cất, thời gian khoảng 30 phút, sau đó được lọc bằng vải muslin Lấy phần bã đem chiết và lọc lại một lần nữa thu được lượng acid hữu cơ cuối cùng

Dịch chiết thu được xử lý với 4g than hoạt tính trong nước nóng khoảng 30 phút và lọc lại bằng giấy lọc Whatman 41 Than sau đó được rửa hai lần với 15mL nước cất

và đem lọc lại bằng giấy lọc Dịch chiết thu được đem cô quay chân không còn lại khoảng 30mL và xử lý với 120mL etanol, rồi khuấy đều khoảng 15 phút, thu được chất rắn dạng keo và ly tâm Đem rửa hai lần với dung môi etanol, phần chất rắn thu được nổi lên bề mặt, để thu hết lượng acid bám chặt trên đó Cả hai phần lơ lửng được gộp lại và cô quay dưới áp suất, còn lại khoảng 25mL và lưu giữ ở nhiệt độ

40C để sử dụng về sau Hàm lượng acid được xác định bằng phương pháp chuẩn độ acid – base với dung dịch NaOH 0,1N và chất chỉ thị phenolphtalein, là 27% so với khối lượng của vỏ khô

* Phương pháp 2: vỏ khô Garcinia cowa Roxb được chiết soxhlet với

100mL với mỗi dung môi axeton và metanol, trong thời gian mỗi mẫu chiết là 8 giờ, ở nhiệt độ 600C Dịch chiết được lọc bằng giấy lọc Whatman 41 và cô quay chân không Dịch chiết của hai dung môi lơ lửng tách biệt nhau trong nước cất và than hoạt tính Cả hai dịch chiết của dung môi đều được làm nóng trong bình với thời gian khoảng 30 phút và lọc bằng giấy lọc Whatman 41 Than hoạt tính được rửa hai lần với 10mL nước cất và thu được nước rửa Dịch chiết của hai dung môi axeton và metanol thu được lượng acid HCA khoảng 26,3% và 25,4% so với khối lượng nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ acid - base với dung dịch NaOH 0,1N và chất chỉ thị là phenolphtalein

* Kết quả phân tích hàm lượng HCA trong quả tai chua

Hàm lượng của HCA trong quả tai chua được phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – HPLC và phương pháp chuẩn độ Theo đó, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng trong phân tích là thiết bị của Hewlett Packard dòng model HP 1100 thế hệ thứ tư, pha động là MeOH và acid phosphoric 0,01M, tốc độ dòng là 0,7mL/phút Kết quả, tác giả thu được các giá trị hàm lượng

khác nhau của HCA trong quả tai chua - Garcinia cowa Roxb khi phân tích bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp chuẩn độ, thể hiện ở phụ lục 1 Bảng 1 và Bảng 2 Bên cạnh đó, giá trị thời gian lưu của HCA trong quả tai

chua (5,842 phút) cũng gần với kết qủa phân tích HCA trong bứa Garcinia

cambogia (5,3 phút)

Ngoài ra, dựa trên kết quả nghiên cứu, các tác giả Bhabani S Jena, Guddadarangavvanahally K Jayaprakasha và Kunnumpurath K Sakariah, nhận

thấy rằng hàm lượng HCA trong quả tai chua – Garcinia cowa Roxb., có giá trị cao

nhất trong số các hợp chất hữu cơ chiết xuất thu được và kết quả này đã mở ra một

hướng mới trong việc tìm nguyên liệu thay thế cho các loài bứa trước đây (Garcinia

cambogia, Garcinia india, Garcinia atroviridis) mà mọi người vẫn hay dùng để

chiết xuất acid HCA sử dụng trong việc giảm béo phì [12]

Đồng thời, theo tài liệu mà chúng tôi tham khảo trên thế giới, đây là nghiên cứu đầu tiên và duy nhất cho đến thời điểm này, về acid hydroxycitric (HCA) của

loài tai chua - Garcinia cowa Roxb Vì vậy, với hướng nghiên cứu của chúng tôi về

loài thực vật này, góp phần làm hoàn thiện hơn nữa các tính năng ưu việt mà acid hydroxycitric (HCA), đặc biệt là muối kép hydroxycitrat tổng hợp từ loài tai chua -

Garcinia cowa Roxb., mà từ trước đến nay chưa có nghiên cứu nào đề cập đến

* Ảnh hưởng của (-)-HCA đến sự tổng hợp acid béo và sự hình thành lipid: Theo các tác giả B S Jena, G K Jayaprakasha, R P Singh và K K Sakari-

ah, acid HCA có vai trò rất quan trọng trong việc tác động đến khả năng giảm béo phì bởi chức năng hóa sinh mà nó mang lại [82] Cụ thể: HCA là chất gây ức chế mạnh ATP citrat lyase, nó đóng vai trò xúc tác phân tách ty ngoại thể của citrat thành oxaloaxetat và axetyl-CoA, những giới hạn mà các phân tử axetyl-CoA dùng

để tổng hợp acid béo và hình thành lipid [17] Trong quá trình nghiên cứu, Sullivan

và các cộng sự đã thấy rằng chỉ có HCA làm giảm đáng kể sự hoán chuyển của

14Ccitrat vào lipid trong gan với tốc độ cao và hoán chuyển 14C alanin vào trong lipid [29] Ngoài ra, Beynen và Geelen (1982) đã phát hiện sự ức chế của việc tổng hợp acid béo từ glucose bằng HCA trong các tế bào gan được cô lập Tuy nhiên, nó không ảnh hưởng đến tổng hợp acid béo từ axetat mà ngược lại [37] Kết hợp với phát hiện của Hackenschmidt và các đồng sự [111], đã cho thấy HCA là một tác nhân hiển nhiên của enzyme axetyl-CoA carboxylaza và các đồng dạng của HCA;

HCA đóng vai trò là một chất ức chế sự hình thành lipid chỉ phân tử axetyl-CoA được sản sinh bởi phản ứng enzyme phân chia citrat [91].

* Tác động đến sự ức chế enzyme trong quá trình phân tách muối citrat:

Enzyme chia tách muối citrat, là ATP citrat lyase [80], xúc tác việc chia tách ngoại

ty thể của muối citrat thành oxaloaxetat và axetyl CoA Watson và các đồng sự đã tìm thấy sự ức chế mạnh mẽ của ATP citrat lyase [55] bởi HCA với enzyme tinh chế (làm sạch) từ gan chuột Trong thí nghiệm đó, HCA có ái lực nhiều lên các

enzyme tinh chế hơn là chất tự nhiên, đó chính là citrat và Ki của HCA cho enzyme

chia tách citrat ở khoảng 0,2 ÷ 0,6 M, tuỳ thuộc vào điều kiện [60] Sau đó,

Cheema Dhadli tìm thấy sự ức chế của enzyme này ở cả HCA tự do (Ki = 8 M) và HCA este vòng (Ki = 50 – 100 M) [85] Các nhà khoa học thấy rằng este vòng của HCA là một chất ức chế rất ít hiệu quả của enzyme chia tách muối citrat [73] Trong não chuột, HCA cho thấy nó là chất gây ức chế tiềm tàng của enzyme chia tách muối citrat [114] Với những nghiên cứu tương tự, Sullivan và Stallings đã quan sát thấy trong 4 đồng phân của HCA, thì (-)-HCA là chất gây ức chế tiềm năng duy nhất của ATP, (-)-HCA được tìm thấy sẽ ngăn chặn ATP được tinh chế 1 phần citrat

lyase từ gan người (Ki = 3 x 10-4M) [75]

Việc khám phá ra sự ức chế mạnh mẽ của enzyme chia tách citrat bởi HCA, sẽ cung cấp thông tin giá trị cho việc nghiên cứu vai trò trao đổi chất của phản ứng chia tách muối citrat [38]

Ảnh hưởng sinh học của HCA xuất phát từ sự ức chế chia tách ngoại ty thể của citrat đến oxaloaxetat và axetyl-CoA [110] Nguồn gốc cơ bản của tất cả nguyên tử carbon của acid béo là axetyl-CoA, nó được hình thành trong ty thể bởi

sự oxi hóa khử nhóm carboxyl của pyruvat (pyruvat là một chất được sử dụng bởi các tế bào (ngoài lactat) trong sản xuất năng lượng) [93], sự oxi hóa thoái biến của vài acid amin hoặc oxi hóa vị trí β của các acid béo mạch dài Việc tổng hợp acid béo lớn nhất khi lượng carbohydrat dồi dào và acid béo ở mức thấp [56] Sự chuyển hoá carbohydrat thành chất béo đòi hỏi phải có sự oxy hoá pyruvat thành axetyl-CoA [107] Acid béo được tổng hợp trong bào tương của tế bào (cytosol), trong khi

axetyl-CoA được hình thành từ pyruvat trong ty thể [115] Để tổng hợp sinh học acid béo, nhóm axetyl của axetyl-CoA phải được chuyển hoá từ ty thể sang dạng bào tương (cytosol) [43] Do đó axetyl-CoA không thể rời khỏi ty thể vào cytosol Rào chắn tới axetyl-CoA được phá bỏ bởi citrat và citrat mang nhóm axetyl vào bên trong màng ty thể [46] Citrat được hình thành trong chất nền ty thể bởi sự ngưng tụ của axetyl-CoA với oxaloaxetat Khi nồng độ cao, citrat được chuyển tới bào tương (cytosol) theo hệ thống vận chuyển tricarboxylat [48] Ở bào tương (cytosol), axetyl-CoA lại được tái sinh từ citrat bởi ATP citrat lyase, nó làm xúc tác cho phản ứng sau [112]:

citrat + ATP + CoA  axetyl-CoA + ADP + oxaloaxetat Pi

axetyl CoA + oxaloaxetat + H2O  citrat CoA ATP citrat lyase được phân bố nhiều ở mô động vật [113] Người ta cho rằng ATP citrat lyase đóng vai trò sinh lý trong sự hình thành lipid từ carbohydrat và sự hình thành glucose trong cơ thể động vật [57] Những thay đổi trong hoạt động của enzyme chia tách citrat có mối tương quan với những thay đổi trong tỷ lệ tổng hợp acid béo và cung cấp những bằng chứng về sự liên quan của phản ứng chia tách citrat trong tổng hợp acid béo [108] Hoạt động của enzyme chia tách citrat thay đổi phù hợp với tình trạng dinh dưỡng của động vật Theo đó, trong lúc đói hoặc khi được cho ăn với một chế độ giàu chất béo, mức độ enzyme sẽ giảm nhanh chóng [109] Còn khi cho ăn với một chế độ carbohydrat cao, mức ATP citrat lyase cũng nâng lên rõ rệt Các dấu hiệu cũng chỉ rõ rằng, hơn 80% của ngoại ty thể axetyl-CoA được tạo thành từ pyruvat ở ty thể của gan chuột được cung cấp bởi ATP-citrat lyase [118]

* Các nghiên cứu khác về (-)-HCA: Brunengraber và các đồng sự đã phát

hiện rằng, (-)-HCA kiềm chế sự tổng hợp acid béo trong gan chuột bởi liên quan đến sự tăng lên do sự tích lũy mô của glycose-6-phosphat, fructose-6-phosphat và glycolytic trung gian từ fructosebisphosphat [59] Các nhà khoa học cho rằng, dung tích citrat được tăng lên trong tế bào chất do sự hiện diện của (-)-HCA Điều này dẫn tới một sự giảm sút của phosphofructokinase bởi vì citrat được xem là nhân tố

kiềm chế enzyme này [78] Trong một báo cáo nghiên cứu của McCune và đồng sự, chỉ ra rằng phosphofructokinase ức chế tế bào gan của chuột bằng (-)-HCA dẫn đến

sự tích lũy của glycose-6-phosphat, fructose-6-phosphat và sự giảm bớt của glycolytic trung gian bên ngoài fructose bisphosphat như là một phản ứng không thuận nghịch [116], được xúc tác bởi phosphofructokinase trong quá trình, dùng điều chỉnh cơ chế glycosis (đây là quá trình phân hủy glucose bằng enzyme và giải phóng năng lượng cùng với acid pyruvic) [119]

1.4.2 Tại Việt Nam

Năm 2000, Nguyễn Diệu Liên Hoa, Harrison cùng với cộng sự, đã phân lập

từ vỏ cây Garcinia vilersiana thu hái tại miền Nam, được các hợp chất của xanthon

như globuxanthon (a), 12b-hydroxy-des-D-garcigerrin A (b) và symphoxanthon (c) (Hình 1.4)

Năm 2006, tác giả Nguyễn Thị Ngọc Tuyết, thuộc trường Khoa học Tự nhiên

- Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, đã trình bày trong báo cáo về “Khảo sát

thành phần hóa học của cây bứa đồng – Garcinia schomburgkiana, họ bứa

(guttiferae)”, theo đó tác giả đã thu hái nguyên liệu tại Tiền Giang và phân lập

được 06 hoạt chất của loài bứa đồng – Garcinia schomburgkiana (Hình 1.5)

Hình 1.4 Cấu trúc của một số xanthon từ loài Garcinia vilersiana

Hình 1.5 Cấu tạo các hoạt chất của bứa đồng

Năm 2008, các tác giả Hà Diệu Ly, Poul Erik Hansen, Fritz Duus, Phạm Đình Hùng, Nguyễn Diệu Liên Hoa [3], đã báo cáo nghiên cứu “Cô lập và nhận

dạng bốn depsidon từ vỏ cây bứa núi – Garcinia oliveri”, cùng với đó là nhóm tác

giả Ngũ Trường Nhân, Đỗ Hữu Bảo Phương, Phạm Đình Hùng, Nguyễn Diệu Liên

Hoa [121], cũng đã phân lập từ cao petrolium ether (ete dầu) của vỏ bứa Delpy thu

hái ở đảo Phú Quốc (Hình 1.6 và Hình 1.7)

Hình 1.6 Cấu trúc của 4-depsidon

Hình 1.7 Cấu trúc của các hoạt chất phân lập từ bứa Delpy

Gần đây nhất, năm 2013, nghiên cứu sinh Đặng Quang Vinh đã báo cáo luận

án tiến sĩ với đề tài “Nghiên cứu chiết tách, chuyển hóa hydroxycitric acid trong lá,

vỏ quả bứa và ứng dụng tạo sản phẩm giảm béo” [1]; theo đó, tác giả đã đưa ra quy trình chiết xuất acid hydroxycitric với hiệu suất cao nhất bằng cách sử dụng năng

lượng lò vi sóng, dịch chiết acid thu được từ loài bứa Garcinia oblongifolia Champ

Ex Benth, được xử lý và tác giả đã xác định hàm lượng acid hydroxycitric bằng sắc

ký lỏng hiệu năng cao – HPLC (15,28%) dựa trên chất chuẩn (-)-calcium hydroxycitrate tribasic hydrate (C12H10O16Ca3.xH2O) của hãng Sigma Aldrich; đồng thời chỉ rõ đồng phân cấu trúc của acid HCA đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp muối đơn kali, canxi hydroxycitrat, cũng như các hoạt tính mà các chế phẩm hydroxycitrat này mang lại trong quá trình thử nghiệm hoạt tính sinh học đối với vi sinh vật, thử độc tính cấp, hạ lipid, chống béo phì trên cơ thể chuột Cho đến nay, đây là công trình trong nước duy nhất, nghiên cứu tương đối bài bản về hàm lượng của acid hydroxycitric (HCA) và các tác động sinh học của nó lên động vật [9]

threo-* Như vậy: acid hydroxycitric (HCA) của các loài bứa đã được các nhà khoa

học nghiên cứu từ lâu trên thế giới, tuy nhiên tại Việt Nam, thì acid này lại chưa được nghiên cứu đầy đủ, chỉ giới hạn ở một vài công trình, chủ yếu về thành phần

hóa học các loài Garcinia thông thường như Garcinia oblongifolia, Garcinia

cambogia, Garcinia oliveri, Garcinia schomburgkiana, Garcinia india, Garcinia

atroviridis Đối với HCA của loài tai - Garcinia cowa Roxb., thì vẫn còn nhiều hạn

chế, mặc dù hàm lượng HCA trong quả tai chua chiếm tỷ lệ tương đối lớn (sau loài

Garcinia cambogia); theo những tra cứu tài liệu tham khảo của chúng tôi, hiện nay

chỉ có một vài báo cáo trên thế giới về hàm lượng acid HCA từ lá, quả và vỏ của loài tai chua Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiếp tục tìm hiểu về acid hydroxycitric

và các dẫn xuất dạng muối của acid này trên loài tai chua - Garcinia cowa Roxb.,

dựa vào các kết quả nghiên cứu đã được công bố của các nhà khoa học trong và ngoài nước

1.5 Kết quả tạo chế phẩm hydroxycitrat từ acid hydroxycitric (HCA)

1.5.1 Nghiên cứu trên thế giới

a Muối đơn

Trong quá trình nghiên cứu về acid hydroxycitric (HCA), các nhà khoa học B.S Jena G K Jayaprakasha, R P Singh [23], đã phát hiện cấu trúc của acid không bền vững, khó bảo quản trong quá trình sử dụng, nên đã chuyển hóa sang dạng muối đơn kali, canxi hydroxycitrat bền vững hơn, thuận lợi cho quá trình sử dụng và bảo quản muối Cấu trúc được thể hiện trên Hình 1.8

Hình 1.8 Cấu trúc của muối đơn hydroxycitrat

Các sản phẩm muối đơn này được tổng hợp chủ yếu từ acid hydroxycitric

của loài bứa Garcinia cambogia, Garcinia indica, Garcinia atroviridis; đối với loài

Garcinia cowa Roxb., thì chưa có nghiên cứu nào đề cập đến [47] Theo đó, quá

trình tổng hợp muối đơn kali hydroxycitrat bằng dịch chiết acid hydroxycitric với dung dịch KOH, K2CO3, điều chỉnh pH khoảng 8 ÷ 11,5; hỗn hợp thu được đem sấy khô chân không hoặc áp suất khí quyển hoặc khí trơ (N2), thu được chất rắn có công thức phân tử C6H5O8K3.H2O, khối lượng phân tử 340,4; tan được trong nước nhưng không tan trong các dung môi CH3OH, C2H5OH 960, Hàm lượng K+chiếm hơn 30%, HCA ≥ 50%, lacton ≤ 2%, độ quay cực là -180 ÷ - 250 [79]

Tương tự, quá trình tạo muối đơn canxi hydroxycitrat được các nhà khoa học Bhaskaran, Wanorie, Sevanti [109], điều chế từ dịch chiết acid HCA của loài

Garcinia cambogia, Garcinia indica Theo đó, dịch acid được phản ứng với dung

dịch KOH, NaOH thu được muối natri hoặc kali hydroxycitrat; đem các muối đơn này phản ứng với dung dịch muối canxi clorua, thu được muối canxi hydroxycitrat,

pH duy trì trong khoảng 9,5 ÷ 11 Kết quả hàm lượng ion canxi khoảng 17%, hàm lượng HCA khoảng 72%

Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu muối hydroxycitrat, các nhà khoa học nhận thấy tầm quan trọng trong việc đưa các ion kim loại vào trong muối, vừa đảm bảo cấu trúc của acid hydroxycitric (HCA), vừa tăng cường bổ sung các ion kim loại bị thiếu hụt trong cơ thể của người bệnh trong quá trình điều trị [51] Cụ thể:

- Ion natri (Na+): tồn tại trong cơ thể dưới dạng muối, nên hàm lượng natri trong cơ thể tương đối lớn Nhu cầu hàng ngày khoảng 800 - 1600mg/người, nhưng trung bình chúng ta sử dụng 4000 - 6000 mg/ngày dưới dạng muối natri clorua (NaCl) Ion natri giúp điều hòa lượng nước trong cơ thể và liên quan đến việc sử dụng năng lượng cũng như chức năng thần kinh Nếu thiếu natri quá mức thì sẽ dẫn đến hiện tượng mất nước ngoại bào, với biểu hiện: khô miệng, chán ăn, nhịp tim nhanh,

- Ion kali (K+): là khoáng chất mà cơ thể cần thiết phải nạp hàng ngày, khoảng 3,5g Theo đó, sự thiếu hụt ion K+ nặng sẽ gây nên sự co thắt của tim mạch, suy nhược cơ bắp và không dung nạp glucose, làm tăng nguyên cơ mắc bệnh tim mạch; đặc biệt là đột quỵ và ảnh hưởng đến pH trong quá trình trao đổi chất của các

tế bào nội phân tử

- Ion canxi (Ca2+): tạo cho hệ xương chúng ta được chắc khỏe, được xem là

“bác sĩ” tuyệt vời trong cơ thể con người, đồng thời phát sinh phản ứng miễn dịch với một số bệnh đã mắc Ion canxi có vai trò quan trọng trong truyền dẫn thần kinh Khi cơ thể thiếu canxi thì hoạt động truyền dẫn thần kinh bị ức chế, công năng hưng phấn và công năng ức chế của hệ thần kinh bị suy giảm [41]

- Ion magie (Mg2+): xây dựng các tổ chức mô, tham gia vào thành phần của nhiều loại men điều hòa các chức năng khác nhau của cơ thể Nhu cầu magie ở người trưởng thành khoảng 350 - 400mg/ngày, những người lao động thể lực nặng nhọc, vận động viên thể thao cần nhiều hơn 1,5 - 2 lần Cơ thể thiếu magie sẽ gây ra các bệnh về tim mạch và đột quỵ [14]

- Ion kẽm (Zn2+): là một khoáng chất cần thiết tìm thấy trong mọi tế bào, cần thiết cho việc chữa trị các vết thương Nhu cầu hàng ngày khoảng 2500mg Quan hệ giữa kẽm và tuyến tiền liệt là cực kỳ mật thiết Khi thiếu kẽm, sức đề kháng và miễn dịch của cơ thể giảm, vết thương sẽ khó lành, giảm chức năng của hấu hết tế bào miễn dịch, làm tăng tiết bã nhờn quá mức và sừng hóa nang lông, nguyên nhân chính gây ra mụn [13]

Bên cạnh đó, các sản phẩm muối đơn này lại mang nhược điểm lớn mà muối kép đang dần khắc phục như: màu (vàng), mùi vị (mùi hăng, chua), khả năng hút

ẩm cao [44] Bởi vì các chế phẩm này được sử dụng trong quá trình điều trị, cũng như làm thực phẩm, chủ yếu thông qua đường miệng nên những nhược điểm trên đã gây cản trở cho quá trình sử dụng, cũng như khó khăn khi bảo quản [123] Tuy nhiên, theo những nghiên cứu đã công bố trên thế giới, các sản phẩm muối kép lại khắc phục được các nhược điểm trên của muối đơn, đồng thời không ảnh hưởng đến tính năng giảm béo của nó, mà còn góp phần tạo sự phong phú đa dạng khi có thể

“ghép nối” các ion kim loại khác nhau trong cấu trúc [106], tạo nên sự phong phú

và đa dạng các loại sản phẩm muối kép, vừa nâng cao tính năng bền vững cấu trúc của muối tạo thành, vừa mở rộng khả năng điều trị các bệnh về xương khớp, tim mạch [42]

Hiện nay, các sản phẩm muối hydroxycitrat được sử dụng chủ yếu là muối đơn, dưới dạng thực phẩm chức năng, dùng trong việc giảm béo được bán trên thị

trường như: Hydrotrim, Garcinia Plus của Công ty thực phẩm chức năng

Indoworld.com Sản phẩm của hợp chất trích từ cây bứa được đầu tư nghiên cứu vào những năm 1960 và thương mại hoá như một dạng thuốc tân dược chống béo phì được tung ra thị trường thế giới trong nhiều thập kỷ qua; bên cạnh đó, một sản

phẩm Herbal Slim Garcinia cambogia được nhập khẩu nguyên lọ từ Canada với

thành phần chiết xuất từ quả bứa (acid hydroxycitric 60%) [117], Tuy nhiên, đối với dòng sản phẩm muối kép hydroxycitrat thì còn hạn chế, chưa thấy xuất hiện nhiều trên thị trường; ngoài ra, các dòng sản phẩm muối đơn hydroxycitrat đều có giá thành cao, một số sản phẩm chưa kiểm định chất lượng rõ ràng, nguồn cung ứng chưa ổn định, chưa tạo niềm tin tuyệt đối cho đối tượng sử dụng [124]

b Muối kép

Muối kép đã được các nhà khoa học Y S Lewis và S Neelakantan quan tâm

từ những năm 1967, sau khi các tác giả phát hiện ra những nhược điểm mà muối đơn "mắc phải"[50], [70] Điều đó đã “mở đường” cho các hướng phát triển sau này

về tổng hợp muối kép thành thương phẩm

Năm 2000, Balasubramanyam, K., Chandrasekhar, B.; Ramadoss, C S.; Rao; đã công bố nghiên cứu “Hòa tan kim loại nhóm IA và IIA của (-)-acid hydroxycitric, quá trình chuẩn bị và sử dụng nó làm thức ăn, đồ uống ngoài hiệu quả làm gia vị”, theo đó các tác giả đưa ra phương pháp tạo thành cặp kim loại muối hòa tan nhóm IA và IIA của (-)-HCA [58]

Thí nghiệm 1: Dịch chiết thu được từ 3kg vỏ bứa khô với 3,6 lít nước, thu

được 620mg acid và phần hòa tan khác trong nước Hiệu suất dịch chiết đạt trên 90% Dịch thu được này cho vào bình và trung hòa với 358mg NaOH Sau đó làm lạnh dung dịch ở nhiệt độ phòng, cho tiếp 500mL dung dịch của Ca2+chứa 450mg CaCl2 vào dung dịch trên và ly tâm, thu được muối canxi không tan, rửa muối để loại bỏ màu và phần tạp chất hòa tan trong nước Muối thu được đem sấy khô và cân nặng được 693mg

Tiếp đó, 100g của dung dịch muối này được cho vào trong bình 1lit và cho vào đó 350mL nước hòa tan với 71,32mg acid oxalicdihydrat, tất cả được khuấy với tốc độ 150vòng/phút trong thời gian khoảng 30 phút và lọc được 210mL phần nổi lên trên Phần nổi lên này được thêm với 100mg của canxi hydroxycitrat và một phần acid hydroxycitric thu thêm, được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao khoảng 45% Dịch chiết acid chứa hàm lượng acid hydroxycitric khoảng 202mg trong 450mL dịch chiết, được trung hòa với 117mg NaOH, làm lạnh

ở nhiệt độ phòng Thêm 200mL dung dịch muối natri của acid hydroxycitric chứa 81mg CaCl2 và khuấy mạnh Muối canxi tan của acid hydroxycitric sau đó được kết tủa bằng etanol và sấy khô thu được 234mg muối canxi hòa tan của acid hydroxycitric (khoảng 91,2%)

Thí nghiệm 2: khoảng 100mg vỏ Garcinia cambogia được chiết 4 lần với

80% axeton trong nước (mỗi giờ 250mL) thời gian khoảng 4giờ Dịch chiết thu được (khoảng 830mL) đem cô cạn còn lại 300mL ở nhiệt độ 560C bằng cô quay chân không Lọc, xử lý bằng than hoạt tính thu được 18mg acid hydroxycitric Cô cạn còn lại khoảng 50mL và được chuyển thành muối natri của acid hydroxycitric bằng cách thêm vào 11mg NaOH dạng viên nhỏ, cho tiếp 9mg CaCl2 vào 20mL dung dịch muối natri của acid hydroxycitric và khuấy mạnh Cho từ từ etanol vào dịch muối và thu được kết tủa hydroxycitrat Lọc kết tủa, rửa lại với etanol, sấy khô thu được 20,7mg muối canxi tan của acid hydroxycitric (khoảng 89,94%)

Đó là các quá trình cơ bản tổng hợp muối kép của acid hydroxycitric với các kim loại nhóm IA và IIA Các sản phẩm thu được đã vượt qua những nhược điểm

mà muối đơn mắc phải, đồng thời phát triển thêm một số loại muối kép hòa tan mới

từ kim loại nhóm IA và IIA của (-)-acid hydroxycitric (Hình 1.9) [61]

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của muối kép kim loại nhóm IA và IIA

Trong đó:

Vị trí của kim loại X là của nhóm IA gồm Li, Na, K, Rb, Cs hoặc Fr

Vị trí của kim loại Y là của nhóm IIA gồm Be, Mg, Ca, Sr, Ba hoặc Ra Sau khi cô cạn, hàm lượng của kim loại X trong muối từ 1,5% đến 51,0%; hàm lượng của Y trong muối có giá trị từ 2,0% đến 50,9%; giá trị của HCA trong muối từ 31,0% đến 93,0%, phụ thuộc vào hàm lượng tự nhiên của kim loại X và Y

- Nếu quá trình tổng hợp muối kép của HCA gồm hai kim loại Na và Ca thì công thức cấu tạo của muối kép như Hình 1.10

Hình 1.10 Công thức cấu tạo muối kép Na/Ca HCA

Theo đó, hàm lượng của natri trong muối kép 8,58%; hàm lượng của canxi trong muối là 14,92%; hàm lượng của (-)-acid hydroxycitric là 76,50%

Nhóm tác giả G Ganga Raju; Labbipet (Ấn Độ) [41], đã báo cáo đề tài

“Thành phần của acid hydroxycitric trong dược phẩm và sản phẩm thức ăn cung cấp trong chế độ ăn uống của phương pháp giảm béo cơ thể”, theo đó quá trình chiết vỏ

khô loài Garcinia được thực hiện trong nước nóng, sau đó dịch chiết được lọc và cô

cạn khoảng 45% tổng lượng chất rắn khi cô quay dưới áp suất thấp nhiệt độ cao Theo quá trình này, hàm lượng acid hydroxycitric thu được 10% đến 12%, lacton của nó chiếm khoảng 11% đến 13% trọng lượng và acid citric chiếm khoảng 2% đến 3% Sau đó tác giả và cộng sự tiến hành làm giàu (-)-acid hydroxycitric bằng cách rửa muối canxi hydroxycitrat không tan với nước để loại bỏ phần dịch trong quá trình chuyển hóa thành muối canxi hydroxycitrat, cụ thể là các tạp chất như pectin, đường và màu sắc [62] Muối canxi hydroxycitrat được hòa tan với dung dịch acid phosphoric loãng để chuyển về dạng acid hydroxycitric và canxi phosphat Loại bỏ canxi phosphat và dung dịch acid hydroxycitric làm giàu được chuyển

thành muối canxi khi cho tác dụng với Ca(OH)2, điều chỉnh pH lần thứ nhất khoảng 3,5 đến 5 bằng acid HCA và lần thứ hai với dung dịch KOH, pH từ 8 đến 9 Dung dịch muối canxi này sau đó được lọc và cô cạn dưới áp suất thấp thu được khoảng 50% tổng lượng rắn Sau khi cô cạn đem xử lý với 75% cồn/axeton tạo thành muối canxi rắn màu trắng Muối canxi thu được đem sử dụng làm chất phối kết hợp với muối của kim loại nhóm IA như K, Na, Rb, tạo thành hợp chất muối kép của acid hydroxycitric có chứa kim loại canxi [64] Thành phần acid hydroxycitric trong hợp chất giảm còn khoảng 14% đến 26% hàm lượng canxi, và khoảng 24% đến 40% hàm lượng của kali, khoảng 14% đến 24% trọng lượng của natri

Gokaraju cùng với các cộng sự [45], đã đưa ra kết quả nghiên cứu về “Quá trình chuẩn bị mẫu tạo muối kép mới của acid hydroxycitric”, theo đó các tác giả đã đưa ra quy trình tổng hợp muối kép của kim loại nhóm IIA với acid hydroxycitric [47] Sản phẩm muối kép này mang lại lợi ích trong việc cung cấp chế độ ăn kiêng

và dùng làm đồ uống [35] Cấu trúc chúng được xác định như Hình 1.11

Hình 1.11 Cấu trúc muối kép của kim loại nhóm IIA với (-)-HCA

Trong đó, X và Y phụ thuộc vào kim loại được lựa chọn từ những kim loại nhóm II (IIA và IIB) của bảng hệ thống tuần hoàn Cụ thể muối kép của kim loại nhóm II phụ thuộc vào sự lựa chọn trong số các kim loại như: Be, Mg, Ca, Sr, Ba và

Ra (nhóm IIA), Zn, Cd hoặc Hg (nhóm IIB) dưới dạng hợp chất carbonat, oxit hoặc hydroxit của chúng [32] Trong công thức cấu tạo của muối kép trên, nếu sản phẩm muối kép là canxi và magie của (-)-HCA thì X là canxi và Y là magie; nếu muối kép của (-)-HCA là canxi và kẽm thì X là canxi và Y là kẽm; nếu muối kép của (-)-HCA

là magie và kẽm thì X là magie và Y là kẽm

Ngoài ra, các tác giả đã sử dụng dịch chiết của loài Garcinia cambogia đã xử

lý, kết hợp với các hợp chất muối vô cơ của kim loại nhóm II như canxi, magie,

kẽm; tạo ra các sản phẩm muối kép bền vững, sử dụng làm chế độ ăn kiêng, đồ uống và dinh dưỡng [33] Qui trình tổng hợp được thể hiện trong tài liệu [19]:

Mẫu 1: muối kép canxi và magie của HCA: dịch chiết của loài Garcinia

được làm sạch (trong 332mL, 14g) được thêm dung dịch magie carbonat (8g) trong nước (50mL) và khuấy đều trong thời gian 30 phút Sau đó thêm dung dịch canxi hydroxit (4,8g) trong nước (100mL) vào hỗn hợp trên, tiến hành khuấy đều dung dịch ở nhiệt độ khoảng 700C – 800C, trong thời gian 4 giờ Điều chỉnh pH của dung

dịch đến 7,5 bằng dung dịch của Garcinia Sau đó thêm than hoạt tính (5g) vào và

khuấy ở nhiệt độ 700C – 800C trong thời gian 1 giờ và lọc bằng giấy lọc Dung dịch được làm bay hơi hoặc làm khô thu được muối kép canxi và magie của HCA không màu (13g)

Phân tích muối kép thu được kết quả cụ thể: (-)-HCA là 73,17%; lacton là 0,43%; canxi là 11,88% và magie là 5,73% Công thức cấu tạo được thể hiện ở Hình 1.12

Hình 1.12 Công thức cấu tạo của muối kép Ca/Mg HCA

Mẫu 2: muối kép magie và kẽm của HCA, dịch chiết của loài Garcinia được

làm sạch (83mL; 3,5g), được thêm 3,6g MgCO3 vào trong trong 20mL nước và khuấy trong 30 phút Sau đó, thêm 2g kẽm carbonat vào 50mL nước đổ vào dung dịch trên và khuấy đều ở nhiệt độ 700C - 800C trong thời gian 4 giờ Thêm than hoạt tính (3g) vào và khuấy đều ở nhiệt độ 700C - 800C trong thời gian 1 giờ, lọc bằng giấy lọc

Cô cạn, thu được muối kép magie và kẽm hydroxycitrat không màu (5g) và kết quả phân tích thu được: (-)-HCA là 66,5%; lacton là 0,65%; magie là 8,5% và kẽm là 9,5% Công thức cấu tạo được thể hiện ở Hình 1.13

Hình 1.13 Công thức cấu tạo của muối kép Mg/Zn HCA

Mẫu 3: muối kép canxi và kẽm của HCA, dịch chiết của loài Garcinia được

xử lý (83mL; 3,5g) và thêm dung dịch của ZnCO3 (1,25g) trong nước (20mL), khuấy trong 30 phút Thêm than hoạt tính (2g) vào và khuấy đều ở nhiệt độ 70 -

800C trong thời gian 1 giờ và đem lọc bằng giấy Sau đó, thêm dung dịch của canxi hydroxit (1,8g) trong nước (50mL) vào dung dịch trên và khuấy đều ở nhiệt độ 70 –

800C trong thời gian 4 giờ Dung dịch làm lạnh, lọc chất kết tủa rắn và sấy khô thu được muối kép canxi kẽm hydroxycitrat không màu (5g) Kết quả phân tích thu được: (-)-HCA 64,14%; lacton 0,42%; canxi 10,09% và kẽm 9,69% Công thức cấu tạo được thể hiện ở Hình 1.14

Hình 1.14 Công thức cấu tạo của muối kép Ca/Zn HCA

Ngày 01 tháng 02 năm 2007, nhóm phát minh gồm Ganga R Gokaraju, Andhra Pradesh, Venkata Subbaraju Gottumukkala, Venkateswarlu Somepalli, Sridhar Pratha (IN) [42], đã công bố nghiên cứu “Quá trình chuẩn bị mẫu để tạo muối kép của acid hydroxycitric với nhóm amin và kim loại nhóm IIA”, kết quả nghiên cứu cho rằng, sự kết hợp của nhóm amin với kim loại nhóm IIA bất kỳ tạo nên muối kép hydroxycitrat có tác dụng rất tốt đối với sức khỏe con người [28]

Sản phẩm muối kép này rất ổn định và hòa tan tốt trong nước, được sử dụng làm chất dinh dưỡng, là tác nhân trong việc giảm béo và làm đồ uống Muối kép thu được có công thức tổng quát như Hình 1.15 [36]

Hình 1.15 Công thức cấu tạo của muối kép HCA chứa nhóm amin

Trong đó, X là kẽm hoặc kim loại theo nhóm IIA và Y là glusamin, caffein hoặc biết đến như là một amin bất kỳ tạo chứng biếng ăn, những amin như là (4,5-dihydro-5-phenyl-2-oxazolamine), clobenzoex ((+)-N-[(2-chlorophenyl)methyl]-α-methylbenzeneethanamine), cyclexedrine, diphemethoxidine (2-(diphenylmethyl)-1-piperidineethanol), denbutrazate (α-ethyl-benzeneacetic acid 2-(3-methyl-2-phenyl-4-morpholinyl)ethyl ester), fenproporex-(3-[(1-methyl-2-phenylethyl)-amino]propanenitrile), furfuryl methylamphetamine (N-methyl-N-(1-methyl-2-phenylethyl)-2-furanmethan amine), levophacetoperance (α-phenyl-2-piperidine-methanol acetate), mefenorex (N-(3-chloropropyl)-α-methyl-benzene-thanamine), metamfepramone (2-(dimethylamino)-1-phenyl-propanone), norseudoephedrine (threo-2-amono-1-hydroxyl-1-phenylpropane), pentorex (α,α,β-trimethylbenzene-ethanamine), peakilorex (3-(4-chlorophenyl)-5-cyclopropyl-2-me-thylpyrolidine), sibutramine (1-(4-chlorophenyl)-N,N-dimethyl-α-(2-methylpropyl) cyclobutane-mathanamine) hoặc phenylpropanolamine (2-amino-1-phenyl-1-propanol) [97]

Glucosamin là một amin saccarit, nó giúp cho cấu trúc xương được chắc khỏe, cải thiện khả năng vận động liên tục [122] Hơn nữa, nguồn gốc của bốn loại glucosamin được báo cáo với các tên glucosamin hydroclorit, glucosamin hydroiodit, glucosamin sunphat và N-axetyl glucosamin [21]

Trong những hợp chất glucosamin, thì glucosamin sunphat được ưu tiên hơn

và được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh viêm khớp mãn tính và cấp tính khác

[30] Ravi Gajanam và cộng sự [42], đã mô tả sự tạo thành muối của kim loại clorit bằng phản ứng giữa glucosamin hydroclorit và kim loại sunphat Công thức muối kép được thể hiện ở Hình 1.16

Hình 1.16 Cấu tạo muối kép của HCA với amin và kim loại nhóm IIA

Trong đó, X là kim loại kẽm hoặc kim loại nhóm IIA của bảng tuần tuần hoàn; phần còn lại Y là glucosamin hoặc caffein hoặc nhóm amin bất kỳ [31] Công thức cấu tạo chi tiết của hợp chất được thể hiện trên Hình 1.17

Hình 1.17 Cấu tạo của glucosamin và kim loại hydroxycitrat

Trong đó X là kẽm hoặc kim loại nhóm IIA Quá trình tạo muối kép được thể hiện ở các mẫu sản phẩm sau:

Mẫu 1 muối kép canxi, glucosamin của (-)-HCA: dịch chiết của loài

Garcinia (27mL, 2g, 1mol) được thêm dung dịch base tự do glucosamin (100mL, 1,7g, 1mol) và khuấy đều trong 1 giờ Cho canxi hydroxit (708 mg, 1mol) vào và khuấy đều trong thời gian khoảng 2 giờ, thêm than hoạt tính (0,5g) và khuấy tiếp trong 1 giờ Lọc và xử lý, thu được muối kép glucosamin không màu dạng bột (3,5g), hàm lượng của (-)-HCA là 46,3%, lacton là 8,3%, glucosamin là 30,3% và canxi là 8,25% Muối này chứa 1,01% clorit Công thức cấu tạo của chúng được thể hiện trên Hình 1.18

Hình 1.18 Công thức cấu tạo của glucosamin và canxi hydroxycitrat

Mẫu 2 Muối kép magie glucosamin của (-)-HCA: dịch chiết của loài Garcinia (27mL, 2g, 1mol) được thêm dung dịch base tự do glucosamin (100mL,

1,7g, 1mol) và khuấy đều trong 1 giờ Sau đó thêm magie carbonat (0,93g, 1mol) và khuấy đều trong thời gian khoảng 2 giờ, cho vào than hoạt tính (0,5g) và khuấy tiếp trong 1 giờ Dung dịch được lọc và làm trơ dưới áp suất thấp thu được muối kép magie glucosamin của HCA không màu dạng bột (3,0g), hàm lượng của (-)-HCA là 49,8%, lacton là 6,3%, glucosamin là 31,3% và magie là 5,5% Muối này chứa 0,5% clorit Công thức cấu tạo của chúng được thể hiện trên Hình 1.19

Hình 1.19 Công thức cấu tạo của glucosamin và magie hydroxycitrat

Mẫu 3 Muối kép kẽm glucosamin của (-)-HCA: dịch chiết của loài Garcinia

(27mL, 2g, 1mol) được thêm dung dịch base tự do glucosamin (100mL, 1,7g, 1mol)

và khuấy đều trong 1 giờ Sau đó thêm kẽm carbonat (1,0g, 1mol) và khuấy trong thời gian khoảng 2 giờ, cho vào tiếp than hoạt tính (0,5g) và khuấy tiếp trong 1 giờ Dung dịch được lọc, xử lý, thu được muối kép magie glucosamin của HCA không màu dạng bột (2,8g), hàm lượng của (-)-HCA là 46,6%, lacton là 6,5%, glucosamin

là 29,453% và kẽm là 10,2% Muối này chứa 0,8% clorit Công thức cấu tạo của chúng được thể hiện trên Hình 1.20

Hình 1.20 Công thức cấu tạo của glucosamin và kẽm hydroxycitrat

Mẫu 4 Muối kép canxi, norephedrin của (-)-HCA: dịch chiết của loài Garcinia (27mL, 2g, 1mol) được thêm dung dịch norephedrin (1,4 g, 1mol) và

khuấy đều trong 1 giờ Thêm canxi hydroxit (708 mg, 1mol), khuấy đều trong thời gian khoảng 2 giờ; thêm than hoạt tính (0,5g) và khuấy tiếp trong 1 giờ Dung dịch được lọc, xử lý, thu được muối kép canxi, norephedrin của HCA không màu dạng bột (2,8g); hàm lượng của (-)-HCA là 42,14%, lacton là 12,32%, norephedrin là 32,18% và canxi là 7,09% Công thức cấu tạo của chúng thể hiện trên Hình 1.21

Hình 1.21 Công thức cấu tạo của norephedrin và canxi hydroxycitrat

Mẫu 5 Muối kép magie norephedrin HCA: dịch chiết của loài Garcinia

(27mL, 2g, 1mol) được thêm dung dịch norephedrin (1,4 g, 1mol) và khuấy đều trong 1 giờ Sau đó thêm magie carbonat (0,9g, 1mol) và khuấy đều trong khoảng 2 giờ, cho tiếp than hoạt tính (0,5g) và khuấy tiếp trong 1 giờ Lọc và làm bay hơi nước dưới áp suất thấp thu được muối kép magie norephedrin của HCA không màu dạng bột (2,9g) Phân tích các đặc điểm muối kép magie norephedrin của HCA thu được hàm lượng (-)-HCA là 45,84%, lacton là 9,37%, norephedrin là 32,14% và magie là 5,62% Công thức cấu tạo của chúng được thể hiện trên Hình 1.22 [34]

Hình 1.22 Công thức cấu tạo của norephedrin và magie hydroxycitrat

Mẫu 6 Muối kép kẽm, norephedrin của (-)-HCA: dịch chiết của loài Garcinia (27mL, 2g, 1mol) được thêm dung dịch norephedrin (1,4 g, 1mol) và

khuấy đều trong 1 giờ Sau đó thêm kẽm carbonat (1,0g, 1mol) và khuấy đều trong thời gian khoảng 2 giờ, cho vào than hoạt tính (0,5g) và khuấy trong 1 giờ Lọc và làm bay hơi nước dưới áp suất thấp thu được muối kép kẽm norephedrin của HCA không màu, dạng bột (3,0g) Phân tích các đặc điểm của muối kép kẽm norephedrin HCA thu được hàm lượng của (-)-HCA là 42,83%, lacton là 10,35%, norephedrin là 30,47% và kẽm là 10,2% Công thức cấu tạo của chúng thể hiện trên Hình 1.23

Hình 1.23 Công thức cấu tạo của norephedrin và kẽm hydroxycitrat

Mẫu 7 Muối kép magie, sibutramin của (-)-HCA: dịch chiết của loài Garcinia (27mL, 2g, 1mol) được thêm dung dịch sibutramin (2,6 g, 1mol) và khuấy

đều trong 1 giờ Sau đó thêm magie carbonat (0,9g, 1mol), khuấy đều trong thời gian khoảng 2 giờ, tiếp tục thêm than hoạt tính (0,5g) và khuấy tiếp trong 1 giờ Lọc

và làm bay hơi nước dưới áp suất thấp thu được muối kép magie, sibutramin của HCA không màu dạng bột (3,5g)

Phân tích các đặc điểm của muối kép magie, sibutramin của HCA thu được hàm lượng của (-)-HCA là 38,58%, lacton là 10,16%, sibutramin là 40% và magie

là 3,52% Công thức cấu tạo của chúng được thể hiện trên Hình 1.24

Hình 1.24 Công thức cấu tạo của sibutramin và magie hydroxycitrat

Năm 2007, Samuel và các đồng nghiệp [99], đã công bố nghiên cứu “Phương pháp, thành phần cấu tạo muối phức kim loại của acid hydroxycitric”, theo đó tác giả đã nghiên cứu thành phần cấu tạo và những phương pháp tổng hợp các muối phức tạp chứa ba, bốn và năm nguyên tử kim loại của (-)-HCA, với các muối chứa

ít nhất 3 kim loại khác nhau được lựa chọn từ kẽm, magie, natri, kali và canxi Trong thành phần của muối có chứa 2 phân tử của acid hydroxycitric [103] Thành phần (-)-HCA trong các muối trên chiếm 40% - 75% khối lượng Quá trình tổng hợp muối ba hay bốn kim loại của (-)-HCA bao gồm các bước: chuẩn bị dịch chiết acid hydroxycitric, hỗn hợp các hợp chất của ít nhất 3 kim loại trong số các kim loại kẽm, magie, natri, kali và canxi trong dung dịch, sấy khô dung dịch để thu muối ba, bốn kim loại của acid hydroxycitric Nhiệt độ của quá trình sấy khô từ 1500C đến

2000C Cụ thể:

Mẫu 1 400 lít dịch chiết HCA được bơm vào thùng phản ứng 500 lít, sau đó

cho phản ứng với 7kg NaOH được hòa tan trong 25 lít nước đã được khử khoáng và được khuấy đều khoảng 60 phút ở nhiệt độ khoảng 700C - 800C Sau đó một hỗn hợp sền sệt của 6,8kg Mg(OH)2 và 3kg ZnCO3 trong 25 lit nước được khử khoáng thêm vào Cuối cùng, 4,3 kg Ca(OH)2 được thêm và khuấy trong 60 phút Dung dịch được trung hòa đã tẩy màu bằng 5 kg than hoạt tính Kết quả thu được dung dịch có màu vàng nhạt, đem sấy khô ở nhiệt độ khoảng 1600C, thu được chất rắn màu trắng (phụ lục 1 Bảng 3) [102]

Mẫu 2 Dùng 200 lít dịch chiết HCA được bơm vào thùng phản ứng chứa

500 lít Sau đó trộn với hỗn hợp base gồm 6kg Na2CO3, 1,8kg Mg(OH)2, 7,3kg CaCO3, 4kg KOH và 1,24kg ZnCO3 dưới dạng sền sệt với 100 lit nước đã khử

khoáng, trong khoảng thời gian 6 giờ được chia nhỏ ra, dung dịch được tẩy màu bằng 5kg than hoạt tính Kết quả thu được dung dịch màu vàng nhạt, làm bay hơi và duy trì ở nhiệt độ 1800C, thu được 28 kg tinh thể rắn màu trắng (phụ lục 1 Bảng 4)

Mẫu 3 Hỗn hợp base gồm 2,8kg Mg(OH)2, 2,35kg Ca(OH)2 và 0,4kg ZnCO3 được trộn dạng sền sệt với 35 lit nước đã khử khoáng, sau đó thêm vào 80 lít dịch chiết của HCA; tiến hành khuấy đều trong khoảng thời gian 4 giờ được chia nhỏ ra Trung hòa dung dịch được tẩy màu bằng 5kg than hoạt tính Dung dịch được trung hòa đem sấy khô duy trì ở nhiệt độ 1800C thu được 10,8kg tinh thể rắn màu trắng (phụ lục 1 Bảng 5) [104]

Gần đây, Moffett và các cộng sự đã công bố một hướng mới trong quá trình tổng hợp muối kép với chủ đề “Phương pháp điều chế và sử dụng chế phẩm muối kép hai lần (-)-acid hydroxycitric” [87], phát minh đã cung cấp muối kép nhóm IA

và IIA của hai lần HCA (gọi là “DDM-HCAs”) Sản phẩm DDM-HCAs có hiệu quả trong việc cung cấp chế độ ăn uống, phù hợp sử dụng dưới dạng thuốc viên, dạng bột khô được đóng gói Những phương pháp được sử dụng trong xử lý giảm béo, giảm cân, làm tăng tốc độ trao đổi chất trong chuột, các sản phẩm dựa trên sơ đồ phản ứng thể hiện ở Hình 1.25 [94]

Hình 1.25 Quá trình phản ứng tạo sản phẩm của DDm-HCAs

X là kim loại nhóm IIA như Be, Mg, Ca, Sr, Ba hoặc Ra; Y là kim loại nhóm

IA như là Li, Na, K, Rb, Cs, hoặc Fr Sản phẩm muối kép hai nhóm acid của K/Mg HCA được tạo ra theo qui trình sau: hỗn hợp dịch chiết acid thu được (bao gồm cả dịch acid tự do và lacton của nó) đem trung hòa với dung dịch KOH, theo đó nhiệt

độ phản ứng được duy trì thấp nhất từ 270C đến 330C, đây là điều kiện để trung hòa hoàn toàn hỗn hợp trên Sau đó lấy dung dịch trung hòa trên đem trộn với 1 mol Mg(OH)2, nhiệt độ được duy trì thấp nhất khoảng 600C, đây là nhiệt độ để thủy phân lacton của acid; còn pH của hỗn hợp được duy trì ổn định khoảng 8,8 đến 9,2; thu được chế phẩm muối kép hai lần HCA và kết quả phân tích chế phẩm này được thể hiện tại phụ lục 1 Bảng 6 [92]

Ngoài ra, Moffett và các cộng sự đã xác định hàm lượng muối K/Mg HCA bằng phương pháp sắc ký hiệu năng cao - HPLC Theo đó, khối lượng phân tử của hợp chất DDM - HCA được tính toán theo lý thuyết là 594,1g/mol, còn sản phẩm thu được dự đoán khoảng 590,7g/mol và công thức cấu tạo muối kép hai lần acid HCA được thể hiện ở Hình 1.26 [101]

Hình 1.26 Công thức cấu tạo muối kép hai lần acid HCA

Từ các kết quả phân tích hàm lượng, nhóm tác giả đã đưa ra các cấu trúc có thể có của muối kép hai lần HCA (Hình a, b, c) [93] Sau đó, muối kép này đem phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân, dựa vào kết quả đo mà tác giả và cộng sự đã chọn ra các công thức cấu tạo phù hợp với mỗi sản phẩm tạo thành [105]

1.5.2 Nghiên cứu trong nước

a Muối đơn

Hiện nay, theo tài liệu tham khảo của chúng tôi, chỉ có tác giả Đặng Quang Vinh [9], đã công bố trong Luận án tiến sĩ về acid hydroxycitric và chuyển hóa acid

hydroxycitric từ vỏ, lá của loài bứa (Garcinia oblongifolia Champ.) ứng dụng giảm

béo phì Qua đó tác giả đã tổng hợp muối đơn hydroxycitrat của kim loại nhóm IA

và IIA như muối HCK (Hình 1.27), HCCa (Hình 1.28) Cụ thể, dịch chiết của HCA thu được sau cùng, đem tác dụng với dung dịch KOH 40% khuấy trộn cẩn thận Tiếp đến cho etanol vào và muối kali của HCA tạo thành được quan sát cẩn thận để tiến hành xử lý nhiều lần với tỷ lệ cồn/nước lần lượt là 10/90, 20/80, 30/70, 40/60, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20, 90/10 và 100/0 (cồn tuyệt đối)

Tương tự, tác giả cũng đã đưa ra qui trình tổng hợp muối đơn canxi của HCA: dịch chiết sau khi làm sạch, cô quay còn lại khoảng 100mL, phản ứng với dung dịch NaOH 10% (44,4g/400mL nước), pH điều chỉnh từ 2 ÷ 7

Hình 1.27 Cấu tạo của muối đơn HCK

Dung dịch thu được đem khuấy trộn khoảng 30 - 120 phút Sau đó cho phản ứng tiếp với dung dịch CaCl2 (32g/100mL nước) Khi thêm CaCl2 vào, lúc đầu xuất hiện ít kết tủa trắng, sau xuất hiện nhiều hơn và dày đặc tạo thành bùn Lọc rửa kết tủa, đem sấy ở nhiệt độ khoảng 800C trong 24 giờ, được chất rắn màu trắng xám, khó tan trong nước Khối lượng muối thu được trung bình khoảng 11,327g/100g mẫu, hiệu suất của nó khoảng 83,97% đến 88,83% Phân tích cấu trúc của nó bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân thu được công thức cấu tạo như Hình 1.28 [100]

Hình 1.28 Công thức cấu tạo của HCCa

b Muối kép

Theo những tài liệu chúng tôi tham khảo được tại Việt Nam, hầu như chưa có công trình khoa học công bố về tổng hợp muối kép của HCA, mà chỉ có những khảo sát về điều kiện tổng hợp muối kép của HCA trong phòng thí nghiệm và các số liệu này chỉ mang tính chất tham khảo Đặc biệt, đối với muối kép của dịch chiết acid

hydroxycitric từ vỏ quả tai chua - Garcinia cowa Roxb., thì chưa có bất kỳ tài liệu

nào đề cập đến

* Như vậy: các muối đơn đã được nghiên cứu từ lâu trên thế giới, tuy nhiên

chúng lại mắc các nhược điểm và muối kép đang dần thay thế chúng Ngoài việc khắc phục các nhược điểm mà muối đơn gây nên, thì muối kép vừa bổ sung các ion kim loại cần thiết cho cơ thể, vừa đảm bảo cấu trúc của acid hydroxycitric (HCA), hạn chế sự chuyển hóa dạng lacton Tuy nhiên, đối với muối kép Na/Mg và Na/Zn hydroxycitrat thì chưa có nghiên cứu nào được công bố; đặc biệt các muối

hydroxycitrat từ loài tai chua - Garcinia cowa Roxb Điều đó càng thôi thúc chúng

tôi tiến hành nghiên cứu và tạo các chế phẩm từ loài thực vật này Dựa trên các chế phẩm muối kép hydroxycitrat, chúng tôi tìm hiểu về các tác động của chúng trong

quy mô phòng thí nghiệm và vai trò ứng dụng sinh học đối với sức khỏe con người

1.6 Vai trò của muối hydroxycitrat từ HCA trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng

1.6.1 Hoạt tính độc tính cấp

Một nhóm tác giả gồm Sunny E Ohia, Catherine A Opere, Angela M Leday, Manashi Bagchi, Debasis Bagchi và Sidney J Stohs (2002) [86], đã đưa ra nghiên cứu về tác động của muối kép HCA đối với cơ thể của chuột và thỏ bị bạch tạng với tên gọi “Phát hiện mới dạng muối kép của dịch chiết HCA được sử dụng an toàn trong việc giảm sự thèm ăn”, theo đó dịch chiết của HCA được chuyển hóa dạng muối kép và đưa vào cơ thể của các động vật bằng đường miệng [88] Nghiên cứu này cũng chỉ ra muối quan hệ về sự tác động giữa muối kép HCA với võ não của chuột bạch tạng, thông qua hợp chất 5-hydro-xytryptamine hoặc serotonin ([3H]-5-HT), hợp chất này tham gia vào việc điều khiển cảm giác về sự thèm ăn thông qua một hệ thống dẫn truyền thần kinh [94] Cụ thể: các mẫu được thử nghiệm trên chuột đực và chuột cái bạch tạng, theo đó chuột đực và chuột cái cân nặng khoảng 208g đến 216g, được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 690F đến

760F (khoảng 20C ÷ 2,20C), độ ẩm khoảng 30% đến 82% và ánh sáng được duy trì theo thứ tự 12 giờ sáng và 12 giờ tối Lượng muối kép của HCA được đưa vào theo đường uống trong quá trình điều trị giảm cân khoảng 10mL/kg phụ thuộc vào trọng lượng của mỗi cá thể đem thí nghiệm [97] Muối kép của HCA được bơm vào trong

dạ dày của chuột bằng ống cao su mềm đã được tính toán trước, với liều lượng khoảng 3mL trong mỗi xilanh Thời gian để chuột ổn định khoảng 18 ÷ 20 giờ sau khi tiêm và sau đó khoảng 3 ÷ 4 giờ thì tiếp tục Quá trình thí nghiệm được thực hiện trong 2 nhóm chuột, mỗi nhóm gồm 5 chuột đực và 5 chuột cái, liều dùng trong mỗi cá thể trong nhóm khoảng 5000 mg/kg và lượng đưa vào ở dạng lỏng

Quan sát lâm sàng lượng chuột tử vong sau khi tiêm thuốc khoảng 1,3 và 4 giờ, mỗi ngày từ 2 ÷ 3 lần vào buổi sáng và buổi chiều, liên tục trong 14 ngày Trọng lượng cơ thể của chuột được kiểm tra sau 1 ngày, 7 ngày và 14 ngày (kết thúc thí nghiệm) Sau khi kết thúc thí nghiệm, tất cả chuột được sử dụng đều phải bị làm

ngạt bằng cacbon dioxit (CO2) Khi kết thúc phẫu thuật, kiểm tra lại tất cả hệ thống các cơ quan như xương sọ, ngực và khoang bụng của tất cả chuột [98] Kết quả nhận thấy ở chuột đều có sự giảm về cân nặng các bộ phận với các giá trị gần bằng 11.7%, 18.1% và 13% so với lúc ban đầu (phụ lục 1 Bảng 7 và Bảng 8) [120]

Tương tự như vậy, các nhà nghiên cứu đã thực hiện thí nghiệm với thỏ trắng bạch tạng và quan sát sự kích thích xảy ra trên da của chúng khi tiêm vào một lượng độc tính của muối kép HCA Liều lượng đưa vào phụ thuộc trọng lượng của mỗi cá thể thí nghiệm [67]

Thỏ đực và thỏ cái New Zealand bạch tạng (trọng lượng mỗi cá thể khoảng 2227g – 2466g) Thỏ được làm quen với nhiệt độ phòng thí nghiệm ít nhất 6 ngày, trước khi tiêm liều lượng vào cơ thể của chúng Nhiệt độ duy trì trong thời gian làm thí nghiệm khoảng 20C - 2,20C, độ ẩm khoảng 50 đến 80%, ánh sáng được bật liên tục theo thứ tự thay đổi 12 giờ sáng và 12giờ tối Liều lượng tiêm của muối kép HCA trong mỗi cá thể thỏ phụ thuộc vào trọng lượng riêng của chúng, với giá trị trung bình khoảng 2000 mg/kg Muối kép được giảm bớt khi tiêm trực tiếp vào da, đảm bảo không gây nên sự trầy lở của mỗi cá thể [74] Sau 1 ngày tiêm lượng muối kép vào, kiểm tra mức độ ảnh hưởng của nó đến da của mỗi cá thể thỏ, các nhà khoa học kiểm tra lượng lông sau lưng của chúng để đánh giá mức độ suy giảm và tác động của muối kép HCA [71] Tất cả các thí nghiệm đều thực hiện trên 2 nhóm thỏ bạch tạng, mỗi nhóm có 5 con đực và 5 con cái; mỗi con được tiêm liều lượng như nhau (phụ lục 1 Bảng 9)

1.6.2 Hoạt tính giảm béo cơ thể

Một nhóm nghiên cứu, Michael Shara, Sunny E Ohia, Robert E Schmidt, Taharat Yasmin, Andrea Zardetto Smith, Anthony Kincaid, Manashi Bagchi, Archana Chatterjee, Debasis Bagchi và Sidney J Stohs (2003) [86], đã công bố kết quả “Phát hiện mới đặc tính tác động hóa lý của dịch chiết acid hydroxycitric đến trọng lượng cơ thể, các bộ phận cơ thể được chọn, gan nhiễm mỡ, phân mảnh DNA, huyết học và mô bệnh học với thời gian trên 90 ngày”, theo đó muối canxi kali được

hòa tan với 60% HCA được chiết từ Garcinia cambogia, mẫu được sấy khô và lưu