nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát tác dụng chống viên cấp của phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ cây dây đòn gánh ( gouania leptostachya dc) họ táo ta (rhamnaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ ĐỊNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CHIẾT XUẤT TỪ LUẬN V

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ ĐỊNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CHIẾT XUẤT TỪ

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ ĐỊNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CẤP CỦA PHÂN ĐOẠN ETHYL ACETAT CHIẾT XUẤT TỪ

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60720406 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu

HÀ NỘI 2017

TS Nguyễn Thị Hường – Hiệu trưởng và các anh chị, bạn bè đồng nghiệp của bộ môn Dược liệu – trường cao đẳng Dược TW Hải Dương đã động viên, hỗ trợ về vật chất lẫn tinh thần, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học Cao học

Cám ơn gia đình luôn là động lực cho tôi phấn đấu trên bước đường của mình

Hà Nội,ngày 4 tháng 04 năm 2017

Xin chân thành cảm ơn!

Đỗ Thị Định

MỤC LỤC

MỤC LỤC 4

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC BẢNG 9

DANH MỤC HÌNH 10

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về thực vật chi Gouania Jacq và cây Dây đòn gánh 3

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Gouania Jacq .3

1.1.2.Đặc điểm thực vật và tính đa dạng sinh học của chi Gouania Jacq 3

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2.2 Tính đa dạng sinh học 3

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của một số loài thuộc chi Gouania 4

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Gouania javanica Miq 4

1.1.3.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Gouania leptostachya DC 4

1.2 Thành phần hoá học 6

1.2.1 Thành phần hoá học của loài Gouania lupuloides 6

1.2.2 Thành phần hóa học của loài Gouania ulmifolia 6

1.2.3 Thành phần hoá học của cây Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.) 6

1.3 Tác dụng sinh học 11

1.3.1 Tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Gouania Jacq 11

1.3.2 Tác dụng sinh học của cây Dây đòn gánh 11

1.4 Công dụng theo y học cổ truyền 13

1.4.1 Tính vị và công năng 13

1.4.2 Chủ trị 13

1.4.3 Một số bài thuốc có cây Dây đòn gánh 13

1.4.3.1 Chữa sưng tấy, tụ máu, đau nhức do chấn thương 13

1 4.3.2 Chữa bỏng nhất là bỏng vôi 14

1 4.3.3 Chữa sốt cao gây co giật ở trẻ em 14

1.4.3.4 Chữa rắn cắn 14

1.4.3.5 Diệt chấy 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong nghiên cứu 15

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất 15

2.2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Nghiên cứu về hóa học 16

2.3.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong cây Dây đòn gánh 16

2.3.1.2 Chiết xuất cao toàn phần EtOH và cao phân đoạn EtOAc 17

2.3.1.3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 19

2.3.2 Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp 19

2.3.2.1 Nghiên cứu độc tính cấp 19

2.3.2.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp 21

2.3.3 Phân tích thống kê 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1 Kết quả nguyên cứu hóa học của cây Dây đòn gánh 24

3.1.1 Xác định độ ẩm của dược liệu 24

3.1.2 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong cây Dây đòn gánh 24

3.1.3 Chiết xuất 26

3.1.4 Phân lập 26

3.1.5 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được 28

3.1.5.1 Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM 29

3.1.5.2 Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC 31

3.1.6 Xác định cấu trúc các chất phân lập được 33

3.1.6.1 Chất DG3 33

3.1.6.2 Chất DG5 36

3.2 Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp 39

3.2.1 Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp của cao toàn phần EtOH 39

3.2.1.1 Kết quả nghiên cứu 39

3.2.1.2 Kết luận 39

3.2.2 Kết quả nghiên cứu về tác dụng chống viêm cấp 40

3.2.2.1 Kết quả nghiên cứu 40

3.2.2.2 Kết luận 42

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 43

4.1 Về hóa học 43

4.2 Về độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp 46

4.2.1 Về độc tính cấp 46

4.2.2 Về tác dụng chống viêm cấp 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

KẾT LUẬN 50

1 Về hóa học 50

2 Về độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp 50

KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectrometry HPLC High perfomance liquid chromatography GC/MS Gas Chromatography - Mass Spectometry LC/MS Liquid chromatography- Mass spectrometry FTIR Fourier Transform InfraRed

Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

VHLKH & CNVN Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

DANH MỤC BẢNG

3.1 Xác định độ ẩm của mẫu cây Dây đòn gánh 24 3.2 Tóm tắt kết quả định tính các nhóm chất 25 3.3 Số liệu phổ 1

H và 13C-NMR của hợp chất DG3 và quercitrin 35 3.4 Số liệu phổ 1

H và 13C-NMR của hợp chất DG5 và catechin 38 3.5 So sánh tác dụng chống viêm cấp của mẫu thử phân đoạn

