Nghiên cứu thành phần hoạt chất, hiệu lực kích thích sinh trưởng và xác định dư lượng một số chế phẩm kích thích trưởng đang sử dụng trên rau hiệu nay

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --- TRẦN MINH TRUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT, HIỆU LỰC KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VÀ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẾ PHẨM KÍCH TH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

TRẦN MINH TRUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT, HIỆU LỰC KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG VÀ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CHẾ PHẨM KÍCH THÍCH TRƯỞNG ĐANG SỬ DỤNG TRÊN

RAU HIỆN NAY

Chuyên ngành HÓA PHÂN TÍCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÓA PHÂN TÍCH

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TẠ THỊ THẢO

Hà Nội – Năm 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này do bản thân tôi thực hiện, những kết quả nghiên cứu được đưa ra trong luận văn này là của bản thân tôi và chưa từng được ai nghiên cứu, sử dụng và công bố trên các tạp chí khoa học trước đây, các số liệu và kết quả nghiên cứu được thực hiện một cách trung thực và chính xác

LỜI CẢM ƠN

X W

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Tạ Thị Thảo, Phó chủ nhiệm

Bộ môn Hóa Phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà nội đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, phương pháp nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học và các thầy, cô giáo Khoa Công nghệ Hóa học - Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nội dung học tập và thực hiện đề tài thuận lợi

Xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, lãnh đạo và cán bộ Phòng Kiểm định

Dư lượng và Chất luợng thuốc BVTV – Trung tâm Kiểm định và Khảo nghiệm thuốc BVTV phía Bắc – Cục Bảo Vệ Thực đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu đề tài

Xin trân trọng cảm ơn Phòng Thanh tra Cục BVTV, Ban lãnh đạo và cán bộ tại các phòng thử nghiệm thuộc Viện Bảo vệ thực vật, Viện nghiên cứu Rau quả, Viện cơ điện sau thu hoạch đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè, và các bạn cùng lớp Cao học Hóa cơ bản 2008 - 2010 đã giúp đỡ và động viên tôi trong hai năm học tập và quá trình làm luận văn

Hà Nội, tháng 11 năm 2010

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 2

LỜI CẢM ƠN 3

MỤC LỤC 4

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC CÁC BẢNG 8

DANH MỤC CÁC HÌNH 10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 13

1.1 Các chất điều tiết sinh trưởng cây trồng 13

1.1.1 Nhóm Auxin 14

1.1.2 Nhóm Cytokinin 15

1.1.3 Nhóm Abscisic 15

1.1.4 Etylen và các chất giải phóng etylen 16

1.1.5 Nhóm Gibberellin 17

1.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần HPLC- MS/MS 19

1.2.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21

1.2.1.1 Pha tĩnh trong HPLC 22

1.2.1.2 Pha động trong HPLC 22

1.2.2 Nguồn ion hóa và bộ phận phân tích khối phổ 23

1.2.2.1 Bộ phận phân tích khối phổ 23

1.2.2.2 Các nguồn ion hóa 26

1.2.2.2.1 Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI) 26

1.2.2.2.2 Chế độ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) 27

1.3 Phương pháp QuEChES phân tích đa dư lượng thuốc BVTV 29

1.3.1 Phương pháp QuEChES 30

1.3.2 Phương pháp QuEChERS – AOAC 2007-01 31

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 35

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 35

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 35

2.1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 35

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 36

2.2.1 Chuẩn bị dung môi pha động và dung dịch chuẩn 36

2.2.2 Các hoá chất khác 36

2.2.3 Dụng cụ 37

2.2.4 Thiết bị 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu 38

2.3.1 Điều tra tình trạng sử dụng thuốc KTST trên rau tại Hà Nội 38

2.3.2 Khảo nghiệm hiệu lực kích thích sinh trưởng và xác định thời gian cách ly 38 2.3.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 38

2.3.2.2 Chỉ tiêu và phương pháp điều tra 39

2.3.4 Điều kiện phân tích 42

2.3.4.1 Điều kiện phân tách trên hệ thống HPLC 42

2.3.4.2 Điều kiện phân tích trên hệ thống khối phổ APCI - MS/MS : 42

2.3.4.3 Tiến trình phân tích 43

2.3.4.4 Tính toán kết quả 43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc KTST 44

3.1.1 Thực trạng sử dụng thuốc KTST tại địa bàn Hà Nội 44

3.1.2 Xác định thành phần hoạt chất 45

3.2 Xác định hiệu lực kích thích sinh trưởng của thuốc đối với rau 48

3.2.1 Rau xà lách (Lactuca sativa Capitala) .48

3.2.2 Rau cải (Brassica rapa L.) .51

3.3 Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích GA3 53

3.3.1 Tối ưu hoá các điều kiện đo trên thiết bị HPLC – MS/MS 53

3.3.1.1 Khảo sát các điều kiện hệ thống HPLC 53

3.3.1.1.1 Chọn điều kiện bơm mẫu 53

3.3.1.1.2 Chọn cột tách 53

3.3.1.1.3 Khảo sát thành phần pha động và chế độ chạy 53

3.3.1.1.4 Khảo sát tốc độ dòng pha động 54

3.3.1.2 Khảo sát các điều kiện khối phổ MS/MS 55

3.3.1.2.1 Xác định các thông số cần khảo sát 55

3.3.1.2.2 Khảo sát các điều kiện tối ưu MS/MS 56

3.2.2 Nghiên cứu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 61

3.2.2.1 Khảo sát xây dựng đường chuẩn 61

3.2.2.2 Giới hạn phát hiện LOD 64

3.2.2.3 Giới hạn định lượng LOQ 66

3.2.2.4 Khảo sát điều kiện chiết GA3 trong mẫu thực 66

3.2.2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của axit axetic đến hiệu suất thu hồi 67

3.2.2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng thể tích HCl 0,02M đến hiệu suất thu hồi 69 3.2.2.5 Đánh giá độ chính xác của phương pháp 72

3.3 Phân tích dư lượng GA3 trong mẫu khảo nghiệm 75

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

PHỤ LỤC 84

Phụ lục 1 : Số liệu điều tra thống kê 84

Phụ lục 2 : Số liệu khảo nghiệm sinh học 86

Phụ lục 3 : Số liệu phân tích PHI 92

Phụ lục 4 : Số liệu đánh giá độ chính xác phương pháp 94

Phụ lục 5 : Số liệu xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 97

Phụ lục 6 : Một số sắc ký đồ phân tích mẫu 99

7 MRLs Møc d− l−îng tèi ®a cho phÐp ( mg/kg)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1: So sánh QuEChES với các phương pháp xử lý mẫu khác 29

Bảng 2 1: Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST 39

Bảng 2 2: Các thông số của chế độ ion hóa APCI 42

Bảng 2 3: Các thông số chế độ quét MS/MS 42

Bảng 3 1: Các mức nồng độ chất chuẩn GA3 46

Bảng 3 2: Hàm lượng hoạt chất GA3 trong các mẫu điều tra 47

Bảng 3 3: Bảng qui hoạch thực nghiệm xác định điều kiện tối ưu MS/MS 57

Bảng 3 4: Kết quả thực nghiệm theo bảng thiết kế thực nghiệm 57

Bảng 3 5: Các hệ số hồi quy thu được từ thực nghiệm 58

Bảng 3 6: Điều kiện tối ưu cho thiết bị HPLC – MS/MS 61

Bảng 3 7: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ GA3 62

Bảng 3 8: Các thông số đường chuẩn 63

Bảng 3 9: Độ lặp lại của thiết bị tại nồng độ GA3 tại 2 ng/ml 64

Bảng 3 10: Ảnh hưởng nồng độ axit đến hiệu suất thu hồi 67

Bảng 3 11: Ảnh hưởng V HCI 0,02M đến hiệu suất thu hồi mẫu thêm chuẩn 70

Bảng 3 12: Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn 73

Bảng 3 13: Hiệu suất, độ chụm tại các mức LOQ khi phân tích GA3 trên rau xà lách 73

