NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO OLIGOCHITOSANNANO BẠC VÀ THỬ NGHIỆM BẢO QUẢN BƯỞI DA XANH

Mục tiêu của nghiên cứu là chế tạo oligochitosan từ chitosan, khảo sát khả năng ổn định của hạt nano bạc trong oligochitosan, tăng hiệu lực cộng hưởng kháng vi sinh vật của oligochitosan

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

*****************

LÊ NGHIÊM ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN/NANO BẠC VÀ THỬ NGHIỆM

BẢO QUẢN BƯỞI DA XANH

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm và đồ uống

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO

OLIGOCHITOSAN/NANO BẠC VÀ THỬ NGHIỆM

BẢO QUẢN BƯỞI DA XANH

LÊ NGHIÊM ANH TUẤN

Hội đồng chấm luận văn:

1 Chủ tịch: PGS TS NGUYỄN VĂN KẾ

Đại học Nông Lâm TP.HCM

2 Thư ký: TS HỒ THỊ NGUYỆT THU

Đại học Nông Lâm TP.HCM

3 Phản biện 1: PGS TS NGUYỄN QUỐC HIẾN

Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ

4 Phản biện 2: TS NGUYỄN VŨ HỒNG HÀ

Đại học Quốc tế – ĐHQG TP.HCM

5 Ủy viên: TS BÙI DUY DU

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

Tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Bảo quản và chế biến nông sản thực phẩm

hệ chính quy tại Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh năm 2009

2 Tổng hợp Bạc nano/Chitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Co – 60

ứng dụng làm thuốc bảo vệ thực vật, Tạp chí Đại học Sài Gòn, T06, trang 155 – 161,

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Học viên

Lê Nghiêm Anh Tuấn

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được thực hiện tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn chính của TS Lại Thị Kim Dung và TS Phan Thế Đồng

Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Lại Thị Kim Dung và TS Phan Thế Đồng là người thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất, chỉ bảo, giúp đỡ tôi từng bước trong suốt quá trình thức hiện luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm, phòng Sau Đại học – Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu hoàn thành khoá học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng và các đồng nghiệp trong Trung tâm Sinh học và Vật liệu mới – Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ba Mẹ, những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn bên tôi, động viên tôi trong suốt quá trình học tập

TP.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2012

Học viên

Lê Nghiêm Anh Tuấn

TÓM TẮT

Đề tài "Nghiên cứu quy trình công nghệ chế tạo oligochitosan/nano bạc và

thử nghiệm bảo quản bưởi da xanh (Citrus maxima Burm Merr.cv Da Xanh)" được

tiến hành tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 10/2012 Mục tiêu của nghiên cứu là chế tạo oligochitosan từ chitosan, khảo sát khả năng ổn định của hạt nano bạc trong oligochitosan, tăng hiệu lực cộng hưởng kháng vi sinh vật của oligochitosan khi mang nano bạc và ứng dụng hoạt tính sinh học của OCTS/nAg trong bảo quản nông sản sau thu hoạch Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp bề mặt đáp ứng (response surface) hai yếu tố với sử dụng phần mềm thống kê JMP 4.0 và bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố có lặp lại

Đề tài đã nghiên cứu cắt mạch chitosan ở nhiệt độ phòng bằng phương pháp hóa học sử dụng 2 tác nhân là HCl và H2O2 Kết quả cho thấy khi sử dụng HCl ở nồng độ 18% và thời gian phản ứng là 7 giờ thì MW của OCTS nằm trong khoảng 50 – 80 kDa Còn khi sử dụng H2O2 ở nồng độ 6% và thời gian phản ứng là 10 giờ thì

MW của OCTS trong khoảng 50 – 70 kDa Trên thực tế, phương pháp cắt mạch chitosan bằng H2O2 có nhiều ưu điểm và lợi thế hơn HCl

Đề tài cũng đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ OCTS và hàm lượng nano bạc đến các tính chất đặc trưng của OCTS/nAg, ảnh hưởng của pH đến kích thước trung bình hạt nano bạc và độ ổn định của hạt nano bạc trong OCTS/nAg theo thời gian lưu giữ Kết quả đã tạo ra chế phẩm OCTS/nAg chứa OCTS 5% và nano bạc

50 ppm với khả năng ổn định sau 6 tháng lưu giữ ở pH = 6 – 7

Tiến hành thí nghiệm khảo sát in vitro hiệu lực của OCTS/nAg với hai loại nấm Phytophthora (gây bệnh thối quả) và Colletotrichum (gây bệnh thán thư) trên

cây ăn trái sau thu hoạch ở các độ pha loãng 25 lần (OCTS 0,2%/nAg 2 ppm), 16,7 lần (OCTS 0,3%/nAg 3 ppm), 12,5 lần (OCTS 0,4%/nAg 4 ppm), 10 lần (OCTS 0,5%/nAg 5 ppm) và 8,3 lần (OCTS 0,6%/nAg 6 ppm) của OCTS 5%/nAg 50 ppm Kết quả thu được: OCTS/nAg ở độ pha loãng 10 lần (OCTS 0,5%/nAg 5 ppm) và

độ pha loãng 8,3 lần (OCTS 0,6%/nAg 6 ppm) có hiệu lực tốt nhất Trên cơ sở đó các dung dịch OCTS/nAg có độ pha loãng 11,1 lần (OCTS 0,45%/nAg 4,5 ppm), 10 lần (OCTS 0,5%/nAg 5 ppm) và 9,1 lần (OCTS 0,55%/nAg 5,5 ppm) đã được sử dụng để bảo quản bưởi da xanh Kết quả phân tích cho thấy ở độ pha loãng 10 lần (OCTS 0,5%/nAg 5 ppm) chế phẩm có thể bảo quản bưởi da xanh trong thời gian 3 tháng và thời gian bảo quản dài hơn so với mẫu đối chứng và mẫu so sánh

Kết luận: OCTS có MW = 50 – 70 kDa được chế tạo bằng cách cắt mạch chitosan với tác nhân H2O2 và có thể sử dụng chế phẩm OCTS 0,5%/nAg 5 ppm để bảo quản bưởi da xanh trong thời gian 3 tháng

SUMMARY

The subject untitled "Research on processing technology of oligochitosan/nano silver and its application to preserve post-harvest Da Xanh

pomelo (Citrus maxima Burm Merr.cv Da Xanh)" was conducted from january to

october 2012 at the Institute of Applied Materials Science – Vietnam Academy of Science and Technology The objectives of this work are firstly to obtain oligo-chitosan from chitosan by chemical method and examine the stability of silver nanoparticles in oligochitosan matrix Secondly, to benefit the synergy antimicro-bial effects of oligochitosan and silver nanoparticles in the post-harvest preservation

of agricultural products The experiment was designed according to response surface method with two factors using statistical software JMP 4.0

The cleavage of chitosan chain to oligochitosan with low molecular weight (MW) was performed at room temperature by two chemical agents HCl and H2O2 The effects of agent concentration and reaction time were studied The results showed that: When the concentration of HCl was 18% and the reaction time was 7 hours, the MW of OCTS is between 50 – 80 kDa In case of H2O2 the MW of OCTS varied from 50 to 70 kDa when the concentration was 6% and the reaction time was

10 hours In fact, the cleavage of chitosan by H2O2 was more practical and has some convenient compared to HCl

The effects of OCTS concentration and nano silver content on the characteristics of OCTS/nAg, and then the effects of pH on the average size of silver nanoparticles and on the their stability in OCTS matrix were studied The OCTS/nAg can be produced by mixing OCTS 5% with the solution of 50 ppm of silver particles The product still stable after 6 months of storage at pH = 6 – 7

The antifungal properties of OCTS/nAg were studied using two species of

fungi Phytophthora (causes rot) and Colletotrichum (causing anthracnose) It has

been observed that the diluted solutions with OCTS 0,5%/nAg 5 ppm and OCTS 0,6% /nAg 6 ppm had the best effect Based on these results, the Da Xanh pomelo

was preserved with two diluted solutions of OCTS/nAg (OCTS 0,45%/nAg 4,5 ppm), (OCTS 0,55%/nAg 5,5 ppm) The results showed that the solution of OCTS 0,5%/nAg 5 ppm can prolong the shelf-life of Da Xanh pomelo 3 months compared

to the control

Conclusion: OCTS MW = 50 – 70 kDa is made by cleavage of chitosan with

H2O2 agent and may used OCTS 0,5%/nAg 5 ppm to preserve Da Xanh pomelo for

3 months

MỤC LỤC

TRANG

Trang tựa i

Trang Chuẩn Y ii

Lý Lịch Cá Nhân iii

Lời Cam đoan iv

Lời Cảm ơn v

Tóm tắt vi

Mục lục x

Danh sách các chữ viết tắt xiii

Danh sách các bảng xv

Danh sách các hình xvi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 TỔNG QUAN 3