EtOAc so với lô chứng bệnh lý

41

DANH MỤC HÌNH

1.6

1.7

Cấu trúc hóa học của hợp chất C5

Cấu trúc hóa học của hợp chất C9

9

9

2.1 Sơ đồ quy trình chiết xuất các cao của cây Dây đòn gánh 18 2.2 Quy trình thí nghiệm thử tác dụng chống viêm 22 3.1 Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn EtOAc 28 3.2 Sắc ký lớp mỏng DG3 so với cao EtOH và cao EtOAc 29 3.3 Sắc ký lớp mỏng DG5 so với cao EtOH và cao EtOAc 30 3.4 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất DG3 32 3.5 Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất DG5 33

3.8 Mức độ phù bàn chân chuột (%) theo thời gian (giờ) của các lô

Để bắt kịp nhu cầu và xu thế chung của thế giới những cây thuốc đó cần được nghiên cứu để được đưa vào sử dụng khoa học và hiệu quả Do đó việc nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học các cây thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụng một cách an toàn, hợp lý và hiệu quả nhất nguồn tài nguyên thiên nhiên này

Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.) là cây thuốc sử dụng phổ

biến trong dân gian [4]; nhân dân thường dùng cây này giã nhỏ thêm rượu xoa bóp vào những nơi sưng tấy, đau nhức do đòn đánh, chỗ bị thương do ngã Cũng dùng sắc uống hoặc ngâm rượu uống, có tác dụng đối với gân xương và

bổ dưỡng Cho thấy tác dụng chống viêm và giảm đau của cây Dây đòn gánh

cả đường uống và ngoài da Trong khi đó, tại Việt Nam, những nghiên cứu trên đối tượng này chỉ mới bắt đầu và mang tính khảo sát sơ bộ về thành phần hóa học Hiện nay, trong nước chưa có công trình nghiên cứu về tác dụng

chống viêm cấp của cây Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.) mọc ở

Việt Nam với mục đích chứng minh kinh nghiệm sử dụng cây Dây đòn gánh trong nhân dân (công dụng chữa sưng tấy, đau nhức xương khớp do đòn đánh,

do chấn thương, vết thương hở ) Từ đó đặt ra câu hỏi phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh có hay không tác dụng chống viêm?

Năm 2016, Đặng Thị Thủy đã đánh giá được khả năng chống oxy hóa của các phân đoạn n- hexan, ethyl acetat, n – butanol và nước, trong đó phân

đoạn ethyl acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa tương đối tốt và cao nhất trong 4 phân đoạn thử nghiệm Tiếp nối chuỗi đề tài nghiên cứu tổng thể về cây Dây đòn gánh, chúng tôi tiến hành lựa chọn phân đoạn ethyl acetat

để phân lập các hợp chất hóa học và đánh giá tác dụng chống viêm cấp Trước khi đánh giá tác dụng chống viêm cấp của phân đoạn ethyl acetat, chúng tôi tiến hành đánh giá độc tính cấp của cao toàn phần ethanol phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh với mục đích xác định mức độ an toàn của cây Dây đòn gánh để làm cơ sở tiếp tục các thí nghiệm về tác dụng sinh học trong đề tài này cũng như các đề tài tiến hành về sau

Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu thành phần hóa học

và khảo sát tác dụng chống viêm cấp của phân đoạn ethyl acetat chiết

xuất từ cây Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.), họ Táo ta (Rhamnaceae)” với hai mục tiêu:

1 Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc 2 – 3 chất từ phân

đoạn ethyl acetat chiết xuất từ cây Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.)

2 Đánh giá được độc tính cấp của cao toàn phần EtOH và tác dụng chống viêm cấp của cao phân đoạn ethyl acetat chiết xuất từ cây Dây đòn

gánh (Gouania leptostachya DC.)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về thực vật chi Gouania Jacq và cây Dây đòn gánh

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Gouania Jacq

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan, chi Gouania Jacq thuộc họ Táo ta (Rhamnaceae), bộ Táo ta (Rhamnales), liên bộ Táo ta (Rhamnanae), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [2], [13], [14], [15], [36]

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Hoa hồng (Rosidase)

Liên bộ Táo ta (Rhamnanae)

Bộ Táo ta (Rhamnales)

Họ Táo ta (Rhamnaceae)

Chi Gouania Jacq

1.1.2 Đặc điểm thực vật và tính đa dạng sinh học của chi Gouania Jacq

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Cây nhỡ không gai, mọc leo Lá mọc so le Cụm hoa lưỡng tính, hợp thành bông ở nách lá hoặc ở ngọn; nhánh con cong thành móc Lá đài 5; ống đài ngắn, hình nón ngược Cánh hoa 5, đính dưới mép của đĩa Nhị 5 Đĩa mật

có 5 góc hoặc hình sao, phủ lên ống đài Bầu hạ đính với đĩa mật, có 3 ô; vòi nhuỵ chẻ 3 Quả có 3 cánh, mang các lá đài tồn tại ở đỉnh [4]

1.1.2.2 Tính đa dạng sinh học

Chi Gouania Jacq gồm một số loài dây leo, phân bố chủ yếu ở vùng

nhiệt đới châu Á với tổng số 26 loài [4] Ở Việt Nam, chi này có 2 loài, trong

đó có cây Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.) và được coi là loài phân

bố hẹp ở châu Á

1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của một số loài thuộc chi Gouania