Bảng 3 14: Rau cải và hiệu suất thu hồi, độ chụm tại các mức LOQ 74

Bảng 3 15: Tình hình sử dụng thuốc KTST của nông dân tại địa bàn Hà Nội và Hà Tây 84 Bảng 3 16: Đặc điểm các thuốc KTST dùng phổ biến 85

Bảng 3 17: Tác động thuốc KTST đến chiều cao cây xà lách 86

Bảng 3 18: Ảnh hưởng của thuốc KTST đến khối lượng , năng suất và tỷ lệ(%) thương phẩm cây xà lách 87

Bảng 3 19: Ảnh hưởng thuốc KTST đến một số chỉ tiêu chất lượng rau xà lách 88

Bảng 3 20: Tác động thuốc KTST đến chiều cao cây cải 89

Bảng 3 21: Ảnh hưởng thuốc KTST đến khối lượng cây và năng suất cây rau cải 90

Bảng 3 22: Ảnh hưởng thuốc KTST đến một số chỉ tiêu chất lượng rau cải 91

Bảng 3 23: Kết quả xác định dư lượng thuốc KTST trên rau xà lách theo thời gian 92

Bảng 3 24: Kết quả xác định dư lượng thuốc KTST trên rau cải theo thời gian 93

Bảng 3 25: Xà lách – LOQ = 0,004 (mg/kg) 94

Bảng 3 26: Xà lách – LOQ = 0,01 (mg/kg) 94

Bảng 3 27: Xà lách – LOQ = 0,02 (mg/kg) 95

Bảng 3 28: Xà lách – LOQ = 0,08(mg/kg) 95

Bảng 3 29: Rau cải – LOQ = 0,01 (mg/kg) 96

Bảng 3 30: Rau cải – LOQ = 0,08 (mg/kg) 96

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1: GA phân hủy chất kìm hãm sinh trưởng DELLA 18

Hình 1 2: Công thức cấu tạo của GA3 18

Hình 1 3: Sơ đồ khối thiết bị HPLC-MS/MS 20

Hình 1 4: Mô hình thiết bị khối phổ MS ( LC-MS ) 23

Hình 1 5: Cấu tạo và hoạt động bộ tứ cực 24

Hình 1 6: Mô hình thiết bị khối phổ MS/MS 25

Hình 1 7: Cấu tạo đầu phun ESI 26

Hình 1 8: Vùng phản ứng của chế độ ion hóa APCI 28

Hình 1 9: Cấu tạo nguồn ion hóa đa chế độ ESI + APCI 28

Hình 1 10: Quy trình chiết mẫu AOAC 2007.01 32

Hình 2 1: Quy trình phân tích mẫu 41

Hình 3 1: Tình hình sử dụng thuốc KTST của nông dân tại một số địa bàn Hà Nội …… 44

Hình 3 2: Đường chuẩn xác định hàm lượng GA3 tại 3 mức nồng độ 46

Hình 3 3: Sắc ký đồ của “Viên sủi GA3” tại lượng cân Sp1 46

Hình 3 4: Sắc ký đồ của “Viên sủi GA3” tại lượng cân Sp2 47

Hình 3 5: Tác động thuốc KTST đến chiều cao cây xà lách 48

Hình 3 6: Ảnh hưởng các thuốc KTST đến năng suất cây xà lách 50

Hình 3 7: Tác động thuốc KTST đến chiều cao cây cải 51

Hình 3 8: Ảnh hưởng thuốc KTST đến năng suất cây rau cải 52

Hình 3 9: Sắc ký đồ TIC chuẩn GA3 55

Hình 3 10: Mặt mục tiêu biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic và 3 yếu tố ảnh hưởng 59

Hình 3 11: Phổ đồ GA3 tại điều kiện tối ưu 60

Hình 3 12: Đường chuẩn của GA3 trong khoảng tuyến tính 63

Hình 3 13: Sắc đồ chuẩn GA3 trên nền mẫu trắng tại mức X LOD = 0,5 ng/ml 65

Hình 3 14: Sắc ký đồ TIC mẫu spike khi chiết bằng 2% axit axetic 68

Hình 3 15: Sắc ký đồ TIC mẫu spike khi chiết bằng 3% axit axetic 68

Hình 3 16: Sắc ký đồ TIC chuẩn GA3 có nồng độ 5 ng/ml 69

Hình 3 17: Ảnh hưởng của thể tích HCl 0,02N chiết đến hiệu suất thu hồi 70

Hình 3 18: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của mẫu spike tại 5 ng/ml và pH = 5 71

Hình 3 19: Sắc ký đồ EIC và phổ khối của chuẩn GA3 tại 5 ng/ml 71 Hình 3 20: Diễn biến dư lượng thuốc kích sinh trương trên rau xà lách 76 Hình 3 21: Diễn biến dư lượng thuốc kích sinh trương trên rau cải 77

MỞ ĐẦU

Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề đáng báo động với người dân và các cấp quản lý Nhiều vụ việc như sử dụng những hoá chất cấm trong nuôi trồng, chế biến nông thủy sản, thực phẩm, sản phẩm kém chất lượng lưu hành trên thị trường đang gây ảnh hưởng xấu đến xuất khẩu và tiêu dùng Các vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, trong đó có ngộ độc thuốc bảo vệ thực vật (BVTV), càng làm bùng lên sự lo âu của người tiêu dùng Theo hệ thống cảnh báo và thông báo của Châu Âu, năm 2004, trong số hàng thực phẩm Việt Nam xuất sang châu

Âu, có 59 lô không đạt chất lượng (Việt Nam xếp thứ 13 trong số các nước bị cảnh báo), con số nầy là 124 vàViệt Nam xếp thứ 7 trong năm 2005…[5] Trong 6 tháng đầu năm 2010, nhiều lô hàng nông thủy sản xuất khẩu bị Mỹ, Canada, Nhật, Nga, Singapore từ chối vì xuất hiện chất cấm sử dụng hoặc có hàm lượng vượt mức cho phép

Để xảy ra tình trạng sử dụng bừa bãi hóa chất BVTV, lượng tồn dư thuốc BVTV trong nông sản cao là do lỗi khâu quản lý, ý thức người dân Tuy nhiên cũng cần kể đến vai trò của phân tích kiểm định chưa đáp ứng được yêu cầu nguyên nhân

là do chi phí phân tích cao, đầu tư thiết bị phân tích lớn, quá trình phân tích sử dụng nhiều dung môi hữu cơ độc hại, quy trình phân tích phức tạp…Vì vậy, việc phát triển các phương pháp phân tích theo hướng thân thiện với môi trường, chi phí thấp, cách làm đơn giản là phương án cần chú trọng

Gần đây báo trí và dư luận rộ lên thông tin người dân vì chạy theo lợi nhuận

đã lạm dụng thuốc kích thích sinh trưởng (KTST) tại các vùng sản suất rau gây lo ngại về tồn lưu thuốc KTST trên rau Để góp phần cung cấp cơ sở dữ liệu về thực trạng sử dụng thuốc KTST, loại thuốc KTST phổ biến và phương pháp phân tích dư lượng của nó, luận văn sẽ tập trung vào việc điều tra thống kê, tiến hành khảo nghiệm loại thuốc KTST đang sử dụng, sau đó nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích dư lượng KTST trên rau hướng hóa học xanh, sử dụng ít dung môi hữu

cơ, dùng các chất vô cơ không độc hại, quy trình phân tích đơn giản (trên cơ sở phương pháp QuEChERS) đảm bảo những yêu cầu quản lý chất lượng theo ISO/IEC – 17025: 2005 từ đó sơ bộ kết luận về thời gian cách ly cho người sử dụng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Các chất điều tiết sinh trưởng cây trồng