1.1 Chitosan 3

1.1.1 Tính chất vật lý và hoá học của chitosan 3

1.1.2 Khả năng tạo màng của chitosan 5

1.1.3 Đặc tính ức chế vi sinh vật của chitosan 6

1.1.4 Quy trình sản xuất chitosan 8

1.2 Các phương pháp cắt mạch chitosan tạo thành OCTS 8

1.3 Kim loại bạc và vai trò của bạc 9

1.3.1 Cơ chế sát khuẩn của bạc và nano bạc 10

1.3.2 Ứng dụng bạc và nano bạc 11

1.4 Chế tạo keo nano bạc theo phương pháp chiếu xạ gamma Co – 60 12

1.5 Cơ chế ổn định hạt nano bạc của chitosan 13

1.6 Một số bệnh gây hư hỏng sau thu hoạch do nấm gây ra 15

1.6.1 Bệnh thán thư (do nấm Colletotrichum gloeosporioides) 15

1.6.2 Bệnh đốm đen (do nấm Guignaria sp) 15

1.6.3 Bệnh thối quả (do nấm Phytophthora, Diplodia natalensis) 15

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

1.7.1 Nghiên cứu trong nước 15

1.7.2 Nghiên cứu ngoài nước 17

2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nội dung nghiên cứu 20

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4 Vật liệu, hoá chất và trang thiết bị 25

2.4.1 Đối tượng nghiên cứu 25

2.4.2 Hóa chất thí nghiệm 25

2.4.3 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 26

2.5 Thực nghiệm 26

2.5.1 Thí nghiệm cắt mạch chitosan thành OCTS bằng phương pháp hóa học ở nhiệt độ phòng 26

2.5.1.1.Thí nghiệm cắt mạch chitosan bằng acid HCl 26

2.5.1.2 Thí nghiệm cắt mạch chitosan bằng H2O2 27

2.5.2 Thí nghiệm điều chế OCTS/nAg 28

2.5.2.1 Thí nghiệm khảo sát nồng độ OCTS và hàm lượng nano bạc 28

2.5.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến kích thước trung bình hạt nAg trong OCTS/nAg 30

2.5.2.3 Khảo sát độ ổn định kích thước trung bình hạt nAg trong OCTS/nAg theo thời gian 30

2.5.3 Thử invitro hiệu lực kháng nấm Phytophthora và nấm Colletotrichum của OCTS/nAg 30

2.5.3.1 Thử hoạt tính kháng nấm của OCTS/nAg dạng dung dịch bằng phương pháp khuếch tán thạch 30

2.5.3.2 Thử hoạt tính kháng nấm Phytophthora và nấm Colletotrichum của

OCTS/nAg dạng màng 31

2.5 Phân tích và xử lý số liệu 33

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nghiên cứu cắt mạch chitosan thành OCTS bằng phương pháp hóa học ở nhiệt độ phòng 34

3.1.1 Nghiên cứu cắt mạch chitosan thành OCTS sử dụng tác nhân HCl 34

3.1.2 Nghiên cứu cắt mạch chitosan thành OCTS sử dụng tác nhân H2O2 39

3.2 Quy trình điều chế nano bạc 44

3.3 Nghiên cứu điều chế OCTS/nAg 46

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ OCTS và hàm lượng nano bạc đến kích thước trung bình hạt nano bạc và độ nhớt của dung dịch 46

3.3.2 Ảnh hưởng của pH đến đến kích thước trung bình hạt nano bạc trong OCTS/nAg 53

3.3.3 Khảo sát sự ổn định của dung dịch OCTS/nAg theo thời gian 54

3.4 Quy trình công nghệ điều chế OCTS/nAg 56

3.5 Thử invitro hiệu lực kháng nấm Phytophthora và nấm Colletotrichum của OCTS/nAg 58

3.5.1 Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng dung dịch 58

3.5.1.1 Hiệu lực kháng nấm Phytophthora của OCTS/nAg dạng dung dịch 58

3.5.1.2 Hiệu lực kháng nấm Colletotrichum của OCTS/nAg dạng dung dịch 59

3.5.2 Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng màng 61

3.5.2.1 Hiệu lực kháng nấm Phytophthora của OCTS/nAg dạng màng 61

3.5.2.2 Hiệu lực kháng nấm Colletotrichum của OCTS/nAg dạng màng 62

3.6 Thử nghiệm bảo quản bưởi da xanh bằng OCTS/nAg 64

3.7 Tính toán giá thành sản phẩm và hiệu quả kinh tế 70

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72

PHỤ LỤC 78

dtb Kích thước trung bình của hạt nano bạc

GPC Gel Permeable Chromatography (Sắc ký thẩm thấu gel)

HHKL Hao hụt khối lượng

IC Inhibition Concentration (Nồng độ ức chế)

ICP – AES Inductively Coupled Plasma – Atomic Emission Spectroscopy

(Quang phổ phát xạ nguyên tử cảm ứng plasma)

IR Infrared (Phổ hồng ngoại)

STH Sau thu hoạch

MAP Modified Atmosphere Packaging (Đóng gói điều chỉnh khí)

MBC Minimum Bactericidal Concentration

(Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu) MEA Malt Extract Agar (Thạch chiết malt)

MIC Minimum Inhibition Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

MW Mocular Weight (Khối lượng phân tử)

TEM Transmission Electron Microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) Vit C Vitamin C

XRD X – ray Diffractomete (Nhiễu xạ tia X)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 1.1 Giá trị MIC và MBC ức chế E coli, S choleraesuis và S aureus (µg/ml)

7

Bảng 3.1 MW và DDA của OCTS phụ thuộc nồng độ HCl (CHCl) và tPƯ 34

Bảng 3.2 MW và DDA của chitosan theo nồng độ H2O2 và tPƯ 39

Bảng 3.3 dtb (nm) và độ nhớt [] phụ thuộc vào COCTS và CnAg 47

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH đến đến kích thước trung bình hạt nano bạc 53

Bảng 3.5 Độ ổn định của dung dịch OCTS/nAg theo thời gian lưu giữ 55

Bảng 3.6 Đường kính tản nấm (dT) Phytophthora và IC50 của OCTS/nAg dạng dung dịch 58

Bảng 3.7 Đường kính tản nấm (dT) Colletotrichum và IC50 của OCTS/nAg dạng dung dịch 59

Bảng 3.8 Đường kính kháng nấm (dK) Phytophthora và IC50 của OCTS/nAg dạng màng 61

Bảng 3.9 Đường kính kháng nấm (dK) Colletotrichum và IC50 của OCTS/nAg dạng màng 63

Bảng 3.10 Quan sát cảm quan và khuẩn ty nấm bưởi da xanh trong quá trình bảo quản 64

Bảng 3.11 HHKL, độ Brix và hàm lượng vitamin C (Vit C) của bưởi da xanh theo thời gian (t) bảo quản bằng OCTS/nAg 65

Bảng 3.12 Chi phí sản xuất 10 lít chế phẩm OCTS 5%/nAg 50 ppm 70

Bảng 3.13 So sánh hiệu quả kinh tế 70

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin và chitosan 3

Hình 1.2 Liên kết của chitin và chitosan với Ni 5

Hình 1.3 Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan 8

Hình 1.4 Cơ chế ổn định keo nano bạc bằng chitosan 14

Hình 2.1 Sơ đồ phổ kế ICP-AES 24

Hình 2.2 Sơ đồ cắt mạch chitosan tạo OCTS bằng HCl 27

Hình 2.3 Sơ đồ cắt mạch chitosan tạo OCTS bằng H2O2 28

Hình 2.4 Sơ đồ điều chế OCTS/nAg 29

Hình 2.5 Thước panme với độ chính xác 0,01 m 31

Hình 3.1 Phổ GPC của OCTS có Mw = 85 kDa (CHCl = 16%; tPƯ = 6 giờ) 35

Hình 3.2 Phổ GPC của OCTS có Mw = 45 kDa (CHCl = 16%; tPƯ = 8 giờ) 36

Hình 3.3 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện sự phụ thuộc MW, DDA của OCTS vào CHCl và tPƯ 36

Hình 3.4 Phổ IR của chitosan ban đầu 37

Hình 3.5 Phổ IR của OCTS sau phản ứng cắt mạch bằng HCl 37

Hình 3.6 Phổ XRD của chitosan ban đầu 38

Hình 3.7 Phổ XRD của OCTS sau phản ứng cắt mạch bằng HCl 38

Hình 3.8 Phổ GPC của OCTS có Mw = 66 kDa (Nồng độ H2O2 = 6%; tPƯ = 10 giờ) 40

Hình 3.9 Phổ GPC của OCTS có Mw = 57 kDa (Nồng độ H2O2 = 8%; tPƯ = 12 giờ) 41

Hình 3.10 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện sự ảnh hưởng của nồng độ H2O2 và tPƯ đến MW, DDA của OCTS 41