1.1.3.1 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Gouania javanica Miq

Dây leo hay cây bụi mọc trườn; nhánh có cạnh và có lông Lá mỏng, nhám, gốc tròn, mép có răng, đầu có đuôi, mặt dưới đầy lông; gân phụ 5-6 cặp Chuỳ hoa hẹp, dài 20-25cm Hoa tạp tính, cánh hoa 1mm; nhị 5; bầu 3 ô Quả có 3 cánh, cánh 1 hạt, rộng 1cm; hạt dài 3 mm màu nâu bóng Mùa hoa vào tháng 4, mùa quả vào tháng 6 [14]

Phân bố ở Lào, Campuchia và Việt Nam Ở nước ta, cây mọc ở bìa rừng từ Quảng Trị qua Kontum, Đắc Lắc đến tận An Giang

1.1.3.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Gouania leptostachya DC

Dây đòn gánh còn có tên gọi khác như: Dây gân, Dây đòn kẻ trộm, Dây đoi kiến, Dây xà phòng, Dây râu rồng, Dơn tai mèo, Seng thanh (Mường), Poát pào, Khau căn (Tày), Chừa than hồ (Thái) [16]

Nguồn: PGS.TS Trần Văn Ơn

Hình 1.1 Hình ảnh cây Dây đòn gánh

Hình 1.2 Hình ảnh cây Dây đòn gánh lúc ra hoa

Cây bụi leo, dài hàng mét Thân cành nhẵn, màu nâu sau đỏ xám nhạt

Lá mọc so le, hình bầu dục dài 4-10cm, rộng 2-6cm, gốc tròn hoặc hình tim, đầu thuôn nhọn, mép khía răng cưa; lá non ở ngọn cành biến thành tua cuốn, hai mặt nhẵn, mặt dưới rất nhạt, có gân nổi rõ; lá kèm to bền, bao thân, khía răng; cuống lá dài 1-2cm [16], [23]

Cụm hoa mọc thành chuỳ ở kẽ lá hoặc đầu cành, dài 10-20cm; hoa nhỏ, đơn tính, màu trắng lục; lá bắc hình tam giác nhọn; hoa đực có 5 lá đài có lông ở mặt ngoài, 5 cánh hoa có móng hẹp, nhị 5, dài bằng tràng, bao phấn nhỏ; hoa cái có bầu hạ, 3 ô [16]

Quả khô có 3 cánh dày, khuyết ở hai đầu, màu nâu vàng sáng Mùa hoa: tháng 7-8; mùa quả tháng 9-12 [16]

Loài Gouania leptostachya DC có ba thứ [23]:

- Thứ leptostachya DC.: có quả to, dài 10-12mm, rộng 13-15mm, đen

nhạt có cánh dày Mùa quả tháng 12 [4], [23]

- Thứ tonkinensis Pitard.: có lá răng cưa nhỏ, lá kèm hình lá rất rộng,

ôm lấy thân ở phía dưới, tồn tại Hoa dưới của hoa tự đính trên những trục khá dài và kèm theo lá bắc Quả nâu vàng nhạt [9], [23]

- Thứ macrocarpa Pitard: quả kích thước 12–13 × 13–18 mm, có cánh

dày [9], [23]

Dây đòn gánh thuộc loại dây leo ưa sáng, thường mọc lẫn trong các quần thể rừng thứ sinh, đồi cây bụi, đôi khi gặp cả ở vùng núi đá vôi, thuộc các tỉnh vùng núi thấp và trung du Cây mọc ở nơi nhiều ánh sáng, ra hoa quả hàng năm Sau khi bị chặt, phần gốc và thân còn lại đều có khả năng tái sinh Chưa quan sát được cây con tái sinh từ hạt [16]

1.2 Thành phần hoá học

1.2.1 Thành phần hoá học của loài Gouania lupuloides

Từ thân của loài Gouania lupuloides, các saponin triterpenoid có khung

cấu trúc 16,17-seco-damaran đã được phân lập là Gouanosid A và Gouanosid

B Đây là 2 saponin mới được phân lập lần đầu từ loài này do các nhà khoa học thuộc Đại học Washington thực hiện Cấu trúc của hai hợp chất này được nhận dạng dựa trên các dữ liệu phổ NMR một chiều và hai chiều [27]

1.2.2 Thành phần hóa học của loài Gouania ulmifolia

Hai triterpenoids mới được đặt tên acid Gouanic A và acid Gouanic B,

được phân lập từ Gouania ulmifolia, cùng với sáu hợp chất đã được biết đến

Cấu trúc của các hợp chất mới được xác định dựa trên các dữ liệu phổ, chủ yếu là NMR (1D và 2D) và khối phổ [26]

1.2.3 Thành phần hoá học của cây Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.)

 Trên thế giới:

Nghiên cứu trên thân của G leptostycha DC var tokinensis Pitard., có

hai dẫn xuất mới của benzopyran, 1 - [(rel2S, 3R)-y1 dihydro-2H-chromen-2] ethanon và 1 - [(rel 2S, 3s) -3 , 5,7-trihydroxy-3,4-

3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H-chromen-2-y1] ethanon, cùng với bốn flavonoid được biết là prodelphinidin C, prodelphinidin B3, (-) - epigalocatechin và (+) - galocatechin [33]

 Trong nước:

Khảo sát ban đầu cho thấy, trong lá Gouania leptostachya DC có

alcaloid; thân và lá đều chứa saponin [4], [13], [14], [15]

Theo Nguyễn Văn An [1], phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh có chứa saponin, flavonoid, đường khử, caroten và sterol Tác giả đã phân lập được ba chất tinh khiết từ cắn phân đoạn n - BuOH: acid Gouanic A, acid Gouanic C,

và acid Ceanothenic

HOH2C

COOH

COOH 1

2

4 5 6

8

9 10

14

16 17 18

19 20

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của acid Ceanothenic

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của acid Gouanic C

Ngô Thị Thu năm 2011 đã phân lập được 2 chất từ cắn phân đoạn n - Butanol kí hiệu là C5 và C9 Dựa và dữ liệu khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã xác định được C9 là β – sitosterol – (β – D – glucopyranosid) và C5 là 1 este được tạo thành từ hai hợp phần là hai triterpen, trong đó một hợp phần là acid Zizyberanal và một hợp phần có cấu trúc tương tự như acid Ceanothenic [13]

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất C5

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất C9 (β – sitosterol – (β – D

– glucopyranosid)

Đặng Thị Thủy năm 2016 đã phân lập được 02 hợp chất DG1 và DG2

từ cắn phân đoạn ethyl acetat phần trên mặt đất của cây Dây đòn gánh; các

hợp chất lần lượt được xác định là isoquercitrin (DG1) và O-E-caffeoyl)-β-D-galactopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranosid (DG2); cả

kaempferol-3-O-(6-02 hợp chất đều thể hiện tác dụng chống oxy hóa tương đối tốt [15]

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất DG1 (isoquercitrin)

Hình 1.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất DG2

(kaempferol-3-O-(6-O-E-caffeoyl)-β-D-galactopyranosyl-(1→2)-α-L rhamnopyranosid)

1.3 Tác dụng sinh học

1.3.1 Tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Gouania Jacq

Từ phần trên mặt đất của loài Gouania ulmifolia, các nhà khoa học

Brasil đã phân lập được 6 hợp chất đã biết và 2 hợp chất mới Các thành phần này được tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn, tuy nhiên 2 hợp chất mới phân lập lần đầu từ loài này cho thấy tác dụng kháng khuẩn là không đáng kể [26]

Các nhà khoa học Áo đã tiến hành sàng lọc thử tác dụng kháng động vật đơn bào của 256 loài dược liệu thu hái tại Ecuador, trong đó vỏ thân và

cành loài Gouania lupuloides có tác dụng khá tốt [25]

1.3.2 Tác dụng sinh học của cây Dây đòn gánh

 Trên thế giới

Trong một nghiên cứu sàng lọc được thực hiện ở Ấn Độ, cao khô chiết cồn phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh có tác dụng trên tần số và biên độ hô hấp, có tác dụng hạ huyết áp và tăng co bóp hồi tràng chuột lang cô lập Một tài liệu xác định sơ bộ thấy LD50 tiêm màng bụng của cao khô Dây đòn gánh

là 500mg/kg, nhưng một tài liệu khác lại ghi đã thử đến 1000mg/kg chuột nhắt trắng nhưng không thấy chuột chết Trong một tài liệu khác đã thử cho chuột uống đến 4000 mg/ kg cao toàn phần MeOH, sau 48h không thấy chuột chết hay có dấu hiệu ngộ độc [16]

Dịch chiết toàn phần cây Dây đòn gánh có tác dụng trên cả 3 chủng vi

khuẩn thí nghiệm là: Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa Còn phân đoạn n-butanol thì có tác dụng trên chủng Candida albicans mạnh hơn so với dịch chiết toàn phần và tương đương với Nystatin

500UI/ml Tác dụng này khá ổn định sau 48h và 72h trong khi tác dụng của Nystatin giảm mạnh

Dịch chiết từ Dây đòn gánh có các tác dụng dược lý sau:

Về hoạt động ức chế của các dẫn xuất của Benzopyran trên

α-glucosidase: Nghiên cứu trên thân của loài G leptostycha DC var

tonkinensis Pitard đã phân lập được hai dẫn xuất mới của benzopyran là 1 -

[(rel2S, 3R)一y1 3,5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H-chromen-2] ethanon và 1 -

[(rel 2S, 3s) -3 , 5,7-trihydroxy-3,4-dihydro-2H-chromen-2-y1] ethanon, cùng với bốn flavonoid được biết gồm prodelphinidin C, prodelphinidin B3, (-) - epi - galocatechin và (+) - galocatechin Các hợp chất này đã cho thấy mức độ khác nhau của hoạt động ức chế α-glucosidase Đặc biệt, prodelphinidin C làm giảm đáng kể hoạt động của α-glucosidase Vì vậy, prodelphinidin C có thể là hợp chất có hoạt tính sinh học dùng để tổng hợp hóa học [33]