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường, cây trồng cần các chất

cơ bản như nước, cacbon dioxit, chất khoáng, chất dinh dưỡng…Sự phát triển cây trồng còn phụ thuộc vào một số yếu tố bên ngoài ( ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm …) và yếu tố bên trong của cây ( hoạt động của các phản ứng sinh hóa, trong đó có sự tham gia của một số hóa chất )[8]

Ở thực vật cũng như động vật, sự điều tiết quá trình chuyển hóa, sinh trưởng,

phát triển… phụ thuộc vào những tín hiệu hóa học, gọi là các hormon ( bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp horman là kích thích ) Các hormon giữ một vị trí quan trọng trong

việc điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Các chất điều tiết sinh trưởng thực vật chia thành hai nhóm : các chất kích thích sinh trưởng và các chất ức chế sinh trưởng Sự cân bằng giữa hai nhóm này quyết định đến quá trình sinh trưởng phát triển của cây

Các hormon thực vật ( plant hormon ) là các chất hữu cơ có bản chất hóa học

khác nhau, được tổng hợp với lượng rất nhỏ ở các cơ quan bộ phận nhất định của cây và từ đó chuyển đến những cơ quan bộ phận khác Chúng tham gia điều tiết các quá trình sinh trưởng, phát triển của cây, duy trì mối quan hệ giữa các cơ quan , bộ phận trong cây[8]

Mỗi hormon chỉ ảnh hưởng đến một quá trình sinh lý chuyên biệt của thực vật Hiện nay đã biết được 5 nhóm hormon thực vật gồm: Auxin, gibberellin, cytokintin, axit abscisic và ethylen Trong đó nhóm kích thích tăng trưởng gồm: Auxin, gibberellin, cytokinin, còn nhóm có tác dụng ức chế sinh trưởng là: Axit abscisic và etylen và các chất giải phóng etylen[8,13]

1.1.1 Nhóm Auxin

Auxin (xuất phát từ tiếng Hy Lạp auxein có nghĩa là tăng lên) là hormon thực vật được phát hiện đầu tiên bởi nhà bác học Darwin ( Charles Darwin, 1881) và Went ( W.Went, 1926 ) khi nghiên cứu sự nảy mầm của hạt yến mạch Avena dưới tác dụng của ánh sáng[8]

Chất auxin tự nhiên đầu tiên được phát hiện là axit indoleaceti (IAA ) Trong công thức cấu tạo của IAA có vòng indol giống với phân tử tryphtophan, một axitamin có trong cây

N H

CH2CHOOH

N H

Chức năng và vai trò sinh hóa của nhóm auxin trong cây rất đa dạng và phụ thuộc vào từng chất Có thể liệt kê một số chức năng chính sau :

- Các chất auxin có vai trò trong sự phân hóa mô mạch của cây hình thành và sắp xếp lá cây

- Xúc tiến sự hình thành rễ chính và rễ phụ

- Xúc tiến sự phát triển quả

- Một số auxin tổng hợp còn được dùng để diệt cỏ 2,4-D là một hóa chất gần giống auxin, được tổng hợp và được sử dụng rộng rải để diệt cỏ có lá rộng trong các đồng cỏ

1.1.2 Nhóm Cytokinin

Cytokinin đóng vai trò chính trong sự phân cắt tế bào Cytokinin được tạo ra trong ngọn rễ và trong hạt đang phát triển và được vận chuyển qua mô gỗ từ rễ lên thân Ngoài ra, cytokinin còn kích thích sự biến đổi của những chồi còn non thành trưởng thành; giúp chồi bên tránh bớt được sự ức chế của chồi ngọn, làm chậm sự lão hóa, đặc biệt là đối với lá

Tác động của cytokinin lên sự tăng trưởng của tế bào trong môi trường nuôi cấy mô lệ thuộc vào sự hiện diện đồng thời của auxin Tỷ lệ giữa cytokinin và auxin

có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định sự chuyên hóa của tế bào mới Khi trong môi trường nuôi cấy cytokinin nhiều hơn auxin thì thân và lá được tạo ra trong khi auxin nhiều hơn thì sự tăng trưởng của rễ bắt đầu Sự cân đối giữa hai loại hormon này xác định loại mô sẽ phát triển; do đó chúng kiểm soát hình thái của cây

Trong một cây phát triển bình thường, cytokinin và auxin có hoạt động phối hợp trong một số trường hợp, nhưng trong một số trường hợp khác lại có tác động đối nghịch nhau Thí dụ, chúng có tác động hổ trợ nhau thúc đẩy tế bào phân cắt nhưng lại có tác động đối nghịch về ảnh hưởng sự tăng trưởng của chồi bên Cả hai hormon đều ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của tế bào nhưng auxin chỉ kích thích sự tăng dài trong khi cytokinin thúc đẩy sự phân cắt tế bào[8]

1.1.3 Nhóm Abscisic

Hormon axit abscisic đầu tiên được xem là chất kiểm soát sự rụng lá ở nhiều cây như tên của nó (abscission: tách ra) Nó cũng được xem là chất cảm ứng miên trạng của chồi và hột vào mùa thu để đợi đến mùa xuân Ngày nay, người ta biết vai trò kiểm soát sự rụng lá là không quan trọng, mà dường như có vai trò trong miên trạng của hột, ít nhất là ở một số loài

Mặc dù từ lâu axit abscisic được xem là yếu tố ngăn cản sự tăng trưởng, nhưng trong nhiều trường hợp nó lại có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng và phát triển Thí dụ chúng thúc đẩy sự vận chuyển những sản phẩm quang hợp cho phôi phát triển trong hột và cảm ứng sự tổng hợp protein để dự trữ trong hột Ngoài ra, chúng còn giúp các khí khẩu đóng lại khi trời khô Chỉ vài phút sau khi cây bắt đầu héo, nồng độ axit abscisic trong lá tăng lên 10 lần

1.1.4 Etylen và các chất giải phóng etylen

Tác dụng sinh học của etylen đối với cây trồng được khám phá trước khi khám phá ra nhóm auxin Một trái bị thối, thì nhiều trái sẽ thối theo Ngày nay, người ta biết rằng trái đó ảnh hưởng lên các trái khác là do trái thối sinh ra khí ethylen Ethylen giữ một số vai trò trong chu kỳ đời sống của cây, bao gồm sự tăng trưởng, phát triển và sự lão hóa hay sự chín của trái Ethylen là một chất khí nên thoát ra trong không khí Ethylen được tổng hợp trong các mô đang xảy ra sự lão hóa hay sắp chín như ở trái

Một trong những nghiên cứu về ảnh hưởng của ethylen là kích thích sự chín của trái Một trái khi đạt được một kích thước tối đa, nó trở nên nhạy cảm với ethylen, và đây là một hóa chất gây ra sự chín Quá trình chín bắt đầu khi có sự bộc phát về các hoạt động biến dưỡng do nồng độ ethylen tăng lên khoảng 100 lần Ngăn cản sự tạo ethylen hay loại bỏ được ethylen ngay khi chúng được sinh ra thì ngăn chận được sự chín Trái được thu hoạch và vận chuyển lúc còn xanh và cứng

để tránh dập, sau đó trái được xử lý với ethylen cho chín trước khi đem đi bán Các chất điều tiết sinh trưởng theo cơ chế giải phóng khí etylen được con người tổng hợp như Ethephon, Triacontanol, Brassinolide và nhóm Brasinosteroid

… là những hoạt chất trong những thương phẩm nổi tiếng sử dụng rộng rãi[8]