Hình 3.11 Phổ IR của chitosan ban đầu 42

Hình 3.12 Phổ IR của OCTS sau phản ứng cắt mạch bằng H2O2 42

Hình 3.13 Phổ XRD của chitosan ban đầu 43

Hình 3.14 Phổ XRD của OCTS sau phản ứng cắt mạch bằng H2O2 43

Hình 3.15 Phản ứng cắt mạch chitosan tạo thành OCTS 44

Hình 3.16 Sơ đồ điều chế nano bạc bằng phương pháp chiếu xạ 44

Hình 3.17 Keo nano bạc 45

Hình 3.18 Phổ XRD của keo nano bạc 45

Hình 3.19 Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nAg trong keo nano bạc 46

Hình 3.20 Đồ thị bề mặt đáp ứng thể hiện sự ảnh hưởng của COCTS và CnAg đến dtb và [] của OCTS/nAg 48

Hình 3.21 Phổ UV - vis của CTS, CTS/Ag+, OCTS/nAg 49

Hình 3.22 Phổ UV - vis của OCTS/nAg theo nồng độ khác nhau của OCTS 49

Hình 3.23 Sự biến đổi dtb của OCTS/nAg theo nồng độ OCTS khác nhau 50

Hình 3.24 Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong dung dịch OCTS/nAg (4 %/50 ppm) 51

Hình 3.25 Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong dung dịch OCTS/nAg (4,5%/50 ppm) 51

Hình 3.26 Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong dung dịch OCTS/nAg (5%/50 ppm) 51

Hình 3.27 Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc trong dung dịch OCTS/nAg (5,5%/50 ppm) 52

Hình 3.28 Phổ XRD của OCTS và OCTS/nAg (OCTS 5% và nAg 50 ppm) 52

Hình 3.29 Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc ở pH = 6 53

Hình 3.30 Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc ở pH = 7 54

Hình 3.31 dtb của nano bạc trong OCTS/nAg lưu giữ theo thời gian 55

Hình 3.32 Ảnh TEM và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc sau 6 tháng lưu giữ 56

Hình 3.33 Sơ đồ quy trình điều chế OCTS/nAg 57

Hình 3.34 Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng dung dịch theo độ pha loãng 60

Hình 3.35 Hiệu lực kháng nấm của OCTS/nAg dạng màng theo độ pha loãng 63 Hình 3.36 Đồ thị biểu diễn HHKL của bưởi theo thời gian bảo quản 68 Hình 3.37 Đồ thị biểu diễn độ Brix của bưởi theo thời gian bảo quản 68 Hình 3.38 Đồ thị biểu diễn hàm lượng Vit C của bưởi theo thời gian bảo quản 68 Hình 3.39 Bưởi sau thời gian 2 tháng bảo quản 69 Hình 3.40 Quy trình bảo quản bưởi bằng OCTS/nAg 69

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vùng Nam bộ có các loại cây ăn quả mang tính đặc trưng của vùng nhiệt đới

và có giá trị kinh tế cao và gắn liền với những chỉ dẫn địa lý như bưởi Da xanh, xoài cát Hòa Lộc, măng cụt Lái Thiêu, vú sữa Lò Rèn, thanh long Bình Thuận… đã được canh tác theo quy trình sản xuất hàng hóa, tuy nhiên do công nghệ bảo quản sau thu hoạch (STH) còn chưa được chú trọng nên tổn thất STH là khá lớn, cả về số lượng

và chất lượng dẫn đến hiệu quả kinh tế không cao

Hiện nay, ở Việt Nam chỉ có một số doanh nghiệp lớn và các siêu thị có phương tiện tồn trữ trái cây ở nhiệt độ thấp, còn đa số các vựa thu mua trái cây cũng như nông dân đều thu hoạch, vận chuyển và tồn trữ trái cây theo tập quán, chưa có quy trình bảo quản Việc thiếu đầu tư các công nghệ bảo quản nông sản STH cũng dẫn đến tính chất thời vụ, hơn nữa dẫn đến tình trạng ứ đọng và hư hỏng sản phẩm

Trong bối cảnh hòa nhập kinh tế với nhiều cơ hội và thách thức, xuất phát từ những yêu cầu ngày càng cao của thị trường trong nước, vấn đề vận chuyển và bảo quản trái cây STH đã được các nhà kinh doanh cũng như các nhà vườn đặc biệt quan tâm, điều này đòi hỏi các nhà khoa học đặt ra hướng nghiên cứu bảo quản trái cây STH Nhiều công trình nghiên cứu đã có kết quả bước đầu khả quan Khi hướng đến xuất khẩu thì việc áp dụng các công nghệ bảo quản STH để ổn định chất lượng

và kéo dài thời gian tồn trữ trong quá trình vận chuyển là một yêu cầu tất yếu Do

đó những công trình nghiên cứu bảo quản trái cây STH bằng các chế phẩm sinh học đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là rất cần thiết, có thể mang lại những đóng góp đáng kể trong việc nâng cao giá trị thương phẩm cho trái cây trên thị trường trong

và ngoài nước đem lại hiệu quả kinh tế cao

Trong thời gian gần đây, các loại trái cây với đầy đủ chủng loại từ nho, táo lê của Mỹ, Úc, Trung Quốc, chuối của Philippin, đến Sầu riêng, xoài Thái Lan… đang

được tiêu thụ trên thị trường Việt Nam Việc xây dựng thương hiệu trái cây để cạnh tranh là vấn đề hết sức cần thiết và cấp bách, nếu không trái cây Việt Nam sẽ mất chỗ đứng trên chính thị trường trong nước và càng không thể cạnh tranh tại thị trường ngoài nước

Chitosan là một loại hợp chất sinh học cao phân tử được chiết xuất từ vỏ tôm

và có đặc tính ưu việt hơn các loại hoá chất khác dùng trong bảo quản trái cây Màng chitosan chống thoát hơi nước, kháng vi sinh vật, thân thiện với môi trường

và con người Bạc đã được biết đến có tính năng kháng khuẩn mạnh, hạn chế và tiêu diệt sự phát triển của nấm mốc, khi bạc nguyên tử ở kích thước nano, hoạt tính sát khuẩn tăng lên khoảng 20 – 50 lần so với bạc ion (Bùi Duy Du, 2009) Điều này đã thu hút nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu ứng dụng nano bạc vào thực tiễn

Qua những thông tin liên quan, luận văn chọn thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ chế tạo oligochitosan/nano bạc (OCTS/nAg) và thử nghiệm bảo quản bưởi da xanh” với các mục tiêu:

1 Điều chế oligochitosan từ chitosan

2 Điều chế oligochitosan/nano bạc

3 Khảo sát khả năng cộng hưởng hiệu lực kháng nấm của oligochitosan khi mang hạt nano bạc

4 Ứng dụng hoạt tính sinh học của OCTS/nAg trong bảo quản bưởi da xanh

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

- Sử dụng OCTS/nAg được sản xuất từ vỏ tôm phế liệu (rẻ tiền, có sẵn), dễ phân huỷ sinh học

- OCTS/nAg có hiệu quả cao trong bảo quản nông sản và an toàn vệ sinh thực phẩm Thành công này còn góp phần rất lớn trong việc giải quyết tình trạng ô nhiễm môi trường do chất thải từ ngành chế biến thủy hải sản

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Chitosan

Chitin là polysaccharide mạch thẳng, được cấu tạo từ các đơn vị glucosamine, trong đó nhóm (– OH) ở C2 của các đơn vị glucose được thay thế bằng nhóm acetyl amino (– NHCOCH3) (Hình 1.1a), vậy chitin có thể gọi poly – (N – acetyl – 2 – amino – 2 – deoxi – β – D – glucopyranose) liên kết với nhau bởi các liên kết β – (1 – 4) glycoside Chitin là một polymer sinh học tự nhiên nhiều thứ hai

acetyl-sau cellulose (Marguerite Rinaudo, 2006)

Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin Chitosan được cấu tạo từ các đơn vị D-glucosamin liên kết với nhau bởi các liên kết -(1→4)-glicosid, do vậy chitosan có thể gọi là poly  – (1 – 4) – 2 – amino – 2 – deoxi – D – glucopyranose

hoặc là poly – (1 – 4) – D – glucosamin (Hình 1.1b)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin và chitosan

Trong lớp vỏ của một số loài giáp xác (tôm, cua, mực) thành phần chitin chiếm khoảng 20 – 30%, chitin còn hiện diện trong một số loài nấm mốc