Tác dụng chống oxy hóa: Trong nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa của một số dược liệu Việt Nam và Mông cổ do tác nhân oxy hóa NO, dịch

chiết ethanol của cây Gouania leptostachya là một trong 18 cây thể hiện tác

dụng dọn gốc tự do mạnh với IC50 = 2,34µg/ml [18]

Tác dụng chống viêm: Dịch chiết methanol của G leptostachya có tác

dụng chống viêm thông qua sự ức chế hoạt động của Src và NF-kB là các chất trung gian của phản ứng viêm [30]

 Trong nước

Nguyễn Thị Thuỷ năm 2009 cho thấy cắn phân đoạn n-BuOH chiết từ

loài Gouania leptostachya DC có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm khá tốt

[14]

Nguyễn Văn An năm 2010 và Ngô Thị Thu năm 2011 cho thấy: tác dụng kháng VSV của cắn n-BuOH là không đáng kể đối với vi khuẩn và không có tác dụng đối với vi nấm [1], [13]

Đặng Thị Thủy năm 2016 đã đánh giá được khả năng dọn gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn của dịch chiết ethanol phần trên mặt của cây Dây đòn gánh Kết quả cho thấy phân đoạn ethyl acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa tương đối tốt và cao nhất trong 04 cao phân đoạn thử nghiệm bao

gồm n-hexan, ethyl acetat, n-butanol và nước với giá trị IC50 là 97,98 μg/ml [15]

1.4 Công dụng theo y học cổ truyền

Dây đòn gánh thông mạch, làm tan máu ứ, tiêu sưng, giảm đau, chữa sưng tấy, đau nhức do đòn đánh, chỗ bị thương do ngã, đau người, đau ngang lưng, gánh vác nặng đau sụn xương sống, cơ lưng Ngày 8-16g sắc uống hoặc ngâm rượu uống [16]

Dùng ngoài, giã nhỏ cây và lá, thêm rượu hoặc giấm xoa bóp vào những nơi sưng tấy, mụn nhọt, đinh độc, hoặc đắp vào vết bỏng, vết thương,

lở ngứa [16]

Lá giã nát đắp vào trán, gan bàn tay để giảm sốt, sài giật, cảm gió [16] Các thầy lang người Dao Tiền ở xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, Thái Nguyên đã biết sử dụng khá nhiều cây thuốc để chữa bệnh ngoài da, trong đó

có cây Dây đòn gánh (Gouania leptostachya DC.) Cách sử dụng chủ yếu là

đun nước tắm gội; dùng giã nát đắp, bôi; ngâm rượu bôi, sắc nước bôi, sắc nước ngâm [4]

1.4.3 Một số bài thuốc có cây Dây đòn gánh

1.4.3.1 Chữa sưng tấy, tụ máu, đau nhức do chấn thương

Lá Dây đòn gánh 10g

Lá Náng hoa trắng 10g

Lá Bạc thau 8g Tất cả dùng tươi, giã nát, thêm ít rượu, đắp, bó Ngày làm một lần [16]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: cao phân đoạn EtOAc của phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh

Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Dây

đòn gánh Gouania leptostachya DC

Nơi thu hái: Xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, Thái Nguyên

Thời điểm thu hái: Tháng 1/2016 và 11/2016

Mẫu nghiên cứu được ThS Nghiêm Đức Trọng – Bộ môn Thực vật,

Trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Gouania leptostachya DC var tonkinensis Pitard., họ Táo ta (Rhamnaceae) Mẫu hiện

đang lưu tại Phòng tiêu bản, Khoa tài nguyên – Viện Dược liệu, số hiệu mẫu NIMM TB – 10663A, NIMM TB – 10663B, NIMM TB – 10663C

Dược liệu sau khi thu hái về được rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô ở 600

C, nghiền thành bột bảo quản trong túi nilon kín để làm thực nghiệm hóa học và tác dụng sinh học

2.2 Hóa chất và thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất

- Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích quy định trong Dược điển Việt Nam IV

2.2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Cân phân tích Precisa

- Ống đong các loại (10-2000ml)

- Bình cầu đáy tròn các loại 50-2000ml

- Bình gạn 1-2 lít

- Bình chiết, phễu, cốc, buret

- Các loại cột sắc ký (cột thủy tinh)

- Cột C18 (4.6 x 250 mm; 5 µm, Optimapak, RStech Corp, Korea)

- Máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) – Scanning Camag

- SKLM dùng bản mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 của hãng MERCK (Đức)

- Silica gel (MERCK) dùng cho sắc ký cột, Sephadex LH-20

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, VHLKH & CNVN

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, VHLKH & CNVN

- Chuồng nhốt chuột, bình uống nước, kim đầu tù, máy đo biến đổi thể tích của hãng Ugo basile