1.1.5 Nhóm Gibberellin

Gibberellin là nhóm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhóm auxin Nhóm Gibberellin bao gồm những axit ditecpenoid có tác dụng điều tiết sinh trưởng thực vật, tác động đến nhiều quá trình : phát như triển thân cây, nảy mầm, ra hoa, sự già hóa của lá , quả …

Lịch sử phát triển các Gibberellin bắt đầu từ năm 1926 Trong quá trình nghiên cứu bệnh lúa von, các nhà bác học Nhật Bản phát hiện ra một chất được sản

sinh ra từ loài nấm Gibberella fujikuroi, có tác dụng kích thích điều tiết quá trình

nảy mầm sinh trưởng của cây lúa Năm 1930 người ta đã phân lập và kết tinh một chất từ Gibberella nay được gọi là gibberellin Trong vòng 30 năm đã có hơn 70 chất khác nhau được phân lập từ nấm mốc và nhiều thực vật có hoa được xếp vào gibberellin (GAs)[13] Cho đến năm 2003 người ta đã tìm thấy 126 loại GA khác nhau và đặt tên từ GA1, GA2, GA3 đến GA126 Trong 126 loại này thì GA3 được ứng dụng nhiều nhất, có hoạt tính kích thích sinh trưởng thực vật cao nhất vì vậy được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trên thế giới Các thí nghiệm cho thấy trong cây các dạng Gibberelin nhanh chóng bị hydrat hoá thành dạng không hoạt tính nhưng dạng GA3 bị chuyển thành dạng không hoạt tính chậm hơn so với các dạng khác [26] Đồng thời các nghiên cứu cũng cho thấy dạng GA3 bị chuyển hoá ở các thân cây đã trưởng thành nhanh hơn so với cây con (Huapu, M Blake et al) [28]

Gibberellin có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào theo chiều dọc; Kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây theo chiều cao, làm thân vươn dài, giúp hình thành các chồi nách nhiều hơn; làm mất hạt của quả, phá giai đoạn ngủ nghỉ của hạt để kích thích hạt nảy mầm; tăng số lượng lá, thay đổi hình dạng và tăng diện tích của lá; kìm hãm sự phát triển của bộ rễ; kích thích ra hoa, kéo dài cuống hoa, giúp hoa to hơn

Gibberellin thường được sử dụng trong các thí nghiệm là GA3 hay axit gibberellic có tác dụng chính là kéo dài tế bào (cellular elongation) thông qua việc

phân hủy một nhóm protein kìm hãm sinh trưởng ở thực vật là DELLA protein [13]

Hình 1 1: GA phân hủy chất kìm hãm sinh trưởng DELLA

Axit gibberelic (GA3) là chất có nhiều ứng dụng nhất trong nhóm Gibberellin Hoạt chất được các nhà hóa học Nhật Bản phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 30 của thế kỷ XX [27] Đây là chất có cấu trúc phân tử phức tạp, gồm các nhị vòng và 8 trung tâm không gian Mỗi cấu trúc có hoạt tính sinh học riên và tác động lên cây trồng theo những cách khác nhau Tùy vào mục đích sử dụng, người ta có thể tạo ra những đồng phân có cấu trúc phù hợp được xác định

Hình 1 2: Công thức cấu tạo của GA3

GA3 có khối lượng mol 346,4 đvc, thể kết tinh rắn nhiệt độ nóng chảy 223 –

2250C được công ty ICI Plant Protection ( bây giờ là tập đoàn Syngenta AG) lần đầu tiên đưa vào nông nghiệp ở dạng sản phẩm thương mại[20]

Năm 1995, Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (nơi cấp phép cho các hóa chất được sử dụng trong nông nghiệp) đã xếp GA3 nằm ở nhóm chất độc nhóm II EPA cho phép sử dụng GA3 ở Hoa Kỳ mà chưa có cảnh báo cụ thể về ảnh hưởng của nó đối với môi trường cũng như vật nuôi và sinh vật hoang dã (theo Environmental Protection Agency, 1995) [24] Tổ chức WHO và một số nước khác cũng xếp GA3 vào nhóm độc II [33] Tại New zealand cũng không áp dụng mức dư lượng tối đa cho phép (MRL) đối với GA3 mà chỉ cần điều kiện dùng <200 gui/ha/năm [33] Tại Đài Loan, MRL của GA3 đối với rau là 5 mg/kg, Nhật Bản là 0,2mg/kg Có thể nói GA3 tương đối an toàn cho người sử dụng rau quả[ 23,34 ]

Ngày nay trên thị trường GA3 được sản xuất bởi các hãng khác nhau mang các tên thương phẩm khác nhau, chẳng hạn như 920 (BSI), Berelex (ICI), Gib-Tabs (Elanco), Gib-sol (Elanco), pro-Gibb (Abbott), Pro-Gibb Plus (Abbott), Activol [20]

1.2 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ hai lần HPLC- MS/MS

Hiện nay các chất phân tích và nên mẫu đều phức tạp, giới hạn phát hiện và định lượng yêu cầu ngày một thấp Nên khi phân tích dư lượng hóa chất BVTV bằng các thiết bị sắc ký khí (GC) (với các detecter cộng kết điện tử (ECD), quang hóa ngọn lửa (FPD)…) hoặc HPLC ( với các đầu dò UV-Vis, DAD …) mẫu phân tích cần lấy lượng lớn Điều này làm phức tạp cho giai đoạn làm sạch của quá trình

xử lý mẫu nhất là với những nông sản chứa nhiều đường, tinh dầu Với những hoạt chất kém bền, không ổn định quy trình chuẩn bị mẫu lại càng khó khăn, tốn kém Một trong những trở ngại của phân tích viên là có nhiều hoạt chất do bản chất gần nhau (các họ hoạt chất đồng đẳng, các đồng phân ) nên yếu tố thời gian lưu không

đủ cơ sở để định tính các chất Việc phân biệt pic hoạt chất trên nền mẫu, xử lý số liệu cần nhiều thông tin hơn[9]

Để khắc phục những nhược điểm trên các kỹ thuật công nghệ cao được ứng dụng vào trong phân tích công cụ Các detecter dạng UV-Vis, DAD, ECD, FPD,

NPD được thay thế bằng bộ phận phân tích khối phổ MS, MS/MS kết hợp với đầu

dò phát hiện ion như cốc Faraday, nhân electron thứ cấp

Có thể khẳng định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC kết hợp với

bộ phận phân tích khối phổ MS/MS là một kỹ thuật ứng dụng hiện đại và rất hữu hiệu để phân tích lượng vết, các dạng tồn dư chuyển hóa thuốc BVTV trong nông sản

Hệ thống HPLC-MS/MS có sơ đồ khối như hình 1.3

Hình 1 3: Sơ đồ khối thiết bị HPLC-MS/MS

Trong đó: 1 - Bình chứa dung môi pha động

7 - Detector thu nhận và chuyển đổi sang tín hiệu điện

8 - Máy tính lưu trữ và xử lý số liệu

Hoạt động của thiết bị HPLC-MS/MS theo nguyên tắc sau :

Pha động trong bình chứa (1) được bơm cao áp (2) bơm qua bộ phân bơm mẫu tự động (3) vào cột tách (4), quá trình sắc ký xảy ra tại đây Sau khi rời bỏ cột tách(4) tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử tới nguồn ion hoá (5) Ở đây pha động hoá hơi còn các cấu tử được chuyển thành ion phân tử và đi qua bộ lọc khối phổ MS/MS (6) Tại đây ion phân tử bị bắn phá lần nữa thành các ion thứ cấp, (6)

sẽ lọc lựa chọn những số khối m/z của hoạt chất phân tích mới đi qua tới detecter (7) chuyển thành tín hiệu điện Số liệu kết quả được xử lý trên máy tính(8)[19]