1.1.1 Tính chất vật lý và hoá học của chitosan

Độ deacetyl của chitosan nằm trong khoảng 56% đến 99%, trung bình là 80%, tùy thuộc vào từng loại giáp sát và phương pháp sản xuất (No và Meyers,

1995; No và ctv, 2002) Để đánh giá độ deacetyl (DDA) người ta thường dùng phương pháp quang phổ IR và tính theo một trong các công thức sau:

Domszy and Roberts (1985), DDA = 100 – [(A1655 / A3450) x 100 / 1,33] (1) Sabnis and Block (1997), DDA = 97,67 – [26,486 x (A1655 / A3450)] (2) Baxter và ctv (1992), DDA= 100 – [(A1655 / A3450) x 115] (3) Rout (2001), DDA = 118,883 – [40,1647 x (A1655 / A3450)] (4) Trong các công thức trên: A1655 là cường độ hấp phụ tại đỉnh 1655

- Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm – OH, nhóm – NH2 trên các đơn vị D – glucosamin có nghĩa chúng vừa là alcohol vừa là amin, vừa là amide Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O –, N –, hoặc

O –, N

- Mặt khác chitosan là những polymer mà các monomer được nối với nhau bởi

các liên kết β – (1 – 4) – glycoside; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các tác nhân hoá học như: acid, base, tác nhân oxy – hóa và các enzyme

a) Các phản ứng của nhóm – OH

+ Dẫn xuất sulfate

+ Dẫn xuất O – acyl của chitin/chitosan

+ Dẫn xuất O – tosyl hoá chitin/chitosan

b) Phản ứng ở vị trí N

+ Phản ứng N – acetyl hoá chitosan

+ Dẫn xuất N – sulfate chitosan

+ Dẫn xuất N – glycochitosan (N – hydroxyl – ethylchitosan)

+ Dẫn xuất acroleylen chitossan

c) Phản ứng xảy ra tại vị trí O, N

+ Dẫn xuất O, N – cacboxymethylchitosan

+ Phản ứng cắt đứt liên kết β – (1 – 4) glycoside

d) Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại của chitosan

Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên

tử oxy và nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+,

Cd2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+ Ví dụ: phức Ni(II) với chitosan có cấu trúc tứ diện với số phối trí bằng 4 (Qi L và ctv, 2004)

Ni(II)chitin Ni(II)chitosan

Hình 1.2 Liên kết của chitin và chitosan với Ni

1.1.2 Khả năng tạo màng của chitosan

Chitosan có khả năng tạo màng sử dụng trong bảo quản thực phẩm như thịt,

cá tươi và rau quả nhằm hạn chế các tác nhân gây hư hỏng bằng phương pháp MAP

 Màng chitosan có thể điều chỉnh độ ẩm, thành phần khí quyển trong bao bì, giúp bảo quản rau quả tươi được lâu hơn và giữ chất lượng được tốt hơn Trong khi

đó đối với bao bì làm từ PE khả năng trao đổi hơi nước và không khí qua màng tương đối kém do vậy mức cung cấp oxy bị hạn chế đồng thời hơi nước bị ngưng đọng tạo môi trường thuận lợi cho nấm mốc phát triển (Romanazzi, 2009)

 Tính chất cơ học của màng chitosan tương đối tốt, màng dai, khó xé rách, độ bền tương đương với một số chất dẻo được dùng làm các loại bao bì truyền thống

 Bao gói rau quả bằng màng chitosan làm chậm quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polymer hóa của oquinon, ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho rau quả tươi hơn và ít bị thâm (Qi L và ctv, 2004)

1.1.3 Đặc tính ức chế vi sinh vật của chitosan

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan được nghiên cứu trong nhiều tài liệu (El Ghaouth A và ctv, 1992; Vishnu prasanna K.N, 2000; Qi L và ctv, 2004) Theo những nghiên cứu trước, hoạt tính kháng khuẩn của chitosan trong môi trường acid

là do sự proton hóa nhóm – NH2 tại vị trí C2 của D – glucosamine Chitosan mang điện dương sẽ tạo nối trên bề mặt tế bào vi khuẩn mang điện âm, phá vỡ màng bằng cách làm thoát những thành phần chứa bên trong hoặc bằng cách ức chế sự truyền dưỡng chất vào trong tế bào, nồng độ ức chế thấp nhất khoảng 0,03 – 0,25% Trong một nghiên cứu về tính kháng khuẩn của chitosan khi bổ sung chitosan vào môi trường nuôi cấy, tế bào vi khuẩn sẽ chuyển từ tích điện âm sang tích điện dương Quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang cho thấy chitosan không trực tiếp hoạt động

ức chế vi khuẩn E.coli mà là do sự kết tụ lại của các tế bào và sự tích điện dương ở

màng tế bào của vi khuẩn Chitosan N – carboxybutyl, một polycation tự nhiên, có thể tương tác và hình thành polyelectrolyte với polymer có tính acid trên bề mặt vi khuẩn, do đó làm dính kết một lượng vi khuẩn với nhau

Nhiều kết quả nghiên cứu gần đây chứng minh chitosan có khả năng ức chế

sự phát triển của vi sinh vật Đặc tính này của chitosan phụ thuộc vào MW và loại vi sinh vật, chitosan có Mw = 470 kDa ức chế vi khuẩn gram dương rất tốt, như

Lactbacillus sp, L monocytogenes, B megaterium, B cereus, S aureus, L brevis, L

khuẩn gram âm như E.coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella, Vibrio molyticus… với nồng độ chitosan 0,1% pH = 5,6 có khả năng kháng các loại nấm:

kDa đều kháng tốt vi khuẩn S.aureus và nấm candida Điều này thể hiện cơ chế

kháng khuẩn khác nhau ở chitosan có MW thấp và cao, kết quả cho thấy khả năng

này giảm khi khối lượng phân tử tăng Khả năng kháng VSV tăng cao ở pH thấp, và

giảm khi có mặt ion Ca2+, Mg2+

Wen – Li Du và ctv (2009) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của

những hạt nano chitosan tripolyphosphate mang nhiều kim loại khác nhau như Ag+,

Cu2+, Zn2+, Mn2+ và Fe2+ Những vi khuẩn được chọn để thử nghiệm là Escherichia

coli 25922, Salmonella choleraesuis ATCC 50020 và Staphylococcus aureus 25923

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được tiến

hành trong phòng thí nghiệm Kết quả được nêu trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Giá trị MIC và MBC ức chế E coli, S choleraesuis và S aureus (µg/ml)

(Wen – Li Du và ctv, 2009)

MIC MBC MIC MBC MIC MBC

Nano chitosan mang Fe2+ 121 195 121 195 146 195

Oligochitosan có diện tích tiếp xúc và điện tích dương lớn hơn chitosan nên

có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan, các nghiên cứu chế tạo

nano oligochitosan để tăng hoạt tính kháng khuẩn (Qi L và ctv, 2004)

1.1.4 Quy trình sản xuất chitosan

Chitosan được sản xuất theo phương pháp hóa học ở nhiệt độ phòng theo kết quả nghiên cứu của tác giả Lại Thị Kim Dung (2011) được trình bày ở Hình 1.3 Điểm nỗi bật của quy trình là không sử dụng nhiệt dẫn đến tiết kiệm chi phí năng lượng, góp phần bảo vệ môi trường, giá thành sản xuất thấp và chất lượng sản phẩm tốt do không bị tác động bởi nhiệt độ

Hình 1.3 Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan ở nhiệt độ phòng

1.2 Các phương pháp cắt mạch chitosan tạo thành OCTS

Độ dài của mạch polymer trong phân tử chitosan thể hiện tính chất lý hoá cũng như hoạt tính sinh học của chitosan Phản ứng cắt mạch chitosan là phản ứng

làm đứt liên kết β – (1 – 4) – glycoside cho sản phẩm là chitosan có khối lượng

phân tử trung bình (MW) thấp hơn so với MW của chitosan ban đầu

Các phương pháp cắt mạch chủ yếu:

Phương pháp sử dụng các loại acid mạnh: cắt mạch bằng acid hữu cơ và acid

vô cơ (Cabrera J C., 2005 và Nguyễn Thị Huệ, 2005) cho sản phẩm là chitosan có

MW thấp và giá trị DDA cao Tuy nhiên cắt mạch bằng acid vô cơ xảy ra nhanh và mãnh liệt hơn bằng acid hữu cơ, ví dụ như cắt mạch sử dụng HCl, ở nhiệt độ cao thì chitosan sẽ bị cắt mạch thu được OCTS

Vỏ tôm

Vỏ tôm đã khử protein Khử protein (DD NaOH 4%, t = 8 giờ

Khử khoáng (DD HCl 1%, t = 2 giờ) (HCl/KNO3 = 2/1)

Chitin

Đề acetyl (NaOH 40%, Khuấy trong 4 giờ, để yên trong 24 giờ)