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về hóa học

2.3.1.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong cây Dây đòn gánh

Định tính các nhóm chất theo phương pháp phân tích sàng lọc các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong dược liệu (Alcaloid, saponin, polysaccarid, glycosid tim, tanin, flavonoid, coumarin, sterol…) bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [3], [12]

2.3.1.2 Chiết xuất cao toàn phần EtOH và cao phân đoạn EtOAc

Phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh khô (bột dược liệu đã xay thô, khối lượng 10 kg, độ ẩm 9,986%) được chiết bằng dung môi ethanol 800

ở nhiệt độ thường (ngâm chiết 3 lần, mỗi lần 4 ngày, tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1: 6)

Cô cạn dịch chiết bằng máy cất quay ở áp suất giảm được cắn Khối lượng cắn 823,95g

Hòa 517,23g cắn cao toàn phần EtOH vào nước (tỷ lệ 1:2) rồi chiết

phân đoạn với n–hexan (tỷ lệ là 1:1, chiết 4 lần) để loại tạp kém phân cực Thu gộp phần dịch chiết chứa n–hexan (phần nửa trên bình gạn); cô cất quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu cắn phân đoạn n–hexan

Thu gộp dịch chiết nước (phần nửa dưới bình gạn) còn lại sau khi chiết

với n–hexan Lấy dịch chiết đó đem chiết phân đoạn với ethyl acetat (tỷ lệ

dịch chiết/EtOAc là 1:1, chiết 4 lần) Thu gộp lấy dịch chiết phân đoạn EtOAc (phần nửa trên bình gạn); cô cất quay thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn cao phân đoạn EtOAc Khối lượng cắn 102,47g

Phương pháp chiết phân đoạn: làm thủ công, không siêu âm, tỷ lệ dịch chiết nước/ DM là 1: 1, sử dụng bình gạn 1 L

Quy trình chiết xuất các cao từ phần trên mặt đất của cây Dây đòn gánh

được mô tả tóm tắt trong Hình 2.1

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình chiết xuất các cao của cây Dây đòn gánh

Bột cây Dây đòn gánh khô

Cất thu hồi dung môi 517,23g

2.3.1.3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

- Phân lập các chất bằng sắc ký cột

- Theo dõi các phân đoạn sắc ký bằng SKLM

- Chất tách được kết tinh lại trong dung môi phù hợp

- Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được bằng SKLM và HPLC

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên tính chất cảm quan, các thông số vật lý và các phương pháp phổ gồm: điểm chảy, phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1

H-NMR) và hai chiều NMR) và so sánh dữ liệu phổ thu được với các dữ liệu phổ đã công bố.[11]

(2D-2.3.2 Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp

2.3.2.1 Nghiên cứu độc tính cấp

Phương pháp

Theo "Phương pháp xác định độc tính của thuốc" LD50 được tính theo phương pháp Behrens-Karber được mô tả bởi Đỗ Trung Đàm [5] Phương pháp thử độc tính cấp theo mô hình cổ điển kết hợp với một số hướng dẫn trong OECD 420 [28]

Lô 1: uống liều 4g cao EtOH/ kg

Lô 2: uống liều 8g cao EtOH/kg

Lô 3: uống liều 12g cao EtOH/kg

- Đường dùng thuốc: đường uống, cho chuột uống bằng cách dùng kim tiêm có kim đầu tù để đưa mẫu thử một cách nhẹ nhàng vào dạ dày chuột

- Mẫu thử: Cao ethanol được cân chính xác một lượng, thêm một lượng chính xác nước, nghiền mịn (100, 200, 300 mg cao EtOH/ ml nước cất) Chuột được cho uống cao với những liều khác nhau tính theo gam cao/kg thể trọng chuột Thử các liều tương đương 48g, 96g, 144g dl/ kg thể trọng chuột (ngoại suy tương đương 200, 400, 600 g dl/ ngày ở người, tính quy ước hệ số

12, cân nặng mỗi người 50kg) Cho các lô chuột uống cùng thể tích 0,4 ml nước cao/ 10g thể trọng

- Thời gian theo dõi: Sau khi được uống mẫu thử, chuột được cho ăn và uống đầy đủ Theo dõi và quan sát các biểu hiện về hành vi, hoạt động, ăn uống, bài tiết của chuột và số chuột sống chết trong 3 ngày (72 giờ)

- Sau khi thử nghiệm thăm dò, động vật thí nghiệm được chia thành 6 lô, mỗi lô 10 con (thử nghiệm chính thức) Tìm liều tối đa mà không có chuột nào của lô thí nghiệm chết (LD0) và liều tối thiểu để 100% chuột của lô thí nghiệm chết (LD100) Thử thêm 2 - 4 liều trung gian giữa 2 liều nói trên để xác định LD50

- Theo dõi động vật trong vòng 7 ngày sau khi dùng mẫu thử (theo dõi liên

tục trong vòng 4 giờ đầu, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau)

Thông số đánh giá

- Trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc, ghi chép lại các thông số sau:

 Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu

 Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống

 Số động vật chết: xác định tỷ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ để tính toán LD50

 Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng

Nếu cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

- Tiếp tục theo dõi động vật cho đến thời điểm 7 ngày sau khi uống thuốc

- Xác định LD50 (nếu có)

- Công thức tính: LD50 = LD100 - (d x z)

n

Trong đó:

d: hiệu số của hai liều kế tiếp

z: trung bình số chuột chết giữa 2 liều kế tiếp

n: số chuột trong 1 lô

2.3.2.2 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp

- Lô 1: lô chứng bệnh lý uống dung môi

- Lô 2,3: lô uống cao chiết phân đoạn ethylacetat với 2 liều 40mg, 80mg

cao/ kg tương đương 2,4g, 4,8g dl/ kg

- Lô 4: lô uống diclofenac liều 10 mg/kg

Chuột thí nghiệm được uống nước muối sinh lý, dung môi pha thuốc

hoặc mẫu thử với cùng thể tích 0,5 ml/100g thể trọng chuột

Chuột thí nghiệm được uống mẫu thử (các lô uống cao chiết, diclofenac)

và uống nước (lô chứng bệnh lý) trước 4 ngày thí nghiệm Ngày thứ 5 tiến hành thí nghiệm, cho chuột uống nước hoặc mẫu thử, đo thể tích bàn chân sau phải (từ khuỷu chân trở xuống) của tất cả chuột trước khi gây viêm (được chỉ

số V0)

Gây phù bàn chân chuột bằng cách tiêm dưới da gan bàn chân dung dịch Carragenin 1% pha trong dung dịch NaCl 0,9% với liều 0,1 ml/1 bàn chân chuột

Ngay sau khi gây viêm, cho chuột của tất cả các lô uống nước 3,5 ml/100g Sau khi gây viêm 3 giờ và 5 giờ và 24 giờ, đo thể tích bàn chân của tất cả chuột thí nghiệm (được các chỉ số V3,V5 và V24)

Quy trình tiến hành thí nghiệm được mô tả ở Hình 2.2

Hình 2.2 Qui trình thí nghiệm thử tác dụng chống viêm

Thông số đánh giá

- Đo thể tích bàn chân sau phải của chuột

- Mức độ phù bàn chân phải của chuột được tính theo công thức:

∆V: Mức độ phù chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm

Vt: Thể tích chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây tiêm; tại từng thời điểm sau gây phù (t = 3 giờ, 5 giờ, 24 giờ)

Vo: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm

- Phần trăm ức chế của lô thử so với lô chứng được tính theo công thức:

I (%) = [(∆Vc – ∆Vt)/∆Vc] × 100

I (%): Phần trăm ức chế phù của lô chứng so với lô thử

∆Vc, ∆Vt: Mức độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng và lô thử

So sánh độ phù trung bình bàn chân chuột giữa lô chứng bệnh lý và lô thử thuốc ở từng thời điểm, nếu thuốc có tác dụng chống viêm cấp thì độ phù

lô thử thuốc sẽ giảm hơn lô chứng bệnh lý

2.3.3 Phân tích thống kê

Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống

kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ sai số chuẩn (M±SE) Đánh giá, so sánh giữa các lô thí nghiệm bằng phương pháp thống kê sử dụng chuẩn t-Student

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả nguyên cứu hóa học của cây Dây đòn gánh

3.1.1 Xác định độ ẩm của dược liệu

Lấy khoảng 8g bột dược liệu nghiên cứu để xác định độ ẩm Bật máy

đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ 1050

C Đổ dược liệu lên đĩa cân, trải đều bột dược liệu trên mặt đĩa, đợi máy tự động hiện kết quả trên màn hình, sau 10 phút đọc kết quả Độ ẩm dược liệu nghiên cứu (phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh) là 9,986 %

Bảng 3.1: Xác định độ ẩm của mẫu cây Dây đòn gánh

3.1.2 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong cây Dây đòn gánh

 Kết quả định tính các nhóm chất chính bằng phản ứng hóa học đặc trưng

được thể hiện qua Bảng 3.2

Bảng 3.2: Tóm tắt kết quả định tính các nhóm chất chính trong cây Dây

3 Alcaloid

P/ư thuốc thử Mayer -

Không có P/ư thuốc thử Bourchardart -

P/ư thuốc thử Dragendorff -

4 Saponin

Không có

7 Glycosid tim P/ư Liebermann Bouchardart ++

Không có P/ư thuốc thử Baljet -

10 Acid béo Bay hơi trên giấy lọc - Không có

13 Polysacharid P/ư với thuốc thử Lugol 1% - Không có

Chú thích: + : Phản ứng dương tính - : Phản ứng âm tính

Kết quả định tính sơ bộ cho thấy phần trên mặt đất cây Dây đòn gánh

có chứa các nhóm chất flavonoid, saponin triterpenoid, đường khử, caroten và sterol