1.2.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau[12]

Về cơ bản, LC-MS/MS như các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC bao gồm 3 phần chính:

- Phần đầu là bình chứa dung môi pha động: có 4 bình chứa 4 loại dung môi khác nhau Tùy thuộc vào cấu tạo bơm 2 kênh hoặc bơm 4 kênh kết hợp với chế độ chạy isocratic hoặc gradien mà có thành phần pha động mong muốn

- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách và cột phụ trợ (tiền cột), buồng điều nhiệt cột, bộ phận bơm mẫu tự động Mẫu phân tích được bộ phận bơm mẫu tự động nạp vào hệ thống với dung tích ( cỡ µl) tùy thuộc khả năng cột tách

- Phần phát hiện và xử lí số liệu: Ở đây hệ thống HPLC thông thường bao gồm các detector, phần khuếch đại tín hiệu, phần chuyển đổi tín hiệu tương tự sang tín hiệu số Máy tính sẽ lưu trữ dữ liệu nhận được và phần mềm xử lí số liệu ( tùy thuộc từng hãng theo thiết bị) cho các kết quả phân tích

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản; sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết

- Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluen…Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực

- Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động là dung môi phân cực như nước, methanol, axetonitril…Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ

phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực [12]

1.2.1.2 Pha động trong HPLC

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh-

- Bền vững và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

- Hoà tan được mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao

- Có độ nhớt thấp và phù hợp với detector hoặc phần thiết bị nối tiếp sau

+ Pha động có độ phân cực cao, có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha đảo

+ Pha động có độ phân cực thấp là các dung môi ít phân cực như xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluene…Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, nên người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích các hỗn hợp mẫu phức tạp Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này gọi là rửa giải gradient nồng độ

1.2.2 Nguồn ion hóa và bộ phận phân tích khối phổ

1.2.2.1 Bộ phận phân tích khối phổ

Máy phân tích khối phổ hay chính xác hơn máy phân tích “tỉ lệ khối lượng theo điện tích (m/z) của ion “ là thiết bị phân tích dựa trên sự chuyển động của các ion trong môi trường chân không ‘’[14]

Các máy phân tích khối phổ thường được phân loại tuỳ vào việc tách các ion mang điện theo phương pháp nào Ở đây ta chỉ xét thiết bị thông dụng là khối phổ

tứ cực ( quadrupole mass spectrometer ) Để rõ đặc điểm của LC – MS/MS ( 2 lần khối phổ ) ta xét thiết bị LC- MS ( một lần khối phổ ) trước

Hình 1 4: Mô hình thiết bị khối phổ MS ( LC-MS )

Phần quan trọng nhất là bộ lọc tứ cực (quadrupole mass spectrometer) Sự ion hoá mẫu xảy ra tại nguồn ion hoá Các ion được phân tách bởi bộ tứ cực Q1 trước khi tới detector [14]

Hình 1 5: Cấu tạo và hoạt động bộ tứ cực

Trong đó :

- Source : Nguồn ion hóa

- Resonant ion : ion cộng hưởng (ion được lựa chọn)

- Nonresonnant ion : ion bị loại bỏ

- DC and AC voltages : Nguồn điện một chiều và xoay chiều áp lên bộ tứ cực

Bộ tứ cực gồm 2 cặp thanh hình trụ được đặt song song với nhau một cách chính xác hai đầu đặt lên giá đỡ Từng cặp thanh đối diện được nối điện với nhau Điện xoay chiều áp lên cả 4 thanh nhưng thanh gắn cực âm đối diện 180o với thanh gắn cực dương Các thanh mang điện + hay - phụ thuộc giá trị điện thế một chiều

áp lên Mỗi cặp thanh đối diện nhau chịu tác dụng dòng điện có tần số rất lớn 108

Hz và chiều điện áp trên mỗi thanh cũng thay đổi tương ứng Do ảnh hưởng lực điện từ trường các ion vừa di chuyển trong không gian nằm giữa các thanh trụ vừa dao động quanh trục tâm Như vậy với mỗi giá trị điện áp được áp lên thì chỉ có những ion có tỷ số m/z thích hợp mới đi qua bộ tứ cực tới detecter Khi ta chọn mảnh m/z đặc trưng cho chất được nghiên cứu thì phần mềm chuyển tỷ số này

thành sự thay đổi tần số và điện thế áp lên bộ tứ cực để ion quan tâm có được dao động cộng hưởng để di chuyển qua tứ cực và tới bộ phận ghi nhận tín hiệu[31]

Kỹ thuật MS một lần có một số nhược điểm như : không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, chịu ảnh hưởng rõ rệt nền mẫu chất phân tích, do kỹ thuật ion hoá êm dịu nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử… [21]

Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm

độ nhạy ( cỡ fentogram ), tăng độ chính xác kết quả loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu Máy khối phổ MS – MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm (collision cell ) MS đầu tiên (tứ cực Q1) được sử dụng để cô lập ion sơ cấp (precursor ion), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra những ion thứ cấp (product ion ) tiếp theo MS thứ hai ( tứ cực Q2 ) sẽ phân tách những ion này Những ion mong muốn sẽ đi tới detector và chuyển thành tín hiệu [14,15]

Hình 1 6: Mô hình thiết bị khối phổ MS/MS

Trong đó :

- Rough pump : bơm chân không sơ cấp hút loại bỏ các chất không ở dạng ion như dung môi, các cấu tử bền không bị ion hóa…

- Turbo pump : bơm chân không thứ cấp tạo môi trường chân không sâu 2,7–3,3.10-5 torr nhằm tránh sự phân mảnh ion do va chạm

- Collision cell : Nơi các ion bị phân mảnh do va chạm với khí N2 99.999%

1.2.2.2 Các nguồn ion hóa

Việc ghép sắc ký lỏng LC vào máy khối phổ MS không thể thực hiện trực tiếp được, vì muốn đo khối phổ cần phải tạo ra các ion ở thể khí, trong khi sắc ký lỏng được áp dụng cho các chất ít bay hơi Vấn đề còn phức tạp thêm ở việc khi hợp chất

đi ra khỏi cột sắc ký lỏng, hợp chất đó đang ở trong pha động lỏng, cần phải loại bỏ dung môi trước khi đưa hợp chất khảo sát vào MS

Những sự không tương thích cơ bản giữa hai loại kỹ thuật này là :

- Máy khối phổ MS hoạt động trong điều kiện chân không sâu, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở thể khí, vận tốc dòng chảy nhỏ…

- Máy sắc ký lỏng LC hoạt động trong điều kiện : áp suất cao, nhiệt độ tương đối thấp, các chất khảo sát ở thể lỏng, vận tốc dòng chảy lớn…

Để khắc những khó khăn trong việc ghép HPLC và MS cần phải có kết nối chuyển đổi trung gian và kèm theo là các kiểu ion hoá ESI, APCI [15,21]

1.2.2.2.1 Chế độ ion hóa đầu phun điện tử (ESI)

Đầu phun điện tử (Electrospray Ionization: ESI ) có cấu tạo như hình 1.7 [14]

Hình 1 7: Cấu tạo đầu phun ESI

Trong đó :

- Nebulizing gas : Khí N2 (>99,5%) nén ở áp suất 60 psi được trộn hợp với dung môi pha động của HPLC tạo dạng sương mù

- Heated nitrogen drying gas : Khí N2 (>99,5%) được gia nhiệt 330oC tốc độ

5 lit/phút thổi khô, hóa hơi toàn bộ sương mù

- Capilary : Ống mao quản được áp thế 2,5 kV để hút các ion phân tử Phụ thuộc dạng ion phân tử là positive/negative mà chiều điện trường có chiều ngược lại

Trong kỹ thuật ESI, sắc ký lỏng được nối với ống mao quản làm bằng thép không gỉ, pha động (dung môi pha động có thêm chất điện ly ) kết hợp khí nén nitơ

áp suất cao ( 60 psi ) được phun sương mù ra khỏi ống mao quản vào vùng có điện trường mạnh (3-6 kV )ở nhiệt độ cao ( trên 300oC)

Do ảnh hưởng của nhiệt độ dung môi hoá hơi hoàn toàn và điện thế cao hỗn hợp chất cần phân tích chuyển thành ion phân tử và bị hút vào MS (Q1)

Kỹ thuật ESI có thể tạo ion dương hoặc âm tuỳ vào áp cực điện thế ESI ít cho phân mảnh ion rất thích hợp phân tích các hợp chất kém bền nhiệt, có khối lượng phân tử lớn[21]

1.2.2.2.2 Chế độ ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI)

Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển ( Atmospheric Pressure Chemical Ionization : APCI ) hoạt động theo nguyên tắc sau: Hoạt chất cần phân tích trong pha động sau khi qua khỏi cột sắc ký HPLC, qua ống mao quản kết hợp khí trơ ở áp suất cao (60psi) Khi ra khỏi ống mao quản pha động chuyển thành dạng sương mù Các hạt sương nhỏ được khí gas ở nhiệt độ cao hoá hoàn toàn thành thể khí Ở áp suất khí quyển, tại đầu que phóng điện Corona (đặt điện áp rất lớn 3- 6 kV) tập chung điện trường rất mạnh các cấu tử xảy ra sự ion hoá hoá học (hình 1.8)[14]

Hình 1 8: Vùng phản ứng của chế độ ion hóa APCI

Tại đây có sự trao đổi proton để thành ion dương ( M+H )+ và trao đổi electron hoặc proton để biến thanh ion âm (M-H)- Do điện áp cao 2500 V các ion được hút vào capillary và đi tới bộ phận phân tich khối phổ [14,15]

Với dòng máy Agilent 6410 Triple Quad LC-MS/MS hỗ trợ cả hai dạng ion hoá ESI và APCI trên cùng một nguồn ion hoá (nguồn multimode – hình 1.9) Đây

là thiết bị và nguồn ion hoá đề tài sử dụng để phân tich tồn dư hoạt chất GA3

Hình 1 9: Cấu tạo nguồn ion hóa đa chế độ ESI + APCI

Với nguồn ion hóa đa chế độ thì cả 2 chế độ ion hóa ESI và APCI đều được xây dựng Điều này rất thuận tiện vì các hoạt chất khác nhau phù hợp với từng kiểu ion hóa mà không cần thay đổi nguồn ion hóa Tuy nhiên quá trình bảo trì, vệ sinh làm sạch trở nên phức tạp và độ nhậy thiết bị giảm xuống so với từng nguồn ion hóa riêng biệt

1.3 Phương pháp QuEChES phân tích đa dư lượng thuốc BVTV

QuEChES là phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc BVTV trong các mẫu nông sản có hàm lượng chất béo thấp như rau hoa quả QuEChES là tên ghép từ các chữ cái đầu của : Quick (nhanh), Easy (dễ dàng), Cheap ( giá thành rẻ), Effective (hiệu quả), Rugged (triệt để ) và Safe (an toàn) Phương pháp này được Michelangelo Anastassiades, Steven J Lehotay và các cộng sự nghiên cứu và phát triển tại phòng thí nghiệm USDA và CVUA (Stuttgart) [17,32]

QuEChERS có nhiều ưu điểm so với các phương pháp phân tích khác, ban đầu được áp dụng cho phân tích dư lượng nhiều loại hóa chất BVTV trong trái cây

và rau quả nhưng gần đây đã mở rộng phạm vi phân tích lượng vết chất gây ô nhiễm trong thực phẩm như thịt và cá

Hiện nay QuEChES được các phòng thí nghiệm trên thế giới ( EU, Mỹ, Nhật Bản ) nghiên cứu áp dụng có nhiều sự thay đổi cho các đối tượng nông sản khác nhau phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm [17]

Bảng 1 1: So sánh QuEChES với các phương pháp xử lý mẫu khác

Phương pháp truyền thống

sử dụng SPE, GPC QuEChES

Các ưu điểm QuEChES Thời gian xử lý 6 mẫu( phút) 120 phút 30 Nhanh hơn 4 lần Lượng dung môi sử dụng 90 ml 10 ml Dung môi ít hơn 9 lần

An toàn, thân thiện môi trường, giá thành thấp hơn

Dụng cụ thủy tinh/Các thiết

bị phụ trợ

Phễu, bể gia nhiệt

200 ml, thiết bị cô quay chân không

Không Không cần các hỗ

trợ cơ bản khác

sự khác biệt trong một mẫu và tăng tối đa bề mặt tiếp xúc cho quá trình chiết Với những mẫu thô như hoa quả thì được cắt ở kích cỡ < 3x3 cm sau đó mới đem đồng nhất mẫu Sau khi đồng nhất mẫu được cân một lượng phù hợp để phân tích ngay hoặc bảo quản nhiệt độ < - 20oC

- Cân 10 – 15 gam/mẫu vào ống tuyp ly tâm loại 50ml có nắp kín Với mẫu có hàm lượng nước thấp như chè, gạo, ngũ cốc thì cần thêm nước vào để hàm lượng nước > 75% để trong 2 h

- Thêm 10 ml axetonitril (ACN) rung lắc mạnh khoảng 2 – 3 phút Sau đó thêm MgSO4, NaCI, hỗn hợp muối đệm xitrat Na3C6H5O7và Na2C6H6O7 sao cho

pH mẫu đạt 5 -5,5 [32]

- Rung lắc mạnh 2-3 phút và ly tâm 3000vòng/phút trong 5 phút để pha hữu

cơ được phân tách Thu pha hữu cơ và thêm các chất hấp phụ amin như PSA, than hoạt tính (GCB) để làm sạch loại bỏ cơ chất thực vật, chất diệp lục Tiến hành ly tâm lần nữa, thu lấy pha hữu cơ đem thổi khô bằng khí N2 Tùy thuộc thiết bị phân tích là hệ GC-MS/FPD/µECD hay HPLC-MS/MS mà định mức bằng dung môi thích hợp [32]

Hiện nay để thuận tiện trong chiết tách người ta đóng gói sẵn hỗn hợp muối

vô cơ, muối đệm, chất làm sạch (PSA, GCB ) thành những bộ kit (dạng dung dịch hoặc dạng bột rất mịn ) Hiển nhiên tùy theo đối tượng nông sản và hoạt chất pesticide quan tâm mà thành phần mỗi bộ kit là khác nhau Chính vì có nhiều hoạt

chất và nhiều loại nông sản khác nhau mà hiện nay tồn tại nhiều quy trình khác nhau

1.3.2 Phương pháp QuEChERS – AOAC 2007-01

Áp dụng được cho các thuốc trừ sâu dưới đây trên đối tượng nho, rau diếp, và cam: Atrazine, azoxytrobin, bifenthrin, carbaryl, chlorothalonil, chlorpyrifos, chlorpyrifos-methyl, lambda-cyhalothrin (trong rau diếp), cyprodinil, o-p’-DDD, dichlorvos, endosulfan-sulfat, ethion ( trong cam), imazalil, imidacloprid, kresoxim-methyl ( trong nho) , linuon, methamidophos, methomyl, permethrins ( trong dau diếp) procymidone, pymetrozine, tebuconazole, thiabendazole ( trong cam), tolyfluanid, và trifluralin Đây là các thuốc trừ sâu được lựa chọn để phân tích trong những nông sản đại diện cho chúng, và phương pháp có thể áp dụng cho nhiều loại

hóa chất bảo vệ thực vật trên các nông sản khác [18]

Nguyên tắc:

Phương pháp sử dụng ACN để chiết dư lượng thuốc BVTV ra khỏi nông sản, tách lớp pha hữu cơ và pha nước ở trong mẫu bằng MgSO4 Làm sạch bằng cách chiết phân tán pha rắn (SPE) để loại bỏ các xít hữu cơ, lượng nước thừa, các hỗn hợp khác cùng với một sự kết hợp của chất hấp thụ (PSA) và MgSO4 Sau đó dịch chiết được phân tích bằng thiết bị (MS)

Hình 1 10: Quy trình chiết mẫu AOAC 2007.01

Mẫu (>1kg) được cắt nhỏ ra, lấy khoảng 200g mẫu đại diện và đồng

nhất bằng thiết bị đồng nhất mẫu

Chuyển 15g mẫu đã đồng nhất vào ống Teflon 50ml

Thêm 15ml 1% CH3OOH trong ACN +1,5g NaCH3COO+6g

MgSO4+7,5µl dung dịch nội chuẩn

Lắc mạnh trong khoảng 1 phút, sau đó ly tâm với tốc độ >1500

vòng /phút và trong 1 phút

Chuyển 1-8ml vào ống trong đó đã có 150mg MgSO4+50 mg PSA/ml

dịch chiết và lắc trong khoảng 30 giây

Ly tâm >1500 vòng/phút trong khoảng 1 phút

Chuyển 0,25 ml trong bước 10 vào trong ống ly tâm Thêm 0,4 ml

TPP và 1ml toluen

Chuyển 0,5-1 ml dịch chiết vào vial 2 ml của GC và thêm nội chuẩn Triphenyl Phosphat Chuyển 0,15-0,3 ml vào vial 2 ml của LC và

thêm 0,.45-0,9ml của 6,7 mM axit formic

Cho bay hơi ở 50oC bằng N2 tới khi được 0,3-0,5 ml Thêm toluen để được 1 ml Sau đó thêm MgSO4 để tăng lên 0,2 ml và lắc xoáy để

>6ml trên vạch

Ly tâm >1500 vòng/phút trong 1 phút Chuyển 0,6ml vào trong vial 2 ml của GC Phân tích bằng thiết bị (LVI) GC/MS và LC/MS/MS

Sơ đồ hình 1.10 phác thảo quy trình dự kiến Dịch chiết cuối cùng được chuyển vào ống của bơm tự động và phân tích bằng GC/MS và LC/MS/MS để định tính và định lượng một dãy rộng dư lượng thuốc trừ sâu Để đạt được mức giới hạn xác định thấp (10ng/g) với thiết bị GC/MS, thì cần tăng lượng thể tích mẫu bơm vào máy ( 8ul ), hoặc dịch chiết cuối cùng được cô đặc lại và thay đổi dung môi bằng toluen ( lượng cơ chất/dung môi cuối khoảng 4g/ml), trong trường hợp này ta dùng

2 ul bơm vào máy và sử dụng chế độ bơm không chia dòng (splittless)

Cả hai thiết bị GC/MS và LC/MS/MS bị ảnh hưởng của cơ chất mẫu trong phân tích dư lượng thuốc trừ sâu Để loại trừ ảnh hưởng này, các điểm dung dịch chuẩn phải pha trong cơ chất mẫu Lượng mẫu và thể tích dịch chiết cuối cùng là khác nhau đối với một vài phòng thí nghiệm Phụ thuộc vào hàm lượng nước của cơ chất, với 15 g mẫu với mỗi loại thêm 11-15ml ACN đầu tiên, sau đó được ly tâm Bằng cách dùng muối MgSO4 – CH3COONa, khoảng một nửa dịch chiết thô này bị nằm ở trong hỗn hợp muối (dạng bột mịn ) Vì vậy ta chỉ thu khoảng 6-7 ml của dịch chiết cuối cùng cho 15 g mẫu Có hai phương án được dưa ra trong phương pháp của AOAC2007-01 này để tính toán cho tình huống sử dụng chuẩn trong nền matrix hoặc trong nền dung môi : [18]

Phương án A: nếu phòng thí nghiệm có thể bơm vào máy với một lượng thể

tích lớn thì một hoặc hai ml dịch chiết thô được cho vào để chiết khuyếch tán pha rắn ( thể tích để chiết qua SPE phụ thuộc vào sự phù hợp của chất phân tích và loại máy ly tâm và các ống ly tâm trong phòng thí nghiệm) Thể tích chiết thu được là 0,5 ml nếu 1 ml dịch thô được cho vào SPE phân tán, và 1 ml nếu 2 ml dịch thô đi xuống trong bước làm sạch

Phương án B: nếu lượng thể tích bơm mẫu lớn không có giá trị đối với một

số thiết bị GC/MS, thì 30 ml dịch chiết thô của mẫu trắng là cần thiết để làm sạch qua SPE để chuẩn bị cho việc pha các điểm chuẩn trong matrix( hoặc lớn hơn 60

ml dịch chiết đầu tiên) Trong trường hợp này, 6 mẫu trắng với lượng cân 15 g được chiết cùng với mẫu kiểm tra để cung cấp đủ thể tích dịch chiết mẫu trắng, ước

lượng 8ml của 7 mẫuđược phân bổ vào 7 ống chiết khuyếch tán pha rắn có chứa 0.4g PSA +1.2g MgSO4 khan [18]

Như vậy theo AOAC 2007.01 thì giai đoạn đầu thêm ACN có 1% axit axetic

và sử dụng muối NaCOOCH3 thay cho NaCl Trong khi đó tiêu chuẩn Châu Âu EN

15662 lại quy định khắt khe hơn với mỗi nhóm nông sản phải sử dụng một bộ kit của nhà sản suất đã được chứng minh, kiểm định Ngoài ra thiết bị phân tích phải là khối phổ (khuyến khích MS-MS) [17]

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật trong nông nghiệp đã, đang và sẽ trở thành công cụ không thể thiếu đối với nước ta Song chúng cũng gây ra những tác động không mong muốn cho con người và môi trường Điều tra của Cục BVTV cho thấy thực trạng báo động về ô nhiễm hoá chất và vi sinh vật độc hại trong nông sản

Tỷ lệ mẫu có dư lượng thuốc BVTV vượt mức cho phép thay đổi theo từng đối tượng nông sản, theo từng năm, và có chiều hướng tăng lên, không thể kiểm soát được nhất là tại các vùng chuyên canh, sản xuất mang tính hàng hoá Đặc biệt tình trạng sử dụng thuốc kích thích tăng trưởng tràn lan không rõ nguồn gốc trên rau xanh tại một số vùng trồng rau ở thành phố Hà Nội gây lo lắng cho người tiêu dùng

Vì vậy việc điều tra nghiên cứu tiến hành khảo nghiệm, phân tích loại thuốc kích thích sinh trưởng hiện nay đang sử dụng là hết sức cần thiết để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng, để làm cơ sở phục vụ cho công tác quản lý nhà nước

Đối tượng cây trồng được nghiên cứu trong đề tài luận văn là rau xà lách

(Lactuca sativa Capitala) và rau cải (Brassica rapa L.) thu thập tại các vùng trồng

rau trên địa bàn thành phố Hà Nội

2.1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

- Điều tra tình hình sử dụng thuốc kích thích sinh trưởng đang sử dụng trên rau hiện nay Trên cơ sở đó thống kê xác định loại thuốc, hoạt chất KTST được dùng phổ biến

- Xác định loại hoạt chất, hàm lượng thuốc kích thích sinh trưởng sử dụng phổ biến trên rau

- Phân tích chất lượng rau dưới tác dụng của thuốc kích thích sinh trưởng và hiệu lực sinh học của thuốc trên đồng ruộng

- Xây dựng phương pháp phân tích dư lượng axit Giberilic trong rau trên thiết

bị HPLC-MS/MS

- Phân tích dư lượng GA3 trong mẫu rau từ đó xác định thời gian cách ly – PHI

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Chuẩn bị dung môi pha động và dung dịch chuẩn

- Chuẩn bị dung môi pha động

Dung dịch kênh A: MeOH/H2O (2 : 8) (v/v) + 5mM CH3COOH : Lấy 200ml MeOH cho vào bình định mức 1 lit dùng pipetman lấy chính xác 0,288 ml glacical axit axetic, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần khử ion, lắc kỹ, siêu âm 15 phút Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm trước khi đưa vào hệ thống HPLC-MS/MS

Dung dịch kênh B: MeOH/H2O (9 : 1) (v/v) + 5mM CH3COOH : Lấy 900ml MeOH cho vào bình định mức 1lit, dùng pipetman lấy chính xác 0,288 ml glacical acid axetic, định mức tới vạch bằng nước cất 2 lần khử ion, lắc kỹ, siêu âm 15 phút Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm trước khi đưa vào hệ thống HPLC-MS/MS

- Chuẩn bị dung dich chuẩn

+ Dung dịch chuẩn gốc – 1000 µg/ml

Cân khoảng 0,01g chất chuẩn GA3 chính xác tới 0,00001g vào bình định mức

10 ml, hoà tan và định mức tới vạch bằng axetonitril được dung dịch chuẩn gốc Chú ý: Do chất chuẩn bảo quản ở - 20oC nên phải đưa về nhiệt độ phòng trước khi cân Dung dịch chuẩn sau khi pha bảo quản ở 0 -5 oC

+ Dung dịch chuẩn làm việc

Bằng cách pha loãng liên tục và định mức bằng hồn hợp dung môi pha động

và ACN theo tỷ lệ thể tích 1 : 1 được các mức nồng độ chuẩn làm việc 2, 5, 10, 20,

40 ng/ml

2.2.2 Các hoá chất khác

Các loại hóa chất dùng trong phương pháp phân tích đều thuộc loại hóa chất tinh khiết phân tích (P.A.) gồm :

- Chất chuẩn Gibberellic Axit 98%

- Axit axetic băng 99,8%

- Methanol (MeOH)

- Acetonnitril ACN

- Magie sunphat MgSO4

- Natri clourua NaCl

- Natri sunphat khan Na2SO4 (hoạt hóa 130oC trong 8 giờ, để nguội, cho vào bình đậy kín, bảo quản trong binh hút ẩm)

- Thiết bị trộn hợp Ultra Turrax T25 ( điều chỉnh tốc độ nghiền )

- Máy ly tâm Rotina 38R buồng lạnh 5 – 40oC, tốc độ ly tâm 1000 – 15000 vòng/phút

- Máy Vortex Genie 2TM điều chỉnh tốc độ lắc

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy siêu âm Sonorex Super RK514BH kết hợp gia nhiệt bể siêu âm, thời gian siêu âm tùy biến ( 1-15 phút)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Điều tra tình trạng sử dụng thuốc KTST trên rau tại Hà Nội

Tiến hành điều tra tại các điểm nghiên cứu thông qua phiếu điều tra kết hợp với phỏng vấn trực tiếp nông dân Lấy 4 huyện làm đơn vị điều tra, mỗi huyện điều tra tại các vùng sản xuất rau chuyên canh Điều tra 30 hộ nông dân/ huyện, tổng số điều tra 120 hộ Các hộ nông dân tham gia phỏng vấn được thực hiện một cách ngẫu nhiên

Nội dung điều tra gồm : Số hộ nông dân sử dụng thuốc KTST, chủng loại thuốc KTST sử dụng, liều lượng sử dụng, loại cây rau và số lần phun thuốc trong một lứa rau

2.3.2 Khảo nghiệm hiệu lực kích thích sinh trưởng và xác định thời gian cách ly

Bảng 2 1: Công thức thí nghiệm khảo nghiệm thuốc KTST

STT Tên thuốc

khảo nghiệm

Liều lượng (ppm)

Ghi chú

120 Liều lượng nông dân sử dụng

(Gấp 5 lần khuyến cáo )

1 “Tăng phọt 920”

( Thuốc ngoài danh mục )

240 Gấp đôi liều lượng nông dân sử dụng

(Gấp 10 lần khuyến cáo )

120 Liều lượng nông dân sử dụng

(Gấp 5 lần khuyến cáo )

2 ”Viên sủi GA3”

( Thuốc ngoài danh mục )

240 Gấp đôi liều lượng nông dân sử dụng

Thời gian xử lý thuốc

+ Rau xà lách: Xử lý ngày 27/3/2010 (17 ngày sau trồng) + Rau cải: Xử lý ngày 10/4/2010 (14 ngày sau trồng)

Thời gian thu hoach rau

+ Rau xà lách: Thu hoạch ngày 6/4/2010 (10 ngày sau xử lý) + Rau cải: Thu hoạch ngày 24/4/2010 (14 ngày sau xử lý)

2.3.2.2 Chỉ tiêu và phương pháp điều tra

Chỉ tiêu theo dõi :

- Chiều cao cây (đối với rau cải, xà lách) và đường kính tán cây đối với xà lách ở trước xử lý và 3, 7, 10 (hoặc 14) ngày sau xử lý và một ngày trước thu hoạch

- Xác định lượng thuốc tồn dư tại 2 giê, (1), 2, 3, 4, 5 ngµy sau xö lý

- Khối lượng trung bình cây (g/cây) và năng suất (tấn rau tươi/ha)

- Ảnh hưởng xấu của thuốc với cây rau 1,3,7,14 ngày sau phun theo Quy phạm khảo nghiệm trên đồng ruộng số 10 TCN415 – 2000 của Bộ Nông nghiệp và PTNT như sau :

Cấp triệu trứng nhiễm độc của cây trồng :

1 – Cây bình thường

2 – Sinh trưởng cây giảm nhẹ

3 – Ngộ độc tăng lên, sinh trưởng của cây giảm nhưng triệu chứng ( màu sắc, hình dạng ) chưa rõ ràng

4 – Có triệu chứng ngộ độc nhưng chưa ảnh hưởng đến năng suất

5 – Cây biến màu thuốc gây ảnh hưởng đến năng suất

6 – Thuốc làm giảm năng suất ít

7 – Thuốc gây ảnh hưởng nhiều tới năng suất

8 – Triệu chứng ngộ độc tăng dần tới làm chết cây

9 – Cây bị chết hoàn toàn

Phương pháp theo dõi

- Chiều cao cây : Đo từ mặt đất lên đỉnh lá cao nhất tại 5 điểm trên ô, mỗi điểm 4 cây

- Khối lượng trung bình (kg tươi/cây) được lấy mẫu tai 5 điểm trên ô, mỗi điểm 1 cây

- Năng suất rau tươi tính toàn ô khi thu hoạch

2.3.2.3 Xác định ảnh hưởng của thuốc đối với chất lượng rau

Các chỉ tiêu xác định về chất lượng rau và phương pháp xác định các chỉ tiêu này như sau :

+ Hàm lượng chất khô(%): xác định theo phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi và cân

+ Hàm lượng diệp lục: xác định theo phương pháp so màu

+ Hàm lượng Vitamin C: xác định theo phương pháp chuẩn độ 2,6 D

+ Hàm lượng một số chất khoáng (N, P, K): Tỷ lệ nitơ tổng số xác định theo phương pháp Kendan, tỷ lệ P tổng số xác định theo phương pháp so mầu, tỷ lệ K tổng số xác định theo phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử AES