Chitosan

Phương pháp cắt mạch bằng tác nhân oxi hoá: như NaBrO3, H2O2 và các peacid, NaNO2/H+ cho chitosan có MW thấp: ví dụ cắt mạch bằng H2O2 mẫu chitosan cho trương trong nước, điều chỉnh về pH = 9 bằng NaOH, đưa H2O2 với nồng độ từ 1 – 3% với xúc tác FeSO4.H2O, tỉ lệ chitosan/dung dịch = 1/15 (trọng lượng/thể tích) Sau khoảng thời gian oxy hóa, mẫu được rửa sạch bằng nước và sấy khô ở 600C (Xueqiong Yin và ctv, 2004)

Phương pháp bức xạ: thường dùng tia bức xạ (Co – 60), phản ứng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ thường và cho sản phẩm có độ tinh khiết cao Ví dụ: Dung dịch chitosan 5% (w/v) được cho vào túi PE chiếu xạ cắt mạch trên nguồn Co – 60 trong khoảng liều xạ từ 4 – 50 kGy (Nguyen Ngoc Duy và ctv, 2011)

Phương pháp sinh học (Issac S.N, 1994): dùng các enzyme như chitosanase,

papain, protease…để làm đứt liên kết β – (1 – 4) – glycoside, phản ứng cắt mạch

được thực hiên ở điều kiện thí nghiệm nghiêm ngặt và xảy ra khá chọn lọc Enzyme

phân cắt chitosan chủ yếu là enzyme chitosanase thuộc nhóm Hydrolase, hiện diện

ở nhiều loại vi sinh vật như xạ khuẩn (streptomyces N174), nấm (penicilium islandicum), vi khuẩn (Bacillus circulans MH – K1) và ở một số loài thực vật và

hầu hết là enzyme ngoại bào

1.3 Kim loại bạc và vai trò của bạc

Sử dụng bạc để ngăn ngừa nhiễm khuẩn đã biết từ thời Hy Lạp và La Mã cổ đại, Hippocrates, ông tổ của ngành y học hiện đại, đã viết rằng bạc có tính chất ngăn ngừa và chống lại một số loại bệnh, người Phoenician cổ xưa đã biết dùng những bình bằng bạc để chứa nước, rượu và dấm nhằm bảo quản chúng lâu hỏng Thời trung cổ, bạc đã được dùng để khử trùng nước và thức ăn lưu trữ, điều trị phỏng và vết thương Đầu những năm 1900, người ta thường cho đồng tiền bạc vào trong bình sữa để giữ cho sữa tươi lâu (lúc đó tủ lạnh chưa được phổ biến), thủy thủ tàu

- CH2OH - CH2OH

- CH2OH - CH2OH Chitosan - OH Oligochitosan - OH (5)

HCl

T0 cao

viễn dương cũng cho tiền bạc vào thùng nước và rượu để bảo quản đồ uống Năm

1920, dung dịch muối bạc được FDA (Food and Drug Administration của Hoa Kỳ) chấp thuận cho sử dụng làm chất kháng khuẩn

1.3.1 Cơ chế sát khuẩn của bạc và nano bạc

Mặc dù có nhiều giả thuyết khác nhau nhưng cơ chế chính xác về tính sát khuẩn của bạc vẫn chưa được hiểu rõ Một trong số đó là thuyết “oligodynamic

effect” phát hiện năm 1893 bởi Swiss KW Nägeli, thuyết này cho rằng tính kháng

khuẩn của bạc bắt nguồn từ hóa tính của của ion bạc Ag+ (muối bạc) hoặc bạc bị oxid hóa thành Ag+, Ion Ag+ tạo liên kết mạnh với những hợp chất (là thức ăn của

vi khuẩn) mà vi khuẩn sử dụng trong quá trình chuyển hóa sinh năng lượng cho chúng, những hợp chất này thường có chứa lưu huỳnh, nitrogen và oxygen vì vậy vi khuẩn không thực hiện được chuyển hóa năng lượng cần thiết, chúng trở nên bất hoạt và dần dần sẽ chết Những vi khuẩn thuộc gram âm và dương đều bị ảnh hưởng bởi cơ chế này

Bạc làm mất hoạt tính của enzyme bằng cách phản ứng với nhóm thiol (SH) tạo thành bạc sulfide, bạc cũng phản ứng với các nhóm amino-, carboxyl-, phosphate-, imidazole của enzyme và làm suy giảm hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase và glutathione peroxidase

Một hướng giải thích khác: (1) các phân tử nano bạc bám chặt trên bề mặt làm biến đổi đặc tính của màng tế bào làm suy biến phân tử lipopolysaccharide, tích lũy bên trong màng tế bào, nguyên nhân làm tăng tính thấm của màng (2) Nano bạc đâm thủng vào trong tế bào vi khuẩn, kết quả làm tổn thương DNA (3) Đặc tính hóa lý có vai trò rất quan trọng trong tính kháng VSV của nano bạc, phân tử nhỏ

hơn 10 nm thì gây độc với E.coli, P aeruginosa

Tóm lại tính kháng khuẩn của nano bạc được giải thích theo một số cơ chế sau:

 Với tính chất xúc tác, nano bạc vô hiệu hoá các enzyme mà vi khuẩn và nấm cần cho quá trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến rối loạn quá trình biến dưỡng của

vi khuẩn Tác động này làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt nhanh chóng

 Hạt nano bạc liên kết với các nhóm chứa phospho trong phân tử DNA làm rối loạn quá trình sao chép DNA làm chết vi khuẩn

 Các hạt bạc nano tương tác với nhóm – SH của các protein, enzyme trên màng

tế bào dẫn đến sự thay đổi hình thái và gia tăng tính thấm của màng Sự vận chuyển vật chất qua màng tăng làm vỡ màng tế bào của vi khuẩn

 Nano bạc giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong nước hoặc không khí tương tác với các lipid màng làm tổn thương màng tế bào

Nhờ có kích thước rất nhỏ (0,1 nm – 100 nm), diện tích bề mặt của nano bạc rất lớn và hiệu quả hoạt động của nano bạc tăng đáng kể so với hạt bạc có kích thước lớn hơn (micro) Đây là ưu điểm của hạt nano bạc so với hạt bạc có kích thước lớn hơn và với bạc ion Theo tính toán lý thuyết nano bạc có hoạt tính mạnh hơn ít nhất 20 ngàn lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung dịch keo bạc thông thường Vì vậy, người ta có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả tương đương Điều này rất có ý nghĩa vì theo EPA (Environmental Protection Agency), một người chỉ có thể dùng tối đa 350 µg/liều/ngày, nếu nhiều hơn sẽ bị hiện tượng Argyria hay còn gọi là trúng độc bạc Nếu dùng 1 – 2 muỗng cà phê/ngày (20 ppm) tương đương 100 – 200 µg/ngày (thấp hơn so với khuyến cáo của EPA về hàm lượng bạc trong nguồn nước cung cấp ở Mỹ) Điều này đảm bảo cho người dùng có thể sử dụng nano bạc mà không bị hiện tượng Argyria

kỷ 90 được thay thế bằng kem silver sulfadiazine (SSD Cream) Hiện nay, gạc phủ bạc hoạt hóa (silver – coated dressing) được dùng kèm với kem SSD chúng có tác dụng giảm đau, thuốc sát trùng Hihi (Công ty dược Quang Minh) Gần đây, bạc được đặc biệt quan tâm vì có phổ sát khuẩn rộng, khi nó được sử dụng chung với

alginate, một loại polymer sinh học tự nhiên chiết xuất từ rong biển, bạc alginate được điều chế nhằm ngăn ngừa việc nhiễm khuẩn trong quá trình điều trị vết thương, đặc biệt là đối với bệnh nhân bỏng Rất nhiều dạng dung dịch hay dạng keo có chứa bạc được thương mại hóa để điều trị nhiều loại bệnh khác nhau

Thực phẩm:

Hiện nay trên thị trường đã có sản phẩm thương mại chứa nano bạc với vai trò chính là sát khuẩn được ứng dụng như nước rửa rau quả Microdyn và thậm chí bạc còn có mặt trong tủ lạnh sát khuẩn của Samsung, Daewoo Bạc còn được xem như là một chất phụ gia thực phẩm thuộc nhóm màu trang trí với mã số E174

Lĩnh vực khác:

Nano bạc còn được ứng dụng làm nước tẩy trùng bề mặt (ASAP), nước khử mùi hôi cơ thể (Shiseido), quần áo chống khuẩn tự làm sạch, bình sữa kháng khuẩn của hãng Mummy (Hàn quốc)…