3.1.3 Chiết xuất

Quy trình chiết xuất các cao từ phần trên mặt đất của cây Dây đòn gánh

được mô tả tóm tắt trong Hình 2.2, Chương 2

3.1.4 Phân lập

- Quy trình phân lập:

Cao phân đoạn EtOAc (36 g) được đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường (silica gel- Merck, đường kính cột 7 cm, chiều dài 80 cm); mẫu được đưa lên cột theo phương pháp tẩm mẫu trên silica gel; rửa giải bằng hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH với tỷ lệ MeOH tăng dần (30:1; 10:1 đến 5:1) Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng SKLM, gộp chung dịch rửa giải có thành phần tương tự

nhau, thu được 06 nhóm phân đoạn chính: PĐ1, PĐ2, PĐ3, PĐ4, PĐ5, PĐ6

Nhóm phân đoạn PĐ4 (3.8 g) đưa lên cột silica gel pha đảo RP18 (cột có

đường kính 2 cm, chiều dài 80 cm) sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O tỷ lệ MeOH tăng dần (1:2; 1:1 đến 2:1) Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng SKLM, gộp chung dịch rửa giải có thành phần tương tự nhau thu được 03 nhóm

phân đoạn chính PĐ 4.1, PĐ 4.2, PĐ 4.3

Nhóm phân đoạn PĐ 4.2 (0,258g) tiếp tục được phân tách bằng cột

sephadex ( sephadex LH20, cột đường kính 2 cm, chiều dài 80 cm) sử dụng

dung môi MeOH, thu được PĐ 4.2.1

Nhóm phân đoạn PĐ 4.2.1 (0,151g) tiếp tục được phân tách bằng cột

silica gel pha đảo RP18 (cột có đường kính 2 cm, chiều dài 80 cm) sử dụng

hệ dung môi MeOH/H2O (2:3) Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng SKLM, gộp chung dịch rửa giải có thành phần tương tự nhau, thu được 2 nhóm phân

đoạn PĐ 4.2.1.1, PĐ 4.2.1.2

Nhóm phân đoạn PĐ 4.2.1.1 (0,072g) tiếp tục được phân tách bằng cột

sephadex (sephadex LH20, cột đường kính 1 cm, chiều dài 70 cm) sử dụng

dung môi MeOH làm pha động thu được hợp chất DG3 (28 mg)

Nhóm phân đoạn PĐ 4.3 (0,26 g) được đưa lên cột silica gel pha đảo

(đường kính cột 2 cm, chiều dài 80 cm) sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (2:3) làm pha động Kiểm tra thành phần dịch rửa giải bằng SKLM, gộp chung

dịch rửa giải có thành phần tương tự nhau, thu được 2 phân đoạn chính PĐ

4.3.1, PĐ 4.3.2

Nhóm phân đoạn PĐ 4.3.1 (0,098 g) được đưa lên cột sephadex

(sephadex LH20, cột đường kính 1 cm, chiều dài 70 cm) sử dụng dung môi

MeOH làm pha động thu được hợp chất DG5 (30 mg)

Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn EtOAc được tóm tắt trong sơ

đồ Hình 3.1

Hình 3.1: Quy trình phân lập các chất từ phân đoạn EtOAc

Cao phân đoạn EtOAc

PĐ 4.2.1 0,151g

SKC Sephadex DM: MeOH

3.1.5 Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được

3.1.5.1 Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM

Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là Toluen - Ethyl acetat – Acid acetic – Acid fomic (5:2:2:1), vết chất được quan sát bằng đèn tử ngoại (ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm) và sử dụng thuốc thử hiện màu là hỗn hợp acid boric : acid oxalic (tỷ lệ 2/1) 10%/ nước, sấy trong khoảng 10 phút ở 105oC Quan sát ở bước sóng 365 nm và ánh sáng thường Kết quả thu được như Hình 3.2 và Hình 3.3

Ghi chú: A: Hình ảnh quan sát ở UV 254 nm trước khi phun thuốc thử

B: Hình ảnh quan sát ở UV 365 nm trước khi phun thuốc thử

C: Hình ảnh quan sát UV 365 nm sau khi phun thuốc thử

D: Hình ảnh quan sát ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử

Nhận xét:

Sắc ký đồ của hợp chất DG3 có Rf = 0,227

Sắc ký đồ của DG3 trước khi phun thuốc thử: quan sát ở UV 254 nm

thấy có 1 vết duy nhất, quan sát ở UV 365nm không quan sát thấy vết nào

Sắc ký đồ của DG3 sau khi phun thuốc thử: quan sát ở UV 365 thấy có

1 vết phát quang màu xanh sáng, quan sát ở ánh sáng thường vết có màu vàng

Có thể thấy rằng, chất DG3 phân lập được tương đối tinh sạch

Ghi chú: A1: Hình ảnh quan sát ở UV 254 nm trước khi phun thuốc thử

B1: Hình ảnh quan sát ở UV 365 nm trước khi phun thuốc thử

C1: Hình ảnh quan sát UV 365 nm sau khi phun thuốc thử

D1: Hình ảnh quan sát ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử