Chiết xuất, phân lập và thử tác dụng hoạt hóa enos trong tế bào nội mô mạch máu của saponin có trong nần nghệ ( dioscorea collettii hook f, dioscoreace) thu hái tại sơn la

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH HẠNH CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG HOẠT HÓA eNOS TRONG TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU CỦA SAPONIN CÓ TRONG NẦN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MINH HẠNH

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG HOẠT HÓA eNOS TRONG TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU CỦA SAPONIN CÓ TRONG NẦN

NGHỆ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace)

THU HÁI TẠI SƠN LA

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MINH HẠNH

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ THỬ TÁC DỤNG HOẠT HÓA eNOS TRONG TẾ BÀO NỘI MÔ MẠCH MÁU CỦA SAPONIN CÓ TRONG NẦN

NGHỆ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace)

THU HÁI TẠI SƠN LA

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60720406

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hoàng Tuấn

TS Đỗ Thị Nguyệt Quế

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong lĩnh vực cùng đồng nghiệp và gia đình

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Sau Đại học, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Cao đẳng

Y tế Quảng trị, Sở Y tế Quảng Trị, các giảng viên trong Khoa Dược – Trường Cao đẳng Y tế Quảng Trị đã tạo điều kiện cho tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hoàng Tuấn – Bộ môn Dược liệu, TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, luôn quan tâm chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin cám ơn TS Đỗ Thị Hà, Trưởng khoa Hóa Thực vật- Viện Dược liệu, ThS Nguyễn Thị Duyên cùng các anh chị kỹ thuật viên Khoa Hóa thực vật- Viện Dược liệu đã tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi nghiên cứu

và hoàn thành luận văn này

Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình, người thân và bạn bè những luôn luôn bên cạnh ủng hộ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 04 tháng 4 năm 2017 Nguyễn Thị Minh Hạnh

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây nần nghệ 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Bộ phận dùng và phân bố 4

1.1.4 Sinh thái và thu hái 5

1.1.5 Thành phần hóa học 5

1.1.6 Tác dụng sinh học 9

1.2 Cấu trúc mạch máu và vai trò của hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu đối với bệnh tim mạch 13

1.2.1 Cấu trúc mạch máu 13

1.2.2 Vai trò của hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu đối với bệnh tim mạch 14

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng 17

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, máy móc 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Chiết xuất và phân lập, xác định cấu trúc saponin trong thân rễ nần nghệ thu (D collettii) hái tại Sơn La 20

2.2.2 Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV 304 của saponin phân lập từ nần nghệ (D collettii) 23

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học saponin có trong nần nghệ (D collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La 29

3.1.1 Chiết xuất 29

3.1.2 Phân lập 31

3.1.3 Xác định cấu trúc 35

3.2 Thử tác dụng hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu của saponin có trong thân rễ nần nghệ (D collettii) 48

3.2.1 Thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV 304 của saponin NN02 48

3.2.2 Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS của saponin dioscin (NN02) 49

Chương 4 BÀN LUẬN 51

4.1 Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của saponin trong nần nghệ 51

4.2 Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV304 của saponin NN02 có trong nần nghệ (D collettii) 53

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

Tiếng Anh

Tài liệu trực tuyến

PHỤ LỤC

Phụ lục 1

Phụ lục 2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance

DMSO : Dimethyl sulfoxid

DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DETA : Ethylen Diamin Tetraacetic acid

eNOS : Endothelial nitric oxide synthase

FBS : Fetal bovine serum

1H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance

HPLC : High-performance liquid chromatography

HMBC : Heteronuclear multilpe bond cerelation

HSQC : Heteronuclear single quantum corelation

m/z : Khối lượng/điện tích ion

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các sapogenin trong thân rễ nần nghệ 6

Bảng 1.2 Các hợp chất saponin thu được từ dịch chiết ethanol của nần nghệ 7

Bảng 3.1 Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ thân rễ nần nghệ 30

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất NN01 và gracillin 38

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất NN02 và dioscin 45

Bảng 3.4 Giá trị mật độ quang và mức độ gây chết tế bào của các lô tế bào sau khi ủ với MTT 48

Bảng 3.5 Số lần tăng mức độ biểu hiện p-eNOS so với lô chứng 50

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc thành động mạch và tĩnh mạch 14

Hình 2.1 Cây nần nghệ 17

Hình 2.2 Thân rễ nần nghệ 17

Hình 2.3 Thân rễ nần nghệ thái lát 17

Hình 2.4 Quá trình chạy điện di 26

Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân rễ nần nghệ 30

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất saponin từ thân rễ nần nghệ 31

Hình 3.3 Cắn của các phân đoạn phân lập được 33

Hình 3.4 Chất NN01 33

Hình 3.5 Chất NN02 33

Hình 3.6 Sắc ký đồ của NN01, T (cao ethanol 80%) và NN02 trên silica gel 60 RP-18 F254 (Merck, 5x10 cm), sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng 34

Hình 3.7 Sắc ký đồ NN01, T (cao ethanol 80%) và NN02 dưới ánh sáng thường, trên silica gel 60 F254 (Merck, 5x10 cm), sau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn tuyệt đối và hơ nóng 34

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của hợp chất NN01 35

Hình 3.9 Phổ HSQC của hợp chất NN01 35

Hình 3.10 Phổ 13C-NMR của hợp chất NN01 36

Hình 3.11 Phổ HSQC của hợp chất NN01 36

Hình 3.12 Phổ COSY của hợp chất NN01 37

Hình 3.13 Phổ HMBC giãn của hợp chất NN01 37

Hình 3.14 Phổ HR-ESI-MS của chất NN01 38

Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của hợp chất NN01 40

Hình 3.16 Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất NN01 41

Hình 3.17 Phổ 1H-NMR của hợp chất NN02 42

Hình 3.18 Phổ HSQC của hợp chất NN02 42

Hình 3.19 Phổ 13C-NMR của hợp chất NNO2 43

Hình 3.20 Phổ HSQC của hợp chất NN02 43

Hình 3.21 Phổ DEPT của chất NN02 43

Hình 3.22 Phổ HMBC giãn của hợp chất NN02 44

Hình 3.23 Phổ COSY của hợp chất NN02 44

Hình 3.24 Phổ APCI-MS của chất NN02 45

Hình 3.25 Cấu trúc hóa học của hợp chất NN02 47

Hình 3.26 Tương tác HMBC và tương tác COSY trong phân tử NN02 47

Hình 3.27 Mức độ biểu hiện p-eNOS khi phân tích bằng Western blot 49

Hình 3.28 Số lần tăng biểu hiện p-eNOS của lô ủ với saponin dioscin (NN02) với lô chứng 49

ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một đất nước có nền Y học cổ truyền lâu đời cùng với nguồn tài nguyên cây thuốc vô cùng phong phú Là một quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt nam có nhiều điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển tạo ra hệ thực vật phong phú và đa dạng Với trình độ ngày càng phát triển thì nhu cầu về chăm sóc sức khỏe của con người ngày càng được nâng lên rõ rệt Trên thế giới, trong chăm sóc sức khỏe, việc phòng và điều trị bệnh hiện nay và ngay cả tương lai đã và đang ngày càng chú trọng hơn đến việc dùng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên Nhiều bài thuốc cổ truyền đã được phát triển, nhiều hợp chất, nhóm chất có tác dụng sinh học quý giá đã được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng vào thực tế

Trong thời kỳ hiện đại cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật với rất nhiều thành tựu mới trong các lĩnh vực công nghiệp dược đã có rất nhiều thuốc sản xuất từ các hoạt chất được chiết xuất từ cây cỏ trong thiên nhiên Trong số đó có rất nhiều các loài thuốc quý và đang được sử dụng Nguồn cây thuốc dân gian cũng như vốn sử dụng dược liệu phong phú của đồng bào các dân tộc vẫn là kho tàng quý giá để khám phá Tuy nhiên việc sử dụng chúng chủ yếu là theo kinh nghiệm dân gian hay trong y học cổ truyền được lưu truyền từ đời này qua đời khác, còn rất nhiều cây thuốc chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa có hệ thống Vì vậy việc nghiên cứu cây cỏ làm thuốc một cách đầy đủ và toàn diện là điều cần thiết góp phần nâng cao tính an toàn

và hiệu quả điều trị

Saponin được chú ý rất nhiều bởi các nhà khoa học trên toàn thế giới, bởi cấu trúc đặc biệt của nó và tác dụng sinh học đa dạng Nhiều tác dụng dược lý đáng chú ý từ dịch chiết, từ các nhóm hoạt chất hay hoạt chất tinh khiết được chứng minh như hạ đường huyết, hạ cholesreol, tăng cường miễn

dịch, chống viêm, chống mệt mỏi, chống ung thư [16] Đã có rất nhiều dạng thuốc được sản xuất từ saponin và sử dụng trên khắp mọi nơi trên thế giới

Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra trong nần nghệ (D collettii) có rất

nhiều saponin [14], được dùng trị đau khớp xương do phong thấp, đau lưng gối, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, bạch đới, rắn độc cắn [6], cao nần nghệ có tác dụng hạ cholesterol khá rõ rệt trên mô hình gây tăng cholesterol thực nghiệm và có tác dụng chống viêm [3] Ở Việt nam hiện nay có một số chế phẩm dùng để hạ lipid máu được sản xuất từ nần nghệ mà chưa có bài báo nào công bố về tác dụng của hợp chất saponin trong nần nghệ trên các bệnh liên quan đến tăng cholesterol, lipid máu như chống xơ vữa động mạch

Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện luận văn “Chiết xuất, phân lập và thử tác dụng hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu của saponin có

trong Nần Nghệ (Dioscorea collettii Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn

La” với mục tiêu:

1 Chiết xuất và phân lập được 2 saponin từ nần nghệ (Dioscorea collettii

Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La

2 Đánh giá được tác dụng hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu

ECV304 của saponin phân lập được từ nần nghệ (Dioscorea collettii

Hook.f, Dioscoreace) thu hái tại Sơn La

Dioscorea collettii Hook.f

- Tên khoa học của vị thuốc: Rhizoma Dioscoreae [3]

- Tên đồng nghĩa:

+Dioscorea collettii var collettii

+ Dioscorea gracillima var collettii (Hook.f.) Uline ex R.Knuth,

+ Dioscorea gracillima var collettii (Hook f.) Uline ex Yamam.

+ Dioscorea hui R.Knuth

+Dioscorea kelungensis Hayata

+Dioscorea nigrescens R.Knuth Illegitimate

+ Dioscorea oenea Prain & Burkill

+ Dioscorea tashiroi Hayata [46]

- Tên khác: nần nghệ, từ collett, râu hùm, nần vàng [11], [13]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây dây leo nhiều năm, thân vặn, quấn trái, không có lông, đôi khi có lông màu vàng dày và ngắn [26] Thân rễ mọc ngang, phân nhiều nhánh ngắn

hình dạng giống gừng, chiều dài đa dạng, dày khoảng 2cm, lõi màu vàng, rễ mảnh dạng sợi [26]

Lá mọc đơn, so le [5], [11], [26], cuống lá dài từ 4-7 cm, phiến lá khô hơi đen, kích thước 5-19 (-22) x 3-13 (-16) cm, thường có màng, mặt dưới đôi lúc có lông, nhất là dọc theo các gân, có 7 gân trong đó có 3 gân gốc vươn tới chóp lá mặt lá hình tim, mép lá nguyên hay hơi lượn sóng, đôi khi trong suốt, đỉnh nhọn Các cụm hoa đực đơn độc hoặc 2 hay 3 cụm mọc cạnh nhau Hoa đực: mọc đơn hay thành cụm hoa xim gồm 2 hay 3 bông, không cuống; lá bắc hình oval dẹt, lá bắc con hình trứng, bao hoa màu vàng, lúc khô thường màu đen, hình đĩa, nhị 3, gắn trong ống bao hoa, chỉ nhị ngắn, bao phấn hình trứng, thon dài khi hoa nở, hình chữ chi; các nhị lép có dạng sợi mảnh Cụm hoa cái dạng bông đơn độc, dài tới 5cm Hoa cái: có nhị lép, bầu hoa hình trụ thon Quả nang quặt lại, nâu bóng, hình trứng ngược hay hình bầu dục, thường hơi góc cạnh, dài 1,6 – 2,1 cm, đỉnh cụt, cánh rộng 0,8 – 1,1 cm Hạt nằm ở gần giữa quả, có cánh bao xung quanh [6]

Loài D collettii Hook.f gồm hai thứ:

+ D collettii var collettii: Mép lá không trong suốt; bao phấn rộng bằng hoặc

gấp đôi khi hoa nở; quả nang hình trứng ngược, đỉnh cụt hau tròn

+ D collettii var hypoglauca: Mép lá trong suốt; bao phấn hẹp lại khoảng

một nửa khi hoa nở; quả nang hình bầu dục, đỉnh tròn

1.1.3 Bộ phận dùng và phân bố

Bộ phận dùng: Thân rễ phơi khô

Phân bố: Nần nghệ (D collettii) phân bố ở nam Trung Quốc, Ấn Độ,

Mianma, Bắc Việt Nam, Mộc Châu (Sơn La) [5], [11] Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” cây chỉ gặp trong rừng núi cao một số nơi thuộc bắc bộ, ở

độ cao 1000-3200m [11].“Thực vật chí Trung Quốc” cho biết cây mọc ở rừng hỗn hợp, rừng sồi cấp hai, rừng rậm núi dốc, ở độ cao 200-3200m [26]

1.1.4 Sinh thái và thu hái

Thường mọc tập trung ở những nơi có đất tơi xốp, pha lẫn nhiều đá sỏi hoặc đá vôi, đặc biệt những nơi có nhiều ánh sáng như các sườn đồi cỏ tranh, các nương rẫy mới bỏ hoang thường có lửa cháy hàng năm Nần nghệ thường mọc thành từng đám một, mỗi đám rộng vài trăm mét vuông, thường tập trung nhiều nhất ở những nơi gần bìa rừng hoặc những nơi có lác đác một vài cây to Dưới thung lũng, nhất là dọc các chân đồi cỏ tranh chúng tương đối phát triển, thường có thân rễ khá to Đặc biệt những cây mọc gần tảng đá vôi hoặc gần gốc cây to có thể thấy thân rễ của chúng to hơn rất nhiều so với cây bình thường Càng lên đỉnh đồi thân rễ càng nhỏ đi [2] “Sách Đỏ Việt Nam” cũng cho biết cây mọc rải rác ven rừng, trong rừng tre nứa, tráng cây bụi, ven sông ven suối, sườn núi [4]

Thân rễ nằm dưới đất đến tháng hai mới mọc thân khí sinh, tháng 5-6 ra hoa và kết quả, cây tàn lụi vào tháng 11-12 [4]

Hàm lượng diosgenin đạt cao nhất trong thời kỳ ra hoa, tháng 5-6 [4], [11], vì thế để đạt hiệu quả cao nhất nên khai thác vào thời kỳ cây ra hoa

Nần nghệ (D collettii) có đặc điểm mọc thành từng đám, khá dày, đôi

khi có thể gặp 4-5 gốc mọc sát nhau, thường chỉ mọc cách nhau vài mét, vì thế khai thác loài này tương đối đơn giản và dễ dàng {trong khoảng thời gian

3 giờ, có thể khai thác được 25-30 kg nần nghệ (D collettii) trên một diện tích

khoảng 500 m2} [2]

1.1.5 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra trong nần nghệ (D collettii) có

rất nhiều saponin, trong đó có 2 sapogenin chính là diosgenin và yamogenin Hàm lượng diosgenin lên tới 3,8 – 4,2 % [14]

Một số sapogenin có trong thân rễ nần nghệ (D collettii): diosgenin,

Yamogenin, β – sitosterol, một dihydroxysterol, ∆3,5 – deoxyneotigogen, ∆3,5

-deoxyneotigogenin, diosgenin palmitat, yamogenin palmitat, isonarthogenin, yamogenin - D –glucosid [35]

Một nghiên cứu đã xác định được 14 hợp chất saponin từ dịch chiết

ethanol của nần nghệ (D collettii var hypoglauca) bao gồm: prosapogenin A

của dioscin, dioscin, gracillin, proroneodioscin, protodioscin, protoneogracillin, protogracillin, methyl protoneodioscin, methyl protodioscin, methyl protoneogracillin, methyl protogracillin, hypoglaucin F, hypoglaucin G, hypoglaucin H [31]

Các sapogenin và các saponin được tìm thấy trong thân rễ nần nghệ (D collettii var hypoglauca) được trình bày ở 2 bảng sau:

Bảng 1.1 Các sapogenin trong thân rễ nần nghệ

(D collettii var hypoglauca)

7 Diosgenin palmitat

O

CH 3

CH3C

Bảng 1.2 Các hợp chất saponin thu được từ dịch chiết ethanol của nần nghệ

(D collettii var hypoglauca)

1 Prosapogenin A

của dioscin

1: R1 =α-L-Rha, R2=R3= H 2: R1=R3=α-L-Rha, R2= H 3: R1= α-L-Rha, R2=β-D-Glc, R3= H

Liu CL và cộng sự đã xác định được bốn saponin steroid phân lập từ

thân rễ của nần nghệ (Dioscorea collettii Hook F) là

3-O-(β-D-glucopyranosyl)-yamogenin; 3-O-{α-L-rhamno pyranosyl glucopyranosyl}-yamogenin; 3-O-{a-L-rhamnopyranosyl (1→4)–{α-L-rhamnopyranosyl (1→2)}-β-D-glucopranosyl}-yamogenin; 3-O-(β-D-glucopyranosyl (1 → 3)-{α-L-rhamnopyranosyl (1→2)}-β-D-glucopyranosyl) –yamogenin [34]

(1→4)-β-D-Nghiên cứu trên một số loài Dioscorea trong đó có nần nghệ (D collettii) cho thấy tổng hàm lượng saponin nằm trong khoảng từ 114.48 đến

216.66 μg/g dược liệu [43]

1.1.6 Tác dụng sinh học

1.1.6.1 Tác dụng hạ huyết áp

Kết quả đánh giá tác dụng sử dụng cao nước nần nghệ (D collettii) trên

huyết áp thỏ cho thấy:

Ở liều 2-4mg/kg cân nặng huyết áp dao động không đáng kể

Ở liều 10mg/kg cân nặng gây hạ khoảng 20 -30 % huyết áp Tác dụng xuất hiện nhanh sau khi đưa thuốc kéo dài khoảng 7-10 phút

Ở liều 25mg/kg cân nặng gây hạ 40% huyết áp so với mức ban đầu, kéo dài 10-15 phút [10]

Chế phẩm Diosgin từ nần nghệ (D collettii) có tác dụng hạ huyết áp

trên hầu hết bệnh nhân có huyết áp cao, trong quá trình điều trị không thấy có tai biến và tác dụng không mong muốn nào [11]

1.1.6.2 Tác dụng hạ cholesterol

Cao nần nghệ (D collettii) có tác dụng hạ cholesterol khá rõ rệt trên mô

hình gây tăng cholesterol thực nghiệm Tất cả các chỉ số lipid máu đều trở về trị

số bình thường Điều đáng lưu ý là nần nghệ (D collettii) hạ cholesterol, đặc biệt

hạ rất mạnh LDL, trong đó lại có xu hướng làm tăng HDL (40 ± 2,1 đến 36 ± 2,5 với p<0,05), do đó hạ được chỉ số cholesterol/HDL (4,3 đến 3,2) [14]

Thử nghiệm Diosgin trên khoảng 200 người bệnh, kết quả xét nghiệm sinh hóa trên 5 chỉ tiêu về lipoprotein trong máu (gồm triglycerid, cholesterol toàn phần, LDL, HDL và cholesterol toàn phần/HDL) cho thấy, Diosgin cho tác dụng tốt, trong quá trình điều trị không thấy có tai biến, tác dụng phụ nào [13]

1.1.6.3 Tác dụng chống viêm

Khả năng giảm sưng phù chân chuột trên mô hình gây viêm bằng dextran

Cao nần nghệ (D collettii) với liều 300mg/kg cho chuột bị gây viêm

bằng dextran uống 3 lần (24 giờ, 3 giờ, 30 phút trước khi gây viêm) có tác dụng giảm viêm rõ rệt, tác dụng này tương đương với prednisolon liều 70mg/kg uống 1 lần 30 phút trước khi gây viêm [14]

Nần nghệ (D collettii) cũng được sử dụng để chống viêm trong đau do

viêm khớp, được khuyến cáo như một biện pháp khắc phục để chống viêm khớp, tăng lưu thông máu, giãn cơ, rất hữu dụng trong đau do thấp khớp và tê chân tay Ngoài ra nó còn được sử dụng như 1 chất chống viêm cho các tổn thương ngoài da, bao gồm cả eczema [22]

1.1.6.4 Tác dụng gây giãn cơ trơn

Cao nần nghệ (D collettii) gây giãn cơ trơn của mạch và ruột [13] Cụ thể:

Trên ruột thỏ cô lập: Liều 0,1; 0,2; 0,3ml dung dịch cao nần nghệ 5% trong 50ml dịch nuôi ruột gây giãn rõ rệt Tác dụng hết sau 10-15 phút Liều 0,5ml trở lên gây giãn không hồi phục

Trên mạch tai thỏ cô lập: Liều 0,1-0,2ml dung dịch cao nần nghệ (D collettii) 5% (được truyền lẫn vào dòng chảy của dung dịch nuôi tai) gây tăng

rõ rệt số giọt chảy (gấp 3-4 lần) so với trước khi thêm mẫu thử Tác dụng hết sau 10-15 phút Liều 0,5 ml trở lên gây giãn mạch tai thỏ, trong đó nhiều trường hợp mạch tai thỏ giãn không hồi phục [13]

1.1.6.5 Ảnh hưởng đến hoạt động của tim

Thí nghiệm trên tim ếch (ếch khoảng 50g), thuốc được tiêm vào túi bạch huyết với thể tích không quá 0,5ml

Kết quả như sau:

Trên tim bình thường: Với liều 20-30-40mg/kg cân nặng, hoạt động của tim hầu như không thay đổi Với liều 100mg/kg cân nặng gây rối loạn nhịp tim ở đa số ếch thử, tim đập chậm lại, biên độ co tăng gấp 2-3 lần so với bình thường [13]

Trên suy tim: Ở mức liều 30-40mg/kg cân nặng 70% số ếch thử có tim được hồi phục, nhịp tim đều trở lại, biên độ tăng cao, thậm chí có trường hợp đập mạnh hơn lúc bình thường [13]

1.1.6.6 Tác dụng chống ung thư

Các hợp chất chiết được từ dịch chiết saponin toàn phần của nần nghệ

(D collettii) đã được đánh giá có độc tính chống lại tế bào ung thư dòng K562 in vitro [31]

Tám hợp chất: protoneodioscin, protodioscin, protoneogracillin, protogracillin và methyl protoneodioscin, methyl protodioscin, methyl

protoneogracillin, và methyl protogracillin được chiết từ thân rễ nần nghệ (D collettii) cho thấy các tác dụng gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư K562 in vitro [28]

Các nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư của saponin steroid từ thân

rễ của nần nghệ (D collettii) đã cho thấy methyl protoneogracillin và gracillin

có khả năng gây độc tế bào đối với các dòng tế bào ung thư ở người bị bệnh bạch cầu, ung thư thần kinh trung ương, và ung thư tuyến tiền liệt Gracillin gây độc tế bào với hầu hết các dòng tế bào, nhưng không có hoạt tính chống lại EKVX (ung thư buồng trứng) và SN12C (ung thư thận) [26]

Gần đây, một nghiên cứu hệ thống cho biết methyl protogracillin đã được sử dụng ở Viện ung thư quốc gia Mỹ làm thuốc chống ung thư

Các nghiên cứu độc tính sơ bộ trên người cho thấy 11 trong số 14

saponin steroid của nần nghệ (D collettii) có khả năng chống lại bệnh bạch

cầu myeloid cấp tính (AML) dòng tế bào K562 trong ống nghiệm [32] Tác dụng ức chế tế bào ung thư dòng K562 của saponin furostanol 4-11 tương tự như saponin spirostanol 1-3 [31]

Protoneodioscin một saponin furostanol phân lập từ thân rễ của nần nghệ

(D collettii) được sử dụng trong điều trị ung thư cổ tử cung, ung thư bàng quang

tiết niệu, và khối u thận Nghiên cứu cho thấy protoneodioscin gây độc tế bào đối với hầu hết các dòng tế bào ung thư bạch cầu và khối u rắn [32]

Dioscin có thể làm giảm mức độ kháng thuốc của tế bào HepG2/adriamycin, và ức chế đáng kể biểu hiện P-glycoprotein, cũng như tăng sự tích tụ adriamycin trong tế bào HepG2/adriamycin như được đo bằng phân tích dòng chảy cytometric Những kết quả này cho thấy Dioscin là một tác nhân đảo ngược đa kháng thuốc có tiềm năng và có thể là một chất bổ trợ tiềm năng cho hóa trị liệu khối u [39]

1.1.6.7 Tác dụng chống nấm

14 saponin steroid được phân lập từ thân rễ của nần nghệ (D collettii):

cho thấy hoạt tính kháng nấm gây biến dạng hình thái của sợi nấm và bào tử

của Pyricularia oryzue (một loại nấm phytopathogenic gây bệnh đạo ôn)

trong đó có 3 saponin sporostanol, 9 - saponin furostanol, và 2 - glycosid pregnan [27], [28], [31], [32]

1.1.7 Công dụng

Trong đông y, nần nghệ có vị khổ, tính bình, tác dụng giải độc, tiêu thũng, tán ứ chỉ thống, khu phong trừ thấp Cây được dùng trị đau khớp xương do phong thấp, đau lưng gối, cảm nhiễm đường tiết niệu, bạch đới, rắn độc cắn [6]

Cao của thân rễ nần nghệ có tác dụng chống viêm và làm giảm cholesterol trong máu [3]

1.2 Cấu trúc mạch máu và vai trò của hoạt hóa eNOS trong tế bào nội

mô mạch máu đối với bệnh tim mạch

1.2.1 Cấu trúc mạch máu

Thành động mạch kể cả động mạch nhỏ đều rất dày và gồm 3 lớp là lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong

Lớp ngoài (áo ngoài): hợp thành bởi mô liên kết- sợi chun, chứa nhiều

bó sợi tạo keo chạy dọc theo động mạch, làm cho thành động mạch dai, bền khó bị dập vỡ Lớp này còn giúp đề phòng túi phồng động mạch ở các mạch máu không có hoặc thiếu cơ trơn Trong lớp này còn chứa nhiều sợi thần kinh thực vật, ở những động mạch lớn còn có các mạch máu nuôi dưỡng thành động mạch [1] Ở ngoài cùng, gồm nhiều sợi nguyên bào, cấu tạo chủ yếu gồm mô liên kết Ngăn áo giữa với áo ngoài là lá chun ngoài Áo ngoài của các mạch máu lớn như động mạch, tĩnh mạch còn có các mạch máu nhỏ nằm trong vùng ngoài của lớp áo giữa để cung cấp oxy và các chất nuôi dưỡng cho các tế bào này hoạt động [9]

Lớp giữa (áo giữa): lớp này dày nhất, do các sợi cơ trơn, sợi liên kết có khả năng chun giãn theo chiều vòng và các sợi đàn hồi Tỷ lệ giữa sợi cơ trơn

và sợi đàn hồi thay đổi tùy theo loại động mạch Ở những động mạch cơ như động mạch đùi, sợi cơ trơn nhiều hơn, ỡ những động mạch đàn hồi như động mạch chủ thì sợi đàn hồi nhiều hơn Lớp này quyết định tính chất sinh lý của động mạch [1] Lớp áo giữa được ngăn cách với lớ áo ngoài bằng một màng chun gọi là màng ngăn chun ngoài Lớp này gồm các tế bào cơ trơn được bao quanh bởi rất nhiều sợi collagen, chất nền ngoại bào và các vòng lá chun có các lỗ hở không đều Các sợi collagen tạo khung nâng đỡ các tế bào cơ trơn

và chống phình giãn thành mạch Khoảng gian bào giữa các tế bào cơ trơn cũng chứa nhiều các glycoprotein như fibronectin, vitronectin… Elastin cũng được xếp xen kẽ giữa các lớp tế bào [9]

Hình 1.1 Cấu trúc thành động mạch và tĩnh mạch [47]

Lớp trong (áo trong): lớp trong cùng Lớp áo trong bao gồm:

Lớp tế bào nội mô lót mặt trong lòng ống mạch máu.Các tế bào nội mô

không chỉ tạo nên một bề mặt trơn phẳng mà còn tiết collagen tuýp II, IV và V; lamin, endothelin, nitric oxid (NO).Ngoài ra tế bào nội mô thành mạch còn tiết ra men chuyển angiotensin; bradykinin, serotonin, các prostaglandin, thrombin, norepinephrin

Lớp dưới nội mô: nằm ngay dưới lớp tế bào nội mô (nằm ở giữa của lớp

nội mô và lá chun trong) bao gồm những mô liên kết lỏng lẻo và các tế bào cơ trơn nằm rải rác

Phía dưới lớp dưới nội mô làlá chun trong, có các sợi chun, ngăn cách lớp áo trong với lớp áo giữa [9]

1.2.2 Vai trò của hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu đối với bệnh tim mạch

Nội mô mạch máu là một lớp tế bào màng mỏng nằm ở mặt trong cùng của lòng mạch máu, đóng vai trò cốt yếu trong duy trì cấu trúc mạch máu, sự co giãn mạch máu và đảm bảo cho máu lưu thông tốt trong lòng mạch máu [20]

Tế bào nội mô mạch máu nhạy cảm với các kích thích hóa học hoặc sinh học khác nhau xảy ra bên trong lòng mạch máu và có những đáp ứng nhằm điều chỉnh dạng mạch máu (co mạch hoặc giãn mạch) hoặc đáp ứng bằng cách giải phóng những chất hóa học để chống lại ảnh hưởng của các kích thích này Để thực hiện được chức năng này tế bào nội mô mạch máu có khả năng sản xuất ra nhiều phân tử hóa học khác nhau Chất hóa học quan trọng nhất giúp điều hòa trương lực mạch máu, hoạt hóa của các tế bào viêm

và điều hòa quá trình đông máu là NO

Một số rối loạn khác có liên quan đến tổng hợp giảm hoặc tăng sự suy thoái của NO trong mạch máu bao gồm tăng cholesterol máu, đái tháo đường, tăng huyết áp và hút thuốc Các rối loạn chức năng nội mạc gây ra bởi những rối loạn này góp phần làm thay đổi trong khả năng hoạt động của mạch trong các điều kiện khác nhau Sự giảm hoạt động NO của mạch máu cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của xơ vữa động mạch [33]

Quá trình oxy hóa L-arginine tạo ra L-citrulline và Nitric oxid (NO) nhờ xúc tác của enzym eNOS

Trong tế bào nội mô mạch máu enzym eNOS có thể tồn tại dưới dạng hoạt động hoặc không hoạt động Enzym NOS sẽ hoạt động khi phân tử serin

1177 trênenzym này được phosphoryl hóa [33], [36]

NO sau khi được tạo ra sẽ khuếch tán đến các tê bào cơ trơn thành mạch máu làm giãn mạch máu NO cũng đóng vai trò quan trọng trong ức chế

xơ vữa động mạch vì nó ức chế quá trình oxy hóa lipid, ức chế sự kết dính bạch cầu lên tế bào nội mô mạch máu, ức chế sự kết tập của các tiểu cầu và ức chế sự kết dính của các tiểu cầu lên trên bào nội mô mạch máu [25] Ở hệ tuần hoàn và hô hấp, NO đóng một vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh chức năng sinh lý của các cơ quan này từ và điều tiết trương lực mạch máu và phế quản Vai trò phân tử hỗ trợ trong miễn dịch không đặc hiệu và sự truyền tải của khớp thần kinh thuộc hệ thống không-adrenergic không cholinergic [15]

Giảm dạng hoạt động của eNOS – giảm dạng eNOS phosphoryl hóa ở phân tử serin 1177 có thể dẫn đến tăng áp lực lên thành mạch máu và sinh ra bệnh mãn tính trên mạch máu [36] Nhiều nghiên cứu chứng minh rối loạn chức năng tế bào nội mô mạch máu với biểu hiện giảm hoạt tính enzym eNOS

là một trong những chỉ điểm sớm nhất ở những bệnh nhân có các yếu tố nguy

cơ xơ vữa ngay cả khi chưa chụp được ảnh xơ vữa trên mạch máu của bệnh nhân Chức năng tế bào nội mô mạch máu cải thiện cũng là một chỉ số cần đạt khi điều trị hoặc khi điều chỉnh các yếu tố nguy cơ gây xơ vữa động mạch

Mỡ máu đóng vai trò chính là suy giảm chức năng tế bào nội mô mạch máu làm giảm NO và hoạt hóa tín hiệu tiền viêm trong tế bào này [25], [33]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

Dược liệu được thu hái, rửa sạch, loại bỏ rễ con, sấy khô ở 60oC, xay nhỏ và bảo quản trong túi polyetylen kín

Đặc điểm bột dược liệu sau khi sấy khô: Thân rễ không có hình dạng nhất định, thường phân nhánh và thắt thành từng đoạn không đều nhau, chiều

dài khoảng từ 5-8 cm, dày khoảng 2-3 cm, tạo thành khối Ở tận cùng các nhánh có những lớp bần tụ thành từng đám vẩy màu đen, vỏ ngoài có màu vàng nâu hoặc xám, xù xì, lồi lõm, mang rất nhiều rễ con dạng sợi cứng, đường kính vài milimet, dài 10-20 cm, phần sát với thân rễ có vết tích của lớp bần bị bong ra, tạo thành những ống ôm lấy rễ con, rễ con chỉ tồn tại ở những phần thân rễ còn non, ở những phần già rễ con tự rụng đi làm cho bề mặt thân rễ thường nhẵn hơn, có màu vàng nâu rõ hơn Mặt cắt màu vàng tươi, chất cứng và dai Dược liệu cứng và dai, mùi thơm nồng đặc biệt, vị đắng chát

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ, máy móc

Các hóa chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV

+ Silicagel dùng cho sắc ký cột pha thường (Merck, Kielselgel 60, cỡ hạt

là 0,020- 0,040 và 0,040- 0,063mm), pha đảo (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd), Dianiom HP- 20

+ Hóa chất: Acid sulfuric, acid clohydric, natri hydroxyd, natri carbonat…

+ Dung môi: Chloroform, methanol công nghiệp, methanol Merck, ethanol, aceton, nước cất, Acetonitril (Merck), acid phosphoric (Merck), nước cất 2 lần

+ Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), huyết thanh ngựa (horse serum: HS), huyết thanh bò (fetal bovine serum: FBS) của hãng Invitrogen-Đức Kháng thể kháng IgG thỏ có gắn HRP (anti-rabbit IgG HRP-linked antibody), kháng thể kháng IgG chuột nhắt có kháng HRP (anti-mouse IgG HRP-linked antibody), kháng thể kháng phospho-AMPKα-Thr172,kháng thể kháng β-actin (sc-47778) của hãng Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Califonia, USA)

+ Dụng cụ: bát sứ, ống nghiệm, pipet chính xác, bình nón, bình đựng mức, cốc có mỏ, ống đong, dụng cụ chứa tế bào (chai nuôi cấy, đĩa peptri,…), micropipet các loại

+ Thiết bị:

- Bếp cách thủy, sinh hàn hồi lưu, bình ngấm kiệt

- Máy HPLC Shimadzu LC- 10ATVP (Nhật Bản)

- Cân phân tích Precisa(Thụy Sỹ)

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

- Máy đo độ ẩm Sartorius (Đức)

- Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 và 366 nm

- Phổ khối ion hóa phun điện tử APCI-MS, HR - ESI-MS đo trên máy Agilent 1100LC –MSD Trap (Mỹ)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- NMR, 13C – NMR, HMBC, HSQC, COSY) đo trên máy Bruke AM500 FT- NMR (Thụy Sỹ) tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy Volter

- Nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản)

- Đĩa 96 giếng Costarb3596 (Corning, Mỹ)

- Máy đọc ELISA kèm theo bộ ủ ấm (xMark, Bio- Rad)

- Thiết bị khuấy từ (Helidolph, Đức)

- Tủ hood hay tủ cấy tế bào (EUROCLONE Biological Safety Mỹ)

- Tủ ấm CO2 (SANYO)

- Bể ổn nhiệt (MEMMERT)

- Tủ mát, tủ lạnh (4 °C, -80 °C)

- Dụng cụ đếm tế bào

- Kính hiển vi soi ngược (OLYMPUS CX41)

- Thiết bị chạy điện di và máy chuyển màng Bio-rad

- Máy tính có cài đặt phần mềm Image J

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất và phân lập, xác định cấu trúc saponin trong thân rễ nần nghệ thu (D collettii) hái tại Sơn La

2.2.1.1 Chiết xuất

Xác định độ ẩm: Lấy khoảng 2g bột dược liệu để xác định độ ẩm Bật

máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1100C Trải đều dược liệu lên đĩa cân, đậy đĩa cân và đợi máy chạy tự động và hiển thị kết quả Tiến hành 3 lần với 3 mẫu ở các 3 vị trí khác nhau để lấy trung bình

đến kích thước thích hợp (bột thô) cho vào bình kín, chiết 3 lần với cồn 80% ở nhiệt độ 700C theo một tỷ lệ thích hợp, thu được dịch chiết toàn phần Dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn ethanol toàn phần

Chiết phân bố tạo các dịch chiết phân đoạn: Phân tán cao cắn ethanol

toàn phần trong nước, rồi tiến hành lắc phân đoạn lần lượt với các dung môi hữu cơ n-hexan, ethylacetat, n-butanol Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm duy trì nhiệt độ nồi cách thủy dưới 600C, thu được lần lượt cao cắn phân đoạn n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol và nước tương ứng

Hàm lượng cắn các phân đoạn được tính theo công thức:

F=

( ) x 100

Trong đó: F: hàm lượng chất (%)

b: Khối lượng cắn (g)

M: Khối lượng dược liệu đem chiết (g)

x: độ ẩm dược liệu đem chiết (%)

2.2.1.2 Phân lập

Phân lập các hợp chất saponin trong thân rễ nần nghệ (D collettii) bằng

sắc ký cột Trong đó chất hấp phụ (pha cố định) được nhồi trong cột hình trụ

và dung môi pha động được khai triển liên tục với nhiều loại hệ dung môi khác nhau Tùy theo chất được sử dụng trong cột khác nhau mà ta có các cơ chế và tên gọi khác nhau: Cột hấp phụ, cột phân bố, cột trao đổi ion… Sắc ký cột được tiến hành trên cột silica gel pha thường (0,040- 0,063 mm và 0,020- 0,040 mm, Merck), silica gel pha đảo YMC (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Dianion HP- 20

Các bước tiến hành:

Chuẩn bị:

+ Chất hấp phụ: Silica gel hấp phụ pha thuận và pha đảo

+ Cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước dài 40cm, đường kính 2,9-3,2 cm + Dung môi rửa giải là hỗn hợp dung môi được pha từ các dung môi thường dùng như: n-hexan, chloroform, ethylacetat, dicloromethan, aceton, methanol và nước

Tiến hành phân lập:

+ Chuẩn bị cột: Cố định cột trên giá đỡ, lót một lớp bông mỏng dưới đáy cột Cân một lượng silicagel vừa đủ, phân tán trong hệ dung môi rửa giải thành một hỗn hợp đồng nhất không có bọt khí Mở khóa của cột, rót nhanh hỗn dịch silicagel vào cột để cho silicagel lắng tự nhên Bổ sung silicagel liên tục lên cột, chú ý không để cột bị khô hay làm xáo trộn lớp silicagel bề mặt Sau khi silicagel chảy được 2 giờ thì bổ sung dung môi đến gần miệng cột Đậy nút mài và để yên 12 giờ rồi tiến hành đưa mẫu lên cột

+ Nạp mẫu lên cột: Hòa mẫu cần phân lập trong dung môi thích hợp, trộn đều với một lượng vừa đủ silicagel, sấy khô rồi tán thành bột tơi xốp Cho bột lên

cột thật đều, rải thành một lớp mỏng đều đặn Sau khi lớp bột mang mẫu ổn định, rắc thêm một lớp mỏng silica gel lên bề mặt và lót một lớp bông mỏng lên trên để tránh xáo động mặt cột khi cho dung môi rửa giải lên cột

+ Rửa giải: Phản hấp phụ bằng một hệ dung môi thích hợp, kiểm soát tốc

độ dòng chảy, hứng dịch rửa giải vào các bình nón hoặc ống nghiệm thích hợp Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp các phân đoạn có thành phần tương tự nhau thành những phân đoạn mới

Tinh chế các chất phân lập:

Sử dụng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan các chất phân lập

Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lâp:

Độ tinh khiết của chất phân lập được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lớp

mỏng Mỗi chất phân lập được kiểm tra bằng nhiều hệ dung môi khác nhau

2.2.1.3 Xác định cấu trúc hóa học của saponin phân lập được

Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D-NMR và 2D-NMR) [7], [8] và so sánh dữ liệu phổ của hợp chất phân lập được với dữ liệu phổ có

trong thư viện phổ và các tài liệu tham khảo

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều, phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử Các proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ có độ dịch chuyển khác nhau Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của các carbon Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon Nói cách khác các dữ liệu phổ cho biết carbon đó là C, CH, CH2, CH3, gián tiếp cho biết số carbon và hydro trong phân

tử Kỹ thuật thường được sử dụng hiện nay là DEPT Trong phổ DEPT-135, C

bậc IV không xuất hiện, C bậc II là các đỉnh âm, C bậc I và III là các đỉnh dương

Ở phổ DEPT-90, chỉ có C bậc III là các đỉnh dương trong phổ

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều: các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều còn cho thêm các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó (thường dùng hiện nay là HSQC), giữa proton của các C kế cận (phổ COSY), hay phổ tương tác giữa proton và các carbon kế cận (thường dùng phổ HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY)

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được đo trên máy Brucker AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội), tại Viện hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.2 Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV 304 của saponin phân lập từ nần nghệ (D collettii)

2.2.2.1 Thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV 304 của saponincó trong thân rễ nần nghệ (D collettii)

Trước khi đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu (ECV304), tiến hành đánh giá nhằm thăm dò khả năng gây độc tế bào

ECV304 của saponin này

Phương pháp được sử dụng để đánh giá độc tính trên tế bào là kỹ thuật định lượng MTT (MTT assay) [42]

 Quy trình tiến hành

 Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào: Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào ECV304 trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bò, penicillin 100UI/ml: streptomycin 0,1mg/ml ở 370C trong môi trường không khí có 5%

CO2 Nuôi tế bào đến khi tế bào phát triển ổn định Cấy chuyển tế bào vào đĩa

96 giếng với mật độ 2.103 tế bào/100 µl môi trường

 Ủ tế bào vào mẫu thử: Hút loại bỏ môi trường cũ và thay bằng môi trường mới Các giếng chứa tế bào được chia thành các lô và ủ với mẫu thử như sau:

Lô 1: Ủ với mẫu thử với nồng độ 400,00µg/ml

Lô 2: Ủ với mẫu thử với nồng độ 200,00µg/ml

Lô 3: Ủ với mẫu thử với nồng độ 100,00µg/ml

Lô chứng: Không ủ với mẫu thử, chỉ bổ sung DMSO

Tế bào được ủ với mẫu thử (hòa tan trong dimethyl sulfoxid- DMSO) với các nồng độ khác nhau (400,00, 200,00 và 100, 00µg/ml) trong 48 giờ, đảm bảo nồng độ DMSO trong mỗi giếng < 0,1% Tiến hành song song với các giếng chứng (chỉ bổ sung dung môi pha mẫu thử là DMSO) Tế bào được chia thành các lô, mỗi lô 3 giếng:

 Đánh giá độc tính trên tế bào của mẫu thử

- Thêm 20µl thuốc thử MTT (nồng độ 5mg/ml) vào mỗi giếng

- Ủ các đĩa 5h ở 370C trong môi trường không khí có 5% CO2, ủ trong bóng tối

- Hút bỏ dung dịch ủ tế bào Thêm 100µl dung dịch DMSO, trộn đều

và để trong 15 phút Đem đo quang ở bước sóng 540nm bằng máy ELISA

Thí nghiệm được lặp lại 2 lần ở cùng điều kiện

 Cách đánh giá kết quả

So sánh giá trị mật độ quang giữa các giếng có ủ với mẫu thử với các giếng không ủ với mẫu thử (giếng chứng) để đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử đến chức năng sống của tế bào

Mức độ gây chết tế bào của mẫu thử so với lô chứng được tính theo công thức:

ℎứTrong đó:

X: Phần trăm tế bào chết của lô thử so với lô chứng (%)

OD chứng: Mật độ quang của giếng tế bào lô chứng

OD thử: Mật độ quang của giếng tế bào lô thử

2.2.2.2 Đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu ECV304 của saponin có trong thân rễ nần nghệ (D collettii)

Sau khi thăm dò khả năng gây độc tế bào ECV 304 của các saponin có

trong thân rễ nần nghệ (D collettii) Tiến hành thử và đánh giá mức độ hoạt hóa eNOS trong tế bào nội mô mạch máu (ECV 304)

eNOS được hoạt hóa (gọi tắt là p-eNOS) khi phosphoryl hóa phân tử serin 1117 trên eNOS Đánh giá tác dụng hoạt hóa eNOS của hợp chất saponin tinh khiết trên dựa trên mức độ biểu hiện p-eNOS ở tế bào ECV 304 sau khi được ủ bằng kỹ thuật Western blot [24], [38], [41], [44] Quy trình được thực hiện theo 4 bước:

 Nuôi cấy tế bào và ủ thuốc

- Tế bào ECV304 đang được bảo quản nhiệt độ ở - 800C, được hoạt hóa

và nuôi cấy trong môi trường DMEM đã bổ sung 10% huyết thanh bò (FBS), penicillin 100UI/ml, treptomycin 0,1mg/ml ở 370C trong môi trường không khí có 5%CO2 Cấy chuyển tế bào vào đĩa 6 giếng (mật độ 106 tế bào/2ml môi trường/giếng) và tiếp tục nuôi cấy trong 24h

- Bổ sung mẫu thử đã được hòa tan trong dimethyl sulfoxid (DMSO) với nồng độ 100mg/ml, 2µl/giếng (nồng độ cuối cùng của các mẫu thử trong các giếng tế bào là 100 µl/ml Giếng chứng chỉ bổ sung 2µl DMSO/giếng

 Thu tế bào và chuẩn bị protein để điện di:

Tế bào sau khi ủ với mẫu thử, hút loại bỏ hết môi trường nuôi cấy Bổ sung dung dịch ly giải ECB (gồm Tris HCl 50mM, NaCl120mM, EDTA 1mM, NP-40 0,5%, NaF 50mM có bổ sung 1% phosphatase inhibitor và 1% protease inhibitor) để phá vỡ màng tế bào Ly tâm loại bỏ cặn thu lấy protein sao cho nồng độ protein tổng số trong các mẫu đều là 2,5µl/1µl Biến tính protein bằng dung dịch SDS 5x (gồm glycerol 50%, bromophenol 0,05%, sodium dodecyl sulfat 10%, mecarptoethanol 25%) ở 1000C trong 5 phút

 Điện di trên gel polyacrylamid:

Hình 2.4 Quá trình chạy điện di Tiến hành điện di protein trên polyacrylamid 8 Quá trình điện di gồm các bước sau:

Chuẩn bị và đồ bản gel polyacryamid 8% theo công thức sau:

Bảng 2.1 Công thức chuẩn bị gel polyacrylamid

Điện di protein trên bản gel polyacrylamid với dung dịch chạy điện di (running buffer: gồm glycerin 14,4g; tris bazơ 3,03g, SDS 1g, nước cất vừa đủ 1 lít), hiệu điện thế 150V trong 100 đến 120 phút (quan sát trên bán điện di thấy màu xanh của dung dịch tải mẫu di chuyển đến sát mép dưới bản gel thì dừng)

 Phát hiện protein

- Chuyển toàn bộ protein trên bản gel sang màng nitrocellulose bằng cách áp bản gel vào màng nitrocellulose lắp vào dụng cụ chuyển màng và đổ đầy dung dịch chạy chuyển màng (transfer buffer: gồm glycerin 14,4g, tris bazơ 3,03g, 200ml methanol, nước cất vừa đủ 1 lít), hiệu điện thế 60V trong

- Nhận biết eNOS đã hoạt hóa (p-eNOS) nằm trên màng nitrocellulose:

ủ màng với kháng thể kháng p–eNOS (kháng thể thứ 1) qua đêm ở nhiệt độ

2-80C, lắc liên tục trong quá trình ủ Rửa sạch kháng thể 1 thừa bằng cách rửa màng 3 lần bằng dung dịch TBS-T, mỗi lần rửa trong 5 phút bằng 100ml dung dịch TBS-T Ủ màng với kháng thể đơn dòng của thỏ (kháng thể thứ 2) có gắn sẵn horseradish peroxidase (HRP) Ủ màng với dung dịch luminal và dung dịch peroxide trong 5 phút ở nhiệt độ phòng Khi có mặt hydro peroxide, HRP xúc tác cho phản ứng oxi hóa luminol tạo thành các chất phát quang Ánh sáng quang học phát ra được hiện trên trên phim X- quang bằng cáp áp màng với phim X- quang trong bóng tối Rửa phim để thu được bản film có chứa các tín hiệu protein

- Sử dụng β-actin làm protein đối chứng Nguyên tắc và cách tiến hành đánh giá biểu hiện của β-actin tương tự như trên trong đó sử dụng các kháng thể 1 là kháng thể kháng β-actin và kháng thể 2 là kháng thể đơn dòng của chuột nhắt có gắn HRP

Số liệu được xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft Excel 2007 Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p<0,05 Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M ± SD)