1.4 Chế tạo keo nano bạc theo phương pháp chiếu xạ gamma Co-60

Khi chiếu xạ dung dịch muối AgNO3 thì quá trình khử ion kim loại thành nguyên tử kim loại sẽ diễn ra bởi các sản phẩm phân ly bức xạ của nước có khả năng phản ứng cao, đặc biệt là electron solvat hoá (e-aq) và gốc tự do H, OH Phản ứng phân ly bức xạ nước được tóm tắt như sau:

H2O ^^^ e-aq, H, OH, H2O2, H2, H3O+ (6)

Trong đó: e-aq có hiệu suất phân ly bức xạ G (e-aq) = 0,28 mol/J, thế oxi khử E0(H2O/e-aq) = - 2,78 V và gốc tự do H có G(H) = 0,06 mol/J, E0(H+/ H) =- 2,3V là hai tác nhân chính khử ion kim loại thành nguyên tử kim loại, E0(Ag+/Ag0)

hóa-= - 1,8V (Bùi Duy Du, 2009) Khi chiếu xạ dung dịch muối bạc phản ứng xảy ra như sau:

tự do OH thường là các alcol như iso – propanol, ethanol, methanol được bổ sung vào dung dịch trước khi chiếu xạ

R2CHOH (RCH2OH) + OH (H)  R2CO (RCHOH) + H2O (H2) (11) Gốc tự do của các ancol có thế oxi hóa – khử (E0) trong khoảng - 2,1 đến - 1,8 V tuỳ thuộc vào dạng phối tử, tiếp tục khử bạc ion ở dạng cụm liên kết có thế oxi hóa-khử cao hơn E0(Ag+n/Ag0n) ~ 0,8 V góp phần phát triển kích thước và hình thành hạt nano bạc

R2CO (RCHOH) + Ag+n  Ag0

n + R2CO (RCOH) + H+ (12) Khi nồng độ chất bắt gốc tự do thích hợp (đủ lớn) phản ứng chỉ xảy ra một chiều tạo Ago

Nếu nồng độ chất bắt gốc tự do OH nhỏ còn xảy ra quá trình:

Ago + OH  OH- + Ag+ (13)

Khi nồng độ chất bắt gốc tự do nhỏ còn xảy ra hiện tượng khâu mạch hoặc cắt mạch các polymer là chất ổn định nano bạc

Bạc ion khi bị khử bởi bức xạ sẽ tạo các hạt nguyên tử, các hạt này phát triển

và có xu hướng kết tụ hình thành dạng cụm chứa nhiều nguyên tử và cuối cùng là giai đoạn phát triển kích thước tạo hạt bạc Để hạn chế sự kết tụ tạo thành hạt lớn, các polymer với vai trò là chất ổn định được bổ sung đồng thời vào dung dịch muối bạc Các chất ổn định có các nhóm chức ái lực cao với bạc ion như – NH2, – COOH, – OH và phải dễ hòa tan trong nước, không hoặc không đáng kể phản ứng khử bạc ion trước khi chiếu xạ Chitosan tan trong nước được sử dụng làm chất ổn định nano bạc chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ (Phu D.V và ctv, 2010)

1.5 Cơ chế ổn định hạt nano bạc của chitosan

Phân tử chitosan chứa các nhóm chức như – OH vị trí C3 và C6, và – NH2 vị trí C2 rất linh động và ái lực cao với ion kim loại nên thích hợp sử dụng làm chất ổn định chế tạo kim loại nano Gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chitosan vừa làm chất khử vừa là chất ổn định để chế tạo nano bạc theo phương pháp thủy nhiệt Kết quả nhận được là đã nghiên cứu chế tạo keo nano bạc có kích thước trung bình hạt bạc nhỏ hơn 10 nm, ổn định tốt trong khoảng pH rộng bằng phương pháp chiếu xạ Co – 60, sử dụng chitosan với vai trò vừa làm chất ổn định

vừa là chất bắt gốc tự do (Chen và ctv, 2007 và Long và ctv, 2007) Hiệu ứng ổn định keo nano bạc và khả năng bắt gốc tự do OH của chitosan được trình bày tóm tắt như sau: trong dung dịch lỏng Ag+ tạo phức với chitosan thông qua liên kết với nhóm amin (NH2Ag+), khi chiếu xạ, tác nhân e-aq và H sẽ khử Ag+ thành Ag0, sau

đó Ag0 hấp thụ Ag+ tạo thành Ag2+, quá trình tiếp diễn tạo Agn+ và tạo hạt nano bạc

ổn định trên cấu trúc mạng chitosan Do cấu trúc mạng cồng kềnh và lớp chitosan bao phủ, trên bề mặt hạt bạc tích điện dương (– NH3+) nên gây ra lực đẩy tĩnh điện

và hiệu ứng ức chế không gian làm hạn chế sự kết tụ của các hạt bạc (Chen và ctv, 2007) Ngoài ra chitosan còn thể hiện là chất bắt gốc tự do OH tạo thành gốc tự do chitosan có khả năng khử bạc ion dạng cụm liên kết, góp phần quan trọng cho quá trình phát triển hình thành hạt nano bạc Theo Chen và ctv (2007), tiến trình khử bạc ion, phản ứng bắt gốc tự do OH và khử ion bạc bằng liên kết tạo nano bạc như sau:

Hình 1.4 Cơ chế ổn định keo nano bạc bằng chitosan

Theo đánh giá của Temgire và Joshi (2004) thì phản ứng bắt gốc tự do của alcohol bậc 1, bậc 2 sẽ sinh ra một lượng nhất định aldehyde hoặc ketone, nhưng alcohol bậc 3 hoặc alcohol mạch nhánh thì không bị oxi hóa thành ketone Kết quả

nghiên cứu của Choi (2002) và Panacek (2006) về tính kháng vi khuẩn S aureus và

E coli của nano bạc cho thấy, hoạt tính sát khuẩn của nano bạc ngoài sự phụ thuộc

vào kích thước trung bình hạt, loại vi sinh vật còn tuỳ thuộc vào chất ổn định keo

nano bạc

1.6 Một số bệnh gây hư hỏng sau thu hoạch do nấm gây ra

1.6.1 Bệnh thán thư (do nấm Colletotrichum gloeosporioides)

Là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất trên cây ăn trái Bệnh do nấm

Colletotrichum gloeosporioides gây ra Trên quả, bệnh tấn công làm trái bị thối đen

Trên quả lúc đầu chỉ xuất hiện các chấm nâu nhỏ, sau đó phát triển thành các đốm thối đen, lõm trên mặt vỏ quả, làm quả thối khi bảo quản Nhiệt độ và ẩm độ là hai trong những yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến diễn biến của bệnh thán thư, ở ẩm độ cao (trên 80%), trời ấm (nhiệt độ 25 – 260C) nấm bệnh phát triển mạnh

1.6.2 Bệnh đốm đen (do nấm Guignaria sp)

Bệnh do nấm Guignaria sp gây ra, tổn hại trên vỏ quả, làm cho vỏ quả vàng

nhanh, hạn chế chất lượng Nguồn lây lan chủ yếu của bệnh là ở thân, cành Khi gặp điều kiện thuận lợi (nhiệt độ, độ ẩm cao) các bào tử nấm sẽ phát tán, xâm nhập, nẩy mầm, bám vào vỏ quả thông qua các khí khổng hoặc các túi tinh dầu trên vỏ quả để gây hại ngay từ khi quả còn non có đường kính khoảng 2 – 3 cm

1.6.3 Bệnh thối quả (do nấm Phytophthora, Diplodia natalensis)

Bệnh hại quả xảy ra trong quá trình bảo quản và vận chuyển làm thối phần thịt quả ở vị trí gần cuống hoặc những vị trí có vỏ bị trầy xướt hay bầm dập Trái cây sau thu hoạch không có cuống cũng rất dễ bị bệnh xâm nhập và lây lan sau 2 –

3 ngày bảo quản

1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.7.1 Nghiên cứu trong nước

Hiện nay, chitosan được áp dụng trong việc bảo quản cho các loại trái cây như nhãn, cà chua, chuối, cam, quít, Màng zein và chitosan ứng dụng trong bảo quản trứng và một số loại trái cây có giá trị kinh tế ở đồng bằng sông Cửu Long (Nguyễn Văn Mười, 2009) Kết quả thí nghiệm thăm dò cho thấy màng chitosan 1% mang lại hiệu quả bảo quản cam và trong một mức độ nào đó đối với xoài (sau khi thu hoạch được xử lý bằng dung dịch Na2CO3 1% kết hợp dung dịch benzoat natri 1%, sau đó tiến hành bao màng chitosan 1%, cho vào bao bì xốp và bảo quản ở nhiệt độ 6 – 8oC thì giữ được chất lượng và giá trị cảm quan đến ngày thứ 71) Chitosan có độ deacetyl 75% DDA sử dụng bảo quan na tốt hơn chitosan có độ

deacetyl cao (86%; 94% DDA) Quả na được xử lý bằng dung dịch chitosan 1% có

độ deacetyl 75% DDA kết hợp với bao gói màng film PE độ dày 0,04 mm, bảo quản

ở 100C làm chậm quá trình chín, giảm cường độ hô hấp và có thể kéo dài thời gian bảo quản đến 12 ngày mà vẫn duy trì được giá trị cảm quan và dinh dưỡng (Nguyễn Thị Hằng Phương và ctv, 2008)

Bùi Văn Miên và Nguyễn Anh Trinh (2003) đã nghiên cứu tạo màng vỏ bọc chitosan từ vỏ tôm và ứng dụng bảo quản thủy sản Dùng dung dịch chitosan 2% trong dung dịch acid acetic 1,5% để bảo quản thủy sản, tùy theo độ ẩm của cá và mực mà sản phẩm có thời gian bảo quản khác nhau, độ ẩm càng thấp thời gian bảo quản càng dài, với độ ẩm 26 – 30%, cá khô bảo quản được 83 ngày, mực khô giữ được 85 ngày còn ở độ ẩm 41 – 45% thì cá khô giữ được 17 ngày, mực khô được 19 ngày

Oligochitosan có cấu tạo từ 3 đến 30 gốc glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – glycoside có tính chất kháng khuẩn rộng, khi cắt mạch chitosan bằng các phương pháp: bức xạ, thủy phân bằng enzyme, tác nhân oxy hóa H2O2  – Oligochitosan được tạo ra bằng phương pháp oxy hóa sử dụng tác nhân H2O2 (OC – 90[ox]) có khối lượng phân tử thấp nhất (MW = 9.380 Da) có hiệu ứng kháng vi sinh vật hiệu quả ở nồng độ 1%; 1,5% (Văn Thị Thu Tâm và ctv, 2009) Năm 2009, PGS.TS Lê Văn Hòa, Trường Đại học Cần Thơ và các cộng sự tiến hành nghiên cứu quy trình bảo quản trái quýt đường bằng cách bao màng chitosan ở nồng độ 0,25% kết hợp với bao Polyethylene (PE) đục 5 lỗ với đường kính mỗi lỗ 1 mm và ghép mí lại bằng máy ép, bảo quản ở nhiệt độ 120C, thời gian bảo quản đến 8 tuần vẫn giữ được hàm lượng đường, hàm lượng vitamin C luôn ổn định, tỷ lệ hao hụt khối lượng thấp, màu sắc vỏ trái đồng đều và đẹp

Nguyễn Duy Lâm (2010, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch), thử nghiệm mô hình sử dụng dung dịch tạo màng chitosan dùng trong bảo quản bưởi và chuối tại Hợp tác xã bưởi Năm Roi Mỹ Hòa (huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long (bưởi Năm Roi sau thời gian thu hoạch 1 tháng và chuối sau khi thu hoạch 2 tuần vẫn giữ được màu sắc tươi xanh, giữ được chất lượng tốt ở điều kiện

môi trường bình thường) Dung dịch tạo màng là một dịch lỏng dạng nhũ tương được phun xịt bao quanh bề mặt rau quả, khi dịch lỏng khô đi tạo ra một lớp màng mỏng trong suốt trên bề mặt rau quả Lớp màng mỏng này sẽ làm giảm khả năng trao đổi khí, từ đó làm chậm quá trình chín hoặc lão hóa của sản phẩm Dung dịch sinh học chitosan còn được ứng dụng để bảo quản chuối được tạo ra bằng cách hòa

tan 1 g chitosan trong acid acetic 1% có thể ức chế nấm mốc Aspergillus niger, vi khuẩn gram âm (Pseudomonas aeruginosa) và vi khuẩn gram dương (Staphylo- coccus aureus), kéo dài thời gian bảo quản của chuối gấp 3 lần so với các mẫu đối

chứng (Phạm Võ Minh Thiện, 2010)

1.7.2 Nghiên cứu ngoài nước

Chitosan dùng làm màng bao bảo quản quả dâu tây và quả mâm xôi (10 và

15 mg/ml) đã ức chế được mốc xanh và Rhizopus rot, hơn thế nữa khả năng kháng

nấm của chitosan tương đương với hóa chất tổng hợp như ipriodione và thiabendazole (TBZ) (El Ghaouth và ctv., 1992; Zhang và Quantick, 1998) Đối với

nấm S.Sclerotiorum chitosan ở nồng độ 2% và 4% có khả năng ức chế nấm tốt hơn

iprodione và TBZ (Luna và ctv., 2001), Trong một báo cáo khác của El Ghaouth và ctv., (1997), tiến hành bảo quản quả ớt chuông bằng chitosan nồng độ 10 mg/ml kéo dài thời gian bảo quản lên đến 7 ngày Chitosan ở nồng độ 1% và 2% đã ức chế sự

phát triển của nấm P.expansum trong suốt quá trình bảo quản táo (de Capdeville và

ctv, 2002) Nếu kết hợp chitosan (0,1%, 0,5% và 1,0%) với hypobaric (0,50 và 0,25 atm) để bảo quản quả anh đào, kết quả sẽ tốt hơn nếu chỉ dùng chitosan (Romanazzi

và ctv, 2003)

Tác giả Xiao – Fang Li và ctv (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của trọng

lượng phân tử và độ deacetyl của chitosan lên khả năng kháng nấm Aspergillus

100 ± 1,58 % Sử dụng màng bao chitosan ở nồng độ 2 g/l bảo quản táo cắt tươi ở

250C thì thời gian lên đến 10 ngày (Odilio Benedito Garrido Assis, 2008) Ở nồng

độ này chitosan ức chế tốt sự phát triển của 2 loại nấm gây hư hỏng chủ yếu trên táo

cắt tươi là Penicillium sp và Alternaria sp

Nadeem Akhtar và ctv (2009) nghiên cứu ảnh hưởng của lớp màng bao chitosan được chiếu xạ (CHIirr, Mv = 5,14 × 104) và không được chiếu xạ (CHIun,

Mv = 2,61 × 105) trong quá trình bảo quản trái xoài sau thu hoạch (Mangifera indica L.) cho thấy ở liều chiếu xạ 200 kGy xoài có thể bảo quản trong 4 tuần ở

nhiệt độ 150C và độ ẩm 85% Kết quả khẳng định lớp màng bao chitosan chiếu xạ

có một tiềm năng tuyệt vời để sử dụng bảo quản sản phẩm tươi duy trì chất lượng

và kéo dài thời hạn sử dụng Tác giả Natarajan Velmurugan và ctv (2009) cho rằng màng chitosan chứa nano bạc ở các nồng độ khác nhau: 10 ppm, 50 ppm và 100 ppm (kích thước trung bình hạt nano nằm trong khoảng 100 – 200 nm) đều ức chế

tốt các loại nấm: Ophiostoma flexuosum, Ophiostoma tetropii, Ophiostoma cum, và Ophiostoma, nhưng ở nồng độ nano bạc 100 ppm, màng chitosan ứng chế 100% nấm Ophiostoma flexuosum và có khả năng ức chế cao với 3 loại nấm còn lại được khảo sát bằng phương pháp khuếch tán thạch trên môi trường MEA agar

poloni-Theo tác giả Honary S và ctv (2011), kích thước trung bình hạt nano bạc bị ảnh hưởng bởi MW của chitosan Nhóm tác giả nghiên cứu với 3 Mw của chitosan gồm: LMw = 100 kDa, MMw = 400 kDa và HMw = 600 kDa, kết quả cho thấy kích thước trung bình hạt nano bạc giảm theo thứ tự sau: MMw, LMw và HMw Sự khác biệt về kích thước trung bình hạt nano bạc thể hiện khác biệt khá rõ giữa nhóm

HMw(dtb = 24 – 31 nm), LMw (dtb = 50 – 70 nm) và nhóm MMw (76 – 97 nm) Jiashen An và ctv (2008) dùng màng bao chứa nano bạc (15 – 25 nm) bảo quản Green asparagus (loại rau có giá trị kinh tế cao) ở nhiệt độ từ 1 – 30C thì kéo dài được 14 – 15 ngày với mà độ hao hụt trọng lượng, hàm lượng acid ascorbic, thay đổi màu sắc không đáng kể so với ban đầu trong khi ở điều kiện thường thời gian khoảng 3 – 5 ngày Tác giả Xinlin Li và ctv (2011) đã tiến hành nghiên cứu quá trình bảo quản dưa leo biển (sea cucumber) bằng màng bao chứa nano bạc kết hợp với sấy lạnh bằng sóng microwave, kết quả cho thấy ở nồng độ nano bạc 0,3 mg/l

đã kiểm soát được 99 % vi khuẩn Bacillus subtilis

Các tài liệu nghiên cứu đều cho thấy chitosan là hoạt chất sinh học tự nhiên không độc, dễ phân hủy, thân thiện với môi trường, có hoạt tính kháng vi sinh vật

cao, có khả năng tạo màng và đặc tính thấm của màng chitosan là ưu điểm để ứng dụng trong nghiên cứu bảo quản nông sản Với những ưu điểm quý giá như trên nhưng chitosan lại không hòa tan trong nước mà chỉ hòa tan trong môi trường có tính acid vì vậy việc ứng dụng chitosan bị hạn chế Để khắc phục nhược điểm trên của chitosan thường sử dụng phương pháp đơn giản là cắt mạch chitosan tạo thành các oligochitosan có khả năng tan trong nước nhưng hoạt tính kháng vi sinh vật không giảm mà còn tăng lên Tuy nhiên, nếu Mw của chitosan < 50 kDa thì độ nhớt dung dịch chitosan cũng thấp dẫn đến khả năng ổn định hạt nano bạc không tốt gây

ra hiện tượng keo tụ hạt nano bạc (Bùi Duy Du, 2009) và ảnh hưởng đến quá trình tạo màng chitosan nên không phát huy tối đa tính chất của nó OCTS/nAg tạo ra một công nghệ bảo quản nông sản thực phẩm hoàn toàn mới khi kết hợp những ưu điểm của oligochitosan với nano bạc Nano bạc có tính ưu việt trong ức chế, kháng

vi sinh vật phổ rộng, không gây độc với người và động vật Ở Việt Nam chưa có tiêu chuẩn nào quy định hàm lượng bạc trong thực phẩm, nước sinh hoạt và cả nước thải sinh hoạt (Quyết định số 46/2007/QĐ – BYT – Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm; TCVN 5502 : 2003 – Nước cấp sinh hoạt, yêu cầu chất lượng; TCVN 6772 : 2000 – Chất lượng nước, nước thải sinh hoạt giới hạn ô nhiễm cho phép; Thông tư số: 25/2011/TT – BYT – Ban hành danh mục hoá chất, chế phẩm diệt côn trùng, diệt khuẩn dùng trong lĩnh vực gia dụng và

y tế được phép đăng ký để sử dụng, được phép đăng ký nhưng hạn chế sử dụng và cấm sử dụng tại Việt Nam)

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

 Cắt mạch chitosan tạo thành OCTS bằng phương pháp hóa học với MwOCTS = 50 – 70 kDa

 Điều chế tạo keo nano bạc

 Pha chế OCTS mang nano bạc và khảo sát khả năng ổn định của nano bạc trong OCTS

 Thử invitro hoạt tính kháng nấm: Phytophthora, Colletotrichum

 Thử nghiệm bảo quản bưởi da xanh sau thu hoạch bằng OCTS/nAg

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài đã được thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 10/2012 tại Trung tâm Sinh học và Vật liệu mới - Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và trường Đại học Nông Lâm TP.HCM

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp hóa học:

Cắt mạch chitosan bằng acid HCl và H2O2 tạo oligochitosan

Phương pháp đo phổ sắc ký thẩm thấu gel (GPC) xác định MW của OCTS:

Hỗn hợp được tách theo kích thước phân tử các chất phân bố khác nhau trong các lỗ xốp của pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ chui sâu bên trong lỗ xốp được rửa giải ra sau và ngược lại Thời gian lưu của polymer có MW trung bình khác nhau sẽ khác nhau, so sánh với thời gian lưu của mẫu chuẩn ta có thể xác định được các MW polymer theo thời gian lưu đó với các phân đoạn tương ứng, polymer

có MW càng lớn thời gian lưu càng ngắn và ngược lại Sử dụng dung dịch rửa giải đệm 0,25 M CH3COONa/0,25 M CH3COOH và chất chuẩn là Pullulan

Tiến hành: hòa tan OCTS trong nước với nồng độ 0,3% cho đến khi tan hoàn

toàn, thêm muối 0,25 M CH3COONa/0,25 M CH3COOH, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 m Tiêm mẫu dung dịch OCTS với thể tích khoảng 50 μl vào cột sắc ký Mẫu chuẩn pullulan được đo trong điều kiện tương tự Xác định thời gian lưu và so sánh với đường chuẩn để xác định MW của mẫu OCTS cần đo

Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) xác định độ deacetyl của OCTS:

Độ deacetyl hóa của chitosan là một đặc tính quan trọng của chitosan, ảnh hưởng rất nhiều đến các tính chất của chitosan, có rất nhiều phương pháp xác định

độ deacetyl hóa như phương pháp Ninhydrin, phương pháp hồng ngoại, phổ NMR, quang phổ UV… Đề tài được sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại để xác định độ deacetyl hóa của chitosan Bột chitosan và KBr được trộn, nghiền thật kỹ trong cối,

để hỗn hợp đồng nhất và nén thành đĩa tiến hành đo trên máy IR

Độ đề axetyl (DDA%) của chitosan được xác định theo công thức của Domszy and Roberts (1985):

DA (%) = (A1655 / A3450)*(100 / 1,33) (16) Trong đó: DA: độ acetyl (degree of acetylation)

A: là cường độ hấp thụ tại đỉnh 1655 và 3450 trên phổ IR

DDA (%) = 100 – DA (17) Tiến hành:

Mẫu chitosan được nghiền nhỏ bằng cối nghiền bi (Fritsch, Đức) và rây qua rây 200 mesh Cân khoảng 3 – 5 mg mẫu bột OCTS trộn cùng với 100 mg KBr trong cối mã não, ép viên trên máy ép chuyên dụng trong thời gian khoảng 10 phút Tiến hành đo phổ IR trên máy FT – IR 8400S (Shimadzu, Nhật)

Đo phổ nhiễu xạ tia X (XRD):

Dùng xác định cấu trúc mạng tinh thể của OCTS và nAg

Nguyên tắc:

Khi chiếu tia tới có bước sóng  bằng khoảng cách d của tinh thể, ta có phương trình Bragg: 2d sin = n. Trong đó: n là số nguyên; d: khoảng cách giữa hai nút mạng;  là độ dài sóng,  là góc tạo bởi mặt mạng với tia tới hay tia phản xạ

Để hiện tượng nhiễu xạ xảy ra thì phương trình Bragg phải thỏa mãn, như vậy người ta phải dùng tia X có bước sóng  thay đổi hoặc xoay mẫu vật

Cường độ nhiễu xạ phụ thuộc vào số lượng điện tử trong mạng tinh thể, do

đó phụ thuộc vào loại nguyên tử và vị trí của nó trong mạng Tóm lại, mỗi tinh thể khác nhau có góc nhiễu xạ khác nhau Các tinh thể giống nhau cho nhiễu xạ giống nhau không bị ảnh hưởng bởi chất khác Do vậy kết quả đo nhiễu xạ dùng để xác định cấu tạo tinh thể của vật liệu bằng cách so sánh với cơ sở dữ liệu chuẩn

Kết quả đo trên máy gồm: trục hoành – góc 2, trục tung – cường độ nhiễu

xạ Như vậy tinh thể có trong mẫu sẽ tạo 1 đỉnh trên trục hoành, đỉnh đó được so sánh với đỉnh chuẩn

Tiến hành: OCTS/nAg được kết tủa bằng aceton, lọc lấy kết tủa, sấy khô,

nghiền mịn, ép thành tấm có bán kính 1 inch, đưa vào đo phổ XRD trên máy ADVANCE 8 – Brooker (Đức), vận hành ở điện thế 40 kV, cường độ dòng 40 mA bằng bức xạ của Cu K

Chụp ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM):

Kích thước và phân bố kích thước trung bình hạt nano bạc được xác định từ ảnh TEM Nhỏ giọt keo nano bạc lên lưới đồng (300 mesh) đã phủ lớp carbon, làm khô tự nhiên, khoảng 15 phút, chụp ảnh TEM trên máy JEM1010, JEOL, Nhật bản với độ phân giải 3 Ao, điện thế gia tốc 80 kV, phim âm bản FUJIFILM kích thước 8,2  11,8 cm

Mỗi mẫu đếm từ 500 – 1.000 hạt (~ 5 ảnh TEM) sử dụng phần mềm Photoshop CS3, Version 9.0 Kích thước trung bình hạt nano bạc (dtb, nm) được xác định theo công thức:

k i i

n X

1 1

/)(

Trong đó: di (nm) là giá trị tổ thứ i của số tổ k

ni là số hạt đếm được (tần số) của tổ i Phương pháp xác định giá trị độ nhớt đặc trưng [η]:

Đối với chất lỏng hay các polymer như chitosan thì độ nhớt chủ yếu phụ